CN112079851A - 一种fto小分子抑制剂金配合物及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种FTO小分子抑制剂金配合物及其合成方法，合成方法是取2‑苯甲酰吡啶和氨基硫脲混合溶解于甲醇中，滴加浓硫酸，于65℃回流搅拌反应，得淡黄色沉淀物；将所得淡黄色沉淀物过滤后用无水甲醇洗涤，干燥后得配体；取配体和Na[AuCl4]•2H2O混合，混合后溶解于甲醇中，于37℃搅拌反应，得黄绿色固体；将黄绿色固体用乙醚洗涤，干燥，用二氯甲烷溶解，过滤，在滤液中加入正己烷，出现明显分层现象，扩散72h后得到深红棕色晶体，即为金配合物。对金配合物进行了肿瘤细胞增殖抑制活性实验，进行了FTO蛋白活性测试实验以及测定金配合物和FTO蛋白的相互作用，证明金配合物可以作FTO蛋白小分子抑制剂的备选。本发明合成方法，操作简单，便于实施。
Description
技术领域
本发明涉及FTO小分子抑制剂，具体是一种以2-苯甲酰吡啶缩氨基硫脲为配体的金配合物及其合成方法，并验证了该金配合物对FTO蛋白的活性的影响。
背景技术
FTO(fat mass and obesity associated)基因，也被称为肥胖基因，是至今为止研究证实最确定的肥胖易感基因。最新研究发现肥胖基因FTO还与癌症关系密切，会导致各类癌症的发生，这为开发有效的靶向治疗药物提供了潜在靶点。2011年，FTO被确证为调控RNA甲基化修饰的去甲基化酶。这一发现揭示了细胞内m6A修饰过程是动态可逆的，并掀起了m6A修饰及其调控蛋白质生物学研究热潮，逐步形成了以m6A修饰为核心内容的表观转录组学研究新方向。后来发现，FTO基因是白血病、乳腺癌、成胶质细胞脑瘤等癌症发生的重要致癌基因之一。
FTO在癌症的发展和进程中起着至关重要的作用，主要是因为它调节癌症干细胞和免疫逃逸，更切确地说是促进癌细胞的生长、自我更新、转移和免疫逃逸，突出了将FTO靶向癌症治疗的广泛潜力。据报道，修改FTO或使用小分子抑制FTO会中断供应链，使癌症得以发展。
缩氨硫脲类是一类具有显著抗肿瘤活性的螯合剂，目前很多研究主要是研究缩氨基硫脲铜、铂等金属配合物，对抗肿瘤缩氨基硫脲金配合物的研究较少，尤其是合成具有抑制FTO蛋白活性的金配合物鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种FTO小分子抑制剂金配合物及其合成方法，该金配合物是以2-苯甲酰吡啶缩氨基硫脲为配体合成的，本发明合成了4个缩氨基硫脲的金配合物，实验证明其具有明显的抑制FTO活性，且对小鼠乳腺癌细胞具有良好的活性。
实现本发明目的的技术方案是：
一种FTO小分子抑制剂金配合物，其结构式如下式C1-C4所示：
上述式C1-C4所示金配合物的合成路线为：
上述式C1-C4所示金配合物的合成方法，包括如下步骤：
(1)取2-苯甲酰吡啶和氨基硫脲混合，混合后溶解于甲醇中，滴加浓硫酸，于65℃回流搅拌反应，得淡黄色沉淀物；将所得淡黄色沉淀物过滤，过滤后用无水甲醇洗涤，洗涤后干燥，干燥后得配体；
(2)取步骤(1)的配体和Na[AuCl4]·2H2O于试管中混合，混合后溶解于甲醇中，于37℃搅拌反应，反应物过滤，得黄绿色固体；将所得黄绿色固体用乙醚洗涤，洗涤后真空干燥，干燥后用二氯甲烷溶解，过滤，在滤液中加入正己烷，出现明显分层现象，扩散72h后得到深红棕色晶体，即为金配合物。
步骤(1)所述氨基硫脲与2-吡啶甲醛的摩尔比为1:1；所述溶剂的用量以能溶解参加反应的原料为宜。
步骤(2)所述配体与Na[AuCl4]·2H2O的摩尔比为1:1；所述溶剂的用量以能溶解参加反应的原料为宜。
本发明选择2-苯甲酰吡啶、氨基硫脲进行缩合反应，得到配体；配体再与Na[AuCl4]·2H2O反应得到金配合物。本发明还提供了C1-C4金配合物对人肺癌细胞A549、人正常细胞HL-7702的细胞活性实验，结果表明，单纯的2-苯甲酰吡啶缩氨基硫脲配体的活性都不高，与金离子配位之后，活性相对都提高了很多，特别是C4金配合物的活性比其它配合物高，可能是和配体上的亲脂基团有关，使活性增加，而对人正常细胞HL-7702细胞而言，C4金配合物的毒性比顺铂低很多。
本发明进一步对合成的C1-C4金配合物进行了FTO蛋白活性测试实验，以及测定金配合物和FTO蛋白的相互作用，证明金配合物对FTO蛋白有很好的抑制效果，并能有效作用于肿瘤，可作为FTO蛋白小分子抑制剂的备选。本发明合成方法，操作简单，便于实施。
附图说明
图1为实施例1合成的C1金配合物的单晶结构图；
图2为实施例2合成的C2金配合物的单晶结构图；
图3为实施例3合成的C3金配合物的单晶结构图；
图4为实施例4合成的C4金配合物的单晶结构图；
