CN112057471A - 间充质干细胞的制药用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了间充质干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病，所述间充质干细胞包括子宫内膜间充质干细胞。

Description

间充质干细胞的制药用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种间充质干细胞的制药用途。
背景技术
子宫内膜癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶行肿瘤的20％-30％。近年来其发病率逐年上升，并呈年轻化趋势。而随着子宫内膜癌及癌前病变患病率的逐年增加以及年轻化，越来越多的患者具有强烈的生育需求。目前大剂量的药物治疗(包括孕激素等)作为子宫内膜癌保留生育功能治疗的首选方案，但存在孕激素治疗时间长、治疗无效切除子宫或治愈后由于内膜损伤导致的生育率低的问题，并且长期孕激素治疗可能导致水钠储溜、体重增加、血栓形成等不良后果，影响患者的生活质量和依从性。而对有生育要求的完全缓解病例，由于内膜癌灶破坏内膜、诊治过程中多次诊刮损伤内膜等原因，导致这部分患者妊娠率不足50％，活产率仅30％左右。因此，有必要寻找新的治疗方案，提升内膜癌保育效果，缩短治疗时间，降低不良反应发生率。
子宫内膜癌及癌前病变的患者的治疗方案从两方面着手，第一是逆转内膜病变，第二是修复子宫内膜。目前的药物治疗只针对治疗内膜病变，并不存在修复子宫内膜的功能。因此，需要研究开发一种新的适合于子宫内膜癌及癌前病变保留生育功能治疗的新方案。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本申请的目的在于提供间充质干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病。
一方面本申请提供了间充质干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病。
在某些实施方式中，所述子宫内膜恶性增生病变包括子宫内膜癌及癌前病变。
在某些实施方式中，其中，所述间充质干细胞包括子宫内膜间充质干细胞。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞包括分选自子宫内膜组织的SUSD2+CD45-细胞群。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞包括分选自子宫内膜组织的CD45-CD73+CD90+CD105+细胞群。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞不包括来源于子宫恶性增生疾病患者的子宫内膜间充质干细胞。
在某些实施方式中，所述间充质干细胞具有如下功能的至少一种：
1)抑制子宫内膜癌细胞的增殖；
2)促进子宫内膜癌细胞的凋亡；
3)抑制子宫内膜癌细胞皮下移植成瘤；
4)抑制子宫内膜癌细胞宫腔移植瘤的进展；
5)增强孕激素对于子宫内膜癌的抑制作用；
6)抑制子宫内膜癌类器官的肿瘤干性相关基因的表达。
在某些实施方式中，所述肿瘤干性相关基因包括C-MYC、BMI-1、CXCR4、Sox9。
在某些实施方式中，所述间充质干细胞或其培养物为所述药物的唯一有效成分或有效成分之一。
在某些实施方式中，所述间充质干细胞或其培养物为所述药物的有效成分之一，所述有效成分还包括孕激素。
在某些实施方式中，所述孕激素包括醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮或、左炔诺孕酮、安宫黄体酮。
在某些实施方式中，所述间充质干细胞与所述孕激素被配置为同时向受试者施用。
在某些实施方式中，所述间充质干细胞与所述孕激素被配置为分别向受试者施用。
另一方面，本申请还提供了用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病的药物，所述药物包括治疗/预防有效量的间充质干细胞。
在某些实施方式中，所述间充质干细胞或其培养物为所述药物的唯一有效成分。
在某些实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载体。
在某些实施方式中，所述子宫内膜恶性增生病变包括子宫内膜癌及癌前病变。
在某些实施方式中，所述间充质干细胞包括子宫内膜间充质干细胞。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞包括分选自子宫内膜组织的SUSD2+CD45-细胞群。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞包括分选自子宫内膜组织的CD45-CD73+CD90+CD105+细胞群。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞不包括来源于子宫内膜恶性增生疾病患者的子宫内膜间充质干细胞。
另一方面，本申请还提供了药物组合，所述药物组合包括a)治疗/预防有效量的间充质干细胞；b)治疗/预防有效量的孕激素。
在某些实施方式中，所述间充质干细胞与所述孕激素各自分别存在于不同的容器中。
在某些实施方式中，所述药物组合包含第一制剂和第二制剂，所述第一制剂包含所述间充质干细胞和药学上可接受的第一载体，且所述第二制剂包含所述孕激素和药学上可接受的第二载体。
在某些实施方式中，所述药物组合包含药物组合物，且所述药物组合物包含所述间充质干细胞和所述孕激素。
在某些实施方式中，所述子宫内膜恶性增生病变包括子宫内膜癌及癌前病变。
