CN112057628A - 一种抗肿瘤药物盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗肿瘤药物盒。所述药物盒包括：含有蒽环类化合物的制剂，及含有黄芪提取物的制剂。所述黄芪提取物占所述蒽环类化合物的质量百分数为5～20wt％。经本发明实验创造性发现本发明提供的黄芪提取物具有具有降低蒽环类化合物对心脏和造血系的毒性作用，具体包括缓解蒽环类化合物引起的心功能障碍，减少蒽环类化合物引起的心肌细胞自由基累积，缓解蒽环类化合物对细胞能量代谢的抑制作用，和降低蒽环类化合物对心肌细胞凋亡的促进作用。

Description

一种抗肿瘤药物盒

技术领域

本发明属于药物组合物领域，具体涉及一种抗肿瘤药物盒。

背景技术

蒽环类化合物是有链霉素均属产生的具有抗肿瘤活性的化学物质。常见的蒽环环类抗生素主要包括阿霉素(adriamycin，ADM)、表阿霉素(epirubicin，EPI)、柔红霉素(daunorubicin，DNR)、吡喃阿霉素(4'-0-tetrahydropyranyladriamycin，THP)、去甲氧柔红霉素(idarubicin，IDA)、阿克拉霉素(aclacinomycin，ACM)和米托蒽醌(mitoxantrone，MIT)等。蒽环类抗生素具有抗瘤谱广、抗瘤作用强、疗效高的特点，主要用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤，如急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌等，但容易引起骨髓抑制和心脏毒性等不良反应。蒽环类抗生素的心脏毒性反应在早期表现不明显，一般呈进展性、不可逆性，严重时会导致病人死亡。因此早期监测和预防蒽环类抗生素所致心脏毒性具有重要意义。近年来，国内外越来越多的学者与专家对蒽环类抗生素心脏毒性的特点、临床表现、机制和防治等问题进行研讨。为了进一步规范蒽环类抗生素的合理应用，我国今年制定了最新的《中国蒽环类药物特性专家共识》。

目前关于蒽环类化合物的心脏毒性预防方式主要为选用对心脏毒性小的蒽环类药物、在药物中加入配料如抗氧化剂等方式对其毒性，但这些预防方式效果均不佳，而且加入的抗氧化剂对抗肿瘤作用也会产生影响。

发明内容

为达到上述技术目的，本发明的技术方案包括：

本发明提供一种抗肿瘤药物盒，所述药物盒包括：含有蒽环类化合物的制剂，及含有黄芪提取物的制剂。

具体的，所述黄芪提取物占所述蒽环类化合物的质量百分数为5～20wt％。

具体的，所述黄芪提取物包括杂多糖提取物和烟酰胺提取物，所述杂多糖提取物和烟酰胺提取物的重量配比为(1～10):(1～20)。

具体的，所述黄芪提取物还包括毛蕊异黄酮提取物，杂多糖提取物、烟酰胺提取物和毛蕊异黄酮提取物的重量配比为(1～10):(1～20):(0.1～1)。

具体的，所述杂多糖提取物是由以下方法得到：

S11、取黄芪用醇溶液提取后，取残渣，用水提取；

S12、对水提取液用醇溶液进行分级沉淀法，在3倍量醇溶液中分离得到沉淀；

S13、取沉淀溶于水，去除不溶物，溶液通过纤维层析柱后，洗脱；

S14、收集洗脱液，用乙醇和丙酮溶解后，经凝胶层析精制，得到杂多糖的精制品。

具体的，所述杂多糖提取物中含有已糖醛酸、葡萄糖、鼠李糖和果糖的质量配比为(3～5):2:(0.5～1):(0.5～1)。

具体的，所述烟酰胺提取物是由以下方法得到：

S21、取黄芪用醇溶液回流提取多次后，合并提取液，浓缩得到浸膏；

S22、浸膏用水分散后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得萃取液；

S23、萃取液过硅胶柱，用乙酸乙酯-丙酮体系进行梯度洗脱，收集硅胶柱馏分，HPLC法检测是否含烟酰胺；

S24、对于含有烟酰胺的馏分过凝胶柱分离，采用乙酸乙酯与甲醇体系进行洗脱，得到烟酰胺的精制品。

具体的，所述毛蕊异黄酮提取物是由以下方法得到：

S31、取黄芪研磨成粉末，将其用醇溶液回流提取多次后，合并提取液；

S32、将提取液浓缩，过硅胶柱，用于醇溶液洗脱，收集馏分，HPLC法检测是否含毛蕊异黄酮；

S33、对于含有毛蕊异黄酮的馏分过凝胶柱分离，采用甲醇-乙腈-水体系进行洗脱，得到烟酰胺的精制品。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

