CN112034070A - 一种油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法，属于油茶育种技术领域。选择至少3株高产和低产油茶品种分别作为高产组和低产组；从高产组或低产组中每个油茶单株上在上部、中部和下部3处各采集嫩芽，采集的嫩芽以组为单位混合；将高产组或低产组嫩芽样品用醇溶剂提取，去除溶剂后，得到的高产组或低产组深褐色膏状物经稀释后采用GS‑MS联用仪分析，比对高产组代谢表达谱和低产组代谢表达谱中差异化合物，选择含量达到显著性差异水平的化合物作为标识物来选育高产油茶品种。本发明提供的方法科学、取样方法简单、分析方法便捷快速，适合应用于油茶良种选育和遗传改良，将对油茶产业化发展具有极大的推动作用。

Description

一种油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法
技术领域
本发明属于油茶育种技术领域，具体涉及一种油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法。
背景技术
油茶是我国重要木本油料树种，也是世界四大木本油料树种之一，主要分布于南方省区。其产品茶油是高级食用油，脂肪酸组成与橄榄油相似，长期食用十分有利于人类的健康。油茶种植于山上，不与粮食争地，为山区林农提供大量的劳动就业机会。油茶产业是我国特色优势产业，发展油茶产业既可以保障国家粮油安全，改善国民健康，又能促进林农增收致富，助力山区脱贫，乡村振兴，经济、生态和社会效益兼得，符合国家可持续发展战略需求，具有重要的现实意义和广阔的推广应用前景。常规的油茶良种选育要经过优树选择-无性系测定-无性系区域试验等程序，历时十几年，不能满足生产实际对油茶高产优质良种的迫切需求。
大量的研究表明油茶无性系之间的产量差异极大，高产与低产之间差异巨大。目前，影响油茶产业快速发展的关键之一就是油茶高产优质品种的选育与应用。如何科学、准确、快速选择高产无性系是摆在科学家面前的主要科学问题。木本植物产量性状是受多基因控制，而且与环境的影响也特别大，因此，单纯从基因工程的角度构建高产油茶品种存在较大难度。
国外新近的研究结果表明，通过各种现代分析技术如GC-MS，LC-MS，1H-NMR等，能够获得大量靶向或非靶向代谢表达谱。目前，该技术在农作物番茄、小麦、玉米以及杨树、麻栎等林木上得到广泛应用，但未见在油茶上有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法，从代谢表达谱的角度建立一套用于区分低产和高产油茶品种的方法，具有科学、简便、快速的特点。
本发明提供了一种油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法，包括以下步骤：
1)选择至少3株单株产果量大于平均产量50％的油茶品种作为高产组；选择至少3株单株产果量小于平均产量50％的油茶品种作为低产组；
2)从高产组或低产组的每个油茶单株上分别在上部、中部和下部3处各采集4～6个嫩芽，采集的嫩芽以组为单位混合，得到高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品；
3)将所述高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品用醇溶剂提取3～4次，合并提取液，去除溶剂后，得到高产组深褐色膏状物或低产组深褐色膏状物；
4)将所述高产组深褐色膏状物或低产组深褐色膏状物经稀释后采用气相-质谱联用分析，得到高产组代谢表达谱或低产组代谢表达谱；
5)比对所述高产组代谢表达谱和低产组代谢表达谱中差异化合物，选择含量达到显著性差异水平的化合物作为标识物来选育高产油茶品种。
优选的，步骤2)中采集嫩芽的时间为5月份。
优选的，所述高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品的质量和醇溶剂的体积比为100g：900～1100mL。
优选的，步骤3)中所述醇溶剂为无水甲醇、无水乙醇、无水丙二醇和丁醇中的一种或多种。
优选的，所述气相-质谱联用分析时，GC条件如下：
进样量：2.00μl；DB-5弹性石英毛细管柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm；气化温度280℃；程序升温：初始温度60℃，保留1min，然后以10℃/min升至280℃，保留3min；载气为氦气，分流比10:1载气流速0.8ml/min；峰面积归一化法计算各化合物相对含量；紫外检测器条件：波长254nm；带宽16nm；稀释因子1.0000。
优选的，所述气相-质谱联用分析时，MS条件如下：
离子源：EI，电子能量70eV；MS离子源温度：230℃；MS四极杆温度：150℃；采集模式：全扫描，扫描范围20～650amu；检索谱库：NIST谱库。
优选的，所述差异化合物包括角鲨烯或化合物A；
在高产组中，保留时间17.718min的角鲨烯，相对含量为4.07％；
在低产组中，保留时间17.232min的角鲨烯，相对含量为35.87％；
在高产组中，保留时间17.227min的化合物A，相对含量为31.85％，而在低产组中没有检测到。
本发明提供的油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法，根据代谢表达谱与表型性状有显著相关性，以表型高产量的油茶品种和低产量的油茶品种为材料，采用醇溶剂提取其代谢物，将提取的代谢物采用气相-质谱联用分析方法，得到两组代谢表达谱，再筛选含量达到显著性差异水平的物质作为标识物用于后续的高产油茶品种的选育。本发明提供的方法科学、取样方法简单、分析方法便捷快速，适合应用于油茶良种选育和遗传改良，为油茶育种工作者提供了一项新技术和一种新思路，有可能快速进行高产无性系的选择，缩短育种进程，将对油茶产业化发展具有极大的推动作用。
附图说明
图1为油茶高产与低产品种代谢表达谱标记识别流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法，包括以下步骤：
1)选择至少3株单株产果量大于平均产量50％的油茶品种作为高产组；选择至少3株单株产果量小于平均产量50％的油茶品种作为低产组；
