CN112041339A - 用于治疗自身免疫病的抗ifnar1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的抗体或其片段。在各实例中，所述抗体或其片段包括本发明公开的VH和VL的CDR或其变体。本发明还提供了使用所述抗体或其片段治疗自身免疫病和紊乱的方法。

Description

用于治疗自身免疫病的抗IFNAR1抗体
本申请要求申请日为2018年9月18日的专利申请PCT/CN/2018/106157的优先权。本申请引用上述专利申请的全文。
背景
系统性红斑狼疮(SLE)，也简称为狼疮，是一种自身免疫病，其中人体的免疫系统错误地攻击身体许多部位的健康组织。常见症状包括关节疼痛和肿胀、发烧、胸痛、脱发、口腔溃疡、淋巴结肿大、疲倦感以及红疹(最常见于脸)。通常情况下，该疾病有若干段爆发期，而缓和期几乎没有症状。
SLE的原因尚不清楚。该机制涉及自身抗体针对人自身组织的免疫反应。这些是最常见的抗核抗体，会导致炎症。SLE无法治愈，治疗方法可能包括NSAID、皮质类固醇、免疫抑制剂、羟氯喹和甲氨蝶呤。SLE显著增加了心血管疾病的风险，这是该疾病最常见的死亡原因。
I型IFN，特别是IFN-α和IFN-β，因其在SLE和其他自身免疫病和炎性综合征的发病机理中的作用而受到关注。这些多效性细胞因子通过共同受体(IFNAR)发出信号，几乎能影响先天和获得性免疫应答的各个方面，包括MHC和共刺激分子的上调以及抗原呈递细胞产生B细胞存活因子(BAFF，增殖诱导配体(April))，最终导致自身反应性T细胞和B细胞的参与和扩增。在无菌条件下通过自身核酸与胞内Toll样受体(TLRs)的结合诱导产生的I型IFN与狼疮发病机制有特别的相关性。利用针对多种IFN-α和单一IFN-β或它们共同受体的封闭剂开发治疗方法引起了人们广泛的兴趣。
概要
本公开提供了一种对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的抗体或其片段，以及对IFNAR1和另一种抗原例如BAFF具有特异性的双特异性抗体。这些抗体和片段可用于治疗自身免疫病，例如系统性红斑狼疮。
本公开的一个实施例提供了一种对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下列组成的群组：(a)HCDR1：DYYMH(SEQ ID NO:77)，HCDR2：RIDPEDGETKYAPKFQG(SEQ ID NO:78)或RIDPEDAETKYAPKFQG(SEQ ID NO:79)，HCDR3：GGNFYVMDY(SEQ ID NO:80)，LCDR1：KASQNVGTNVV(SEQ ID NO:81)，LCDR2：SASYRVS(SEQ ID NO:82)和LCDR3：QQKNNYPYT(SEQ IDNO:83)；和(b)HCDR1：DYYIH(SEQ ID NO:92)，HCDR2：RIDPEDGETKYAPKFQG(SEQ ID NO:93)或RIDPEDAETKYAPKFQG(SEQ ID NO:94)，HCDR3：YHGYWALDY(SEQ ID NO:95)，LCDR1：KTSQNVGTNVA(SEQ ID NO:96)，LCDR2：STSYRYS(SEQ ID NO:97)和LCDR3：HQYFSYPYT(SEQ IDNO:98)。
在一些实施方案中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为HCDR1：DYYMH(SEQ ID NO:77)，HCDR2：RIDPEDAETKYAPKFQG(SEQ ID NO:79)，HCDR3：GGNFYVMDY(SEQID NO:80)，LCDR1：KASQNVGTNVV(SEQ ID NO:81)，LCDR2：SASYRVS(SEQ ID NO:82)和LCDR3：QQKNNYPYT(SEQ ID NO:83)。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含选自由如SEQ ID NO:7和84-87(如SEQ ID NO:85)所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列，或与选自由如SEQ ID NO:7和84-87(如SEQ ID NO:85)所示的氨基酸序列组成的群组中的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由如SEQ ID NO:8和88-91(如SEQ ID NO:88)所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列，或与选自由如SEQ ID NO:8和88-91(如SEQ ID NO:88)所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。如本文所述，重链可变区和轻链可变区包括如上所述的CDR区。
在一些实施方案中，所述的抗体或其片段包含含有如SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的重链可变区和含有如SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为HCDR1：DYYIH(SEQ ID NO:92)，HCDR2：RIDPEDAETKYAPKFQG(SEQ ID NO:94)，HCDR3：YHGYWALDY(SEQID NO:95)，LCDR1：KTSQNVGTNVA(SEQ ID NO:96)，LCDR2：STSYRYS(SEQ ID NO:97)和LCDR3：HQYFSYPYT(SEQ ID NO:98)。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含选自如SEQ ID NO:73和99-102(如SEQ ID NO:100)所示的氨基酸序列组成的群组，或与如SEQID NO:73和99-102(如SEQ ID NO:100)所示的氨基酸序列组成的群组具有至少90％序列同一性的肽。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由如SEQ ID NO:74和103-106(如SEQ ID NO:105)所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列，或与选自由如SEQ ID NO:74和103-106(如SEQ ID NO:105)所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或其片段包含含有如SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的重链可变区和含有如SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的轻链可变区。
另一些实施方案提供了一种对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段可以结合IFN-α1蛋白中选自由H273、L274、Y275、K276和K278组成的群组中的一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段可以与选自所述群组中的至少两个氨基酸残基结合，如K276和K278。在一些实施方案中，所述抗体或其片段可以与选自所述群组中的至少三个氨基酸残基结合，如H273、K276和K278；L274、K276和K278；Y275、K276和K278；或Y275、K276和K278。在一些实施方案中，所述抗体或其片段可以与选自所述群组中的至少四个、五个或全部氨基酸残基结合。
本公开还提供了一种双功能分子，其包含对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的第一抗原结合部分和对第二蛋白具有特异性的第二部分，其中所述第一抗原结合部分包含如本公开所述抗体的片段。
在一些实施方案中，所述第二部分包含醋酸依屈肽(hCDR1)或TACI-Ig。在一些实施方案中，所述第二部分为对选自由BAFF、CD20、CD22、CTLA4、IL6、CXCL13和C5组成的群组中的蛋白质具有特异性的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第二部分为对人B细胞激活因子(BAFF)蛋白具有特异性的抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述双功能分子具有包含与两个单链可变片段(scFv)或两个Fab片段融合的完整抗体的形式。在一些实施方案中，所述第二部分包含贝利木单抗(Belimumab)的抗原结合片段。
还提供了本公开所述抗体和片段的用途和方法。例如，本公开所述抗体和片段可被用于在有需要的患者中抑制免疫应答或治疗自身免疫病或紊乱。
在一些实施方案中，所述自身免疫病或紊乱选自由1型糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣/银屑病关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮(狼疮)、炎症性肠病、艾迪生氏病(Addison’s disease)、格雷夫斯氏病(Graves’disease)、口干综合征(
Figure BDA0002742802080000031
syndrome)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、重症肌无力、血管炎、恶性贫血和乳糜泻组成的群组。在一些实施方案中，所述自身免疫病或紊乱为系统性红斑狼疮。
附图说明
图1A-B显示8G11H和485G10H抗体有效地阻断了IFNα2b诱导的报告基因的表达，其效力与相应的嵌合抗体相当。
图2A-B显示8G11H和485G10H抗体剂量依赖性地逆转了IFNα2b介导的Daudi细胞增殖的抑制。
图3显示8G11H和485G10H通过正常PBMC培养，剂量依赖性地抑制了重组IFNα2b诱导的IP-10分泌。
图4显示了如分化的细胞表面标志物CD38和CD86表达的显著降低所证实的，8G11H和485G10H抗体有效地抑制了树突状细胞的体外分化。
