CN112043704B - 一种联合药物及其在防治鸡毒支原体感染上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种联合药物及其在防治鸡毒支原体感染上的应用，所述联合药物包括：达氟沙星和大观霉素。使用达氟沙星和大观霉素在防治鸡毒支原体时不仅具有相加的治疗效果，而且在防治普通鸡毒支原体感染时还可以减少普通鸡毒支原体的耐药性。

Description

一种联合药物及其在防治鸡毒支原体感染上的应用

技术领域

本发明属于兽药技术领域，具体涉及一种联合药物及其在防治鸡毒支原体感染上的应用。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum，MG)是明显具有致病性的禽类支原体，常通过呼吸道感染，对鸡和火鸡造成气囊炎和气管炎，并且常常和其他一些病原体协同致病，导致继发性感染。据有关调查，我国鸡群MG阳性感染率已达50％～80％，对我国养鸡业造成了严重的影响。MG既可水平传播又可垂直传播，属高度接触性传染病，一旦传入鸡群就很难根治。目前最重要的治疗是使用疫苗免疫和使用抗菌药物治疗。虽然疫苗免疫是防治MG病的重要手段，但目前生产的大部分MG疫苗特异性不强，且都处于较低级或者说是广谱预防的阶段，保护率只能达70％～80％，最高只能达到90％。因此，常使用抗菌药物对MG感染病鸡进行防治，其中大环内酯类、截短侧耳素类、氟喹诺酮类、四环素类抗菌药均对MG敏感。然而由于抗菌药物的不合理使用，造成耐药性现象普遍存在。

耐药病原微生物对养殖业造成的影响日益严重，联合抑菌试验能够筛选出针对耐药突变株具有协同或者相加作用的药物组合，使抗菌药物对耐药突变株的作用最大化，从而指导临床联合用药，然而目前尚未见抗菌药物对MG耐药突变株进行联合抑菌试验的相关报道，因此亟需研发一种药物组合物，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种联合药物及其在防治鸡毒支原体感染上的应用，以解决现有技术中存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。

为实现上述目的，技术方案如下：

一种联合药物，包括：达氟沙星和大观霉素。

所述达氟沙星和大观霉素的添加的浓度比例为3:(5-80)。

一种联合药物在制备防治鸡毒支原体感染药物中的应用。

所述鸡毒支原体为S6标准株(菌株保藏编号为CAU0742)。

所述达氟沙星和所述大观霉素对所述S6标准株进行联合抑菌试验时的联合作用为相加。

所述达氟沙星和所述大观霉素对所述S6标准株进行联合抑菌试验时的联合作用的FIC值为0.75。

所述鸡毒支原体为耐达氟沙星鸡毒支原体。

所述耐达氟沙星鸡毒支原体的突变株为M1。

所述耐达氟沙星鸡毒支原体的突变株为M2。

所述耐达氟沙星鸡毒支原体的突变株为M4。

所述达氟沙星和所述大观霉素对耐达氟沙星鸡毒支原体进行联合抑菌试验时的联合作用为相加。

所述达氟沙星和所述大观霉素对耐达氟沙星鸡毒支原体的联合作用的部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration，FIC)值为1。

其中耐达氟沙星鸡毒支原体突变株M1相对于大肠杆菌gyrA83位发生氨基酸取代：Ser83→Arg；耐达氟沙星鸡毒支原体突变株M2相对于大肠杆菌gyrA87位发生氨基酸取代：Glu87→Gly；耐达氟沙星鸡毒支原体突变株M4相对于大肠杆菌gyrA83位发生氨基酸取代：Ser83→Arg，且在parC84位发生氨基酸取代：Glu84→Lys。

本发明的有益效果是：提供了一种联合药物及其在防治鸡毒支原体感染上的应用，利用达氟沙星和大观霉素联合对鸡毒支原体进行体外抑菌检测，发现达氟沙星和大观霉素对鸡毒支原体具有联合相加的作用，使用达氟沙星和大观霉素在防治鸡毒支原体时不仅具有相加的治疗效果，而且在防治普通鸡毒支原体感染时还可以减少普通鸡毒支原体的耐药性。

达氟沙星属于喹诺酮类抗菌药，喹诺酮类抗菌药通过与细菌的DNA促旋酶或拓扑异构酶IV结合，诱导DNA促旋酶和拓扑异构酶IV发生构型改变，进而导致DNA降解及菌体死亡。大观霉素是属于氨基糖苷类抗生素，氨基糖苷类抗生素主要与30S核糖体16S rRNA的A部位结合以造成蛋白质的错译，使异常的细胞质膜蛋白破坏细胞质膜完整性，从而起到杀菌作用。喹诺酮类抗菌药物与氨基糖苷类抗生素的抗菌作用机制不相同，联合使用后可能从不同的环节对MG发挥作用。由于大观霉素可以破坏胞膜，所以可以使更多的达氟沙星与大观霉素进入胞内进行作用，从而使杀菌作用变得更好。