图5为对金配合物C1-C4进行FTO蛋白的体外活性抑制实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明内容作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：
C1金配合物的合成，具体合成方法为：
(1)将3mmol的2-苯甲酰吡啶和3mmol的氨基硫脲混合，混合后溶解于20ml的甲醇中，滴加500μL浓硫酸，于65℃回流搅拌反应6h，得淡黄色沉淀物；将所得淡黄色沉淀物过滤，过滤后用无水甲醇洗涤3次，洗涤后干燥，干燥后得配体L1，产率76％；
配体L1的元素分析：Anal.Calcd(％)for C13H12N4S:C,60.91；H,4.72；N,21.86；S,12.51.Found:C,60.20；H,4.59；N,21.07；S,12.88；
红外光谱：IR,cm-1:3407(s,amide),3226(s,NH),3129(m,aromatic hydrogen),1592(s),1458(s),1416(s,aromatic),1325(m,C＝N),1102(s,thioamide),845(m,C-H),770(m,C＝S),653(m)；
质谱：ESI+m/z：C13H12N4S,257.08[M+H]+；
(2)取0.1mmol的Na[AuCl4]·2H2O和0.1mmol的配体L1混合，混合后溶解于10ml甲醇中，于37℃搅拌反应3h，反应物过滤，得黄绿色固体；将所得黄绿色固体用乙醚洗涤3次，洗涤后真空干燥，干燥后用4ml二氯甲烷溶解，过滤，在滤液中加入8ml正己烷，出现明显分层现象，扩散72h后得到深红棕色晶体，即金配合物C1，产率42％，其晶体结构，如图1所示；
金配合物C1的元素分析：Anal.Calcd(％)for C13H12ClN4AuS:C,31.95；H,2.47；N,11.46；S,6.56.Found:C,32.10；H,2.62；N,11.55；S,6.74；
红外光谱：IR,cm-1:3359(s,amide),3276(s,NH),3181(m,aromatic hydrogen),1613(s),1535(s),1506(s,aromatic),1329(m,C＝N),1156(s,thioamide),782(m,C-H),691(m,C＝S),518(m)。
实施例2：
C2金配合物的合成，具体合成方法为：
(1)将3mmol的2-苯甲酰吡啶和3mmol的4-甲基氨基硫脲混合，混合后溶解于20ml的甲醇中，滴加500μL浓硫酸，于65℃回流搅拌反应6h，得淡黄色沉淀物；将所得淡黄色沉淀物过滤，过滤后用无水甲醇洗涤3次，洗涤后干燥，干燥后得配体L2，产率69％；
配体L2的元素分析：Anal.Calcd(％)for C14H14N4S:C,62.20；H,5.22；N,20.72；S,11.86.Found:C,62.18；H,4.99；N,20.77；S,12.08；
红外光谱：IR,cm-1:3296(s,amide),3054(s,NH),2970(m,aromatichydrogen),1539(s),1470(s),1361(s,aromatic),1249(m,C＝N),1042(s,thioamide),818(m,C-H),798(m,C＝S),649(m)；
质谱：ESI+m/z：C14H14N4S,293.08[M+Na]+；
(2)取0.1mmol的Na[AuCl4]·2H2O和0.1mmol的配体L1混合，混合后溶解于10ml甲醇中，于37℃搅拌反应3h，反应物过滤，得黄绿色固体；将所得黄绿色固体用乙醚洗涤3次，洗涤后真空干燥，干燥后用4ml二氯甲烷溶解，过滤，在滤液中加入8ml正己烷，出现明显分层现象，扩散72h后得到深红棕色晶体，即金配合物C2，产率48％，其晶体结构，如图2所示；
金配合物C2元素分析：Anal.Calcd(％)for C14H14ClN4AuS:C,33.45；H,2.81；N,11.14；S,6.38.Found:C,33.52；H,2.92；N,11.32；S,7.01；
红外光谱：IR,cm-1:3266(s,amide),3070(s,NH),3023(m,aromatic hydrogen),1581(s),1520(s),1458(s,aromatic),1305(m,C＝N),1106(s,thioamide),778(m,C-H),691(m,C＝S),643(m)。
实施例3：
C3金配合物的合成，具体合成方法为：
(1)将3mmol的2-苯甲酰吡啶和3mmol的4-苯基氨基硫脲混合后溶解于20ml的甲醇中，滴加500μL浓硫酸，于65℃回流搅拌反应6h得淡黄色沉淀物，将上述所得淡黄色沉淀过滤后用无水甲醇洗3次，干燥后得配体L3，产率56％；
