CN112067564A - 一种快速测定中药复方中总苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速测定中药复方中总苷含量的方法,包括以下步骤:S1提取:取中药复方组合物,提取,得提取液,该提取液为中药复方提取物;S2分离提纯:对所述中药复方提取物进行分离提纯,得到中药复方总苷;S3总苷含量测定:先用DNS法测定所述中药复方总苷中还原糖的含量,然后将所述中药复方总苷进行酸解,得到总糖,再用DNS法测定所述总糖含量,将所述总糖含量减去所述还原糖含量所得结果表征中药复方总苷含量。本发明所提供的方法,无需购买苷类化合物的标准品,无需结合苷类化合物的类型考虑测定仪器及条件,而且DNS法测定还原糖与总糖的方法成熟、简便、快捷,无需贵重仪器,易于操作,适用于中药复方中总苷提取工艺优化。
Description
技术领域
本发明涉及中药复方质检技术领域,更具体地,涉及一种快速测定中药复方中总苷含量的方法。
背景技术
苷类化合物广泛存在于中药中,也是许多中药的有效成分。大量药理研究证实苷类化合物对心血管系统、呼吸系统、消化系统、神经系统、免疫系统表现出重要的药理活性。如人参皂苷有抗肿瘤、抗疲劳、延缓衰老、提高免疫和改善记忆力等活性。葛根中的葛根素与大豆苷元都有抗氧化、保护心血管、抗癌、抗炎、抗溃疡及雌激素等药理作用。因此,苷类成分的含量测定是中药品质评价、质量控制、提取工艺优化、药代动力学、代谢组学等研究中的重要内容。
苷(glycosides)是糖或糖的衍生物与另一非糖物质[苷元(genin)]通过糖基端的碳原子连接而成的一类化合物。凡具有羟基、羧基、氨基或巯基等基团的化合物都可以成为苷元,因此一味中药中可能含有多种苷,如甘草中的甘草苷属于黄酮苷、甘草酸属于三萜皂苷;人参中有原人参二醇、原人参三醇和齐墩果烷三种类型共超过100种人参皂苷被报道(宋齐人参化学成分和药理作用研究进展[J].人参研究,2017,29(2):47-54)。中药复方由两味或两味以上的中药按“君、臣、佐、使”原则配伍而成,其苷类成分种类更为繁多,总苷的含量测定更加困难。
在中药复方总苷提取工艺条件优化时常以总苷的提取量(提取率)为评价指标,因此需要一种能全面表征中药复方总苷含量的测定方法。目前苷类成分的含量测定方法主要为紫外分光光度法或高效液相色谱法,测定时先明确需测定的苷类成分,然后做方法学考察,再进行含量测定,最后根据标准品的含量计算样品中苷类成分的含量。然而,这种思路用于测定中药复方中总苷的含量时存在以下不足:
(1)测定成分难全面覆盖。中药复方是多种中药的组合,其药效是各味中药药效成分综合作用的结果,而中药复方中的苷类成分繁多,其中的一种或几种苷类成分的含量难以全面代表总苷的含量,尤其在进行提取工艺优化时,如以几种苷类成分的含量代表总苷含量,则要加权计算,还需结合各味药在复方中的重要性设置其苷类成分所占的权重。
(2)方法的普适性较差。因苷的种类较多,特性各异,有些苷类成分如人参皂苷的紫外响应较弱,现行的紫外分光光度法或高效液相色谱法难以同时检测出总苷中所有苷类成分的含量。
(3)标准品价格高、不易得。现有测定方法需要购买一种或多种标准品,然而有些标准品价格高、不易得,也限制了含量测定的准确度。
发明内容
基于现有技术中存在的上述技术问题,本发明提供了一种快速测定中药复方中总苷含量的方法,该方法改变现有的聚焦于苷/苷元的含量测定思路,以苷中通过糖苷键与苷元相连的糖为测定对象,通过分别测定总苷酸解后总糖含量与酸解前的还原糖含量,以二者的差值表征中药复方中总苷的含量。
为了实现上述目的,本发明的技术方案如下:
一种快速测定中药复方中总苷含量的方法,包括以下步骤:
