CN112057464A - 人参皂苷Rg3联合GP的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人参皂苷Rg3联合GP在作为抗肿瘤药物中的应用。本发明选用小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC)接种于C57BL/6N小鼠右腋下，观察人参皂苷Rg3和Rg3联合GP对Lewis肺癌的影响；取肝、肾、脾和肿瘤进行苏木精‑伊红染色，检测人参皂苷Rg3联合GP对Lewis肺癌小鼠肝、肾、脾和肿瘤病理变化；对肿瘤组织进行免疫组化染色，检测肿瘤内血管密度与瘤体血小板表面活化标志物的表达；结论是人参皂苷Rg3联合GP可增强其抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长与抑制肿瘤新生血管生成的作用，其抑瘤作用可能与降低CD62P表达密切相关；并且人参皂苷Rg3联合GP可起到增效减毒作用。

Description

人参皂苷Rg3联合GP的应用
技术领域
本发明属于肿瘤辅助治疗药物开发技术领域，尤其涉及一种人参皂苷Rg3联合GP(吉西他滨+顺铂)在作为抗肿瘤的药物中的应用。
背景技术
近年来，癌症在我国的发病率逐年上升，造成的死亡人数仅次于心脑血管类疾病，尤其是肺癌在我国的发病率和死亡率均位居榜首。以吉西他滨与顺铂(GP)为主的联合化疗方案是治疗肺癌的主要手段之一，但GP化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，会损伤免疫细胞，且伴随着一些严重的肝、肾和骨髓抑制毒性。因而，探究可防治肿瘤且减轻这些毒副作用的辅助治疗药物，对提高病人生存质量并延长总生存期具有重要临床意义。
人参皂苷Rg3的结构式为：
Figure BDA0002736222290000011
为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的根，人参皂苷Rg3是人参中的有效活性成分，人参皂苷单体按照其苷元骨架类型分为三大类，Rg3为其中一类。已证实Rg3对肿瘤生长具有抑制作用，其作用机制影响各种信号通路进而影响各种蛋白的表达去诱导肿瘤细胞凋亡、分化、抑制肿瘤细胞转移、增强宿主免疫功能等机制而发挥抗肿瘤作用。其对于很多疾病有改善和预防作用，对于中老年的常见疾病，心脑血管疾病、冠心病、四肢乏力、腿脚不便、记忆力减退都有很好的疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人参皂苷Rg3联合GP在作为抗肿瘤药物中的应用，旨在克服现有GP化疗方式毒性过大的问题。
本发明是这样实现的，一种人参皂苷Rg3联合GP在作为抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述人参皂苷Rg3在作为GP抗肿瘤药性的增效药物中的应用，且所述人参皂苷Rg3在作为抑制GP药物对机体毒性的抑毒药物中的应用。
优选地，所述机体包括肝、肾和脾。
优选地，所述肿瘤包括Lewis肺癌
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明的动物实验结果表明，Rg3与GP化疗联合后可增强Lewis肺癌小鼠肿瘤生长抑制作用与肿瘤新生血管生成的抑制作用，其抑瘤作用可能与降低CD62P表达密切相关；而且人参皂苷Rg3与GP化疗联用后可起到增效减毒作用。
附图说明
图1是本发明实施例中各治疗组间小鼠瘤体积随时间变化；
图2是本发明实施例中各治疗组间小鼠肿瘤大小比较；
图3是本发明实施例中各治疗组肝、肾、脾与肿瘤组织的HE染色；
图4是本发明实施例中各治疗组肿瘤组织MVD和CD62P免疫组化结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明通过小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC)接种于C57BL/6N小鼠右腋下制成荷瘤模型，将接种动物随机分为以下几组并进行动物给药实验：
对照组：每日给以等量生理盐水腹腔注射；
GP化疗组(顺铂+吉西他滨，GP)：顺铂第1、6、8天腹腔注射，给药剂量(5mg·kg-1，0.2mL)，吉西他滨第1、8天腹腔注射，给药剂量(50mg·kg-1，0.2mL)；
Rg3组(人参皂苷Rg3)：每日给予灌胃1次，连续给药12天，给药剂量(8mg·kg-1，0.2mL)；
联合组(人参皂苷Rg3联合GP化疗)：人参皂苷Rg3每日灌胃，连续给药12天，给药剂量(8mg·kg-1，0.2mL)，顺铂与吉西他滨给药方案与GP化疗组相同。