配体L3的元素分析：Anal.Calcd(％)for C19H16N4S:C,68.65；H,4.85；N,16.85；S,9.65.Found:C,68.45；H,4.09；N,16.52；S,9.53；
红外光谱：IR,cm-1:3785(s,amide),3299(s,NH),3051(m,aromatic hydrogen),1593(s),1533(s),1496(s,aromatic),1253(m,C＝N),1174(s,thioamide),921(m,C-H),756(m,C＝S),696(m)；
质谱：ESI+m/z:C19H16N4S,333.11[M+H]+；
(2)取0.1mmol的Na[AuCl4]·2H2O和0.1mmol的配体L3混合，混合后溶解于10ml甲醇中，于37℃搅拌反应3h，反应物过滤，得黄绿色固体；将所得黄绿色固体用乙醚洗涤3次，洗涤后真空干燥，干燥后用4ml二氯甲烷溶解，过滤，，在滤液中加入8ml正己烷，出现明显分层现象，扩散72h后得到深红棕色晶体，即金配合物C3，产率55％，其晶体结构，如图3所示；
金配合物C3的元素分析：Anal.Calcd(％)for C19H16ClN4AuS:C,40.40；H,2.86；N,9.92；S,5.68.Found:C,40.49；H,2.92；N,9.98；S,5.73；
红外光谱：IR,cm-1:3279(s,amide),3193(s,NH),3082(m,aromatichydrogen),1599(s),1549(s),1510(s,aromatic),1266(m,C＝N),1127(s,thioamide),967(m,C-H),758(m,C＝S),699(m)。
实施例4：
C4金配合物的合成，具体合成方法为：
(1)将3mmol的2-苯甲酰吡啶和3mmol的4，4-二甲基-3-氨基硫脲混合，混合后溶解于20ml的甲醇中，滴加500μL浓硫酸，于65℃回流搅拌反应6h，得淡黄色沉淀物；将所得淡黄色沉淀过滤，过滤后用无水甲醇洗涤3次，洗涤后干燥，干燥后得配体L4，产率66％；
配体L4的元素分析：Anal.Calcd(％)for C15H16N4S:C,63.35；H,5,67；N,19.70；S,11.28.Found:C,63.28；H,5.11；N,18.75；S,11.14；
红外光谱：IR,cm-1:3435(s,amide),3074(s,NH),2927(m,aromatic hydrogen),1638(s),1567(s),1512(s,aromatic),1325(m,C＝N),1126(s,thioamide),909(m,C-H),785(m,C＝S),693(m)；
质谱：ESI+m/z:C15H16N4S,285.11[M+H]+；
(2)取0.1mmol的Na[AuCl4]·2H2O和0.1mmol的配体L4混合，混合后溶解于10ml甲醇中，于37℃搅拌反应3h，反应物过滤，得黄绿色固体；将所得黄绿色固体用乙醚洗涤3次，洗涤后真空干燥，干燥后用4ml二氯甲烷溶解，过滤，在滤液中加入8ml正己烷，出现明显分层现象，扩散72h后得到深红棕色晶体，即金配合物C4，产率50％，其晶体结构，如图4所示；
金配合物C4的元素分析：Anal.Calcd(％)for C15H16ClN4AuS:C,34.86；H,3.12；N,10.84；S,6.20.Found:C,35.01；H,3.14；N,11.03；S,6.25；
红外光谱：IR,cm-1:3319(s,amide),3268(s,NH),3059(m,aromatic hydrogen),1541(s),1501(s),1429(s,aromatic),1338(m,C＝N),1133s,thioamide),901(m,C-H),778(m,C＝S),687(m)。
为说明本发明以2-苯甲酰吡啶为配体的金配合物，申请人对上述实施例1-4制得的金配合物C1-C4进行了体外肿瘤细胞增殖抑制活性实验：
一、FTO小分子抑制剂的毒性测试
对人肺癌细胞(A549)、人正常肝细胞(HL-7702)进行了FTO小分子抑制剂的毒性测试：
1、细胞株与细胞培养
本实验选用人肺癌细胞、人正常肝细胞人类细胞株。
所有细胞株均培养在含10％小牛血清、100U/mL链霉素的DMEM培养液内，置37℃含体积浓度5％CO2培养箱中培养。将细胞从-140℃的冰柜中取出，在37℃的恒温水浴锅中进行解冻，转入到五个已灭菌且装有10mL培养液的培养瓶中标记后放入37℃，5％CO2培养箱中，贴壁后换液，当培养瓶中的细胞量达至80％-90％，我们需要对它进行传代，消化分瓶培养，实验完全结束后将细胞冻存于-140℃冰柜中保存。