图5显示了如CD4+T细胞减少IFN-γ的产生所证实的，8G11H和485G10H抗体有效地抑制了树突状细胞的体外分化，从而导致分化的细胞介导MLR中应答受损。
图6显示了人源化单克隆抗体8G11H和485G10H在体外系统中显著抑制了SLE血浆介导的树突细胞发育。
图7描绘了抗IFNAR/BAFF双特异性抗体(Bi-BFINR)四种设计形式的示意图。
图8显示了双特异性抗体在结合IFNAR-1方面表现出与8G11抗体相似的活性，而在与BAFF结合方面表现出与贝利木单抗相当的活性。
图9A-B显示Bi-BFINF抗体在阻断IFNα2b信号传导方面具有与嵌合8G11相当的活性(A)；Bi-BFINF抗体在阻断BAFF诱导的B细胞增殖方面表现出更好的活性(B)。
图10A显示了在2只食蟹猴中485G10H1L3的时间-浓度曲线。
图10B显示了在2只食蟹猴中8G11H2L1的时间-浓度分布。
图11A显示了在24h、48h和72h给药后，流式细胞术(FACs)检测的CD11C、CD38、CD86、MHC I、MHC II和IFN-αR1表达。
图11B显示了给药后24h、48h和72h猴的新蝶呤、beta-2-微球蛋白和CRP的血清水平。
图11C显示了给药后24h、48h和72h在猴PBMC中I型IFN诱导的基因标记的表达水平。
发明详述
定义
应当注意的是，术语“一种”或“一个”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体。因此，术语“一种”(“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
在本发明中，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。该实例包括但不限于重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区(FR)或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分。
在本发明中，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗体片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物以起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区并引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。鉴于本公开的内容，本领域普通技术人员容易想到这些种类和同种型中的每一种改变形式，因此都在本发明公开的保护范围内。所有的免疫球蛋白种类都显然在本发明公开的保护范围内，后面的讨论通常针对免疫球蛋白分子的IgG种类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链典型地通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”口开始并延续通过可变区包围重链。
本发明公开的抗体、抗原结合多肽、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性，全人源、人源化、灵长类化，或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)，包含VK或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如本发明公开的LIGHT抗体的抗Id抗体)。本发明公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或者亚类。
轻链可以分为kappa或lambda(κ、λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。
轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能被使用。就这点而言，应理解，轻链(VK)和重链(VH)部分的可变区决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CK)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CK结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
如上所述，可变区使得抗体能够选择性识别和特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VK结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集结合形成了限定三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由VH和VK链中各自的三个CDR定义(即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。在某些情况下，例如某些来源于骆驼科动物的免疫球蛋白分子或基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，没有轻链。例如参见Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)。
在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是特异性地定位以形成抗原结合结构域的短的、非连续的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“框架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。框架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。特定位置的CDR形成的抗原结合域界定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以容易地鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸，因为其已经被精确定义(参见"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)和Chothiaand Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))。
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“CDR”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services，“Sequences ofProteins of Immunological Interest"(1983)和Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过引用全部并入本文。根据Kabat和Chothia定义的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR都在本发明所定义和使用的术语的范围内。包含以上引用的每个参考文献所定义的CDR的适量的氨基酸残基在下表中被列出进行比较。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可以常规地根据抗体的可变区氨基酸序列确定出哪些残基包含特定的CDR。
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、豚鼠源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。
在本发明中，术语“重链恒定区”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或变体或片段中的至少一种。例如，本发明公开的抗原结合多肽可以包括含有CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、至少一部分铰链区以及CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域以及至少一部分铰链区以及CH3结构域的多肽链；或包含CH1结构域、至少一部分铰链区以及CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施方案中，本发明公开的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。此外，本发明中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如全部或部分CH2结构域)。如上所述，本领域普通技术人员应当理解，重链恒定区可以被修饰从而使得它们在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
在本发明中，抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。
在本发明中，术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。
“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
如上所述，各种免疫球蛋白种类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。在本发明中，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。CH1结构域与VH结构域相邻，并且是免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。