在某些实施方式中，所述间充质干细胞包括子宫内膜间充质干细胞。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞包括分选自子宫内膜组织的SUSD2+CD45-细胞群。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞包括分选自子宫内膜组织的CD45-CD73+CD90+CD105+细胞群。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞不包括来源于子宫内膜恶性增生疾病患者的子宫内膜间充质干细胞。
在某些实施方式中，孕激素包括醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮或、左炔诺孕酮、安宫黄体酮。
另一方面，本申请还提供了试剂盒，其包括本申请中所述的药物组合。
另一方面，本申请还提供了预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗/预防有效量的间充质干细胞。
在某些实施方式中，所述有需要的受试者曾经或正在患有子宫内膜恶性增生疾病。
在某些实施方式中，所述受试者未接受或者接受了孕激素疗法。
在某些实施方式中，所述孕激素对所述受试者治疗无效。
在某些实施方式中，所述方法还包括向所述有需要的受试者施用治疗/预防有效量的孕激素。
在某些实施方式中，同时向所述受试者施用所述间充质干细胞和所述孕激素。
在某些实施方式中，顺次向所述受试者施用所述间充质干细胞和所述孕激素。
在某些实施方式中，所述子宫内膜恶性增生病变包括子宫内膜癌及癌前病变。
在某些实施方式中，其中，所述间充质干细胞包括子宫内膜间充质干细胞。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞包括分选自子宫内膜组织的SUSD2+CD45-细胞群。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞包括分选自子宫内膜组织的CD45-CD73+CD90+CD105+细胞群。
在某些实施方式中，所述子宫内膜间充质干细胞不包括来源于子宫内膜恶性增生疾病患者的子宫内膜间充质干细胞。
在某些实施方式中，孕激素包括醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮或、左炔诺孕酮、安宫黄体酮。
本申请通过对间充质干细胞与子宫内膜癌细胞肿瘤生物学行为的影响进行评估，表明正常子宫内膜间充质干细胞可抑制增殖、促进凋亡，以及抑制皮下及宫腔原位移植瘤形成；同时，本申请通过构建子宫内膜癌类器官生物库，在高度模拟肿瘤异质性情况下，证明了正常子宫内膜间充质干细胞可抑制肿瘤干性相关基因C-MYC、BMI-1、CXCR4、Sox9的表达，抑制子宫内膜癌肿瘤干性特性的维持，表明正常子宫内膜间充质干细胞治疗子宫内膜癌的有效性和安全性。因此，本申请的正常子宫内膜间充质干细胞治疗可作为子宫内膜癌保留生育功能治疗的新方案。
另一方面，由于在子宫内膜癌保育治疗中定期的宫腔镜检查及病灶去处术导致子宫内膜机械损伤，造成人工授精时受精卵不能顺利着床，从而导致生育率低；而利用N-eMSC则避免了该问题，因此N-eMSC疗法不仅可有效治疗内膜癌，同时可起到有效修复损伤内膜的作用，提升内膜癌保育疗效。
另一方面，由于间充质干细胞通常为静脉注射方式给予，其低植入率是治疗有效性的主要障碍；而由于宫腔可通过阴道与外界相通，子宫内膜癌的N-eMSC细胞疗法不局限于静脉注射从而避免了其低植入率的问题。因此，可以利用N-eMSC细胞疗法或者利用N-eMSC搭载抑瘤药物(例如孕激素)或生物制剂来高效治疗子宫内膜癌及癌前病变，从而提高患者的生育率及治愈率。
附图说明
图1A显示的是本申请中光镜下脂肪、脐带及正常子宫内膜间充质干细胞形态。
图1B显示的是本申请中流式分选原代正常子宫内膜单细胞中SUSD2+CD45-细胞群的比例为3.42％。
图1C显示的是本申请中流式细胞学分析体外培养第五代N-eMSC细胞中双阳标记物CD140b+CD146+细胞群及单阳标记物SUSD2+细胞群比例。
图1D显示的是本申请中流式细胞学分析体外培养AD-MSC、UC-MSC、N-eMSC细胞中CD45、CD73、CD90、CD105阳性细胞群比例。
图2A显示的是本申请中CCK8实验显示的不同组织来源间充质干细胞的条件培养基对Hec-1a细胞增殖的作用不同。
图2B显示的是本申请中CCK8实验显示的不同组织来源间充质干细胞的条件培养基对RL952细胞增殖的作用不同。
图3A显示的是本申请中Western blot检测显示不同组织来源MSC对Hec-1A细胞的凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达量影响不同。
图3B显示的是本申请中Western blot检测显示不同组织来源MSC对RL952细胞的凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达量影响不同。
图3C显示的是本申请中Image J灰度值计算Hec-1A细胞的Bax/Bcl-2蛋白表达比例。
图3D显示的是本申请中Image J灰度值计算RL952细胞的Bax/Bcl-2蛋白表达比例。
图4A显示的是本申请中不同组织来源的间充质干细胞对皮下移植瘤的成瘤影响比较结果。
图4B显示的是本申请中不同组织来源的间充质干细胞对皮下移植瘤的瘤体质量影响的统计分析图。
图4C显示的是本申请中N-eMSC对宫腔移植瘤的成瘤影响比较结果。
图4D显示的是本申请中N-eMSC对宫腔移植瘤的瘤体质量影响的统计分析图。
