CN112043709A - 一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡及其制备方法和应用，以甲氨蝶呤和烟酰胺联合作为主药，胆固醇和神经酰胺与非离子表面活性剂进一步制得囊泡载体，将甲氨蝶呤和烟酰胺负载于囊泡载体中，负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡提高了甲氨蝶呤局部给药的皮肤透过量和滞留量，囊泡的稳定性好，同时烟酰胺与甲氨蝶呤还发挥协同治疗银屑病作用，此外，烟酰胺和神经酰胺的保湿和修复作用对治疗银屑病有一定的辅助作用，并且本发明的囊泡还具有低毒、低免疫原性、低成本、可完全生物降解的优点，是一种高效、使用方便、安全可靠的治疗银屑病药物制剂。

Description

一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及银屑病治疗药物技术领域，更具体地，涉及一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
银屑病是一种常见的自身免疫性慢性炎症性皮肤病，以表皮细胞过度增殖、真皮毛细血管扩张和炎性细胞浸润为特征，临床主要表现为红斑、鳞屑，同时伴随有瘙痒、疼痛、出血等症状。银屑病的确切发病机制目前还不完全清楚，目前银屑病的治疗方法包括局部治疗、全身治疗和光疗。
甲氨蝶呤是一种合成的叶酸类似物，属于细胞毒性药物，具有抗细胞增殖和抗炎作用，在1971年已被美国食品和药物管理局批准为银屑病治疗药物。甲氨蝶呤主要作为二氢叶酸还原酶抑制剂，可选择性地抑制银屑病表皮细胞的合成，抑制细胞增殖，从而治疗银屑病。甲氨蝶呤作为治疗银屑病的首选药物之一，可口服或注射给药，如中国专利CN103751191A(申请公布日2014.04.30)公开了一种治疗银屑病的组合药物，包括一定配比的甲氨蝶呤、水飞蓟素、维生素B、法莫替丁制成具有4层结构的胶囊，但由于甲氨蝶呤溶解度不高，因此利用率不高，加上甲氨蝶呤只能从表面减轻银屑病的红斑、鳞屑症状，在改善皮肤表皮增厚、降低小鼠脾脏指数方面的治疗效果不够好。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有甲氨蝶呤溶解度不高，且只能从表面减轻银屑病的红斑、鳞屑症状，治疗银屑病效果不够好的缺陷和不足，提供一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，能提高甲氨蝶呤的溶解度，以及提高甲氨蝶呤的皮肤透过量和滞留量，不仅能减轻银屑病的红斑、鳞屑症状，降低表皮厚度和炎症细胞浸润，使小鼠脾脏指数恢复正常，还能下调各炎症细胞因子mRNA水平，显著提高治疗银屑病的效果。
本发明的又一目的是提供一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的制备方法。
本发明的又一目的是提供一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，以甲氨蝶呤和烟酰胺作为主药，负载于囊泡中，制备所述囊泡的原料包括胆固醇、神经酰胺和非离子表面活性剂，其中各组分的质量份分别为：
Figure BDA0002669299230000021
本发明负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，其中甲氨蝶呤和烟酰胺联合作为主药，囊泡包括胆固醇、神经酰胺制成，烟酰胺与甲氨蝶呤可以发挥协同治疗银屑病的作用，一方面，由于甲氨蝶呤属于难溶性药物，在水中的饱和溶解度较小，加入烟酰胺可以提高甲氨蝶呤在水相中的溶解度，使药物更好的包裹在囊泡内，再借助囊泡载体透过皮肤和滞留在皮肤内(即提高甲氨蝶呤的皮肤透过量和滞留量)，提高甲氨蝶呤的利用率，从而提高治疗效果；另一方面，本发明的囊泡生物相容性较好，可降低囊泡对皮肤的刺激性。另外，烟酰胺和神经酰胺还对皮肤屏障有一定的保湿和修复作用，在银屑病治疗当中具有重要的现实意义。
优选地，所述组分的质量份分别为：
Figure BDA0002669299230000022
更优选地，所述组分的质量份分别为：
Figure BDA0002669299230000023
优选地，所述非离子表活性剂为吐温80、吐温20、吐温40、司盘20、司盘40、司盘80中的一种或几种。
本发明还保护上述负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的制备方法，包括如下步骤：