S1、提取:取中药复方组合物,提取,得提取液,所述提取液为中药复方提取物;
S2、分离提纯:对所述中药复方提取物进行分离提纯,得到中药复方总苷;
S3、总苷含量测定:先用DNS法测定所述中药复方总苷中还原糖含量,然后将所述中药复方总苷进行酸解,使苷元与糖、糖与糖之间连接的糖苷键断裂,得到苷元及单糖,所述单糖与酸解前的还原糖的总和为总糖,再用DNS法测定所述总糖含量;将所述总糖含量减去所述还原糖含量所得结果表征中药复方总苷含量。
在一些实施方式中,所述步骤S3中测定所述中药复方总苷中还原糖和总糖含量的方法包括以下步骤:
(1)将所述中药复方总苷溶解于蒸馏水中,得总苷溶液;
(2)取适量步骤(1)中的所述总苷溶液,加入第一DNS试剂,于540nm下测定总苷中还原糖的含量;
(3)取适量步骤(1)中的所述总苷溶液,加入硫酸,水浴水解,然后取出并加入第二DNS试剂,水浴下显色,于540nm下测定总苷溶液中总糖的含量;
(4)将步骤(3)中所测得的总糖含量减去步骤(2)中所测得的还原糖含量,即为所述总苷溶液的总苷含量。
在一些实施方式中,所述第一DNS试剂和第二DNS试剂由以下方法制备:取45.5000g的酒石酸钠溶解于250mL的水中,依次加入1.6250g的3,5-二硝基水杨酸和10.0000的NaOH,加热搅拌至完全溶解,再加入1.2500g的苯酚和1.2500g的无水Na2SO4搅拌溶解,冷却后用容量瓶定容至500mL,摇匀后储存在棕色瓶中,避光放置7天。
在一些实施方式中,所述步骤(3)中加入硫酸的浓度为3mol/L。
在一些实施方式中,所述步骤(3)中水浴水解时间为80min。
在一些实施方式中,所述步骤(3)中水浴温度为90℃。
在一些实施方式中,所述步骤(3)中,所述总苷溶液与加入的硫酸体积比为1:2。
在一些实施方式中,所述提取方法包括以下步骤:将所述中药复方组合物打粉,按处方比例称取后加10倍量水煎煮2次,每次1h,得水煎液;合并两次水煎液,浓缩,加入无水乙醇使最终浓度为75%,在4℃环境下静置,沉淀多糖。
在一些实施方式中,所述中药复方组合物为中药饮片或由中药原料直接粉碎得到的散剂。
相较于现有技术,本发明的有益效果如下:
因苷是苷元与糖/糖的衍生物结合的产物,苷元与糖/糖的衍生物之间、糖与糖之间通过糖苷键连接,而糖苷键易被酸或酶水解生成糖与苷元,本发明利用苷是糖或糖的衍生物与苷元结合的结合物的结构特征,使苷类成分在强酸作用下发生糖苷键断裂,生成苷元及单糖,以酸解前后糖的差值表征总苷的含量。
本发明适用于优化中药复方总苷提取工艺,因本发明可较全面地表征总苷含量,通过本发明所提供的方法,可快速测定中药复方中提取的总苷含量,通过测定结果可快速获得中药复方总苷最优的提取工艺及条件,提高中药复方中总苷的提取率。
本发明所提供的方法,无需购买苷类化合物的标准品,无需结合苷类化合物的类型考虑测定仪器及条件,而且DNS法测定还原糖与总糖的方法成熟、简便、快捷,无需贵重仪器,易于操作。
附图说明
图1为本发明的测定方法的流程图;
图2为DNS测定葡萄糖标准曲线。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
实施例1
以中药复方“七味白术散”中的总苷为测定对象。七味白术散出自《小儿药证直诀》,由人参、白茯苓、炒白术、藿香、木香、甘草和葛根七味药组成。从处方中的药物来看,七味白术散总苷有人参皂苷、甘草酸、甘草苷、芒柄花苷、葛根素、大豆苷、染料木苷、金丝桃苷等等,主要为黄酮苷和皂苷,其中,葛根素为黄酮碳苷。
黄酮碳苷结构较稳定,需在强酸、高温或高压条件下酸解,如黄酮碳苷在某一条件下可酸解,其余的苷亦可在相同条件下顺利酸解,因此,以黄酮碳苷的酸解条件为中药复方总苷的酸解标准,在特定条件下吸光值达到最大时视为酸解完全。