图5显示的是本申请中CCK8实验表明N-eMSC条件培养基显著增强了MPA对RL952细胞或Hec-1A细胞的增殖的抑制作用。
图6A显示的是本申请中人子宫内膜癌类器官在第1天-第6天的4倍光学显微镜下形态。
图6B显示的是本申请中子宫内膜癌类器官在第1代、第5代及第10代的4倍光学学显微镜下形态。
图6C显示的是本申请中子宫内膜癌类器官免疫荧光染色结果。
图6D显示的是本申请中子宫内膜癌组织和对应子宫内膜癌类器官免疫组织化学染色结果。
图7A显示的是本申请中子宫内膜间充质干细胞对子宫内膜癌类器官肿瘤相关干性基因c-Myc表达的影响。
图7B显示的是本申请中子宫内膜间充质干细胞对子宫内膜癌类器官肿瘤相关干性基因BMI-1表达的影响。
图7C显示的是本申请中子宫内膜间充质干细胞对子宫内膜癌类器官肿瘤相关干性基因CXCR4表达的影响。
图7D显示的是本申请中子宫内膜间充质干细胞对子宫内膜癌类器官肿瘤相关干性基因Sox9表达的影响。
图8显示的是本申请中N-eMSC对子宫内膜癌类器官细胞活性的抑制作用。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请中，术语“间充质干细胞(MSC)”通常是指一类具有分化潜能的多能干细胞。其符合国际细胞治疗学会(ISCT)的如下定义：1)MSC可呈集落粘附生长；2)MSC细胞表面表达标记物CD105，CD73和CD90，且不表达内皮、造血或免疫细胞标记，例如CD45，CD34，CD14，CD11b，CD79α，CD19和HLA-DR。MSC细胞可在不同组织中获得，例如，骨髓组织来源BM-MSC、脂肪组织来源的AD-MSC以及脐带组织来源的UC-MSC，例如，本申请的正常子宫内膜间充质干细胞N-eMSC。
在本申请中，术语“正常子宫内膜间充质干细胞(N-eMSC)”通常是指一类符合上述国际细胞治疗学会(ISCT)对MSC的定义，并参照Gargett团队的报道(Masuda H,Anwar S S,Buhring H J,et al.A Novel Marker of Human Endometrial Mesenchymal Stem-LikeCells[J].Cell Transplant.2012,21(10):2201-2214，及Gargett C E,Schwab K E,Zillwood R M,et al.Isolation and Culture of Epithelial Progenitors andMesenchymal Stem Cells from Human Endometrium[J].Biol Reprod.2009,80(6):1136-1145.)，由单个标记物SUSD2+，或由双阳标记物CD140b+CD146+标记筛选分离，利用流式分选技术分选自正常子宫内膜的细胞。
在本申请中，术语“恶行增生疾病”通常是指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。例如可以包括各种实体瘤或非实体瘤。
在本申请中，术语“正常子宫内膜”通常是指获取自非子宫(包括子宫内膜)恶行增生疾病患者的子宫内膜组织。所述子宫恶行增生疾病可以包括发生在子宫阴道部、宫颈管及宫体的恶性肿瘤，例如，宫颈癌、子宫内膜癌。
在本申请中，术语“子宫内膜恶性增生疾病”通常指子宫内膜组织中由异常细胞生长形成赘生物或实体病变。例如，子宫内膜癌或癌前病变(也称作子宫内膜不典型增生)。子宫内膜不典型增生为子宫内膜增生的一种类型，其腺上皮有异型性，属于子宫内膜的上皮内肿瘤。具有癌变倾向。
在本申请中，术语“间充质干细胞培养物”通常是指所示间充质干细胞(例如本申请的子宫内膜间充质干细胞)经一段时间(例如4小时，8小时，12小时，16小时，20小时，24小时，36小时，48小时或更长时间)的培养后，除去所述间充质干细胞所得的培养液。
在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常是指药学上可接受的涉及携带、储存、转运或施用细胞制剂的物质、组合物或媒介物。例如液体、半固体或固体填充剂，稀释剂，等渗剂，溶剂或包囊材料。
在本申请中，术语“药物组合”通常是指包含至少两种活性成分/治疗剂的组合。在一些实施方式中，各个活性成分/治疗剂可以各自制备成独立的制剂(固体、液体、凝胶体等)，在一些实施方式中，各个活性成分/治疗剂可以存在于不同的容器中，还可以在需要的时候同时或分别与合适的载体配制成期望的制剂；在一些实施方式中，各个活性成分/治疗剂可以是不同来源的(例如不同的商家制备生产或销售的)；在一些实施方式中，各个活性成分/治疗剂可以以混合在一起的形式形成药物组合物。
在本申请中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”通常是指当单独或与另一种治疗剂组合给有疾病发展或疾病复发的风险的受试者施用时抑制疾病的发展或复发的药物量。可以使用本领域技术人员已知的多种方法对治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力进行评估，比如在处于临床试验期间的人类受试者中、在动物模型系统中预测对人类的功效、或者通过在体外测定中测定药剂的活性。
在本申请中，术语“施用”通常是指通过任意引入或递送途径将所述药物或药物组合引入受试者的身体中。可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与所述药物组合接触的任何方法。例如，皮下注射、静脉注射或经阴道递送。
在本申请中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴等。
细胞株