在本发明中，术语“CH2结构域”包括使用常规编号方案时，从抗体的约第244个残基延伸至第360个残基的部分重链分子(第244至360个残基，Kabat编号系统；第231～340个残基，EU编号系统；参见Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983))。CH2结构域是独特的，因为该结构域不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入两个N-连接的分支碳水化合物链。还充分记载了CH3结构域从CH2结构域开始延伸到IgG分子的C-末端，大约包含108个残基。
在本发明中，术语“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的部分重链分子。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Roux et al.,J.Immunol161:4083(1998))。
在本发明中，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸包含可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接的硫醇基团。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CK区通过二硫键连接，两条重链通过两个二硫键在Kabat编号系统中对应的位置239和242(位置226或229，EU编号系统)处相连接。
在本发明中，术语“嵌合抗体”被认为是指其免疫反应性区域或位点从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(在本发明中可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施方案中，靶结合区或位点来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区是人源。
“特异性结合”或“对……具有特异性，”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间具有互补性。根据这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域与该表位结合时比它结合到随机的、不相关的表位更容易，其被称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本发明中用于限定特定抗体与特定表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”比抗体“B”对特定表位具有更高的特异性，或者可以认为抗体“A”以比结合相关表位“D”更高的特异性结合表位“C”。
在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不良的生理改变或紊乱，例如癌症的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”通常指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家养动物、农场动物和动物园、运动或宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
在本发明中，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”等短语包括从施用本发明公开的抗体或组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的受试者，例如哺乳动物受试者。
抗IFNAR1抗体
本公开提供了一种对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有结合特异性的抗体，包括双特异性抗体和抗体片段。如实验实例所示，本公开得到了许多对人IFNAR1蛋白具有高结合亲和力的鼠抗人IFNAR1抗体。其中两个鼠源抗体克隆8G11和485G10被选用进行进一步的人源化和表征。人源化抗体剂量依赖性地逆转了IFNα2b介导的Daudi细胞增殖抑制作用，IFNα2b诱导了抗病毒功能并有效地抑制了多种I型IFN在pM水平引发的细胞信号。上述IFN包括IFNα1、IFNα2a、IFNα4、IFNα5、IFNα6、IFNα7、IFNα8、IFNα10、IFNα14、IFNα16、IFNα17和IFNα21。
其他功能研究表明，这些抗体有效抑制了IFNα2b诱导人PBMC对IP-10的分泌，并抑制了IFNα2b依赖性或SLE血浆介导的树突状细胞发育(如细胞表面标志物CD38和CD86表达的减少所证明)，以及减少了MLR系统中CD4+T细胞产生的IFN-γ。
本公开还制备了多种形式的抗IFNAR1/抗BAFF双特异性抗体，并测试了它们的结合能力和生物学功能。这些双特异性抗体在阻断IFNα2b信号传导方面表现出与单特异性8G11相当的结合活性，甚至在阻断BAFF诱导的B细胞增殖方面表现出更高的活性。
本公开的一个实施方案提供了一种抗体及其片段，其包括在实验实施例中制备抗体的具有CDR区的重链可变区和轻链可变域。所述CDR汇总在下表A中。
表A.CDR序列
Figure BDA0002742802080000101
Figure BDA0002742802080000111
Figure BDA0002742802080000121
Figure BDA0002742802080000131
Figure BDA0002742802080000141
在一些实施方案中，所述VH CDR1、CDR2和CDR3选如自表A中所示的任何一组VHCDR1、CDR2和CDR3，并且VL CDR1、CDR2和CDR3选自如表A所示的任何一组VL CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3选自来自实施例中相同抗体的那些。
在一些实施例中，上述的VH CDR1、CDR2和CDR3以及上述VL CDR1、CDR2和CDR3中的至少一个、两个、或三个、四个、五个或六个，被一个、两个或三个氨基酸的添加、缺失、取代或其组合修饰。
在一些实施例中，抗IFNAR1抗体或其片段包括以下CDR：HCDR1：DYYMH(SEQ ID NO:77)，HCDR2：RIDPEDGETKYAPKFQG(SEQ ID NO:78)，HCDR3：GGNFYVMDY(SEQ ID NO:80)，LCDR1：KASQNVGTNVV(SEQ ID NO:81)，LCDR2：SASYRVS(SEQ ID NO:82)和LCDR3：QQKNNYPYT(SEQ ID NO:83)。
在一个实施方案中，CDR中的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸取代以避免翻译后修饰。抗IFNAR1抗体或其片段例子包括以下CDR：HCDR1：DYYMH(SEQ ID NO:77)，HCDR2：RIDPEDAETKYAPKFQG(SEQ ID NO:79)，HCDR3：GGNFYVMDY(SEQ ID NO:80)，LCDR1：KASQNVGTNVV(SEQ ID NO:81)，LCDR2：SASYRVS(SEQ ID NO:82)和LCDR3：QQKNNYPYT(SEQ IDNO:83)。
在一些实施方案中，抗体是人源化的，但在重链上具有以下一个或多个以下回复突变：12V、20L、24G、38K、48I、68A、70I、72A、79A和81L(按照Kabat编号)及其组合。在一些实施方案中，抗体是人源化的，但在轻链上具有以下一个或多个回复突变：4M、13T、21V、43S、46V、74I、78V和87F(按照Kabat编号)及其组合。
重链可变区的非限制性实例包括SEQ ID NO:7和84-87。轻链可变区的非限制性实例包括SEQ ID NO:8和88-91。
在一些实施方案中，重链可变区包括SEQ ID NO:85。在一些实施方案中，轻链可变区包括SEQ ID NO:88。
在一个实施方案中，抗IFNAR1抗体或其片段包括以下CDR：HCDR1：DYYIH(SEQ IDNO:92)，HCDR2：RIDPEDGETKYAPKFQG(SEQ ID NO:93)，HCDR3：YHGYWALDY(SEQ ID NO:95)，LCDR1：KTSQNVGTNVA(SEQ ID NO:96)，LCDR2：STSYRYS(SEQ ID NO:97)和LCDR3：HQYFSYPYT(SEQ ID NO:C6)。
在一个实施方案中，抗IFNAR1抗体或其片段包括以下CDR：HCDR1：DYYIH(SEQ IDNO:92)，HCDR2：RIDPEDAETKYAPKFQG(SEQ ID NO:94)，HCDR3：YHGYWALDY(SEQ ID NO:95)，LCDR1：KTSQNVGTNVA(SEQ ID NO:96)，LCDR2：STSYRYS(SEQ ID NO:97)和LCDR3：HQYFSYPYT(SEQ ID NO:C6)。
在一些实施方案中，所述抗体为人源化的，但在重链上具有以下一个或多个以下回复突变：20L、24G、38K、48I、68A、70I、72A、81L和97G(按照Kabat编号)及其组合。在一些实施方案中，所述抗体为人源化的，但在轻链上具有以下一个或多个以下回复突变：13T、21V、36Y、46P、78V和104L(按照Kabat编号)及其组合。
重链可变区的非限制性实例包括SEQ ID NO:73和99-102。轻链可变区的非限制性实例包括SEQ ID NO:74和103-106。
在一些实施方案中，重链可变区包括SEQ ID NO:100。在一些实施方案中，轻链可变区包括SEQ ID NO:105。
一个有趣的发现是，目前制备的抗体靶向与已知的抗IFNAR1抗体阿尼福鲁单抗(Anifrolumab)不同的表位。因此，一个实施方案提供了对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段可以结合一个或多个选自由以下氨基酸残基组成的群组：IFNAR1蛋白的H273、L274、Y275、K276和K278的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或片段可以结合这些表位残基中的至少两个，方案如H273和L274、H273和Y275、H273和K276、H273和K278、L274和Y275、L274和K276、L274和K278、Y275和K276、Y275和K278或K276和K278。