如图1所示,七味白术散总苷含量测定的方法,包括以下步骤:
S1、提取:取中药复方组合物,提取,得提取液,所述提取液为中药复方提取物;
S2、分离提纯:对所述中药复方提取物进行分离提纯,得到中药复方总苷;
S3、总苷含量测定:先用DNS法测定所述中药复方总苷中还原糖的含量,然后将所述中药复方总苷进行酸解,得到总糖,再用DNS法测定所述总糖含量,将所述总糖含量减去所述还原糖含量所得结果表征中药复方总苷含量。
更详细地,具体操作如下:
一、七味白术散总苷的制备
土炒白术(浙江,批号:2018062902)、人参(吉林,批号:2018091891)、木香(云南,批号:2018081401)、甘草(宁夏,批号:2018102004)、广藿香(广东,批号:2018041102)、葛根(湖南,批号:2018080601)、茯苓(云南,批号:2018121301),购于湖南中医药大学附属第一医院。
以上七味药烘干至恒重后,打粉机粉碎,过60目筛。
按十分之一的全方剂量(即人参0.75g、土炒白术1.50g、茯苓1.50g、葛根1.50g、木香0.60g、甘草0.30g、藿香1.50g)称取各味药粉末,加入10倍量沸水煎煮2次,每次1小时,合并两次滤液,浓缩滤液至40ml,冷却后加入无水乙醇至乙醇终浓度为75%,4℃醇沉过夜,沉淀多糖,得醇提液;醇提液浓缩后用石油醚(10ml、5ml、5ml)脱脂3次,水层用乙酸乙酯(15ml、10ml、10ml)萃取3次,使用乙酸乙酯萃取后水层用水饱和的正丁醇(15ml、10ml、10ml)萃取3次,合并乙酸乙酯层及正丁醇层溶液,蒸干乙酸乙酯和正丁醇溶剂,得七味白术散总苷。
将所得的七味白术散总苷配成浓度为0.0091g/ml的样品溶液备用。
二、DNS法测定条件的优化
1.DNS试剂的制备
称取酒石酸钾钠45.5000g溶于250ml水中,依次加入3,5-二硝基水杨酸1.6250g,NaOH 10.0000g加热搅拌使其溶解,再加入苯酚1.2500g,无水Na2SO4 1.2500g搅拌溶解,冷却后用容量瓶定容至500ml,摇匀后储存在棕色瓶中,避光放置7天后使用。
2.DNS法最佳检测波长的确定
取1ml浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液,加入上述的5ml DNS试剂,摇匀后沸水浴5min,取出自然冷却后加蒸馏水定容至15ml,摇匀后以蒸馏水为空白进行全波长扫描,确定最大吸收波长为540nm。
3.最佳显色剂用量的确定
取1ml浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液共5份,分别加入1、2、3、4、5ml DNS试剂,摇匀后沸水浴5min,取出自然冷却后加蒸馏水定容至15ml,以蒸馏水为空白,在540nm下检测吸光值,最终确定5ml DNS试剂为最佳显色剂用量。
4.最佳显色时间的确定
取1ml浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液共5份,加入5ml DNS试剂,摇匀后在沸水浴下分别显色9、11、13、15、17min,取出自然冷却后加蒸馏水定容至15ml,以蒸馏水为空白,在540nm下检测吸光值,最终确定13min为最佳显色时间。
5.最佳显色温度的确定
取1ml浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液共5份,加入5ml DNS试剂,摇匀后,分别在60、70、80、90、100℃水浴下显色13min,取出,自然冷却后加蒸馏水定容至15ml,以蒸馏水为空白,在540nm下检测吸光值,最终确定90℃为最佳显色温度。