本申请实施例中的RL952细胞和Hec-1A细胞均为人子宫内膜癌细胞株，均购于美国典藏细胞库(ATCC)。上述两个内膜癌细胞株为ER(雌激素受体)(+)PR(孕激素受体)(+)，分化良好的子宫内膜样癌细胞株。可用于早期分化良好的内膜癌体外模型。
标本收集
本申请实施例中的组织标本均来自于2018年6月至2019年6月来复旦大学附属妇产科医院接受治疗的患者。共收集了人正常子宫内膜组织10例、人子宫内膜癌组织10例、人脐带组织10例、人皮下脂肪组织10例。所有标本均在患者签署知情同意书的前提下进行收集。其中正常子宫内膜及子宫内膜癌病理诊断由两位及以上病理医生确认。
实验动物
本申请实施例中的实验动物购买于上海斯莱克实验动物有限公司，为雌性BALB/C裸鼠，3-4周，动物房观察1周后使用。
统计学方法
本申请实施例中所有实验至少重复3次，使用SPSS 22.0进行数据统计分析。如果为两组独立样本，行t检验和双边检验。如果为多组独立样本，行ANOVA检验。差异性检验以P值(双尾)<0.05为标准。图示中，*:P<0.05，**:P<0.01,***:P<0.001,n.s.无统计学意义。
本申请实施例中数据分析软件有GraphPad Prism 7.0，SPSS 22.0，MicrosoftExcel。
本申请实施例中所用图像分析软件为Adobe Photoshop CS，Image J 3.0，OmniGraffle。
本申请实施例中，双抗是指青链霉素混合液，大皿是指10cm培养皿。
实施例1间充质干细胞的制备
采用常规贴壁筛选法提取脐带及脂肪组织间充质干细胞，即通过胶原酶消化组织为单细胞后，其中贴壁的成纤维细胞样细胞为间充质干细胞(参见[J].Soleimani M,NadriS,et al.A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells frommouse bone marrow.[J].Nature Protocol.2009,41(1):102-132)；参照Gargett团队的报道，子宫内膜间充质干细胞可由单个标记物SUSD2+筛选出，也可以由双阳标记物CD140b+CD146+标记分离(Masuda H,Anwar S S,Buhring H J,et al.A Novel Marker of HumanEndometrial Mesenchymal Stem-Like Cells[J].Cell Transplant.2012,21(10):2201-2214，及Gargett C E,Schwab K E,Zillwood R M,et al.Isolation and Culture ofEpithelial Progenitors and Mesenchymal Stem Cells from Human Endometrium[J].Biol Reprod.2009,80(6):1136-1145.)，利用流式分选技术分选子宫内膜间充质干细胞。具体步骤如下：
1.组织消化：
1)将收集的50-100m g新鲜正常子宫内膜组织、脂肪组织以及华通氏胶(由脐带剥离出)分别放入6cm皿；
2)用眼科剪剪碎组织至1ml枪头可吸取为止；
3)将细胞碎片加入15ml离心管，加入5ml配制好的消化液(100mg DispaseII+100mg collagen XI+100μl双抗+100μlFBS+9.8ml DMEM)；
4)37℃摇床消化50min；
5)反复吹打离心管中的悬液，离心1000rmp，3min；
6)去上清，用无菌PBS重悬细胞，将细胞悬液从40um孔径的滤网滤过，得到过滤液；
7)收集过滤液至15ml离心管，离心1000rmp，3min；
8)去上清液，用完全培养基2(DMEM/F12(glutamax supplement)+FGF2(终浓度5nm/ml)+10％FBS+1％双抗)重悬细胞，在大皿中铺板；
9)第二天吸取培养液，用无菌PBS清洗两次后，再加入新鲜完全培养基2。
2.流式细胞分选：
子宫内膜间充质干细胞需要通过原代消化子宫内膜组织后经过细胞流式分选，分选出SUSD2+阳性的细胞群。
1)将消化后的子宫内膜组织从40um孔径的滤网滤过，得到过滤液；
2)滤液收集至离心管，离心1000rmp，3min；
3)去上清液，用1ml的PBS重悬细胞；
4)加入5μl的PE-SUSD2流式抗体(Biolegend，USA)，避光孵育30min；
5)用PBS洗涤染色的细胞悬液2次；
6)调整细胞密度为1x107个/ml，通过流式细胞仪分选阳性细胞群；
7)分选后得到SUSD2+细胞群，将其铺板于12孔板中，第二天换间充质干细胞的完全培养基2。
3.消化传代：
1)在光学显微镜下观察到细胞的汇合度，汇合度达80％-90％时，可进行传代；
2)将培养基吸去，并用无菌PBS清洗两次；
3)加入1ml胰蛋白酶/大皿，37度培养箱中消化3min；
4)加入3ml完全培养基2中和胰蛋白酶使其停止消化；
5)轻轻吹打细胞，这时候细胞不贴壁漂浮在培养液中，用吸管收集至15ml离心管中；
6)装有细胞悬液的离心管离心1000rmp，3min；
7)用枪头吸去上清液，加入完全培养基2重悬细胞；
8)取新的10cm大皿铺板，以1:3倍数铺板传代，需传代至第三代后使用。
4.细胞冻存：
1)消化后细胞沉淀用10％DMSO+90％FBS冻存液重悬，加入冻存管中；
2)将标记好的冻存管置于冻存盒，-80℃低温冰箱过夜，将冻存管移入液氮罐中。
结果如图1A-D所示，图1A为人脂肪、脐带以及子宫内膜间充质干细胞(AD-MSC、UC-MSC、N-eMSC)4倍光镜下图片，间充质干细胞呈长梭性和多边形，即成纤维细胞样。图1B为消化正常子宫内膜组织成单细胞后，利用流式分选技术分选CD45-SUSD2+细胞群，其中标记物CD45是为了去除造血干细胞群，筛选出的间充质干细胞比例为3.42％，与Gargett等人报道的比例相当。图1C为在体外培养子宫内膜间充质干细胞至第五代后，利用流式分析技术分析N-eMSC细胞比例，显示CD140b+CD146+细胞群占61.3％，SUSD2+细胞群占63.1％。同时根据ISCT的间充质干细胞检验标准去评估AD-MSC、UC-MSC以及N-eMSC细胞的标记物比例符合预期(见图1D)。