将神经酰胺、胆固醇、非离子表活性剂和有机溶剂混合均匀得第一混合液，将甲氨蝶呤、烟酰胺和缓冲溶液混合均匀得第二混合液，将第一混合液和第二混合液混合均匀，至有机溶剂挥发完全后即得负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡。
优选地，所述有机溶剂为乙醇或乙醚。
优选地，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液、磷酸-柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液中的一种。
优选地，所述缓冲溶液的pH为7.2～7.4。
优选地，所述混合的温度为35～75℃
更优选地，所述混合的温度为45～65℃。
本发明保护上述囊泡在制备治疗银屑病药物中的应用。
本发明还保护上述囊泡在制备治疗咪喹莫特诱导的银屑病药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，以甲氨蝶呤和烟酰胺联合作为主药，胆固醇、神经酰胺与非离子表面活性剂进一步制得囊泡，将甲氨蝶呤和烟酰胺负载于该囊泡中，提高了甲氨蝶呤局部给药的皮肤透过量和滞留量，囊泡的稳定性好，烟酰胺可以增加甲氨蝶呤在囊泡中的溶解度，提高甲氨蝶呤的利用率，同时烟酰胺与甲氨蝶呤可发挥协同治疗银屑病作用；此外，烟酰胺和神经酰胺的保湿和修复作用对治疗银屑病有一定的辅助作用。本发明的囊泡还具有低毒、低免疫原性、低成本、可完全生物降解的优点，因此，是一种高效、使用方便、安全可靠的治疗银屑病药物制剂。
附图说明
图1为甲氨蝶呤在不同浓度烟酰胺中的饱和溶解度。
图2为不同时间空白神经酰胺非离子表面活性剂囊泡的粒径和电位变化情况图。
图3为不同时间甲氨蝶呤-烟酰胺的神经酰胺非离子表面活性剂囊泡的粒径和电位变化情况图。
图4为不同体系处理人永生化表皮细胞24h后细胞存活率。(P＜0.05，*表示有显著性差异)。
图5为实验期间第1,3,5,7天不同体系治疗咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠的代表性背部照片。
图6为实验过程中小鼠第1,3,5,7天体重相对第1天变化情况。
图7为实验结束后各体系代表性小鼠背部皮肤苏木精-伊红染色观察皮肤表皮厚度和炎症细胞因子浸润。
图8为第1,3,5,7天各组小鼠银屑病皮损面积和严重程度指数的评分情况，P<0.05，“*”代表与含药囊泡组相比具有显著性差异。
图9为各组小鼠脾脏指数情况图(P<0.05，其中“*”代表与空白组相比具有显著性差异，“#”代表与造模组具有显著性差异，“&”代表与含药囊泡组相比具有显著性差异)。
图10为各组小鼠皮肤不同炎症因子mRNA的表达水平；(A)为皮肤TNF-αmRNA相对空白组表达量；(B)为皮肤IL-17A mRNA相对空白组表达量；(C)为皮肤IL-6 mRNA相对空白组表达量；(D)为皮肤IL-1βmRNA相对空白组表达量(P＜0.05，“*”代表与空白组相比具有显著性差异，“#”代表与造模组具有显著性差异，“&”代表与甲氨蝶呤-烟酰胺囊泡组相比具有显著性差异)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1
一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，以甲氨蝶呤和烟酰胺作为主药，负载于囊泡中，制备所述囊泡的原料包括胆固醇、神经酰胺和吐温80，其中各组分的质量份分别为：
Figure BDA0002669299230000041
上述负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的制备方法，包括如下步骤：
在55℃下，将神经酰胺、胆固醇、吐温80和乙醇混合形成澄清透明混合液；在55℃下，将甲氨蝶呤、烟酰胺和PBS(pH＝7.4)经过磁力搅拌形成澄清透明主药混合液；在55℃下，将混合液快速滴加至主药混合液中，继续搅拌，直至乙醇完全挥发，形成均一稳定的浅黄色溶液，即为负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡(含药囊泡)。
实施例2
一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，以甲氨蝶呤和烟酰胺作为主药，负载于囊泡中，制备所述囊泡的原料包括胆固醇、神经酰胺和司盘80，其中各组分的质量份分别为：
Figure BDA0002669299230000051
上述负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的制备方法与实施例1相同，区别在于组分及其含量的替换。