三、七味白术散总苷样品酸解条件的确定
1.标准曲线制定
精确称取烘至恒重的葡萄糖标准品0.5000g,加适量蒸馏水溶解后定容至500ml,浓度为1mg/ml,分别取1、2、4、6、8ml蒸馏水定容至10ml,配成浓度分别为100、200、400、600、800μg/ml的葡萄糖标准溶液,各取1ml葡萄糖标准溶液与5ml DNS试剂,摇匀后在90℃下水浴13min后自然冷却,定容至15ml,在540nm下检测吸光值。标准曲线为Y=0.0019X-0.0653,R2=0.9992,如图2所示。
2.硫酸浓度的确定
取1ml七味白术散总苷样品溶液(以下简称“样品溶液”)共5份,分别加入1ml浓度为3、4、5、6、7mol/L的硫酸,在90℃水浴1h后,加入等摩尔的氢氧化钠终止反应,将酸解液定容至4ml。分别取酸解前、后的总苷样品液1ml,分别加入5ml DNS试剂在90℃水浴13min,冷却后定容至15ml,在540nm下检测吸光值。确定最优的硫酸浓度为3mol/L。
3.酸水解时间的确定
取浓度为0.0091g/ml的样品溶液1ml共5份,各加入1ml 3mol/L的硫酸,分别在90℃水浴60、70、80、90、100min后,加等摩尔的氢氧化钠终止反应,将水解液定容至4ml。分别取酸解前、后的总苷样品液1ml,按上述测定条件测定吸光值。确定最优水解时间为80min。
4.酸水解温度的确定
取浓度为0.0091g/ml的样品溶液1ml共5份,各加入1ml 3mol/L的硫酸,分别在60、70、80、90、100℃水浴80min后,加等摩尔的氢氧化钠终止反应,将水解液定容至4ml。分别取酸解前、后的总苷样品液1ml,按上述测定条件测定吸光值。确定最优水解温度为90℃。
5.料液比的确定
取浓度为0.0091g/ml的样品溶液1ml共5份,分别按体积比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5(样品溶液:硫酸)的料液比加入3mol/L的硫酸混合,在90℃水浴水解80min后,加等摩尔的氢氧化钠终止反应,将水解液定容至4ml。分别取酸解前、后的样品溶液1ml,按上述测定条件测定吸光值。确定最优料液比为1:2。
四、七味白术散总苷含量的测定
1.七味白术散总苷中还原糖的含量测定
取1ml样品浓度为0.0091g/ml的溶液,加入5ml DNS试剂,在540nm下检测吸光值,测得样品溶液中还原糖的含量为64.1527μg/ml;
2.七味白术散总苷中总糖的含量测定
取1ml样品浓度为0.0091g/ml的溶液,加入3mol/L的硫酸,在90℃下水浴水解80min,取出,然后加入5ml DNS试剂,水浴下显色,于540nm下检测吸光值,测得样品溶液中总糖含量为2171.1579μg/ml;
七味白术散总苷含量=总糖含量-还原糖含量=1587.3684μg/ml。
需要说明的是,除了上述实施例中提到的中药复方,本发明可适用于任意中药复方组合物,尤其是中药饮片或由中药原料直接粉碎得到的散剂。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种快速测定中药复方中总苷含量的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、提取:取中药复方组合物,提取,得提取液,所述提取液为中药复方提取物;
S2、分离提纯:对所述中药复方提取物进行分离提纯,得到中药复方总苷;
S3、总苷含量测定:先用DNS法测定所述中药复方总苷中还原糖含量,然后将所述中药复方总苷进行酸解,再用DNS法测定所述总糖含量,将所述总糖含量减去所述还原糖含量所得结果表征中药复方总苷含量。