实施例2不同组织来源间充质干细胞对内膜癌细胞系增殖的影响
首先收集人脂肪、脐带及正常子宫内膜来源的间充质干细胞培养24小时后的上清液(条件培养基，conditional medium,CM)，不同组织来源间充质干细胞的CM处理内膜癌细胞株48小时后，利用CCK8细胞增殖检测技术进行检测。具体步骤如下：
1.细胞复苏：
1)分别将装有Hec-1A细胞、RL952细胞悬液的冻存管从液氮罐中拿出，迅速放入37度温水浴快速融化；
2)将冻存管离心1000rmp，3min；
3)枪头吸去上清液，用1ml完全培养基1(DMEM/F12+10％FBS+1％双抗)重悬细胞沉淀；
4)将细胞悬液在10cm大皿中铺板，加入10ml完全培养基2大皿；
5)“之”字型晃动培养皿10-20次后，将其放入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
6)第二天吸去原有培养液，并用无菌PBS洗涤两次后，再加入完全培养基1基；
7)复苏细胞传代2次后，再用于后续功能实验。
2.细胞消化传代：
1)在光学显微镜下观察到细胞的汇合度，汇合度达80％-90％时，可进行传代；
2)将培养基吸去，并用无菌PBS清洗两次，
3)加入1ml胰蛋白酶/大皿，37度培养箱中消化3min；
4)加入3ml完全培养基1中和胰蛋白酶使其停止消化；
5)轻轻吹打细胞，这时候细胞不贴壁漂浮在培养液中，用吸管收集至15ml离心管中；
6)装有细胞悬液的离心管离心1000rmp，3min；
7)用枪头吸去上清液，加入完全培养基1重悬细胞；
8)取新的10cm大皿铺板，以1:3倍数铺板传代。
3.MSC细胞条件培养基收集
1)不同组织来源的MSC细胞密度在80％-90％时消化传代；
2)6孔板铺板，每孔细胞量为1x105个；
3)24h后细胞贴壁，用PBS洗涤2次，换完全培养基2；
4)待显微镜下细胞密度为70％-80％左右，吸去培养液，用PBS洗涤2次；
5)每孔换成含有2％FBS的DMEM/F12(购自GIBCO，USA)，每孔2ml；
6)24小时后收集MSC细胞条件培养液Conditional Medium(CM)；
7)将收集的条件培养液离心1000rpm，15min；
8)取上清液，于-80℃保存，用于后续实验。
4.间充质干细胞的CM处理Hec-1A细胞和RL952细胞
1)将-80℃保存的条件培养基取出解冻融化；
2)Hec-1A和RL952铺板于96孔板中，每孔1000个细胞，放置于培养箱培养24小时；
3)吸除细胞培养液，PBS洗涤2次，每孔加入100μl条件培养基，设5个重复孔；
4)培养48h后，吸除条件培养基，PBS洗涤2次，每孔加入预先配制的10％的CCK8溶液100μl；
5)注意避光，放置于培养箱中孵育60min；
6)用酶标仪测定每孔在450nm处的吸收光，测定OD值，进行统计分析。
结果如图2A-B所示，对于Hec-1A细胞，N-eMSC有效抑制Hec-1A增殖(抑制率28％)，AD-MSC则促进Hec-1A增殖(促进率15％)，UC-MSC组对Hec-1A增殖无影响；对于RL952细胞，N-eMSC有效抑制RL952增殖(抑制率15％)，AD-MSC及UC-MSC对RL952增殖无影响。
实施例3不同组织来源间充质干细胞对内膜癌细胞凋亡的影响
利用双室模型评估不同来源间充质干细胞对内膜癌细胞凋亡的影响。按照实施例2中的方法准备Hec-1A细胞和RL952细胞，利用双室模型将不同组织来源间充质干细胞与子宫内膜癌细胞间接共培养，培养48小时后，按照常规Western Blot检测内膜癌细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达量并通过Image J灰度值计算Bax/Bcl-2比例。其中，Western Blot检测所用抗体为GAPDH一抗(购自Cell Signaling Technology，USA)，Bcl-2一抗(购自Proteintech，USA)，Bax一抗(购自Proteintech，USA)抗鼠二抗(购自Proteintech，USA)，抗兔二抗(购自Proteintech，USA)，一抗及二抗稀释液均购自上海碧云天生物科技有限公司；双室模型间接共培养步骤如下：
1)取对数生长期Hec-1A、RL952、MSC细胞消化；
2)调整细胞浓度为Hec-1A(1x105个/ml)、RL952(1x105个/ml)、MSC(5x104个/ml)；
3)将Hec-1A和RL952铺板于6孔板中，每孔1ml；
4)将MSC铺板于Transwell小室(购自于Corning的0.4um孔径Transwell 6孔板小室)中，每孔1ml；
5)第二天，上下室细胞用PBS洗涤2次后，将Transwell小室放置于铺板细胞的6孔板中，共培养模型建立；
6)上下室细胞共培养48h后予以处理，进行Western Blot检测。
结果如图3A-D所示，在Hec-1A细胞中，AD-MSC、UC-MSC和N-eMSC促进凋亡，促进率分别为40％、146％、590％(图3C)。在RL952细胞中，UC-MSC、N-eMSC促进凋亡，促进率分别为110％、171％，AD-MSC抑制RL952细胞凋亡，抑制率23％(图3D)。
实施例4不同组织来源间充质干细胞对内膜癌细胞系异种移植瘤成瘤效率的影响