治疗期间，隔天测小鼠体重和肿瘤体积；治疗结束后，断颈处死小鼠，剥瘤及肝、脾、肾等脏器并称重，计算肿瘤生长抑制率(IR)及脏器指数。
以上动物给药实验后所得的结果表明：Rg3与GP化疗联合后可增强Lewis肺癌小鼠肿瘤生长抑制作用与肿瘤新生血管生成的抑制作用，且其抑瘤作用可能与降低CD62P表达密切相关；而且人参皂苷Rg3与GP化疗联用后可起到增效减毒作用。
具体可见以下的实施例，通过实施例可以进一步的理解本发明。
实施例1
本实施例涉及的是人参皂苷Rg3联合GP化疗抑制Lewis肺癌生长作用的研究。
一、实验材料与方法
(一)主要材料
1、实验动物：32只SPF级雌性C57BL/6N小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK9(京)2016-0006]，分笼饲养于宁夏医科大学实验动物中心[宁医大伦理第2018-50号]，平均体重(14±2)g。实验动物小鼠均自由饮水及饮食，环境温度(20±2)℃，相对湿度(70±2)％。本实施例研究符合3R原则并经宁夏医科大学实验动物伦理委员会批准同意。伦理编号：IACUC-NYLAC-2019-104
2、细胞系：小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，并由宁夏医科大学宁夏特色中医药协同创新中心保存。
3、主要试剂和仪器
人参皂苷Rg3购于上海源叶生物科技有限公司(批号：Z10J10X90072)；顺铂购于上海源叶生物科技有限公司(批号：B12J10L79601)；吉西他滨购于上海源叶生物科技有限公司(批号：T21J8T40183)；高速冷冻离心机(Eppendorf，美国)。
(二)试验方法
1、动物荷瘤模型制备：适应性喂养三天后，将小鼠称重后随机分组，然后在小鼠右腋下注射状态良好的LLC细胞(密度为5×106mL-1)，每只接种0.2mL，制备小鼠Lewis肺癌模型。
2、实验动物分组：待肿瘤体积增长至约50mm3时按照平均瘤体随机分为4组，每组8只。对照组：每日给以等量生理盐水注射；GP化疗组(顺铂+吉西他滨，GP)：顺铂第1、6、8天腹腔注射，给药剂量(5mg·kg-1，0.2mL)，吉西他滨第1、8天腹腔注射，给药剂量(50mg·kg-1，0.2mL)；Rg3组(人参皂苷Rg3)：每日灌胃给药1次，连续给药12天，给药剂量(8mg·kg-1，0.2mL)；联合组(人参皂苷Rg3联合GP化疗)：人参皂苷Rg3每日灌胃给药，连续给药12天，给药剂量(8mg·kg-1，0.2mL)、顺铂与吉西他滨给药方案与GP化疗组相同。
3、观测指标：
3.1、定期测量小鼠体重并记录一般情况变化。
3.2、接种肿瘤后定期用游标卡尺测量肿瘤的长度(a)及宽度(b)，求出肿瘤近似体积V，或V＝ab2/2，单位为mm，记录肿瘤体积的变化规律。
3.3、计算抑瘤率(％)
Figure BDA0002736222290000051
3.4、统计学处理：采用SPSS 24.0软件处理数据，计量资料组间比较采用方差分析，采用平均值±标准差
Figure BDA0002736222290000052
表示，以P<0.05为有统计学意义。
二、实验结果
1、Lewis肺癌小鼠行为特征和体重变化
32只小鼠均造模成功，成瘤率100％。接种LLC肿瘤细胞约3d后，小鼠皮下可触及黄豆大小结节(瘤体积约50mm3)。给药后，对照组前三天正常进食进水，活动正常，三天后出现萎靡和脱毛现象，体重逐渐下降；GP化疗组给药后出现萎靡和脱毛现象，体重持续下降；Rg3组正常进食进水，活动正常，毛色正常，体重持续增加；联合组给药后前三天进食进水不佳，出现萎靡和脱毛现象，体重逐渐下降，三天后进食进水改善，体重逐渐增加，仍有脱毛现象。各组小鼠体重变化见表1：
表1小鼠体重的变化(n＝8)
Figure BDA0002736222290000053
2、Rg3与GP化疗联用对Lewis肺癌小鼠实体瘤的抑制作用
结果如下表2以及图1、图2所示。其中，表2为Rg3与GP化疗联用对小鼠Lewis肺癌实体瘤的抑制作用。与对照组比较，各治疗组瘤体积显著降低，联合组的抑瘤率最高，GP化疗组次之，Rg3组最低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
表2 Rg3与GP化疗联用对Lewis肺癌小鼠实体瘤的抑制作用
Figure BDA0002736222290000061
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