达氟沙星和大观霉素联合药物对已经形成耐药性的耐达氟沙星鸡毒支原体突变株M1、M2和M4具有联合相加的作用，克服了鸡毒支原体对达氟沙星的耐药性，能够防治耐达氟沙星鸡毒支原体的感染。

具体实施方式

以下各步骤仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各步骤技术方案的范围。

实施例1

1.抗菌药品的配制

甲磺酸达氟沙星(含量：78.3％，批号：120501-6，广东温氏大华农生物科技有限公司)、酒石酸泰乐菌素(含量：80.45％，批号：01105010008，山东鲁抗舍里乐药业公司)、盐酸多西环素(含量：87.4％，批号：17070110，广东温氏大华农生物科技有限公司)、延胡索酸泰妙菌素(含量：80.48％，批号：402070010771，广东温氏大华农生物科技有)、盐酸林可霉素(含量：82.04％，批号：010000346，丽珠集团丽珠制药有限公司)、盐酸大观霉素(含量：88.3％，批号：350600132，广东温氏大华农生物科技有限公司)、磷酸替米考星(含量：80.4％，批号：370300415，广东温氏大华农生物科技有限公司)。

将上述药品配制成1280μg/mL的药液，放置于4℃保存备用，使用时稀释至合适的浓度并无菌过滤。

2.培养基配制

使用改良Frey氏液体培养基，参照《中华人民共和国兽药典》2015年版三部上规定的方法配制。

3.鸡毒支原体菌种与菌液的制备

从中国兽医药品监察所购买鸡毒支原体S6标准株(菌株保藏编号为CAU0742)，建立达氟沙星对鸡毒支原体的体内感染PK-PD同步模型(药物动力学和药效动力学结合模型)，经三天给药后筛选出对达氟沙星耐药的鸡毒支原体突变株M1、M2和M4。

其中耐达氟沙星鸡毒支原体突变株M1相对于大肠杆菌gyrA83位发生氨基酸取代：Ser83→Arg；耐达氟沙星鸡毒支原体突变株M2相对于大肠杆菌gyrA87位发生氨基酸取代：Glu87→Gly；耐达氟沙星鸡毒支原体突变株M4相对于大肠杆菌gyrA83位发生氨基酸取代：Ser83→Arg，且在parC84位发生氨基酸取代：Glu84→Lys。

分别将以上菌种活化并培养，传代培养时将长好的菌液与新鲜培养基按照1：9的比例混合，然后将菌液培养至10⁸CFU/mL并稀释至10⁵CFU/mL，备用。

4.抗菌药最小抑菌浓度的测定

4.1测定方法

最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)的测定方法使用Tanner和Wu法并稍加改进，利用96孔板进行检测，在96孔板的前9列孔加入100μL液体培养基，然后在第1列孔加入100μL上述最高浓度药液充分混合均匀后，用2倍比稀释将药物稀释至第8孔；再于各孔中加入100μL 10⁵CFU/mL上述菌液；第10列为200μL的空白培养基作为阴性对照，第11列为200μL相应浊度的上述菌液作为阳性对照，第12列加入pH值为6.8的空白培养基作为生长终点对照；把96孔板用医用胶布封住缝隙，放置于37℃恒温培养箱中培养；每天监测并记录结果，当试验组的颜色与生长终点对照组的颜色一致时，即为生长终点，此时未发生颜色变化的最低药物浓度即该种药物的MIC值；每组试验重复3次。

4.2测定结果

达氟沙星药剂对鸡毒支原体S6标准株、M1突变株、M2突变株和M4突变株MIC的测定结果如表1所示，其中达氟沙星对S6标准株敏感，而M1、M2、M4均出现MIC升高的情况，其中M2相比S6标准株增加4倍，M1和M4相比S6标准株增加32倍。

表1达氟沙星测定4种MG的MIC

鸡毒支原体菌种	S6	M1	M2	M4
					MIC值	0.037 5μg/ml	1.2μg/ml	0.15μg/ml	1.2μg/ml

上述泰乐菌素、多西环素、泰妙菌素、林可霉素、替米考星、大观霉素6种药剂对鸡毒支原体S6标准株、M1突变株、M2突变株和M4突变株MIC值均相同，如表2所示，其中泰妙菌素对S6、M1、M2和M4的敏感性最高为0.0016μg/mL，林可霉素的敏感性则最低为4μg/mL。