1.利用人子宫内膜癌细胞系RL952建立Balb/C裸小鼠人子宫内膜癌的异种皮下移植瘤模型，评估不同组织来源间充质干细胞对子宫内膜癌异种皮下移植瘤成瘤的影响。Balb/C裸小鼠皮下种植RL952细胞(+/-MSC)，共分成4组，包括对照组、AD-MSC组、UC-MSC组及N-eMSC组。具体如下：
1)使用4-5周龄雌性BALB/C裸鼠，观察1周后使用；
2)固定小鼠，消毒右侧颈部皮肤；
3)用胰岛素注射针在小鼠右侧颈部皮下注射FBS重悬的细胞悬液，每只小鼠注射细胞悬液为1x106个RL952单独或混有2x105个不同组织来源的间充质干细胞。
注入小鼠皮下4周后皮下移植瘤的成瘤效果如图4A-B所示，N-eMSC明显抑制子宫内膜癌细胞成瘤(成瘤率0％)，AD-MSC组成瘤平均质量增加，但无统计学差异，UC-MSC对子宫内膜癌皮下异种移植瘤无明显影响。
2.进一步确认N-eMSC对子宫内膜癌异种移植瘤影响。通过子宫内膜癌原位宫腔异种移植瘤模型，评估N-eMSC对子宫内膜癌成瘤效率的影响。具体如下：
1)使用4-5周龄雌性BALB/C裸鼠，观察1周后使用；
2)腹腔麻醉：使用2％戊巴比妥钠麻醉，50mg/kg；
3)固定小鼠，消毒背部皮肤；
4)于小鼠背部中线偏右下行1-1.5cm开口，依次剪开皮肤、腹膜后，暴露左侧卵巢，寻迹找到左侧子宫角；
5)将准备好的细胞悬液用1ml的胰岛素针管注射至子宫角中，每只小鼠注射细胞悬液为1x106个RL952单独或混有2x105个正常子宫内膜来源间充质干细胞；
6)用缝线依次关闭腹膜和皮肤，酒精擦拭切口，将小鼠放置鼠笼中等待复苏；
7)待小鼠苏醒后，观察30min，确认小鼠活动正常。
注入小鼠宫腔內4周后宫腔移植瘤的成瘤效果如图4C-D显示，N-eMSC组成瘤平均质量小于对照组(P＝0.0569)，即N-eMSC可抑制RL952细胞宫腔移植瘤成瘤效果。
实施例5N-eMSC对孕激素治疗子宫内膜癌的疗效的影响
目前子宫内膜癌保育治疗使用大剂量孕激素，本实施例评估N-eMSC与孕激素对子宫内膜癌细胞增殖协同抑制效果。按照实施例2的方法用N-eMSC的CM叠加MPA(安宫黄体酮，终浓度10μM)处理子宫内膜癌细胞株RL952和Hec-1A，48小时后CCK8细胞增殖结果显示N-eMSC叠加MPA组对RL952和Hec-1A细胞的增殖抑制效果最强(见图5)，并与MPA单药组具有显著性差异，极大增强了孕激素治疗子宫内膜癌的效果，表明其能够降低孕激素施用剂量，提高治疗安全性。
实施例6子宫内膜癌类器官的构建
构建高度模拟人体内子宫内膜肿瘤特征的子宫内膜癌类器官。首先采集了因子宫内膜癌在复旦大学附属妇产科医院接受全子宫切除的子宫内膜癌患者病灶，获得5例成人I型子宫内膜癌组织标本。5位捐献者术前均通过诊断性刮宫病理诊断为子宫内膜样癌，并且术后病理确认为子宫内膜样癌I级。标本采集已通过复旦大学附属妇产科伦理委员会审批，审批号为kyy2019-104。子宫内膜癌类器官的构建步骤如下：
1.组织消化：
1)-80℃冰箱取出matrigel(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，使其在0℃冰中融化；
2)将收集的50-100mg新鲜内膜癌组织用眼科剪剪碎组织至1ml枪头可吸取为止；
3)加入5ml消化液(同实施例1中消化液)重悬，放置37℃摇床消化50min；
4)静置5min，可见未消化组织和消化组织分层，取上层液体至离心管中；
5)离心1000rmp，1min；
6)用枪头吸去上清液(注意吸干)，得上皮团块沉淀；
7)用PBS重悬沉淀后，再次离心1000rmp，1min；
8)在冰上，用融化好的matrigel重悬沉淀；
9)快速将上述悬液铺入24孔板中，40μl/孔；
10)用200μl枪头在细胞板孔底涂开matrigel胶，注意不要让胶体碰到孔壁；
11)将细胞板放入37度培养箱10min至matrigel胶凝固；
12)每孔加入500μl的子宫内膜癌类器官培养基(Advanced DMEM/F12+1xB27+1xGlutamax+5mM N-Acetylcysteine+500nM SB202190+5mM Y-27632+500nM A83-01+100ng·ml-1 Noggin+5ng·ml-1 EGF+250ng·ml-1 R-Spondin1)覆盖胶体；
13)每日在倒置显微镜下观察类器官生长情况并拍照；
14)每3-4天换一次培养液；
2.类器官传代(子宫内膜癌类器官传代比例为1:3)：
1)类器官每7-8天传代一次；
2)将24孔板中的培养液吸走，加入1ml的PBS，用200μl枪头刮离matrigel胶，并用PBS重悬，加入1ml的EP管中；
3)离心1000rmp，1min；
4)去上清(注意不要吸走沉淀)，再次用PBS重悬，用1ml枪头反复机械吹打80-100下；
5)离心1000rmp，1min，用枪头吸去上清液(注意吸干)；
6)matrigel重悬沉淀，快速铺板；
7)将细胞培养板放入37度培养箱10min至matrigel胶凝固；
8)加入子宫内膜癌类器官培养基,原代子宫内膜癌类器官随着培养时间增加体积变大，同时可持续增殖传代至第10代以后。
9)按照常规免疫荧光及免疫组化方法染色观察，其中所用抗体为Ki-67一抗(购自Proteintech，USA)CK7一抗(购自Proteintech，USA)ER一抗(购自Abcam，USA)PR一抗(购自Abcam，USA)荧光抗兔二抗Alexa
Figure BDA0002678207620000141
488(购自Cell Signaling Technology，USA)。
结果如图6A-D所示，图6A为人子宫内膜癌类器官在第1天-第6天的4倍光学显微镜下图片，1-6天的子宫内膜癌类器官形态多呈不规则球体结构，每个培养孔中子宫内膜癌类器官单位的总数量相对不变，但随着细胞分裂增殖及分化，每个子宫内膜癌类器官单位的体积逐渐增大；图6B为子宫内膜癌类器官在第1代、第5代及第10代的4倍光学显微镜下形态；图6C为子宫内膜癌类器官免疫荧光染色；图6D为子宫内膜癌组织和对应子宫内膜癌类器官免疫组织化学染色结果。