图1为各组小鼠瘤体积随时间增长点线图，与对照组相比，各治疗组瘤体积增长明显减少，瘤体积增长趋势平缓；治疗9天后，对照组瘤体积持续快速增长，而Rg3组增长缓慢，GP化疗组和联合组增长接近停滞。图2为各组小鼠肿瘤大小，与对照组相比，各治疗组肿瘤明显减小。
3、结论
Rg3组、GP化疗组和联合组对Lewis肺癌小鼠实体瘤均有抑制作用(P<0.05)，其中以联合组最为显著(P<0.01)，表明人参皂苷Rg3能提高GP化疗对肿瘤细胞的杀伤能力。
实施例2
本实施例涉及的是人参皂苷Rg3与GP化疗联用对Lewis肺癌小鼠肝、肾、脾和肿瘤病理变化及脏器指数的影响。
一、实验材料与实验方法
1、主要试剂：苏木精(购于上海源叶生物科技有限公司)；伊红(购于上海源叶生物科技有限公司)
2、实验仪器：正置荧光显微镜(OLYMPUS)；冷冻切片机(德国徕卡)
3、实验方法
3.1、脏器指数的检测：治疗结束后，剥肝、肾和脾脏器并称重，计算其脏器指数。
3.2、HE染色方法：
(1)固定：4％多聚甲酸20mL分装于小瓶内，将取下的新鲜脏器组织置于其中，固定48h；
(2)修块：将固定后的肝组织切分成0.5×0.5cm的小块，放入包埋框内，用流水冲洗30min；
(3)脱水：通过全自动脱水机进行脱水处理：一次将标本放置于75％、85％、90％的浓度的乙醇中浸泡45min，最后用无水乙醇浸泡1h；
(4)透明：将组织浸泡在二甲苯中1h后取出并浸泡在新的二甲苯中1h；
(5)浸蜡：将组织浸泡在65℃的液体石蜡中1h；脱水机工作程序完成后，取出组织包埋框置于通风橱中风干；
(6)包埋：在模具中滴入液体石蜡，将包埋盒中的组织放入模具中；包埋盒的另一半盖住模具，再滴入少许石蜡后，放到冷台上冷却；
(7)切片：连续切片，厚度5～7μm；
(8)烤片：将组织切片放在60℃烤箱中烘烤过夜；
(9)脱蜡：将切片浸于二甲苯中5min，浸泡过程重复两次；
(10)切片经过各不同浓度乙醇进行常规脱水和水洗，顺序如下：无水乙醇2min→95％乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min；
(11)苏木素染色5min，随后用自来水冲洗；
(12)盐酸乙醇分化30sec(提插数下)；兙
(13)50℃温水浸泡5min；
(14)放置于伊红液中，时间2min；
(15)常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)1min→95％乙醇(Ⅱ)→无水乙醇(I)1min→无水乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸→(3：1)1min二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固；
(16)镜下观察各组实验动物肝、肾、脾与肿瘤组织HE染色结果。
4、实验结果
4.1、Rg3与GP化疗联用对Lewis肺癌小鼠脏器指数的影响
结果如下表3所示：
表3 Rg3与GP化疗联用对Lewis肺癌小鼠脏器指数的影响(n＝8)
Figure BDA0002736222290000081
表3为Rg3与GP化疗联用对Lewis肺癌小鼠脏器指数的影响，与对照组相比，Rg3组和联合组肝脏指数、肾脏指数和脾脏指数无明显差异，GP化疗组肝脏指数、肾脏指数和脾脏指数呈现下降趋势，差异不显著(P>0.05)，其原因可能是肿瘤生长过快且给药时间有限，GP化疗组无法造成显著的脏器损伤。
4.2、Rg3与GP化疗联用对Lewis肺癌小鼠肝、肾、脾和肿瘤病理变化的影响
结果如图3所示，图3为各治疗组小鼠肝、肾、脾组织和肿瘤组织HE染色。肝组织中，对照组和Rg3组小鼠肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，肝细胞形态正常，细胞核无改变；GP化疗组肝细胞排列不均匀，肝细胞出现大量空泡状脂滴，细胞核发生固缩；联合组肝细胞脂滴和核固缩减少，病变程度改善。肾组织中，对照组和Rg3组可见肾小管、肾小球结构清楚，形态和染色基本正常；GP化疗组肾小球管腔变窄并有少量坏死，肾小管间质毛细血管扩张充血；联合组肾小球结构正常，肾小管间质毛细血管扩张充血，相对于GP化疗组病变程度改善。脾组织中，对照组和Rg3组的小鼠脾组织实质内结构分明，蓝色白髓、红色红髓结构清楚，脾细胞排列规则，染色均匀；而GP化疗组脾组织学结构紊乱，红髓、白髓分布不清，细胞排列不规则；联合组脾组织实质结构得以修复，红髓和白髓重新形成，脾细胞分布较规则。肿瘤组织中，与对照组相比，各治疗组肿瘤细胞出现不同程度的凋亡，联合组细胞凋亡最为明显，GP化疗组次之，Rg3组较低。
5、结论
本实施例通过各组小鼠体重变化、脏器指数的评估以及各组织HE染色发现，人参皂苷Rg3对GP化疗所致的肝、肾、脾的损伤具有改善作用。