本发明创造性地发现，经过提取的黄芪提取物，其具有降低蒽环类化合物对心脏和造血系的毒性作用。具体的，降低蒽环类化合物对心脏和造血系的毒性作用包括：缓解蒽环类化合物引起的心功能障碍，减少所述蒽环类化合物引起的心肌细胞自由基累积，缓解所述蒽环类化合物对细胞能量代谢的抑制作用，和降低所述蒽环类化合物对心肌细胞凋亡的促进作用。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

黄芪提取物及提取方法

本发明的一个实施方面，提供一种黄芪提取物，包括杂多糖和烟酰胺；进一步的，黄芪提取物还包括毛蕊异黄酮。

1、杂多糖提取的步骤包括：

S11、取黄芪用醇溶液提取后，取残渣，用水提取；

S12、对水提取液用醇溶液进行分级沉淀法；

S13、取沉淀溶于水，去除不溶物，溶液通过纤维层析柱后，洗脱；

S14、收集洗脱液，用乙醇和丙酮溶解后，经凝胶层析精制，得到杂多糖的精制品。

经过上述步骤得到一种杂多糖DS，用醋酸纤维薄膜电泳，阿利新蓝显色，得到清洗斑点。经凝胶层析得到一个单峰。经过分析，DS为白色粉末，溶于水，在水中的特性粘度为6.2。可以发送已糖醛酸的硫酸-咔唑反应、半乳糖醛酸的硫酸-半胱氨酸反应和鼠李糖的硫酸-半胱氨酸反应，证明其结构中含有已糖醛酸、葡萄糖和鼠李糖，并通过氢氧化铜悬浮液，生产不产生将蓝色沉淀而不能使溴水褪色表明分子结构中含有果糖。

针对杂多糖的提取过程，本发明进行了如表1所示的实施例和对比例。表1中，列出了S11步骤的醇提时间，具体的，可为12～24h之间，如12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h；S12步骤中的分级沉淀中的用量及分级次数，具体的分级次数为2～3次，而且每1次的醇溶液用量为S11步骤水提取液的3倍用量或上次的沉淀后上清液的3倍用量，且醇溶液具体可为乙醇的水溶液，沿分级次数其浓度依次提升，如70％、80％和95％。另外，表1中还列举了S14步骤中的乙醇和丙酮溶解的配比，具体可为乙醇的占比为70～95％，如还可以为71％、72％、73％或74％、80％、85％、90％或95％。经过测定，其混合物中或分子结构中含有的已糖醛酸、葡萄糖、鼠李糖和果糖的的分子机构，表1还列举了最终得到的杂多糖的已糖醛酸、葡萄糖、鼠李糖和果糖的基团比例，具体的比例为(3～5):2:(0.5～1):(0.5～1)。由表1可见，对比例1-5最终得到的杂多糖的已糖醛酸、葡萄糖、鼠李糖和果糖的基团比例均不在上述限定的范围内。

表1

	S11	S12	S14	杂多糖糖基团比例
					实施例1	12h	3次，70％、80％、95％	73％	3:2:0.8:0.5
实施例2	18h	3次，70％、80％、95％	73％	4:2:0.7:0.6
					实施例3	24h	3次，70％、80％、95％	73％	5:2:0.6:0.6
实施例4	18h	2次，80％、95％	73％	4:2:0.5:0.5
					实施例5	18h	3次，70％、80％、95％	72％	5:2:0.6:0.8
实施例6	18h	3次，70％、80％、95％	74％	4:2:0.6:1
					对比例1	25h	3次，70％、80％、95％	74％	7:2:0.4:1
对比例2	10h	3次，70％、80％、95％	74％	2:2:0.3:0.8
					对比例3	25h	1次，95％	74％	6:2:0.6:0.4
对比例4	25h	1次，95％	68％	6:2:0.5:0.3
					对比例5	25h	1次，95％	98％	6:2:0.9:0.4