在一些实施方案中，所述抗体或片段可以结合这些表位残基中的至少两个，方案如H273、L274和Y275；H273、L274和K276；H273、L274和K278；H273、Y275和K276；H273、Y275和K278；H273、K276和K278；L274、Y275和K276；L274、Y275和K278；L274、K276和K278；和Y275、K276和K278。
在一些实施方案中，所述抗体或片段可以结合这些表位残基中的至少四个，方案如L274、Y275、K276和K278；H273、Y275、K276和K278；H273、L274、K276和K278；H273、L274、Y275和K278；和H273、L274、Y275和K276。
在一些实施方案中，所述抗体或片段可以结合所有这些表位残基。
本公开的CDR、重链可变区和轻链可变区可以被进一步修饰。在一些实施方案中，修饰的重链可变区或轻链可变区保留至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性并且仍然能够结合IFNAR1。
在一些实施方案中，所述修饰是在各个CDR中的至多一个热点位置处进行取代。在一些实施方案中，所述修饰是在一个、两个或三个这样的热点位置处进行取代。在一个实施方案中，所述修饰是在一个热点位置处进行取代。在一些实施方案中，这样的取代是保守取代。
“保守性氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸家族、包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选将免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基取代为来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以用同一个侧链家族成员中顺序和/或组成不同的、结构相似的一串氨基酸进行取代。
下表中提供了保守的氨基酸取代的非限制性实施例，其中相似性得分为0或更高表明了两个氨基酸之间的保守取代。
氨基酸相似性矩阵
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
E -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
T -2 0 0 1 1 3
A -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
P -3 -1 6
G -3 5
C 12
保守氨基酸取代
Figure BDA0002742802080000171
应当理解本领域普通技术人员应当理解，本发明公开的抗体可以被修饰从而使得衍生自天然存在的结合多肽的它们在氨基酸序列上与天然存在的结合多肽不同。例如，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可以相似，例如具有与开始序列一定百分比的同一性，例如可以与开始序列具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
在某些实施方案中，所述抗体包含氨基酸序列或一个或多个通常与抗体不相关的基团。下面更详细地描述了示例性的修饰。例如，本发明公开的抗体可以包含灵活的接头序列，也可以经过修饰添加功能性基团(例如PEG、药物、毒素或标记)。
本发明公开的抗体、变体或其衍生物包括被修饰(即通过任一类型的分子与抗体的共价附接，其不阻止抗体与表位结合)的衍生物。例如，但不限于，抗体可以被修饰，例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连结等。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任何一种，包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，所述抗体可以含有一个或多个非经典氨基酸。
在一些实施方案中，所述抗体可与治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂、药物剂或PEG缀合。
所述抗体可与治疗剂缀合或融合，所述治疗剂可以包含可检测的标记，例如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂(药物或毒素)、超声波增强剂、非放射性标记及其组合，以及本领域已知的其它此类试剂。
双功能分子
可以预期IFNAR1与免疫系统中涉及的另一种蛋白质的结合将是有利的，甚至是协同的。因此，一些实施方案提供了双功能分子，例如具有如本文公开的抗IFNAR1片段和另一抗原结合片段/部分的双特异性抗体。
所述双功能分子的第二部分可以是以下任一项：(1)靶向B细胞，包括靶向B细胞生长和存活因子，例如抗BAFF片段、TACI-Ig；靶向B细胞的表面分子，例如抗CD20和抗CD22抗体片段；(2)靶向共刺激分子，例如CTLA4-Ig和抗CTLA4抗体片段；(3)靶向T细胞，例如依曲肽(hCDR1)；(4)靶向细胞因子和补体，例如抗IL6、抗CXCL13和抗C5抗体片段。
特别地，可以预期IFNAR1和BAFF(B细胞活化因子)通路在治疗自身免疫病和紊乱例如狼疮中能够具有协同作用。本公开测试了多种形式抗IFNAR1/抗BAFF双特异性抗体(如图7中所示)的结合能力和生物学功能。令人惊讶的是，这些双特异性抗体在阻断IFNα2b信号传导方面表现出与单特异性8G11相当的结合活性，甚至在阻断BAFF诱导的B细胞增殖方面表现出更好的活性。
因此，一个实施方案提供了一种双功能分子，其具有对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的第一抗原结合部分和对人类B细胞激活因子(BAFF)蛋白具有特异性的第二抗原结合部分。抗IFNAR1部分可以是本公开任何实施例中的片段。抗BAFF部分可以是来自贝利木单抗的片段(参见，例如Dubey AK,et al.,Journal ofPharmacology&Pharmacotherapeutics.2011；2(4):317-319)。
所述双功能分子可采用如图7所示的形式，例如具有与单链可变片段(scFv)或两个Fab片段融合的完整抗体。本公开还提供了双功能或双特异性分子的其他形式。在一些实施方案中，每个抗IFNAR1和抗BAFF片段独立地选自Fab片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体进一步包括Fc片段。
编码抗体的多聚核苷酸和制备抗体的方法
本公开还提供了编码本公开所述抗体、变体及其衍生物的分离的多聚核苷酸或核酸分子。本公开的多聚核苷酸可以编码在相同的多聚核苷酸分子上或在分离的多聚核苷酸分子上的抗原结合多肽、变体或其衍生物的整个重链和轻链可变区。此外，本公开的多聚核苷酸可以编码在相同的多聚核苷酸分子上或在分离的多聚核苷酸分子上的抗原结合多肽、变体或衍生物的部分重链和轻链可变区。
制备抗体的方法是本领域公知的并且在本发明中有所描述。在某些实施方案中，本公开的所述抗原结合多肽的可变区和恒定区都是全人源的。可以使用本领域中公开的技术和本发明所述的技术制备全人源抗体。例如，可以通过将抗原施用于转基因动物中来制备针对特定抗原的全人源抗体，所述转基因动物已经被改良过以响应抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已失去功能。可用于制备这种抗体的示例性技术参见美国专利6,150,584、6,458,592和6,420,140，其全部内容通过引用并入本申请。
治疗和诊断方法
在本发明中，本公开的抗体、变体或衍生物可用于某些治疗和诊断方法中。
本公开还涉及基于抗体的疗法，其涉及将本公开所述的抗体施用于患者例如动物、哺乳动物和人，从而治疗本申请所述的一种或多种紊乱或病症。本公开的治疗性化合物包括但不限于本公开所述抗体(包括本发明所述的变体和其衍生物)和编码本发明所述抗体(包括本发明所述的变体和其衍生物)的核酸或多聚核苷酸。
一个实施方案提供了一种在有需要的患者中抑制免疫应答的方法。所述方法需要向患者施用本公开中的抗体、片段或双功能分子。在一些实施方案中，患者是组织或器官移植接受者。
一些实施方案提供了一种治疗自身免疫病或紊乱的方法。自身免疫病或紊乱的非限制性实例包括1型糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣/银屑病关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮(狼疮)、炎症性肠病、艾迪生氏病、格雷夫斯氏病、口干综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血和乳糜泻。
在特定的实施方案中，所述方法可用于治疗系统性红斑狼疮(狼疮)。
对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定抗体及其变体或衍生物、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。
抗体及其变体的施用方法包括但不限于真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外和口服注射。抗原结合多肽或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明的抗原结合多肽的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。
本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。
施用方式可以是全身施用或局部施用。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管连接到如贮液囊(可以是Ommaya贮液囊)来辅助注射。也可以通过肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及使用雾化的制剂。
可能需要将本发明的抗体多肽或组合物局部施用于需要治疗的区域；可以通过但不限于以下方式：手术期间局部输注，例如与手术后伤口敷料联合的局部应用，通过注射，通过导管，借助栓剂或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。