实施例3
本实施例涉及的是人参皂苷Rg3与GP化疗联用对肿瘤微血管密度和CD62P蛋白的影响。
1、主要试剂：MVD试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司(批号：AH03095376)；CD62P试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司(批号：AH11156358)。
2、实验仪器：正置荧光显微镜(OLYMPUS)；冷冻切片机(德国徕卡)
3、免疫组化染色方法
(1)固定：4％多聚甲酸20mL分装于小瓶内，将取下的新鲜肿瘤组织置于其中，固定48h；
(2)修块：将固定后的肝组织切分成0.5×0.5cm的小块，放入包埋框内，用流水冲洗30min；
(3)脱水：通过全自动脱水机进行脱水处理：一次将标本放置于75％、85％、90％的浓度的乙醇中浸泡45min，最后用无水乙醇浸泡1h；
(4)透明：将组织浸泡在二甲苯中1h后取出并浸泡在新的二甲苯中1h；
(5)浸蜡：将组织浸泡在65℃的液体石蜡中1h；脱水机工作程序完成后，取出组织包埋框置于通风橱中风干；
(6)包埋：在模具中滴入液体石蜡，将包埋盒中的组织放入模具中；包埋盒的另一半盖住模具，再滴入少许石蜡后，放到冷台上冷却；
(7)切片：连续切片，厚度5～7μm；
(8)烤片：将组织切片放在60℃烤箱中烘烤过夜；
(9)脱蜡：将切片浸于二甲苯中5min，浸泡过程重复两次；
(10)切片经过各不同浓度乙醇进行常规脱水和水洗，顺序如下：无水乙醇2min→95％乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min；
(11)热修复抗原：将切片侵入枸橼酸盐缓冲液，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10分钟后，反复1～2次，冷却后洗涤1～2次；
(12)滴加内源性过氧化物酶阻断剂，孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；
(13)滴加5％正常山羊血清，封闭30min；
(13)分别滴加CD34(1:300)和CD62P抗体(1:300)，4℃冰箱孵育过夜；
(14)PBS冲洗3次，每次2min，滴加反应增强液；
(15)PBS冲洗3次，每次2min，滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物；
(16)PBS冲洗3次，每次2min，DAB显色，苏木精复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察，拍照。
4、实验结果：免疫组化检测肿瘤组织MVD和CD62P表达结果
结果如下表4与图4所示：
表4 Rg3与GP化疗联用对Lewis肺癌小鼠MVD影响
Figure BDA0002736222290000101
注：与对照组比较，**P<0.01，***P<0.001
表4为Rg3与GP化疗联用对Lewis肺癌小鼠肿瘤MVD影响。图4为MVD和CD62P免疫组化结果。MVD是目前用以衡量肿瘤新生血管程度的有效指标，肿瘤组织中MVD的增高预示瘤体增长速度加快、转移可能性增大；CD62P主要介导肿瘤细胞与血管内皮、血小板的粘附，并在肿瘤的发展、转移中起重要作用。结果显示，对照组小鼠瘤组织微血管大量增生，Rg3组、GP化疗组和联合组肿瘤MVD与对照组比较显著减少(P<0.05)。并且与对照组相比，各治疗组CD62P蛋白表达均出现不同程度降低，且联合组CD62P蛋白表达降低最明显，GP化疗组次之。
5、结论
Rg3与GP化疗联合后可增强Lewis肺癌小鼠肿瘤生长抑制作用与肿瘤新生血管生成的抑制作用，且其抑瘤作用可能与降低CD62P表达密切相关。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.人参皂苷Rg3联合GP在作为抗肿瘤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rg3在作为GP抗肿瘤药性的增效药物中的应用，且所述人参皂苷Rg3在作为抑制GP药物对机体毒性的抑毒药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述机体包括肝、肾和脾。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括Lewis肺癌。
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