2、烟酰胺提取的步骤包括：

S21、取黄芪用醇溶液回流提取多次后，合并提取液，浓缩得到浸膏；

S22、浸膏用水分散后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得萃取液；

S23、萃取液过硅胶柱，用乙酸乙酯-丙酮体系进行梯度洗脱，收集硅胶柱馏分，HPLC法检测是否含烟酰胺；

S24、对于含有烟酰胺的馏分过凝胶柱分离，采用乙酸乙酯与甲醇体系进行洗脱，得到烟酰胺的精制品。

精制品为白色片状结晶。¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ:9.02(1H,d,J＝1.8Hz,Н-2),8.68(1H,dd,J＝4.8,1.8Hz,Н-6),8.20(1H,dt,J＝8.1,1.8Hz,H4),8.16(1H,brs,-NH),7.61(1H,brs,-NH),7.55(1H,dd,J＝4.8,8.1Hz,H-5)。

¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ:166.5(С-7),151.8(С-2),148.6(C-6),135.4(C4)，129.8(C-3),123.6(C-5)。通过上述¹H-NMR和¹³C-NMR的鉴定，故确定该化合物为烟酰胺。

3、毛蕊异黄酮提取的步骤包括：

S31、取黄芪研磨成粉末，将其用醇溶液回流提取多次后，合并提取液；

S32、将提取液浓缩，过硅胶柱，用于醇溶液洗脱，收集馏分，HPLC法检测是否含毛蕊异黄酮；

S33、对于含有毛蕊异黄酮的馏分过凝胶柱分离，采用甲醇-乙腈-水体系进行洗脱，得到烟酰胺的精制品。

精制品为白色结晶体。¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ:9.27(1H,s,OH),10.38(1H,s,OH),6.46(1H,s,CH),6.69(1H,brs,J＝9,1.5Hz,CH),6.76(1H,brs,J＝17,1.5Hz,CH),6.45(1H,brs,J＝17,7.5Hz,CH),7.86(1H,brs,J＝10,1.5Hz,CH),7.08(1H,brs,J＝7,1.5Hz,CH),3.86(1H,brs,J＝4.8,8.1Hz,CH₃),8.68(1H,brs,H)。¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆)δ:158.6(С-8a),153.2(СH-2),175.3(C-4),149.3(C-4),147.1(C-3),165.0(C-7),123.5(C-3),118.2(C-4a),123.3(C-1),101.4(CH-8),116.8(CH-2),112.1(CH-5),115.0(CH-6),128.2(CH-5),122.7(CH-6),56.1(CH₃)。通过上述¹H-NMR和¹³C-NMR的鉴定，故确定该化合物为毛蕊异黄酮。

具体的，本发明提供的黄芪提取物，是将上述实施例提供的方法分别得到杂多糖、烟酰胺和毛蕊异黄酮，然后按照一定的比例配制在一起，作为其组合物。具体的，黄芪提取物包括杂多糖和烟酰胺时，其重量配比杂多糖:烟酰胺＝(1～10):(1～20)，可举例为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、2:1、2:10、5:1、5:2、8:1、8:2、10:1、10:2；对应的，黄芪提取物包括杂多糖、烟酰胺和毛蕊异黄酮时，其重量配比杂多糖:烟酰胺:毛蕊异黄酮＝(1～10):(1～20):(0.1～1)，可举例为1:1:1、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:10:1、1:20:1、2:1:0.5、2:10:0.5、5:1:0.1、5:2:0.1、8:1:0.1、8:1:0.5、8:1:1、8:2:0.1、8:2:0.5、8:2:1、8:2:2、10:1:0.1、10:1:0.5、10:1:1、10:2:0.1、10:2:0.5或10:1:1。上述黄芪提取物的用途中各组分可以在列举的实例中自由选择和组合，也可以对上述各组分范围内没有列举的数值进行选择和组合，均不应作为对各组分重量选择的限制。另外，还将杂多糖、烟酰胺、毛蕊异黄酮、黄芪水煎液和黄芪皂苷I分别作为单一的组分作为对比例，具体如表1。

黄芪提取物及在抗肿瘤药物盒

本发明提供一种抗肿瘤药物盒，药物盒包括：含有蒽环类化合物的制剂，及含有黄芪提取物的制剂。在蒽环类化合物抗肿瘤作用的同时，黄芪提取物具有降低蒽环类化合物对心脏和造血系的毒性作用。具体的，含有蒽环类化合物的制剂和含有黄芪提取物的制剂为分别独立包装的药物制剂，在产生这种减低心脏毒性作用时，黄芪提取物占蒽环类化合物的质量百分数为5～20wt％。针对不同蒽环类化合物，如柔比星(DOX)、柔红霉素(DNR)、伊达比星、吡柔红星、戊柔红星以及米托蒽醌等，对应的产生的心脏毒性作用大小不同，因此，所需的降低心脏毒性的黄芪提取物的分量不同，但其作用的分量均为占蒽环类化合物质量的5～20wt％。