一些实施方案还提供了检测样品中人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白表达的方法，包括使样品与抗体或其片段接触，并检测指示样品中IFNAR1表达的结合情况。
组合物
本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效剂量的抗体和可接受的载体。在一些实施方案中，组合物还包含第二抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。
在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物，特别是用于人类的药物。此外，“药学上可接受的载体”通常将是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。
术语“载体”是指施用于治疗的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗原结合多肽，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
在一个实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。具有代表性地是，用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
本发明的化合物可以配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括衍生自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的与阴离子形成的盐，以及衍生自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的与阳离子形成的盐。
实施例
实施例1小鼠抗人IFNAR-1单克隆抗体的产生
该实施例展示了利用杂交瘤技术产生抗人IFNAR-1小鼠单克隆抗体。
免疫
用含有人IFNAR-1全部胞外区的重组人IFNAR-1蛋白作为免疫原，产生抗人IFNAR-1抗体。首先用50μg免疫原皮下(s.c.)免疫C57BL/6、Balb/c、SJL小鼠或SD大鼠。然后每两周通过腹膜内(i.p.)或皮下注射一次25μg免疫原进行免疫。利用眶后出血监测免疫反应，血浆用ELISA结合测定法进行筛查。简而言之，将带有His标签的IFNAR-1以0.5μg/ml的量包被过夜，然后用含5％BSA的PBS封闭。
将连续稀释的血清与包被的抗原在室温下孵育1小时。将所得平板用PBS/T洗涤，并在室温下与山羊抗小鼠IgG-HRP一起温育1小时。将板用TMB底物显影，并用分光光度计在OD450-630nm处进行分析。选择具有高滴度抗IFNAR1免疫球蛋白的鼠进行融合和以及进一步的筛选。在处死鼠并取出脾脏的三天前，用25μg抗原对鼠进行最终的腹腔内免疫。取出的脾脏用于融合。
融合和杂交瘤筛查
基于标准方案，将从小鼠分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。用电融合仪将被免疫小鼠脾脏淋巴细胞的单细胞悬液融合到三分之一数量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞。将细胞以约1*10E5/孔的数量接种在平底微量滴定板中，然后在含有1*HAT、10％胎牛血清选择性培养基的DMEM中孵育大约10天。10天后，将细胞在HAT替换为HT的培养基中培养。然后通过ELISA筛选各个孔中的小鼠抗IFNAR-1单克隆IgG抗体。将分泌抗体的杂交瘤更换培养基，并在2天后再次筛选。如果抗IFNAR-1抗体呈阳性，则通过有限稀释将杂交瘤亚克隆两次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体，并利用各种功能测定法进一步表征。
选择在IFN反应性报告基因测定中具有强阻断能力的克隆进行亚克隆。2轮亚克隆的上清液被用于确认基于ELISA的人和恒河猴IFNAR-1结合以及IFN alpha阻断能力，然后进行测序和进一步分析。经过这些筛选后，得到38个克隆(4A6、4B12、4D8、8G11、12G11、17F9、18B6、18C1、19B6、20B3、20E10、20E12、21D6、24F6、29E12、30B5、30C8、34H8、36E3、39F5、41F1、46A10、47C6、47F5、104A3、106A7、107E12、124D12、260H8、268E9、269A7,293H10、370E5、392D6、402G3、430H6、485G10和487E3)。这些克隆的序列在表1中列出。产生的与这些杂交瘤的人IgG1 Fc融合的嵌合抗体被用于进一步表征。
表1筛选得到的抗体序列
Figure BDA0002742802080000221
Figure BDA0002742802080000231
Figure BDA0002742802080000241
Figure BDA0002742802080000251
Figure BDA0002742802080000261
Figure BDA0002742802080000271
实施例2抗IFNAR-1小鼠单克隆抗体的结合特性
本实施例通过ELISA测试了抗IFNAR-1小鼠抗体与人IFNAR-1蛋白的结合特性。简而言之，用0.5μg/ml带有His标签的IFNAR-1包被过夜，然后用含5％BSA的PBS进行封闭。将连续稀释的抗IFNAR-1抗体与包被的抗原在室温下孵育1小时。将所得平板用PBS/T洗涤，并在室温下与山羊抗小鼠IgG-HRP一起温育1小时。将平板用TMB底物显影，并用分光光度计在OD 450-630nm处进行分析。ELISA的结果总结在表2中，其显示了与人IFNAR-1蛋白结合的EC50。
表2对hIFNAR-1蛋白结合的EC50(nM)
抗体 EC<sub>50</sub>(nM) 抗体 EC<sub>50</sub>(nM)
4D8 0.067 269A7 0.476
8G11 0.069 293H10 0.097
34H8 0.064 370E5 0.052
104A3 0.056 392D6 0.054
106A7 0.099 402G3 0.137
107E12 0.075 430H6 0.733
124D12 0.062 485G10 0.015
260H8 0.055 487E3 0.028
268E9 0.088
对抗IFNAR-1抗体的BIACORE分析
使用捕获方法，通过Biacore T200检测抗体与重组带His标签的人IFNAR-1-ECD蛋白的结合。使用包被在芯片上的抗人Fc抗体或蛋白A捕获抗IFNAR-1抗体。将连续浓度的带有His标签的人IFNAR-1-ECD蛋白(0-8nM)以30μl/min的流速注入捕获抗体上。解离阶段时长为600s或1200s。结果显示在下表3中。抗IFNAR-1抗体的Biacore分析结果表明，这些抗IFNAR-1抗体对人IFNAR-1具有高的结合亲和力。
表3.抗体与重组IFNAR-1蛋白的结合
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
4D8 2.31E+06 9.03E-05 3.90E-11
8G11 2.36E+06 6.40E-05 2.71E-11
34H8 2.37E+06 4.41E-05 1.86E-11
实施例3.用于筛选抗IFNAR-1小鼠单克隆抗体的IFN反应性报告基因测定
HEK-BlueTM IFNα/β细胞(InvivoGen)是专门设计用于监测由I型IFN诱导的JAK-STAT通路激活。经IFN-α或IFN-β刺激后，这些细胞会激活JAK-STAT通路，随后激活被称为分泌性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的报告基因的表达。通过使用SEAP检测试剂QUANTI-BlueTM(InvivoGen)可以轻松检测上清液中分泌的SEAP。中和抗体通过阻断干扰素与其受体结合来抑制IFN诱导的报告基因表达。该报告基因测定被用于筛选抗IFNAR-1小鼠单克隆抗体。
在抗IFNAR-1小鼠单克隆抗体连续稀释液的存在下，将HEK-BlueTM IFNα/β细胞与400U/ml IFNα2b孵育过夜。通过使用分光光度计在650nm处测定报告基因SEAP的表达。表4中列出了所测试抗体的EC50。在这些抗体中，4D8、8G11、34H8、485G10和487E3抗体在阻断IFNα2b信号方面表现出优异的效果。通过对序列同源性的分析，8G11和485G10的克隆被选中进行进一步的人源化和表征。
表4.对抗体的报告基因测定
克隆ID EC<sub>50</sub>(nM) 克隆ID EC<sub>50</sub>(nM)
4D8 0.460 286E9 3.871
8G11 0.465 293H10 1.285
34H8 0.560 370E5 2.170
104A3 1.310 392D6 0.824
106A7 3.516 402G3 1.267
107E12 1.207 430H6 1.297
124D12 0.981 485G10 0.286
260H8 5.074 487E3 0.161
269A7 6.713
实施例4.抗IFNAR-1mAb的人源化
A.8G11
小鼠抗体8G11可变区基因被用于产生人源化的MAb。在此过程的第一步中，将8G11的VH和VK氨基酸序列与现有的人Ig基因序列数据库进行比较，以鉴定总体上最匹配的人种系Ig基因序列。对于重链，最接近的人类基因匹配是IGHV1-46*01基因。对于轻链，最佳的人类基因匹配是IGKV1-9*01基因。
随后设计人源化可变结构域序列，其中将8G11 VH的CDR1(SEQ ID NO:77)、2(SEQID NO:78)和3(SEQ ID NO:80)序列移植到IGHV1-46*01基因的框架序列，同时将8G11轻链的CDR1(SEQ ID NO:81)、2(SEQ ID NO:82)和3(SEQ ID NO:83)移植到IGKV1-9*01基因的框架序列。然后生成3D模型，以确定是否存在任何构架位点，在该位点中将小鼠氨基酸替换为人氨基酸会影响结合和/或CDR构象。