2.根据权利要求1所述的快速测定中药复方中总苷含量的方法,其特征在于,所述步骤S3中测定所述中药复方总苷中还原糖和总糖含量的方法包括以下步骤:
(1)将所述中药复方总苷溶解于蒸馏水中,得总苷溶液;
(2)取适量步骤(1)中的所述总苷溶液,加入第一DNS试剂,于540nm下测定总苷中还原糖的含量;
(3)取适量步骤(1)中的所述总苷溶液,加入硫酸,水浴水解,然后取出并加入第二DNS试剂,水浴下显色,于540nm下测定总苷中总糖的含量;
(4)将步骤(3)中所测得的总糖含量减去步骤(2)中所测得的还原糖含量,即为所述总苷溶液的总苷含量。
3.根据权利要求2所述的快速测定中药复方中总苷含量的方法,其特征在于,所述第一DNS试剂和第二DNS试剂由以下方法制备:取45.5000g的酒石酸钠溶解于250mL的水中,依次加入1.6250g的3,5-二硝基水杨酸和10.0000的NaOH,加热搅拌至完全溶解,再加入1.2500g的苯酚和1.2500g的无水Na2SO4搅拌溶解,冷却后用容量瓶定容至500mL,摇匀后储存在棕色瓶中,避光放置7天。
4.根据权利要求2所述的快速测定中药复方中总苷含量的方法,其特征在于,所述步骤(3)中所述硫酸的浓度为3mol/L。
5.根据权利要求2所述的快速测定中药复方中总苷含量的方法,其特征在于,所述步骤(3)中水浴水解时间为80min。
6.根据权利要求2所述的快速测定中药复方中总苷含量的方法,其特征在于,所述步骤(3)中水浴水解温度为90℃。
7.根据权利要求2所述的快速测定中药复方中总苷含量的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,所述总苷溶液与所述硫酸体积比为1:2。
8.根据权利要求1所述的快速测定中药复方中总苷含量的方法,其特征在于,所述步骤S1中,对所述中药复方组合物的提取包括以下步骤:将所述中药复方组合物打粉,按处方比例称取后加10倍量水煎煮2次,每次1h,得水煎液;合并两次水煎液,浓缩,加入无水乙醇使乙醇最终浓度为75%,在4℃环境下静置,沉淀多糖,得醇提液。
9.根据权利要求8所述的快速测定中药复方中总苷含量的方法,其特征在于,所述步骤S2中,所述分离提纯方法为:所述醇提液浓缩后用石油醚脱脂3次,水层用乙酸乙酯萃取3次,乙酸乙酯萃取后所得水层再用正丁醇萃取3次,合并乙酸乙酯层和正丁醇层溶液,蒸干乙酸乙酯和正丁醇溶剂,得中药复方总苷。
10.根据权利要求1所述的快速测定中药复方中总苷含量的方法,其特征在于,所述中药复方组合物为中药饮片或由中药原料直接粉碎得到的散剂。
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2020
- 2020-09-14 CN CN202010959851.4A patent/CN112067564A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107228833A (zh) * | 2017-04-21 | 2017-10-03 | 东莞微领生物科技有限公司 | 一种无患子总皂苷快速检测试剂盒及检测方法 |
CN110702843A (zh) * | 2019-09-30 | 2020-01-17 | 佛山市欧若拉生物科技有限公司 | 无患子皂苷标准品的非标定量测定试剂盒及测定方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
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