具体的，降低蒽环类化合物对心脏和造血系的毒性作用包括：缓解所述蒽环类化合物引起的心功能障碍，阻断所述蒽环类化合物与自由基(ROS)的结合作用，缓解所述蒽环类化合物对细胞能量代谢的抑制作用，和降低所述蒽环类化合物对心肌细胞凋亡的促进作用中的至少一种。

由于蒽环类药物能够诱导心肌细胞钙离子、镁离子或锌离子的释放，激活肌浆网的离子通道，造成心肌细胞的金属离子超载，导致心肌细胞结构损伤和功能代谢障碍。而本发明提供的黄芪提取物能够结合金属离子，减少这种损伤。

由于一些蒽环类化合物能够从黄素蛋白激发，产生自由基，自由基与蒽环药物结合形成氧化还原循环，这种循环会导致心肌细胞损伤。

蒽环类药物还能降低三磷酸腺苷(ATP)、磷酸肌酸(PCr)及PCr/ATP水平，降低心脏能源储备，并通过呼吸链中的蛋白复合物引起线粒体DNA的缺失和突变，抑制线粒体的生物生成，从而导致心肌病诱发脂肪酸和葡萄糖利用率下降。

蒽环类药物还可以通过促凋亡蛋白(Bax,caspases和细胞色素C)的上调和抗凋亡蛋白(Bc12,Akt)的下调，诱导心机细胞凋亡。而本发明提供的黄芪提取物具有能够蒽环类药物结合，阻止其活性基团对促凋亡蛋白的上调和抗凋亡蛋白的下调。

为验证本发明提供的黄芪提取物降低蒽环类化合物对心脏和造血系的毒性作用，进行以下试验。

1、材料与方法

1.1实验仪器与材料

彩超仪(型号：Sonos5500，惠普公司)；荧光酶标仪(型号：K3，赛默飞世尔公司)。TQW上述实施例制备；DNR为Sigma-Aldrich公司购买；HE染色试剂盒购自晶都生物技术有限公司；蛋白浓度测定试剂盒购自生工公司；BCL-2、Bax抗体购自CST公司；活性氧物质(ROS)荧光测定试剂盒购自杰美医药科技；细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司。

1.2实验动物分组

SPF级环境饲养健康雄性Balb/c小鼠(6～8w，20～25g)，取一定数量小鼠作为健康组小鼠。

其余小鼠进行实体瘤造模，于无菌条件下取接种7天的MFC细胞和S180瘤源动物的腹水，加无菌生理盐水洗涤后，配制成10⁶个/ml的浓度，于小鼠右前肢腋下皮下接种0.2ml，于彩超照射下，检测实体瘤约1cm³时，表明实体瘤小鼠造模成功。

具体分组如下：

健康组(Healthy组)；生理盐水灌胃健康小鼠；

对照组(Control组)：生理盐水灌胃实体瘤小鼠；

柔红霉素治疗组(DNR组)：DNR 2mg/kg，腹腔注射腹水癌模型小鼠，生理盐水灌胃，给药10d；

柔红霉素+黄芪提取物治疗组(DNR+TQW组)：对腹水癌小鼠模型，按照2mg/kg的DNR，0.1mg/kg的TQW每日灌胃给药小鼠，给药10d。

其中，DNR+TQW组中采用的为本发明提供的黄芪提取物(TQW)，该黄芪提取物包括杂多糖和烟酰胺，进一步的，还包括毛蕊异黄酮。具体的黄芪提取物实施例和对比例，如表2。具体的，实施例11～20中的黄芪杂多糖利用了表1中的实施例6制备的黄芪杂多糖，而对比例16～20中使用的黄芪杂多糖对应为对比例1～5提供的黄芪杂多糖。

表2

1.3小鼠抑瘤检测

将DNR组、DNR+TWQ组治疗腹水癌模型小鼠15d后，于彩超照射下，模拟计算瘤体体积，技术抑瘤率。抑瘤率＝(1-V1/V0)×100％，V1为对应的给药组(DNR组或DNR+TWQ组)的平均瘤体体积；V0为Control组平均瘤体体积。