实施例3
一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，以甲氨蝶呤和烟酰胺作为主药，负载于囊泡中，制备所述囊泡的原料包括胆固醇、神经酰胺和吐温80，其中各组分的质量份分别为：
Figure BDA0002669299230000052
上述负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的制备方法与实施例1相同，区别在于组分及其含量的替换。
实施例4
一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，以甲氨蝶呤和烟酰胺作为主药，负载于囊泡中，制备所述囊泡的原料包括胆固醇、神经酰胺和吐温80，其中各组分的质量份分别为：
Figure BDA0002669299230000061
上述负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的制备方法与实施例1相同，区别在于组分及其含量的替换。
实施例5
一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，以甲氨蝶呤和烟酰胺作为主药，负载于囊泡中，制备所述囊泡的原料包括胆固醇、神经酰胺和吐温80，其中各组分的质量份分别为：
Figure BDA0002669299230000062
上述负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的制备方法与实施例1相同，区别在于组分及其含量的替换。
实施例6
一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，以甲氨蝶呤和烟酰胺作为主药，负载于囊泡中，制备所述囊泡的原料包括胆固醇、神经酰胺和吐温80，其中各组分的质量份分别为：
Figure BDA0002669299230000063
上述负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的制备方法与实施例1相同，区别在于组分及其含量的替换。
性能测试
一、甲氨蝶呤在不同浓度烟酰胺中的饱和溶解度实验
1、测试方法
通过测定甲氨蝶呤在水中以及不同浓度的烟酰胺溶液中的溶解度，测试烟酰胺的加入是否可以提高甲氨蝶呤的溶解度。
分别取4mL水和含2wt％、4wt％、6wt％、8wt％烟酰胺水溶液于10mL的EP管中，再向EP管中投入过量的甲氨蝶呤，在水浴中超声30min，放入摇床中过夜，然后15000rpm离心10min，取上清液，使用0.22μm微孔滤膜过滤后得到样品：(1)4mL甲氨蝶呤过饱和水溶液；(2)4mL甲氨蝶呤过饱和、2％烟酰胺溶液混合液；(3)4mL甲氨蝶呤过饱和、4％烟酰胺溶液混合液；(4)4mL甲氨蝶呤过饱和、6％烟酰胺溶液混合液；(5)4mL甲氨蝶呤过饱和、8％烟酰胺溶液混合液，用高效液相色谱测定以上样品溶液中甲氨蝶呤的浓度。
2、实验结果
甲氨蝶呤在不同溶液中的溶解度结果如图1所示，甲氨蝶呤在水中的溶解度为81.8±4.7μg/mL，在2％，4％，6％，8％烟酰胺水溶液的饱和溶解度分别为756.8±40.0μg/mL，1332.4±42.8μg/mL，1472.1±52.4μg/mL，1656.4±205.5μg/mL。说明随着烟酰胺的加入，甲氨蝶呤的溶解度也随之明显提高，具有显著性差异(P<0.05)。
二、负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的体外透皮实验
1、测试方法
目的：通过对比本发明实施例1制得的囊泡、甲氨蝶呤水混悬液、甲氨蝶呤的烟酰胺水溶液的透皮行为，评价本发明囊泡在皮肤给药中的表现。
将上述实施例1制得的囊泡、对比例1的甲氨蝶呤水混悬液、对比例2的甲氨蝶呤-烟酰胺水溶液分别进行体外透皮实验，观察各体系的皮肤透过行为和滞留效果。
样品：(1)500mL本发明实施例1制得的囊泡，澄清浅黄色液体；
(2)500mL甲氨蝶呤水混悬液，甲氨蝶呤浓度为1mg/mL，浅黄色混浊液体；
(3)500mL甲氨蝶呤-烟酰胺水溶液，甲氨蝶呤浓度为1mg/mL，烟酰胺的浓度为60mg/mL，浅黄色澄清透明溶液。
2、实验方法
皮肤处理：SD大鼠(180～220g)使用1mL 20％乌拉坦进行麻醉，颈椎脱臼处死，用动物剃毛仪剔除大鼠腹部毛发，用手术刀分离出腹部皮肤，然后小心将皮下组织，包括血管和脂肪层从皮肤上去除。用生理盐水彻底清洁皮肤，用滤纸吸去皮肤表面多余的水分。最后使用铝箔纸将皮肤包封并在-20℃下保存。在使用皮肤进行透皮研究之前，需要仔细检查皮肤表面是否有磨损迹象。