表2 6种抗菌药对4种MG的MIC

5.体外联合抑菌试验

5.1试验方法

利用棋盘法进行试验，根据上述已经测定的抗菌药的MIC值，将达氟沙星抗菌药分别与泰乐菌素、多西环素、泰妙菌素、林可霉素、替米考星、大观霉素进行联合抑菌试验，以两药MIC值的4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍分别联合，设置阴性对照(新鲜培养基)、阳性对照(相应浊度的菌液)、药物单用时的单药对照和生长终点对照(pH值为6.8的培养基)，放置于37℃恒温培养箱中培养并观察试验组和对照组的颜色变化，当试验组的颜色与生长终点对照的颜色一致时为生长终点，每组试验重复三次。

其中联合药敏的相互作用以FIC指数作为判定标准，FIC值计算方法如下：

判定标准：FIC≤0.5为协同；0.5＜FIC≤1为相加；1＜FIC≤2为无关；FIC＞2为拮抗。

5.2检测结果

达氟沙星抗菌药分别与泰乐菌素、多西环素、泰妙菌素、林可霉素、替米考星、大观霉素联合作用时的MIC值如表3所示，可以看出达氟沙星和大观霉素作用于S6标准株的MIC值分别为0.01875μg/mL和0.5μg/mL；达氟沙星和大观霉素作用于M1突变株的MIC值分别为0.6μg/mL和1μg/mL；达氟沙星和大观霉素作用于M2突变株的MIC值分别为0.075μg/mL和1μg/mL；达氟沙星和大观霉素作用于M4突变株的MIC值分别为0.6μg/mL和1μg/mL；因此可以看出达氟沙星和大观霉素作用鸡毒支原体的浓度比例为3:(5-80)。

达氟沙星抗菌药分别与泰乐菌素、多西环素、泰妙菌素、林可霉素、替米考星、大观霉素联合作用4种鸡毒支原体的结果分别如表3、表4、表5、表6、表7和表8所示，根据表3、表4、表5、表6、表7和表8的结果可以得出达氟沙星与大观霉素联合的FIC值在0.75-1之间，均表现为相加作用，说明达氟沙星与大观霉素药物组合对S6、M1、M2、M4的作用效果较好，喹诺酮类抗菌药通过与细菌的DNA促旋酶或拓扑异构酶IV结合，诱导DNA促旋酶和拓扑异构酶IV发生构型改变,进而导致DNA降解及菌体死亡。氨基糖苷类抗生素主要与30S核糖体16SrRNA的A部位结合以造成蛋白质的错译，使异常的细胞质膜蛋白破坏细胞质膜完整性，从而起到杀菌作用。喹诺酮类抗菌药物与氨基糖苷类抗生素的抗菌作用机制不相同，联合使用后可能从不同的环节对MG发挥作用。由于大观霉素可以破坏胞膜，所以可以使更多的达氟沙星与大观霉素进入胞内进行作用，从而使杀菌作用变得更好；因此使用达氟沙星和大观霉素在防治鸡毒支原体时不仅具有相加的治疗效果，而且在防治普通鸡毒支原体感染时还可以减少普通鸡毒支原体的耐药性，且对已经形成耐药性的耐达氟沙星鸡毒支原体突变株M1、M2和M4具有联合相加的作用，克服了鸡毒支原体对达氟沙星的耐药性，能够防治耐达氟沙星鸡毒支原体的感染。

表3两药联用时的MIC值

表4达氟沙星联合泰乐菌素的体外抑菌试验结果

表5达氟沙星联合大观霉素的体外抑菌试验结果

表6达氟沙星联合林可霉素的体外抑菌试验结果

表7达氟沙星联合泰妙菌素的体外抑菌试验结果

表8达氟沙星联合替米考星的体外抑菌试验结果

表9达氟沙星联合多西环素的体外抑菌试验结果

Claims (5)

1.一种联合药物，其特征在于，包括：达氟沙星和大观霉素；所述达氟沙星和大观霉素的添加的浓度比例为3:（5-80）。

2.如权利要求1中所述的联合药物在制备防治鸡毒支原体感染药物中的应用；所述鸡毒支原体为耐达氟沙星鸡毒支原体。

3.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于，所述耐达氟沙星鸡毒支原体的突变株为M1。

4.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于，所述耐达氟沙星鸡毒支原体的突变株为M2。

5.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于，所述耐达氟沙星鸡毒支原体的突变株为M4。