1.4心功能检测

异氟醚麻醉小鼠，15MHz小动物高频超声探头行心脏彩超。于乳头肌水平移动探头确保对齐左室长轴，采集清晰图像，测量心脏形态，计算左室舒张末期内径(LVEDD)，左室收缩末内径(LVESD)和左室射血分数(LVEF)。

1.5 ROS含量检测

磷酸盐缓冲液(PBS)清洗心肌组织并制成组织悬液；稀释特异性荧光探针2',7'-二氯荧光乙酰乙酸盐，滴加入组织悬液，37℃孵育30min；期间每3～5min混匀使探针和心肌组织充分接触，PBS洗涤除去残余探针，荧光酶标仪检测ROS荧光含量(激发波长:488nm，发射波长:525nm)。

1.6 Western印迹法检测凋亡蛋白表达

提取心肌总蛋白Bradford法定量后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转印至PVDF膜上，并置于含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液中封闭非特异性结合位点，4℃过夜；TBST洗涤，Bcl-2和Bax一抗4℃过夜，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1h，ECL plus显色，凝胶成像系统行灰度扫描并分析，计算各蛋白与内参β-actin的比值作为相对灰度值，表示目的蛋白的相对表达水平。

1.7 TUNEL法检测心肌凋亡指数

固定、封闭、通透、TdT反应、辣根过氧化物-链霉亲和素反应、二氨基联苯胺法显色、苏木素复染、盐酸酒精分化，用纯水返蓝；酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每张切片随机选取5个高倍镜视野，显微镜下观察并计数凋亡阳性细胞数(判断标准:阴性细胞即未发生凋亡的细胞，核染色为蓝色；阳性细胞即凋亡细胞，胞核染色呈深棕色或棕黄色颗粒)计算凋亡指数(AI)。AI＝阳性细胞数/总细胞数×100％。

1.8统计学分析

采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析及SNK-q检验。

2结果

2.1 TQW改善小鼠心功能障碍

表2(x±s)

表2为各试验组别对DNR引起的心功能障碍的作用影响，其中分别对LVEDD、LVESD和LVEF对应的各组别之间进行的差异显著性分析，并进行差异性显著标记，每列各组别之间分别由小至大标记a、b、c，不同标记表示有显著性差异。由表2可知：

1)与Healthy组相比较，Control组相比较的LVEDD、LVESD和LVEF水平均未发生显著性变化，说明实体瘤小鼠其心脏功能没有受到其肿瘤的显著影响。

2)进一步的，DNR治疗组的平均抑瘤率为45.62±5.23％，其抑制实体瘤效果明显。然而，DNR治疗组的LVEDD和LVESD水平相对于Healthy组均显著升高，LVEF水平相对于Healthy组显著降低，说明DNR在治疗实体瘤的同时，引起了小鼠心脏功能障碍。

3)进一步的，DNR+TQW组在DNR组的基础上，向小鼠给药了本发明提供的黄芪提取物。其中，实施例18、19、20与DNR组处于同一水平的抑瘤率，而其他实施例和对比例均低于DNR组，但也均维持在较高水平的抑瘤率。然而，实施例11-20的LVEDD、LVESD和LVEF水平分别与Control组维持在同一水平，这说明本发明提供的黄芪提取物与DNR一起治疗实体瘤小鼠时，其能够缓解单独给药DNR所带来的小鼠心功能障碍。进而，对比例11-15LVEDD、LVESD和LVEF水平分别与Control组有显著差别，其提供的非本发明的黄芪提取物不能对DNR引起的实体瘤小鼠心功能障碍有解除作用。

4)而进一步的，对比例16-20中的LVEDD、LVESD和LVEF水平分别与Control组有显著差别，其提取的非本发明的黄芪提取物，尤其是其中的杂多糖的分子结构不在本发明限定的范围内，因而，其不能对DNR引起的实体瘤小鼠心功能障碍有解除作用。

2.2 TQW减少ROS过度累积

表3(x±s)

表3为各试验组别对DNR引起的心功能障碍的作用影响，其中对ROS荧光密度对应的各组别之间进行的差异显著性分析，并进行差异性显著标记，每列各组别之间分别由小至大标记a、b、c，不同标记表示有显著性差异。由表3可知：