透皮实验：皮肤使用生理盐水在室温下解冻，并使用滤纸吸干皮肤表面水分，小心地将皮肤安装在扩散池的供给池和接收池之间，皮肤角质层朝向供给池侧。本实验使用的扩散池的有效渗透面积为3.14cm2，接收池体积为7.5mL。首先将接收池灌满7.5ml的接收液PBS(pH 7.4)，在32℃与皮肤保持平衡30min以上。然后,向供给池中分别加入500μL 3组样品(n＝6)，立即使用封口膜将供给池上方密封以防止实验过程中药物挥发。设置扩散池的搅拌速度和水浴温度分别为250rpm和32±1℃。透皮实验过程中，使用取样针在预定时间(1、2、4、6、8、12、24h)从接收池的取样口取出1mL接收液，并立即补充等体积的空白接收液，以保持接收池内溶液体积不变。所得样品经0.22μm微孔滤膜过滤后使用高效液相色谱法测定样品中甲氨蝶呤的含量，按以下公式计算甲氨蝶呤单位面积累积透过量：
Figure BDA0002669299230000081
其中Cn表示第n个取样点测得的浓度，Ci表示第i个取样点测得的浓度，i＝1，2，4，6，8，10，12，24。V0表示接收池的体积，V表示每次取样的体积，A表示有效渗透面积，Qn(μg/cm2)为单位面积累积透过量。
透皮实验后，小心取出安装在接收池和供给池中间的皮肤，分别用甲醇和蒸馏水擦洗皮肤三次以除去残留在皮肤表面多余的药液。将皮肤剪成小块，加入1mL甲醇。超声提取30min，室温静置2h。取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤,取续滤液通过高效液相色谱测定样品中甲氨蝶呤的含量，即为皮肤滞留量。
表1实施例1囊泡、甲氨蝶呤水混悬液、甲氨蝶呤-烟酰胺水溶液的24h离体透皮结果(n＝6)
Figure BDA0002669299230000082
Figure BDA0002669299230000091
备注：*为与甲氨蝶呤水混悬液组之间有显著性差异(P<0.05)；#为与甲氨蝶呤烟酰胺水溶液组之间有显著性差异(P<0.05)。
3、测试结果
体外皮肤透过和滞留结果如表1所示，烟酰胺的加入对甲氨蝶呤在水中的皮肤透过和皮肤滞留几乎没有影响，但是本发明实施例1制得的囊泡能显著增加甲氨蝶呤的单位面积皮肤累积透过量和皮肤滞留量，实施例2～6制得的囊泡同样具有该效果，说本发明制得的囊泡可以增加甲氨蝶呤的皮肤透过，使药物更好的富集在皮肤表皮和真皮，提高治疗效果。
三、初步储存稳定性实验
1、测试方法
将本发明制得的囊泡置于4℃环境下密封保存，观察在实验过程中囊泡的稳定性能。
目的：通过对比不含甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡(空白囊泡)、以及实施例1制得的负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡(含药囊泡)进行初步稳定性实验考察，检测囊泡的稳定性。
2、实验方法
将本发明含药囊泡和空白囊泡分别密封于玻璃小瓶，在4℃条件下储存，进行初步贮存稳定性研究。分别在第0、7、14和28天观察测定，通过囊泡的外观、粒径和电位变化情况来评价其初步储存稳定性能。每组独立进行3个重复样本的实验(n＝3)。
3、实验结果
初步稳定性实验如图2和图3所示，可以看出储存28天时间内，两组囊泡的粒径大小和电位基本保持不变，并且在整个实验过程中含药囊泡并没有观察到有药物析出的现象，说明本发明实施例1～6制得的囊泡载体具有很好的稳定性，为其应用提供基础。
四、体外抑制细胞增殖实验(体外治疗银屑病)
1、测试方法
通过比较不同药物体系的体外抗细胞增殖效果，测试各体系治疗银屑病的作用。
(1)药物的配置
分别用DMEM培养基配置含甲氨蝶呤1mg/mL，烟酰胺60mg/mL的母液，然后再用培养基稀释100倍，使得所有溶液成分浓度保持一致，分别配置6组样品：
①空白对照组(不加任何组分)；
②空白囊泡；
③甲氨蝶呤溶液；
④烟酰胺溶液；
⑤甲氨蝶呤-烟酰胺混合溶液；
⑥实施例1制得的含药囊泡。
(2)MTT稀释液配制
使用无菌水配制MTT母液，浓度为5mg/mL，使用DMEM培养基以1:5的比例将MTT母液稀释得到MTT稀释液。
(3)细胞培养
人永生化表皮细胞在含10％胎牛血清和1％链霉素/青霉素的DMEM培养基培养，放置于37℃和5％CO2的细胞培养箱中。每隔2～3天用0.25％胰酶消化离心传代一次，再用新鲜培养基培养。
(4)抗增殖实验