2、待测化合物的配制
所用的受试药物的纯度≥95％，将其DMSO储液用生理缓冲液稀释后配置成5mmol/L的终溶液，其中助溶剂DMSO的浓度≤1％，测试该浓度下化合物对各种肿瘤细胞生长得抑制程度。
3、毒性测试实验(MTT法)
(1)细胞消化得到细胞悬浮液后，进行细胞计数，取适量细胞于加样槽，加入培养基稀释使细胞浓度达到6×104细胞/mL，以每孔180μL接种于96孔培养板中，使待测细胞浓度至每孔1000～10000/孔(边缘孔用200μL无菌PBS填充)；
(2)5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物20μL，每个浓度梯度设3～5个复孔；
(3)5％CO2，37℃孵育48h，置倒置显微镜下观察；
(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mLPBS，即0.5％MTT)，继续培养4h-6h；
(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡10min，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。
(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：
肿瘤细胞生长抑制率(％)＝[(1-实验组平均OD值)/(对照组平均OD值)]×％；
IC50测定：利用以上方法，每种化合物须设置浓度梯度，其中含多个(一般5～8个)浓度，每个浓度也须设置3～5个副孔，实验得到每个不同浓度的抑制率，然后在SPSS软件中计算化合物的IC50值，见下表1。
表1：
表1：实验结果表明,对于肺癌细胞，单纯的2-苯甲酰吡啶缩氨基硫脲的活性都不高，与金离子配位之后，活性相对都提高了很多，特别是C4金配合物的活性都比其它化合物高，可能是和配体上的亲脂基团有关，使活性增加，而对人正常细胞HL-7702细胞而言，C4金配合物的毒性比顺铂低很多。
二、金配合物C4对15-mer ssRNA中m6A去甲基化抑制作用
选用底物15-mer ssRNA(5’UUGUCA(m6A)CAGCAGA-3’)进行研究，实验过程如下：
配制100μL反应体系，包括50mM HEPES(pH 7.5),4.0μM ssRNA,1.0μM FTO,300μM2OG,280μM(NH4)2Fe(SO4)2,2mM L-ascorbic acid,化合物C4(0.2μM,0.8μM,2.0μM,4.0μM,10.0μM,20.0μM和100.0μM)及H2O,离心,37℃下孵化1h。然后95℃下反应5min,使FTO蛋白失活。离心,向反应体系中加入核酸酶P1(1Unit)和醋酸铵(100μM,5μL)，42℃下反应1h，使ssRNA裂解。离心，体系中加入碳酸氢铵(1.0M,5μL)和碱性磷酸酶CIP(1Unit)，37℃下反应1h，进行去磷酸化。离心，并加入水定容至100μL。利用Thermo TSQ Quantum Ultra LC-MS进行检测(进样量为10μL，流速为180μL/min),并通过与纯核苷酸的标准曲线对比进行定量分析，分析结果如图5所示。
Claims (5)
1.一种FTO小分子抑制剂金配合物，其特征在于，所述金配合物的结构式如下式C1-C4所示：
2.根据权利要求1所述的FTO小分子抑制剂金配合物，其特征在于，C1-C4所示金配合物的合成路线为：
3.根据权利要求2所述的FTO小分子抑制剂金配合物的合成方法，其特征在于，C1-C4所示金配合物的合成方法，包括如下步骤：
(1)取2-苯甲酰吡啶和氨基硫脲混合，混合后溶解于甲醇中，滴加浓硫酸，于65℃回流搅拌反应，得淡黄色沉淀物；将所得淡黄色沉淀物过滤，过滤后用无水甲醇洗涤，洗涤后干燥，干燥后得配体；
(2)取配体和Na[AuCl4]·2H2O混合，混合后溶解于甲醇中，于37℃搅拌反应，反应物过滤，得黄绿色固体；将所得黄绿色固体用乙醚洗涤，洗涤后真空干燥，干燥后用二氯甲烷溶解，过滤，在滤液中加入正己烷，出现明显分层现象，扩散72h后得到深红棕色晶体，即为金配合物。
4.根据权利要求3所述的FTO小分子抑制剂金配合物的合成方法，其特征在于：步骤(1)所述氨基硫脲与2-吡啶甲醛的摩尔比为1:1；
所述溶剂的用量以能溶解参加反应的原料为宜。
5.根据权利要求3所述的FTO小分子抑制剂金配合物的合成方法，其特征在于：步骤(2)所述配体与Na[AuCl4]·2H2O的摩尔比为1:1；
所述溶剂的用量以能溶解参加反应的原料为宜。
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