1)与Healthy组相比较，Control组ROS荧光密度的水平未发生显著性变化，说明实体瘤小鼠其心脏细胞中ROS的水平没有受到其肿瘤的显著影响。

2)进一步的，DNR治疗组虽然具有较高的平均抑瘤率，但与Control组〔(319.18±17.87)荧光密度/mg pro〕相比，DNR组〔(635.88±16.68)荧光密度/mg pro〕小鼠心肌组织内ROS荧光含量显著升高(P＜0.01)，这表明DNR在治疗实体瘤时，激发了黄素蛋白，产生了ROS自由基累积，造成氧化还原循环，而这种循环会导致心肌细胞损伤。

3)进一步的，DNR+低TQW组在DNR组的基础上，向小鼠给药了本发明提供的黄芪提取物。在保证其治疗效果的前提下，其实施例11-20的ROS荧光密度显著低于DNR组，与Control组和Healthy组维持在同一水平，这说明本发明提供的黄芪提取物与DNR一起治疗小鼠实体瘤时，能够降低单独给药DNR带来的小鼠ROS累积，具体是为本发明提供的黄芪提取物与DNR产生的ROS结合，对其进行消解，从而减少自由基对心肌细胞的损伤。

4)进一步的，对比例11-15的ROS荧光强度均显著高于Control组和Healthy组，与DNR组维持在同一水平。更进一步的，实施例15、16相对于实施例11-14，其ROS荧光强度有所降低，这表明本发明提供的黄芪提取物中，黄芪杂多糖与烟酰胺的比例或10:2，8:2时，其效果更佳。而在加入黄芪毛蕊异黄酮后，其ROS荧光强度进一步减低，达到与Healthy组接近，说明在本发明提供的黄芪提取物中加入毛蕊异黄酮，能够获得最佳的降低蒽环类化合物引起的ROS累积作用。

5)进一步的，对比例16-20的ROS荧光强度均显著高于Control组和Healthy组，但低于DNR组，由于其提取的非本发明的黄芪提取物，尤其是其中的杂多糖的分子结构不在本发明限定的范围内，因而，其对DNR引起的实体瘤小鼠心肌细胞ROS累积作用缓解有限。

2.3 TQW降低凋亡相关蛋白的表达

表4(x±s)

表4为各试验组别对DNR引起的心功能障碍的作用影响，其中对Bax表达水平、Bcl-2表达水平和心肌细胞凋亡指数对应的各组别之间进行的差异显著性分析，并进行差异性显著标记，每列各组别之间分别由小至大标记a、b、c，不同标记表示有显著性差异。由表4可知：

1)与Healthy组相比较，Control组Bax表达水平、Bcl-2表达水平和心肌细胞凋亡指数均发生显著性变化，说明实体瘤小鼠其心脏细胞的凋亡未有显著影响。

2)进一步的，DNR治疗组虽然具有较高的平均抑瘤率，但其Bax表达水平显著高于Healthy组，Bcl-2表达水平显著低于Healthy组，心肌细胞凋亡指数显著高于Healthy组，这表明DNR在治疗实体瘤时，促凋亡蛋白Bax的上调和抗凋亡蛋白Bc12的下调，诱导心机细胞凋亡。

3)进一步的，DNR+TQW组在DNR组的基础上，向小鼠给药了本发明提供的黄芪提取物。在保证其治疗效果的前提下，其实施例11-20的Bax表达水平显著低于DNR治疗组，Bcl-2表达水平显著高于DNR治疗组，心肌细胞凋亡指数显著低于DNR治疗组，其对心肌细胞的凋亡有缓解，降低了DNR对心脏的毒性。而对比例11-15的Bax表达水平、Bcl-2表达水平和心肌细胞凋亡指数均与DNR组未有显著差别，表明其未见有减低DNR毒性的作用。对比例16-20的Bax表达水平、Bcl-2表达水平和心肌细胞凋亡指数均与DNR组未有显著差别，由于其提取的非本发明的黄芪提取物，尤其是其中的杂多糖的分子结构不在本发明限定的范围内，这表明本发明提供的黄芪提取物尤其是杂多糖提取物，其对于减低DNR毒性的作用具有显著影响。