实施例7N-eMSC对子宫内膜癌类器官肿瘤干性特性维持的影响
利用实施例6建立的宫内膜癌类器官生物库，进一步验证N-eMSC治疗内膜癌的安全性。
为验证N-eMSC对内膜癌类器官干性特性维持的影响，按照实施例3双室模型间接共培养的方法将N-eMSC与子宫内膜癌类器官共培养，培养96小时后检测子宫内膜癌类器官干性基因表达。按照说明书利用用天根mRNA提取试剂盒提取细胞RNA，使用GoScriptTM逆转录试剂盒(Promega)按照如下步骤进行逆转录反应：
1)配置体系1：digoT(1μl)，random primer(1μl)，RNA(1000mg)，RNase-FreeddH2O(补齐10μl)；
2)将体系1中配制好的溶液放置于PCR仪器中，启动程序：70℃ 5min；
3)配置体系2:5x buffer(4μl)，MgCl2(2μl)，PCR nuclear mix(1μl)，RI(1μl)，RT(1μl)，体系1(10μl)；
4)将体系2配制好的溶液放置于PCR仪器反应，PCR仪器程序为25℃(5min)-4℃(60min)-72℃(15min)-4℃(forever)；
8)反应后得到逆转录产物cDNA用RNase-Free ddH2O稀释至200μl，将cDNA保存在-20℃冰箱。
使用2x SYBR Green qPCR Master Mix(Bimake)进行RT-PCR反应：
1)配制RT-PCR反应体系配置(10μl)：正向引物(0.1μl)，反向引物(0.1μl)，2xSYBR Green qPCR Master Mix(5μl)，cDNA(1μl)，ddH2O(3.9μl)
2)将上述反应体系于Biorad PCR仪器中进行反应，RT-PCR程序为：95℃(30s)-95℃(5s)-60℃(34s(40个循环))-72℃(30s)；
3)统计分析：得到CT值之后，利用Graph Primer软件计算mRNA相对量，分析统计学差异。
C-MYC的正向引物如SEQ ID NO.1所示(CGACGAGACCTTCATCAAAAAC)，C-MYC的反向引物如SEQ ID NO.2所示(CTTCTCTGAGACGAGCTTGG)，BMI-1的正向引物如SEQ ID NO.3所示(CAAGACCAGACCACTACTGAAT)，BMI-1的反向引物如SEQ ID NO.4所示(TATCTTCATCTGCAACCTCTCC)，CXCR4的正向引物如SEQ ID NO.5所示(TGTCATCTACACAGTCAACCTC)，CXCR4的反向引物如SEQ ID NO.6所示(CAACATAGACCACCTTTTCAGC)，Sox9的正向引物如SEQ ID NO.7所示(ACATGAACGGCTGGAGCAACG)，Sox9的反向引物如SEQ ID NO.8所示(CTGCGAGCTGGTCATGGAGTTG)，GAPDH的正向引物如SEQ ID NO.9所示(GGAAGATGGTGATGGGATT)，GAPDH的反向引物如SEQ ID NO.10所示(AACGGATTTGGTCGTATTG)。
结果如图7A-D所示，N-eMSC可明显抑制子宫内膜癌类器官的肿瘤干性相关基因(c-Myc、BMI-1、CXCR4、Sox9)的转录。该结果表明，N-eMSC对于子宫内膜癌类器官没有促瘤作用，具有良好的治疗安全性。
实施例8N-eMSC对人子宫内膜癌类器官细胞活性的影响
按照实施例7的方法将N-eMSC与子宫内膜癌类器官共培养，培养96小时后按照实施例中CCK8检测法检测人子宫内膜癌类器官细胞活性，结果如图8所示，宫内膜间充质干细胞显著抑制了子宫内膜癌类器官细胞活性。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 复旦大学附属妇产科医院
<120> 间充质干细胞的制药用途
<130> YT201398-03
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-MYC的正向引物
<400> 1
cgacgagacc ttcatcaaaa ac 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-MYC的反向引物
<400> 2
cttctctgag acgagcttgg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BMI-1的正向引物
<400> 3
caagaccaga ccactactga at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BMI-1的反向引物
<400> 4
tatcttcatc tgcaacctct cc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CXCR4的正向引物
<400> 5
tgtcatctac acagtcaacc tc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CXCR4的反向引物
<400> 6
caacatagac caccttttca gc 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Sox9的正向引物
<400> 7
acatgaacgg ctggagcaac g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Sox9的反向引物