采用MTT法评价药物的体外抗增殖作用。培养人永生化表皮细胞至其处于对数生长期时，将细胞用胰酶消化离心后，加培养基重悬进行计数，细胞以6～8*103/孔的密度接种于96孔板中，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h，使细胞基本贴壁。除去培养基，并在不同的孔中分别加入100μL配制好的不同药物溶液，以空白培养基为空白组，空白囊泡组为对照组。培养箱中培养24h，小心吸去每孔培养基，再向每孔加入120μL MTT培养基稀释溶液，避光孵育4h，然后将MTT溶液小心去除并加入150μL/孔DMSO，置于摇床在室温下摇晃15min使形成的甲瓒晶体完全溶解。最后，使用酶标仪在波长490nm处测定每孔的光密度(OD)。每孔细胞存活率用以下公式表示：
细胞存活率％＝(A样品–A空白)/(A对照-A空白)x100％
其中，A样品为每个样品孔测定的OD值，A空白和A对照分别为空白组和对照组细胞OD值的平均值。
2、实验结果
不同体系抑制人永生表皮细胞增殖结果如图4所示，可以看出，甲氨蝶呤溶液表现出一定程度的抑制细胞增殖作用，烟酰胺对细胞增殖没有抑制作用，而当甲氨蝶呤-烟酰胺联合应用时，表现出较好的抑制细胞增殖效果，说明烟酰胺可以增加甲氨蝶呤抑制细胞增殖效果，两者使用具有协同治疗银屑病的作用。
此外，空白囊泡几乎不影响细胞存活率，说明该囊泡载体对细胞的安全性好，而本发明实施例1制得的囊泡组表现出最好的细胞增殖抑制作用，与其它给药体系均具有显著性差异，说明本发明实施例1～6制得的囊泡可以促进药物释放，使药物更好的进入细胞，发挥抑制细胞增殖的作用。
五、对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的体内给药实验
1、测试方法
为了考察本发明负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡的抗银屑病活性，进行了体内抗银屑病实验，并将实施例2制得的囊泡、甲氨蝶呤水混悬液、烟酰胺水溶液、甲氨蝶呤口服液进行抗银屑病药效对比。
样品准备：①甲氨蝶呤水混悬液(质量百分比为0.05％)；②甲氨蝶呤口服液(0.0135％水混悬液，0.2ml)；③烟酰胺水溶液(质量百分比为6％)；④空白囊泡；含药囊泡(0.1ml)。
2、实验方法
(1)咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的建立
本实验采用BALB/C小鼠(6～8周)作为模型动物，小鼠在实验环境下饲养一周后进行实验。使用动物剃毛仪除去小鼠背部毛发并使用脱毛膏进行脱毛处理，脱毛48h后进行动物造模。
(2)给药方案
将动物平均分为7个组别：空白组、造模组、空白囊泡组、甲氨蝶呤水混悬液组、烟酰胺水溶液组、甲氨蝶呤口服给药组和含药囊泡组。除空白组外，其余各组每天使用5％咪喹莫特乳膏，以0.1g/只的给药量均匀涂抹在小鼠背部脱毛部位。在给予咪喹莫特乳膏造模4h后，空白组给予100μL蒸馏水作为空白对照，甲氨蝶呤口服给药组给予0.2mL甲氨蝶呤口服液，其余各组分别给予相应的药物配方100μL进行治疗。在实验过程第1,3,5,7天分别对动物皮肤进行拍照，称量体重和皮损评分。在实验结束后，颈椎脱臼处死小鼠，取下实验的背部皮肤分为两部分，一部分放入4％多聚甲醛中固定，石蜡切片后进行苏木精-伊红染色。另一部分放入Trizol溶液中于-20℃保存，用于皮肤PCR实验测定皮肤中炎症相关因子TNF-α，IL-17A，IL-22，IL-23，IL-6，IL-1β的mRNA的表达。取出各组小鼠脾脏，称量体重并计算其脾脏指数。
(3)评价治疗银屑病效果指标
利用小鼠的皮肤红斑和鳞屑现象、小鼠银屑病皮损面积和严重程度指数、苏木精-伊红染色中表皮厚度、炎症细胞因子浸润情况、脾脏指数、mRNA的表达情况来评价药物治疗银屑病效果。其中小鼠银屑病皮损面积和严重程度指数的评分标准：根据各组小鼠的体重变化、银屑病皮损面积、严重程度指数、皮肤鳞屑数、鳞屑厚度、红斑严重程度综合进行评分，其中无症状为0分，轻度为1分，中度为2分，重度为3分，极其严重为4分，总分12分。
3、实验结果
在整个实验过程中各组小鼠体重相对第1天变化情况如图6所示，可以看到实验过程中小鼠体重变化基本不变，说明各处方在整个实验中对小鼠没有产生明显的毒性，即囊泡具有低毒、低免疫原性。