在重链中，鉴定出人框架中的K12、V20、A24、R38、M48、V68、M70、R72、V79和M81(Kabat编号)，并将其回复突变为对应的鼠源氨基酸，即：K12V、V20L、A24G、R38K、M48I、V68A、M70I、R72A、V79A和M81L。在轻链中鉴定出人框架中的L4、A13、I21、A43、L46、T74、L78和Y87(Kabat编号)，并将其回复突变为对应的鼠源氨基酸，即：L4M、A13T、I21V、A43S、L46V、T74I、L78V和Y87F。同时，采用G56A突变去除PTM。
表5.8G11序列和CDR
Figure BDA0002742802080000291
人源化序列在表6中列出：8G11-VH1、8G11-VH2、8G11-VH3、8G11-VH4、8G11-VL1、8G11-VL2、8G11-VL3和8G11-VL4。
表6.人源化序列
Figure BDA0002742802080000301
所有16种IgG均在HEK293细胞系中表达。表达抗体以进行亲和力排名。表7总结了亲和力排名的详细数据。
表7.人源化抗体的亲和力排名。
Figure BDA0002742802080000302
Figure BDA0002742802080000311
基于亲和力排序结果，表达并纯化了4种IgG(VH4+VL3、VH2+VL2、VH2+VL1、VH1+VL1)。纯化的抗体经进一步选择以在不同浓度下进行亲和力测量。表8汇总了详细数据。
表8.所选人源化抗体的亲和力。
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
8G11-H4L3 3.40E+05 7.47E-05 2.20E-10
8G11-H2L2 2.98E+05 1.25E-04 4.19E-10
8G11-H2L1 2.29E+05 9.24E-05 4.03E-10
8G11-H1L1 1.61E+05 2.19E-04 1.36E-09
B.485G10
小鼠抗体485G10的可变区基因被用于产生人源化的MAb。在此过程的第一步中，将485G10的VH和VK氨基酸序列与现有的人Ig基因序列数据库进行比较，以鉴定总体上最匹配的人种系Ig基因序列。对于重链，最接近的人类基因匹配是IGHV1-2*05基因。对于轻链，最佳的人类基因匹配是IGKV1-16*01基因。
随后设计人源化可变区序列，其中将485G10重链的CDR1(SEQ ID NO:92)、2(SEQID NO:93)和3(SEQ ID NO:95)序列移植到IGHV1-2*05基因的框架序列，同时将485G10轻链的CDR1(SEQ ID NO:96)，2(SEQ ID NO:C5)和3(SEQ ID NO:98)移植到IGKV1-16*01基因的框架序列。然后生成3D模型，以确定是否存在任何构架位点，在该位点中将小鼠氨基酸替换为人氨基酸会影响结合和/或CDR构象。在重链中，鉴定出人框架中的V20、A24、R38、M48、V68、M70、R72、M81和A97(K abat编号)，并将其回复突变为对应的鼠源氨基酸，即：V20L、A24G、R38K、M48I、V68A、M70I、R72A、M81L和A97G。在轻链中，鉴定出人框架中的A13、I21、F36、S46、L78和V104(Kabat编号)，并将其回复突变为对应的鼠源氨基酸，即：A13T、I21V、F36Y、S46P、L78V和V104L。同时，采用G56A突变去除PTM。
表9.485G10序列和CDR
Figure BDA0002742802080000312
Figure BDA0002742802080000321
人源化序列在表10中列出：485G10-VH0、485G10-VH1、485G10-VH2、485G10-V H3、485G10-VL1、485G10-VL2、485G10-VL3和485G10-VL4。
表10.人源化序列
Figure BDA0002742802080000322
所有16种IgG均可以在HEK293细胞系中表达。表达抗体以进行亲和力排名。表11汇总了亲和力排名的详细数据。
表11.人源化抗体的亲和力排名。
Figure BDA0002742802080000323
Figure BDA0002742802080000331
基于亲和力排序结果，表达并纯化了4种IgG(VH1+VL2、VH1+VL4、VH1+VL3、VH2+VL3)。纯化的抗体经进一步选择以在不同浓度下进行亲和力测量。表12汇总了详细数据。
表12.所选人源化抗体的亲和力。
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
485G10-H1L2 2.07E+05 3.21E-04 1.55E-09
485G10-H1L4 1.96E+05 2.59E-04 1.32E-09
485G10-H1L3 1.87E+05 2.32E-04 1.24E-09
485G10-H2L3 1.86E+05 3.66E-04 1.96E-09
实施例5.抗IFNAR-1人源化单克隆抗体在IFN反应性报告基因测定中抑制干扰素α2b的生物活性
为了评估人源化抗体的IFNAR-1阻断功能，使用了实施例3中所述的体外IFN反应性报告基因测定法。在抗IFNAR-1人源化克隆抗体连续稀释液的存在下，将HEK-BlueTM IFNα/β细胞与400U/ml IFNα2b孵育过夜，然后使用分光光度计在650nM处进行测定。如图1所示，8G11H和485G10H抗体有效地阻断了IFNα2b诱导的报告基因的表达。它们的效力与相应的嵌合抗体相当。
实施例6.抗IFNAR-1人源化单克隆抗体抑制Daudi细胞增殖中干扰素α2b的生物活性
源自人B淋巴母细胞伯基特氏淋巴瘤的Daudi细胞系表达高水平的IFNAR，这些细胞的生长受到I型干扰素的抑制。为了测量人源化抗IFNAR-1抗体的功能阻断能力，在存在或不存在连续稀释的抗IFNAR-1人源化抗体的情况下，将Daudi细胞与干扰素α2b一起培养。用细胞计数试剂盒8(CCK8，DOJINDO Laboratories)测量细胞增殖。如图2所示，8G11H和485G10H抗体剂量依赖地逆转了IFNα2b介导的对Daudi细胞增殖的抑制。它们的效力与相应嵌合抗体相当。
实施例7.抗IFNAR-1人单克隆抗体抑制多种I型IFN的生物学活性
为了评估人源化抗IFNAR-1抗体抑制多种I型IFN生物学活性的能力，在IFN反应性报告基因测定中测试了不同的IFN alpha亚型。将HEK-BlueTM IFN-α/β细胞在存在连续稀释的被测抗体或同种型对照时与以下IFNα亚型之一一起孵育：1、2a、4、5、6、7、8、10、14、16、17和21。如实施例3所述的方式确定报告信号。如表13所示，8G11H和485G10H抗体可有效抑制多种I型IFN引发的细胞信号。它们的EC50处于pM级别。
表13.多种I型IFN的报告基因检测
Figure BDA0002742802080000341
实施例8.抗IFNAR-1人单克隆抗体抑制I型IFN介导的抗病毒功能
首先通过I型IFN独特的抗病毒功能对其进行鉴定。为了评估抗IFNAR-1抗体对I型IFN介导的抗病毒功能的阻断作用，建立了基于IFNα2b的抗病毒测定方法。简而言之，对Huh7细胞系进行了基因工程改造，使其包含与萤火虫荧光素酶报告基因相连的全长HCV 1b基因型复制子(Con1b)。报告基因的丰度与HCV复制子的复制水平密切相关。抗IFNAR-1抗体在阻断IFNα2b诱导的抗病毒功能中的活性可以通过经IFNα2b处理的Huh7-Con1b细胞中的报告基因水平恢复情况来确定。
在存在或不存在连续稀释的抗IFNAR-1人源化单克隆抗体的情况下，将Huh7-Con1b细胞与400U/ml IFNα2b一起培养48小时。通过添加Britelite plus试剂测量萤火虫荧光素酶报告基因的表达，并进一步使用分光光度计进行测定。如表14所示，抗IFNAR-1人源化单克隆抗体8G11H和485G10H有效抑制了IFNα2b诱导的抗病毒功能，它们的EC50与相应的嵌合抗体相当。
表14.IFNα2b介导的抗病毒测定
克隆ID EC<sub>50</sub>(nM)
8G11-嵌合 7.733
8G11H 8.067
485G10-嵌合 16.267
485G10H 13.867
实施例9.抗IFNAR-1人源化单克隆抗体对I型IFN诱导的IP-10分泌的抑制
在I型IFN刺激后，常规外周血单核细胞(PBMC)表达一系列包括IP-10在内的IFN应答基因。本公开测试了抗-IFNAR-1抗体活性对IFNα2b诱导的常规PBMC分泌IP-10的抑制作用。
在存在或不存在抗IFNAR-1人源化单克隆抗体的情况下，将PBMC与400U/ml IFNα2b孵育48小时。收集上清液，并根据生产商的建议使用定量LANCE试剂盒(Cisbio)分析IP-10浓度。如图3所示，抗IFNAR-1人源化单克隆抗体8G11H和485G10H剂量依赖性地抑制了常规重组IFNa2b诱导的PBMC对IP-10的分泌。
实施例10.抗IFNAR-1人源化单克隆抗体对I型IFN诱导的树突状细胞发育的抑制
众所周知I型IFN诱导树突状细胞的发育和成熟，具体表现为特定细胞表面标志物如CD38、CD80和CD86等的表达以及刺激幼稚同种异体CD4+T细胞增殖的能力(混合淋巴细胞反应，MLR)。为了评估抗IFNAR-1抗体在树突状细胞分化中阻断I型IFN信号传导的功能，建立了IFNα2b介导的树突状细胞分化测定试验。在存在或不存在抗IFNAR-1人源化单克隆抗体的情况下，将从人PBMC中分离出的单核细胞与20ng/ml GMCSF和400U/ml IFNα2b培养72小时。收集单核细胞衍生的树突状细胞，并将其与人类幼稚同种异体CD4+T细胞以1:5的比例进一步培养5天。通过ELISA测定分析培养后上清液中反映CD4+T细胞增殖状态的细胞因子IFN-γ的水平。
如图4所示，向分化系统中添加抗IFNAR-1人源化单克隆抗体8G11H或485G10H导致细胞表面标志物CD38和CD86表达的显著降低，以及如CD4+T细胞减少IFN-γ的产生所证实的那样，在MLR中出现明显的受损的反应(图5)。结果表明，抗IFNAR-1人源化单克隆抗体8G11H和485G10H可以有效地阻断IFNα2b对树突状细胞发育的信号传导。
实施例11.抗-IFNAR-1人源化单克隆抗体对SLE血浆介导的树突状细胞发育的抑制
SLE患者血浆诱导树突状细胞发育的能力与疾病活动相关，并依赖于IFNα的作用。此实施例中，通过经抗体处理的树突状细胞刺激幼稚同种异体CD4+T细胞增殖能力(MLR)的受损情况，来测量纯化的人抗IFNAR-1抗体8G11H和485G10H对SLE血浆诱导树突状细胞发育的抑制作用。