<400> 8
ctgcgagctg gtcatggagt tg 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GAPDH的正向引物
<400> 9
ggaagatggt gatgggatt 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GAPDH的反向引物
<400> 10
aacggatttg gtcgtattg 19

Claims (18)

1.间充质干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述子宫内膜恶性增生病变包括子宫内膜癌或癌前病变。
3.如权利要求1所述的用途，其中，所述间充质干细胞包括子宫内膜间充质干细胞。
4.如权利要求3所述的用途，其中，所述子宫内膜间充质干细胞包括分选自子宫内膜组织的SUSD2+CD45-细胞群。
5.如权利要求3所述的用途，其中，所述子宫内膜间充质干细胞包括分选自子宫内膜组织的CD45-CD73+CD90+CD105+细胞群。
6.如权利要求3所述的用途，其中，所述子宫内膜间充质干细胞不包括来源自子宫恶性增生疾病患者的子宫内膜间充质干细胞。
7.如权利要求1所述的用途，其中，所述间充质干细胞具有如下功能的至少一种：
1)抑制子宫内膜癌细胞的增殖；
2)促进子宫内膜癌细胞的凋亡；
3)抑制子宫内膜癌细胞皮下移植成瘤；
4)抑制子宫内膜癌细胞宫腔移植瘤的进展；
5)增强孕激素对于子宫内膜癌的抑制作用；
6)抑制子宫内膜癌类器官的肿瘤干性相关基因的表达。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述肿瘤干性相关基因包括C-MYC、BMI-1、CXCR4、Sox9。
9.如权利要求1所述的用途，其中，所述间充质干细胞或其培养物为所述药物的唯一有效成分或有效成分之一。
10.如权利要求9所述的用途，其中，所述间充质干细胞或其培养物为所述药物的有效成分之一，所述有效成分还包括孕激素。
11.如权利要求10所述的用途，其中，所述孕激素包括醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮或、左炔诺孕酮、安宫黄体酮。
12.如权利要求10所述的用途，其中，所述间充质干细胞与所述孕激素被配置为同时向受试者施用。
13.如权利要求10所述的用途，其中，所述间充质干细胞与所述孕激素被配置为分别向受试者施用。
14.用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病的药物，所述药物包括治疗/预防有效量的间充质干细胞。
15.药物组合，其中，所述药物组合包括a)治疗/预防有效量的间充质干细胞；b)治疗/预防有效量的孕激素。
16.如权利要求15所述的药物组合，所述药物组合包含第一制剂和第二制剂，所述第一制剂包含所述间充质干细胞和药学上可接受的第一载体，且所述第二制剂包含所述孕激素和药学上可接受的第二载体。
17.如权利要求15所述的药物组合，其中，所述药物组合包含药物组合物，且所述药物组合物包含所述间充质干细胞和所述孕激素。
18.预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗/预防有效量的间充质干细胞。
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SHAQIU ZHANG, NI ZENG, NOUR ALOWAYED, YOGESH SINGH, ANCHUN CHENG, FLORIAN LANG, MADHURI S SALKER: "Downregulation of endometrial mesenchymal marker SUSD2 causes cell senescence and cell death in endometrial carcinoma cells", PLOS ONE, vol. 12, no. 8, pages 0183681 *
XIN LI, LI LI LIU, JU LEI YAO, KAI WANG, HAO AI: "Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles Inhibit Endometrial Cancer Cell Proliferation and Migration through Delivery of Exogenous miR-302a", STEM CELLS INTERNATIONAL, vol. 2019 *
YUHUI XU, JIALI HU, QIAOYING LV, CHENYI SHI, MENGDI QIU, LIYING XIE, WEI LIU, BINGYI YANG, WEIWEI SHAN, YALI CHENG, BING ZHAO, XIA: "Endometrium-derived mesenchymal stem cells suppress progression of endometrial cancer via the DKK1-Wnt/β-catenin signaling pathway", STEM CELL RESEARCH & THERAPY, vol. 14, no. 1, pages 159 *
郑丽红;胡晓丽;朱雪琼;: "子宫来源间充质干细胞对妇科恶性肿瘤生物学行为的影响", 医学研究杂志, no. 03, pages 12 - 15 *
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