从实验过程中各组小鼠背部皮肤情况照片如图5，在整个实验过程中空白组小鼠皮肤没有变化，没有出现任何不良反应。其余各组经过咪喹莫特诱导后，小鼠皮肤会出现严重的红斑和鳞屑现象，并且在实验第5天时银屑病现象最为明显。造模组皮肤症状在实验第7天较第5天有所缓解，说明小鼠本身有一定的恢复能力，但是与其它治疗组相比不容乐观。此外，空白囊泡组、甲氨蝶呤水混悬液组、烟酰胺水溶液组虽然在第7天皮肤表面的鳞屑或者红斑现象还很明显，但是相比第5天有所减少，说明具有一定的治疗效果，而空白囊泡组中可能是神经酰胺发挥作用。甲氨蝶呤口服给药组模拟的是目前常用的、效果比较显著的甲氨蝶呤治疗银屑病的给药方式，但是本发明的含药囊泡组和甲氨蝶呤口服给药组在改善皮肤表面外观状态上具有相似的效果，在第7天皮肤表面状态基本恢复；并且，在图8第1,3,5,7天的小鼠银屑病皮损面积和严重程度指数的评分，也可以看出，在第7天评分中，含药囊泡组的评分最低，较其他组有显著性差异。说明含药囊泡在改善银屑病样皮肤症状上能够达到口服给药组的效果，能明显改善咪喹莫特引起的皮肤红斑鳞屑状态。
由图7可知，经咪喹莫特诱导后，皮肤表皮明显增厚，真皮被大量炎症细胞因子浸润。空白囊泡组小鼠的表皮厚度与造模组相近，说明该空白囊泡在减轻皮肤表皮增厚上没有明显作用。虽然甲氨蝶呤、烟酰胺、口服给药组也能减小皮肤表皮增厚，但是效果不如含药囊泡组显著，说明含药囊泡组在减轻表皮增厚上具有明显优势。
从图9中可以看到，咪喹莫特诱导会使小鼠脾脏指数显著升高。虽然空白囊泡组可以改善小鼠皮肤状态，但是并不能降低小鼠脾脏指数，进一步说明上述改善皮肤的鳞屑或者红斑现象的是空白囊泡中的神经酰胺发挥作用，单独使用甲氨蝶呤和烟酰胺也可以降低小鼠脾脏指数，但是降低程度不如含药囊泡组。虽然甲氨蝶呤口服液在改善银屑病小鼠皮肤外观上与含药囊泡组有相同的效果，但是在降低小鼠脾脏指数上并不理想，与含药囊泡组相比具有显著性差异，说明含药囊泡局部给药的治疗银屑病效果优于甲氨蝶呤口服给药。
图10(A)为TNF-α的mRNA的表达，与空白组相比，使用咪喹莫特造模的小鼠皮肤TNF-α的mRNA表达量明显上升，说明咪喹莫特诱导后可使皮肤产生炎症。经各治疗组治疗后，TNF-α的mRNA表达量都有下降。实施例2含药囊泡组的TNF-α的mRNA表达量与空白组相近，说明含药囊泡组能明显下调咪喹莫特引起的小鼠皮肤TNF-α的mRNA表达量。图10(B)为IL-17A的mRNA的表达，使用咪喹莫特造模的小鼠皮肤IL-17A的mRNA表达量明显上升，在各治疗组中，含药囊泡组对IL-17A的mRNA水平下降最为明显，与其他各治疗组相比具有显著性差异(P<0.05)。图10(C)(D)(E)(F)分别为皮肤IL-6，IL-1β，IL-22和IL-23的mRNA表达，使用咪喹莫特造模的小鼠皮肤IL-6，IL-1β，IL-22以及IL-23的mRNA表达量明显上升，并且在各治疗组中，实施例2的含药囊泡组对mRNA水平的下调最为明显，与空白组相近，无显著性差异(P>0.05)。
综上所述，本发明负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠具有很好的治疗效果，可以增加甲氨蝶呤的单位面积皮肤累积透过量和皮肤滞留量，稳定性好，在体外细胞抗增殖实验和体内治疗银屑病实验中都表现出较好的效果。此外，与其他治疗组相比，含药囊泡组在抑制细胞增殖和体内抗银屑病药效实验中都表现出更显著的疗效与优势，能有效减轻小鼠皮肤红斑和鳞屑情况，降低表皮厚度和炎症细胞浸润，使小鼠脾脏指数恢复正常，能显著下调由咪喹莫特引起的各炎症细胞因子mRNA水平，并且在整个实验过程中不会引起小鼠体重发生巨大变化，说明本发明实施例1～6制得的负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡是一种高效、使用方便、安全可靠的治疗银屑病药物制剂。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡，其特征在于，以甲氨蝶呤和烟酰胺作为主药，负载于囊泡中，制备所述囊泡的原料包括胆固醇、神经酰胺和非离子表面活性剂，其中各组分的质量份分别为：
Figure FDA0002669299220000011
2.根据权利要求1所述的囊泡，其特征在于，所述组分的质量份分别为：
Figure FDA0002669299220000012
3.根据权利要求1或2所述的囊泡，其特征在于，所述非离子表面活性剂为吐温80、吐温20、吐温40、司盘20、司盘40、司盘80中的一种或几种。
4.权利要求1～3任一项所述的囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将神经酰胺、胆固醇、非离子表活性剂和有机溶剂混合均匀得第一混合液，将甲氨蝶呤、烟酰胺和缓冲溶液混合均匀得第二混合液，将第一混合液和第二混合液混合均匀，至有机溶剂挥发完全后即得负载甲氨蝶呤和烟酰胺的囊泡。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇或乙醚。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液、磷酸-柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液中的一种。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH为7.2～7.4。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述混合的温度为35～75℃。