4)进一步的，实施例15、16相对于实施例11-14，其Bcl-2表达水平显著升高，其心肌细胞凋亡指数显著降低，这表明这表明本发明提供的黄芪提取物中，黄芪杂多糖与烟酰胺的比例或10:2，8:2时，其效果更佳。而在加入黄芪毛蕊异黄酮后，其Bax表达水平进一步减低，其Bcl-2表达水平进一步升高，其心肌细胞凋亡指数进一步降低，均达到了与Healthy组接近的水平；说明在本发明提供的黄芪提取物中加入毛蕊异黄酮，能够获得最佳的降低蒽环类化合物引起的心肌细胞凋亡作用。

综上所述：

1、本发明创造性地发现，经过提取的黄芪提取物，其具有降低蒽环类化合物对心脏和造血系的毒性作用。具体的，降低蒽环类化合物对心脏和造血系的毒性作用包括：缓解蒽环类化合物引起的心功能障碍，减少所述蒽环类化合物引起的心肌细胞自由基累积，缓解所述蒽环类化合物对细胞能量代谢的抑制作用，和降低所述蒽环类化合物对心肌细胞凋亡的促进作用中的至少一种。

2、本发明提供的黄芪提取物在降低蒽环类化合物心脏毒性的作用时，对小鼠抑瘤进行检测，发现本发明提供的黄芪提取物与DNR一起治疗实体瘤小鼠时，其能够降低单独给药DNR所带来的小鼠心功能障碍。

3、本发明提供的黄芪提取物与DNR一起治疗小鼠实体瘤时，能够降低单独给药DNR带来的小鼠ROS累积，具体是为本发明提供的黄芪提取物与DNR产生的ROS结合，对其进行消解，从而减少自由基对心肌细胞的损伤。

4、本发明提供的黄芪提取物与DNR一起治疗小鼠实体瘤时对心肌细胞的凋亡有缓解，降低了DNR对心脏的毒性。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种抗肿瘤药物盒，其特征在于，所述药物盒包括：含有蒽环类化合物的制剂，及含有黄芪提取物的制剂。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤药物盒，其特征在于，所述黄芪提取物占所述蒽环类化合物的质量百分数为5～20wt％。

3.如权利要求1所述的抗肿瘤药物盒，其特征在于，所述黄芪提取物包括杂多糖提取物和烟酰胺提取物，所述杂多糖提取物和烟酰胺提取物的重量配比为(1～10):(1～20)。

4.如权利要求3所述的抗肿瘤药物盒，其特征在于，所述黄芪提取物还包括毛蕊异黄酮提取物，杂多糖提取物、烟酰胺提取物和毛蕊异黄酮提取物的重量配比为(1～10):(1～20):(0.1～1)。

5.如权利要求3或4所述的抗肿瘤药物盒，其特征在于，所述杂多糖提取物是由以下方法得到：

S11、取黄芪用醇溶液提取后，取残渣，用水提取；

S12、对水提取液用醇溶液进行分级沉淀法，在3倍量醇溶液中分离得到沉淀；

S13、取沉淀溶于水，去除不溶物，溶液通过纤维层析柱后，洗脱；

S14、收集洗脱液，用乙醇和丙酮溶解后，经凝胶层析精制，得到杂多糖的精制品。

6.如权利要求5所述的抗肿瘤药物盒，其特征在于，所述杂多糖提取物中含有已糖醛酸、葡萄糖、鼠李糖和果糖的质量配比为(3～5):2:(0.5～1):(0.5～1)。

7.如权利要求3或4所述的抗肿瘤药物盒，其特征在于，所述烟酰胺提取物是由以下方法得到：

S21、取黄芪用醇溶液回流提取多次后，合并提取液，浓缩得到浸膏；

S22、浸膏用水分散后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得萃取液；

S23、萃取液过硅胶柱，用乙酸乙酯-丙酮体系进行梯度洗脱，收集硅胶柱馏分，HPLC法检测是否含烟酰胺；

S24、对于含有烟酰胺的馏分过凝胶柱分离，采用乙酸乙酯与甲醇体系进行洗脱，得到烟酰胺的精制品。

8.如权利要求4所述的黄芪提取物的提取方法，其特征在于，所述毛蕊异黄酮提取物是由以下方法得到：

S31、取黄芪研磨成粉末，将其用醇溶液回流提取多次后，合并提取液；

S32、将提取液浓缩，过硅胶柱，用于醇溶液洗脱，收集馏分，HPLC法检测是否含毛蕊异黄酮；

S33、对于含有毛蕊异黄酮的馏分过凝胶柱分离，采用甲醇-乙腈-水体系进行洗脱，得到烟酰胺的精制品。