在存在或不存在抗IFNAR-1抗体(15μg/ml)的情况下，将从人PBMC分离的单核细胞在含有25％SLE患者血浆的培养基中培养三至五天。然后收集分化的细胞，并与人类幼稚同种异体CD4+T细胞以1:5的比例共同培养5天。通过ELISA分析培养后上清液中反映CD4+T细胞增殖状态的细胞因子IFN-γ的水平。如图6所示，分化细胞刺激MLR的能力受损及CD4+T产生细胞因子IFN-γ的显著降低证实，抗IFNAR-1人源化单克隆抗体8G11H和485G10H显著抑制了IFNα依赖的树突状细胞发育。
实施例12.靶向BAFF和IFNAR-1的双特异性抗体
该实施例测试了某些形式的抗BAFF/抗IFNAR1双特异性抗体是否可以保留对两种抗原的结合亲和力和抑制活性。
双特异性单克隆抗体由贝利木单抗(抗BAFF)和8G11嵌合抗体产生。图7展示了抗IFNAR/BAFF双特异性抗体(Bi-BFINR)四种形式的设计示意图。ELISA法分别检测了Bi-BFINR与人IFNAR-1蛋白和人BAFF蛋白的结合特性。如图8所示，Bi-BFINF的形式1在结合IFNAR-1方面表现出与8G11抗体相似的活性，而在与BAFF结合方面表现出与贝利木单抗相当的活性。此外还通过细胞水平的测定表征Bi-BFINF的生物学功能。用基于IFNα2b的报告基因测定检测抗IFNAR-1臂。如图9A所示，形式1的Bi-BFINF抗体在阻断IFNα2b信号传导方面具有与嵌合8G11相当的活性。用BAFF诱导的B细胞增殖测定检测抗BAFF臂。在存在或不存在Bi-BFINF的情况下，将从Tonsil中分离的B细胞与2μg/ml重组BAFF培养72小时。将Cell-title glo加入培养物中以确定B细胞数。如图9B所示，形式1的Bi-BFINF抗体在阻断BAFF诱导的B细胞增殖中表现出更高的活性。
实施例13.鉴定用于8G11结合的hIFNAR-1的关键氨基酸
为了定位8G11抗体的表位，创建了hIFNAR-1(1aa-409aa)的突变文库(丙氨酸扫描)。通过高通量流式细胞术确定8G11 Fab与丙氨酸扫描文库中的每个突变体克隆的结合，一式两份。对于每个点，从原始数据中减去背景荧光，然后将其标准化为Fab对WT靶蛋白的反应性。对于每个突变体克隆，将平均结合值绘制为表达的函数(通过对照反应性表示)。85288Mab(R&D)和阿尼福鲁单抗被用作对照抗体。为了鉴定首要的关键克隆，对对照MAb或8G11 Fab应用>70％结合的阈值，对实验8G11 Fab应用<30％结合的阈值。
突变的筛选结果列于表15中。克隆H273A不符合设定的阈值，但其降低的结合活性且与关键残基接近表明所述突变的残基可能是抗体表位的一部分。突变后使该克隆与特定抗体的反应性最低的关键残基以粗体突出显示并加下划线。经验证的关键残基代表其侧链对抗体-表位相互作用具有最高能量贡献的氨基酸。因此，突出显示的(粗体和带下划线)残基K276和K278可能是结合的主要能量贡献者。结果示于表16。
表15.鉴定8G11 Fab结合的关键残基。
Figure BDA0002742802080000371
表16.Fab与hIFNAR-1蛋白结合的重要残基。
Figure BDA0002742802080000373
用竞争测定法测试抗体4D8、8G11、4B12、30C8、30B5、34H8和阿尼福鲁单抗(Anifrolumab)是否彼此竞争。结果显示4D8、8G11、4B12、30C8、30B5和34H8相互竞争，但均不与阿尼福鲁单抗竞争结合IFNAR-1。这些数据表明，新鉴定出的抗体均靶向IFNAR-1上的相同表位，但都与阿尼福鲁单抗的表位不同。
实施例14.人源化抗IFNAR1抗体在食蟹猴中的药代动力学
以10mg/kg剂量研究8G11-H2L1和485G10-H1L3在食蟹猴中的初步的药代动力学(PK)。相对于抗体注射的时间点，在0(预服)、5Min、30Min、1h、2h、4h、8h、24hr(1天)、48h(2天)、72hr(3天)、96hr(4天)、120小时(5天)、168小时(7天)、240小时(10天)、36小时(14天)、504小时(21天)、672小时(28天)和840小时(35天)时收集血清样品。使用重组IFNAR1蛋白ECD作为捕获抗原通过通用ELISA法测量抗IFNAR1 mAb的水平。PK参数用基于统计矩理论的WinNonlin 6.3软件计算得到。结果示于表17。
时间-浓度曲线表明8G11-H2L1和485G10-H1L3的PK更符合人们对典型IgG的期望(图10A和10B)，表17.8G11-H2L1和485G10-H1L3在食蟹猴中的PK参数
Figure BDA0002742802080000372
实施例15.人源化抗IFNAR1抗体在食蟹猴中的药效学
使用药效学(PD)模型来研究抗IFNAR1抗体在体内抑制干扰素活性的能力。食蟹猴静脉注射(i.v.)10mg/kg 8G11-H2L1和485G10-H1L3或载体对照，然后肌肉注射(i.m.)IFN-α2b(3*10E6U/Kg)，在给药前、治疗和IFN-α2b注射后的24、72和168小时收集血液用于PD标记物测量。用FACS在总PBMC中检测CD11C、CD38、CD86、MHC I、MHC II和IFN-alpha R1的表达。如图11A所示，8G11-H2L1和485G10-H1L3可在治疗后24h显著降低CD14+细胞HLA-DR的表达。同时，在治疗后24小时和72小时，8G11-H2L1和485G10-H1L3也能够抑制CD14+细胞中IFN-alpha R1的表达。
按照制造商的说明书进行ELISA检测食蟹猴中新蝶呤和β-2-微球蛋白的血清水平。通过血液生化测定外周血中的CRP水平。如图11B所示，载体组中的新蝶呤、β-2微球蛋白和CRP在24小时内迅速增加。与载体对照相比，8G11-H2L1和485G10-H1L3可以在给药后24小时和72小时内显著抑制新蝶呤和β-2微球蛋白。同样，在给药后的24小时，8G11-H2L1和485G10-H1L3能够显著降低CRP的水平。
通过实时PCR检测外周血单核细胞中I型IFN诱导的基因标记的表达水平。如图11C所示，载体组中ISG15、HERC5、IFI27和IFIT3的mRNA水平在24小时内迅速增加。与载体对照相比，8G11-H2L1和485G10-H1L3显著阻断了I型IFN对这些基因的诱导作用。
***
本发明并不受所描述的旨在作为本发明各个方面的单个说明的具体实施例范围的限制，并且在功能上等同的任何组合物或方法均在本发明的保护范围内。对本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，落入本发明所附的权利要求及其等同物范围内的修改和变化均属于本发明保护的范围。
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用全部并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请通过引用被明确地和单独地指示参入本文相同。
SEQUENCE LISTING
<110> 天境生物科技（上海）有限公司
<120> 用于治疗自身免疫病的抗IFNAR1抗体
<130> P20113673CP
<150> PCT/CN2018/106157
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Arg Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Val Pro Lys Phe Leu
1 5 10 15
Asp
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Leu Ala Ser Tyr Arg His Arg
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Asp Trp Gly His Ser Phe Asp Tyr
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Gly
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Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
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Ala
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1 5
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Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Val Ile
1 5

Claims (36)

1.一种对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下列组成的群组：
(a)HCDR1：DYYMH(SEQ ID NO:77)，HCDR2：RIDPEDGETKYAPKFQG(SEQ ID NO:78)或RIDPEDAETKYAPKFQG(SEQ ID NO:79)，HCDR3：GGNFYVMDY(SEQ ID NO:80)，LCDR1：KASQNVGTNVV(SEQ ID NO:81)，LCDR2：SASYRVS(SEQ ID NO:82)和LCDR3：QQKNNYPYT(SEQ IDNO:83)；和
(b)HCDR1：DYYIH(SEQ ID NO:92)，HCDR2：RIDPEDGETKYAPKFQG(SEQ ID NO:93)或RIDPEDAETKYAPKFQG(SEQ ID NO:94)，HCDR3：YHGYWALDY(SEQ ID NO:95)，LCDR1：KTSQNVGTNVA(SEQ ID NO:96)，LCDR2：STSYRYS(SEQ ID NO:97)和LCDR3：HQYFSYPYT(SEQ IDNO:98)。
2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