9.权利要求1～3任一项所述的囊泡在制备治疗银屑病药物中的应用。
10.权利要求1～3任一项所述的囊泡在制备治疗咪喹莫特诱导的银屑病药物中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19636252A1 (de) * 1996-08-28 1998-03-05 Deutsches Rheuma Forschungszen Pharmazeutisches Kombinationspräparat zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen
WO2012049677A2 (en) * 2010-10-10 2012-04-19 Dermipsor Ltd. Compositions for treating psoriasis of the scalp
CN108553420A (zh) * 2017-11-20 2018-09-21 平顶山学院 一种口服甲氨蝶呤脂质体及其制备方法
CN111228221A (zh) * 2020-02-25 2020-06-05 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 提高载药囊泡产率的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19636252A1 (de) * 1996-08-28 1998-03-05 Deutsches Rheuma Forschungszen Pharmazeutisches Kombinationspräparat zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen
WO2012049677A2 (en) * 2010-10-10 2012-04-19 Dermipsor Ltd. Compositions for treating psoriasis of the scalp
CN108553420A (zh) * 2017-11-20 2018-09-21 平顶山学院 一种口服甲氨蝶呤脂质体及其制备方法
CN111228221A (zh) * 2020-02-25 2020-06-05 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 提高载药囊泡产率的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALY A. ABDELBARY 等: "Design and optimization of topical methotrexate loaded niosomes for enhanced management of psoriasis: Application of Box–Behnken design, in-vitro evaluation and in-vivo skin deposition study", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS》 *
BAINS, P. 等: "Nicotinamide: Mechanism of action and indications in dermatology", 《INDIAN JOURNAL OF DERMATOLOGY, VENEREOLOGY AND LEPROLOGY 》 *
TAO WAN 等: "Effects of nanoparticles with hydrotropic nicotinamide on tacrolimus: permeability through psoriatic skin and antipsoriatic and antiproliferative activities", 《INT J NANOMEDICINE》 *

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