3.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为HCDR1：DYYMH(SEQ ID NO:77)，HCDR2：RIDPEDAETKYAPKFQG(SEQ IDNO:79)，HCDR3：GGNFYVMDY(SEQ ID NO:80)，LCDR1：KASQNVGTNVV(SEQ ID NO:81)，LCDR2：SASYRVS(SEQ ID NO:82)和LCDR3：QQKNNYPYT(SEQ ID NO:83)。
4.如权利要求3所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段为人源化的，其中所述重链可变区包含一个或多个选自由12V、20L、24G、38K、48I、68A、70I、72A、79A和81L(按照Kabat编号)组成的群组的回复突变及其组合。
5.如权利要求3或4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段为人源化的，其中所述轻链可变区包含一个或多个选自由4M、13T、21V、43S、46V、74I、78V和87F(按照Kabat编号)组成的群组的回复突变及其组合。
6.如权利要求3所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含选自由如SEQ ID NO:7和84-87所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列，或与选自由如SEQ ID NO:7和84-87所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。
7.如权利要求3或6所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由如SEQ ID NO:8和88-91所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列，或与选自由如SEQ ID NO:8和88-91所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。
8.如权利要求3所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。
9.如权利要求3所述的抗体或其片段，其特征在于，所述的抗体或其片段包含含有如SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的重链可变区和含有如SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的轻链可变区。
10.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3为HCDR1：DYYIH(SEQ ID NO:92)，HCDR2：RIDPEDAETKYAPKFQG(SEQ ID NO:94)，HCDR3：YHGYWALDY(SEQ ID NO:95)，LCDR1：KTSQNVGTNVA(SEQ ID NO:96)，LCDR2：STSYRYS(SEQ ID NO:97)和LCDR3：HQYFSYPYT(SEQ ID NO:98)。
11.如权利要求10所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段为人源化的，其中所述重链可变区包含一个或多个选自由20L、24G、38K、48I、68A、70I、72A、81L和97G(按照Kabat编号)组成的群组的回复突变及其组合。
12.如权利要求10或11所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段为人源化的，其中所述轻链可变区包含一个或多个选自由13T、21V、36Y、46P、78V和104L(按照Kabat编号)组成的群组的回复突变及其组合。
13.如权利要求10所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含选自由如SEQ ID NO:73和99-102所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列，或与选自由如SEQ ID NO:73和99-102所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。
14.如权利要求10或13所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由如SEQ ID NO:74和103-106所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列，或与选自由如SEQ ID NO:74和103-106所示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。
15.如权利要求10所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:100所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO:105所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。
16.如权利要求10所述的抗体或其片段，其特征在于，所述的抗体或其片段包含含有如SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的重链可变区和含有如SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的轻链可变区。
17.一种对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；
其中：
HCDR1、HCDR2和HCDR3的集合选自表A或为衍生自表A的CDR集合，所述CDR集合中的一个或多个CDR具有1、2或3个氨基酸的添加、缺失和/或取代，和
LCDR1、LCDR2和LCDR3的集合选自表A或衍生自表A的CDR集合，所述CDR集合中的一个或多个CDR具有1、2或3个氨基酸的添加、缺失和/或取代。
18.一种对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段可以结合IFN-α1蛋白中选自由H273、L274、Y275、K276和K278组成的群组中的一个或多个氨基酸残基。
19.如权利要求18所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以与选自所述群组中的至少两个氨基酸残基结合。
20.如权利要求18所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以与选自所述群组中的至少三个氨基酸残基结合。
21.如权利要求18所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段可以与选自所述群组中的所有五个氨基酸残基结合。
22.一种双功能分子，其包含对人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白具有特异性的第一抗原结合部分和对第二蛋白具有特异性的第二部分，其中所述第一抗原结合部分包含如权利要求1-21中任一项所述抗体的片段。
23.如权利要求22所述的双功能分子，其特征在于，所述第二部分包含醋酸依屈肽(hCDR1)或TACI-Ig。
24.如权利要求22所述的双功能分子，其特征在于，所述第二部分为对选自由BAFF、CD20、CD22、CTLA4、IL6、CXCL13和C5组成的群组的蛋白质具有特异性的抗原结合片段。
25.如权利要求22所述的双功能分子，其特征在于，所述第二部分为对人B细胞激活因子(BAFF)蛋白具有特异性的抗原结合片段。
26.如权利要求25所述的双功能分子，其特征在于，其具有包含与两个单链可变片段(scFv)或两个Fab片段融合的完整抗体的形式。
27.如权利要求25或26所述的双功能分子，其特征在于，所述第二部分包含贝利木单抗的抗原结合片段。
28.一种组合物，其包含如权利要求1-21中任一项所述的抗体或其片段或权利要求22-27中任一项所述的双功能分子，以及药学上可接受的载体。
29.一种分离的细胞，其包含编码如权利要求1-21中任一项所述的抗体或其片段或如权利要求22-27中任一项所述的双功能分子的一种或多种多核苷酸。
30.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-21中任一项所述的抗体或其片段或如权利要求22-27中任一项所述的双功能分子中的一条或多条链。
31.一种在有需要的患者中抑制免疫应答或治疗自身免疫病或紊乱的方法，其包括向所述患者施用如权利要求1-21中任一项所述的抗体或其片段或如权利要求22-27中任一项所述的双功能分子。
32.如权利要求1-21中任一项所述的抗体或其片段或如权利要求22-27中任一项所述的双功能分子在制备用于在有需要的患者中抑制免疫应答或治疗自身免疫病或紊乱的药物中的用途。
33.如权利要求31所述的方法或权利要求32所述的用途，其特征在于，所述的方法或所述的用途用于治疗自身免疫病或紊乱。
34.如权利要求31所述的方法或权利要求32所述的用途，其特征在于，所述自身免疫病或紊乱选自由1型糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣/银屑病关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮(狼疮)、炎症性肠病、艾迪生氏病、格雷夫斯氏病、口干综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血和乳糜泻组成的群组。
35.如权利要求31所述的方法或权利要求32所述的用途，其特征在于，所述自身免疫病或紊乱为系统性红斑狼疮。
36.一种检测样品中人干扰素alpha和beta受体亚基1(IFNAR1)蛋白表达的方法，其包括使所述样品与如权利要求1-21中任一项所述的抗体或其片段接触，通过检测结合情况以表征样品中IFNAR1的表达。
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