2)从高产组或低产组的每个油茶单株上分别在上部、中部和下部3处各采集4～6个嫩芽，采集的嫩芽以组为单位混合，得到高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品；
3)将所述高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品用醇溶剂提取3～4次，合并提取液，去除溶剂后，得到高产组深褐色膏状物或低产组深褐色膏状物；
4)将所述高产组深褐色膏状物或低产组深褐色膏状物经稀释后采用气相-质谱联用分析，得到高产组代谢表达谱或低产组代谢表达谱；
5)比对所述高产组代谢表达谱和低产组代谢表达谱中差异化合物，选择含量达到显著性差异水平的化合物作为标识物来选育高产油茶品种。
本发明提供了一种油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法如图1所示，包括试验设计、样品采集、样品处理、GC-MS参数设定、代谢表达谱分析和标记识别。
本发明选择至少3株单株产果量大于平均产量50％的油茶品种作为高产组；选择至少3株单株产果量小于平均产量50％的油茶品种作为低产组。
在本发明中，每组中单株数量越大，筛选结果越准确，但是操作过程越繁琐。所述高产组或低产组包含的单株数量优选为4～6株。所述高产组，单株产果量优选大于平均产量60％～80％，更优选为70％。所述低产组，单株产果量优选小于平均产量60％～80％，更优选为70％。高产组和低产组中，单果产量差距越大，对后续筛选标识物越有利。在本发明实施例中，所述高产组选择3株油茶单株，产量分别为2.62、2.35和1.5Kg；所述低产组选择3株油茶单株，产量分别为0.49、0.46和0.01Kg。
得到高产组或低产组后，本发明从高产组或低产组的每个油茶单株上分别在上部、中部和下部3处各采集4～6个嫩芽，采集的嫩芽以组为单位混合，得到高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品。
在本发明中，采集嫩芽的时间优选在花芽分化期间的5月份进行。每个部位采集嫩芽的数量优选为5个。本发明对所述嫩芽的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的嫩芽即可。本发明优选采用混合取样方法有利于全面评价高产、低产油茶。
得到高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品后，本发明将所述高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品用醇溶剂提取3～4次，合并提取液，去除溶剂后，得到高产组深褐色膏状物或低产组深褐色膏状物。
在本发明中，所述高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品的质量和醇溶剂的体积比优选为100g：900～1100mL，更优选为100g：1000mL。提取的温度优选为20～30℃，更优选为25℃。所述醇溶剂优选为无水甲醇、无水乙醇、无水丙二醇和丁醇中的一种或多种。本发明所述去除溶剂的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的去除溶剂的方法即可。在发明实施例中，所述去除溶剂的方法采用减压蒸馏法进行。
得到高产组深褐色膏状物或低产组深褐色膏状物，本发明将所述高产组深褐色膏状物或低产组深褐色膏状物经稀释后采用气相-质谱联用分析，得到高产组代谢表达谱或低产组代谢表达谱。
在本发明中，所述稀释是将高产组深褐色膏状物或低产组深褐色膏状物稀释至0.05ppm浓度进行上样。上样体积优选为1mL。所述气相-质谱联用分析时，GC条件优选如下：
进样量：2.00μl；DB-5弹性石英毛细管柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm；气化温度280℃；程序升温：初始温度60℃，保留1min，然后以10℃/min升至280℃，保留3min；载气为氦气，分流比10:1载气流速0.8ml/min；峰面积归一化法计算各化合物相对含量；紫外检测器条件：波长254nm；带宽16nm；稀释因子1.0000。
在本发明中，所述气相-质谱联用分析时，MS条件优选如下：
离子源：EI，电子能量70eV；MS离子源温度：230℃；MS四极杆温度：150℃；采集模式：全扫描，扫描范围20～650amu；检索谱库：NIST谱库。
得到高产组代谢表达谱和低产组代谢表达谱后，本发明比对所述高产组代谢表达谱和低产组代谢表达谱中差异化合物，选择含量达到显著性差异水平的化合物作为标识物来选育高产油茶品种。
在本发明中，将获得的高产组和低产组代谢表达谱优选按相对含量进行排序，采用方差分析，以两组中含量达到显著性差异水平的化合物作为标识物在后续选育高产油茶品种中应用。所述标识物的判断方法优选化合物含量优选相差5～10倍。
在本发明实施例中，筛选的标识物包括两种，一种为角鲨烯，另一种为出峰时间17.227min的化合物A。高产组中角鲨烯相对含量为4.07％，低产组角鲨烯相对含量为35.87％。化合物A在高产组中相对含量为31.85％，低产组中没有检测到。
下面结合实施例对本发明提供的一种油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
在福建省沙县水南国有林场选择3株高产油茶树(编号为A、B和C)，2017-2019年单株平均产果量依次为2.62、2.35和1.5Kg，构建高产组，选择3株低产油茶品种(编号为D、E和F)，2017-2019年单株平均单株产果量依次为0.49、0.46和0.01Kg，构建低产组。
在2020年5月12日采取样品BULK方法，在每个单株上的上、中、下部位分别采集5个嫩芽，先按每株混合，然后每组进行混合。
将高产组和低产组样品各取100g新鲜混合样品，用1000mL无水甲醇浸泡3天，倾出溶剂并收集，重复3次，把3次所得全部溶液合并，然后减压蒸干溶剂，高产组得深褐色膏状物31.5g，低产组得深褐色膏状物30.8g。将所得两组深褐色膏状物深褐色膏状物分别用甲醇稀释至1mL，得到两组代谢物溶液。
将两组代谢物溶液稀释至0.05ppm进行GC-MS上机分析，GC条件为进样量：2.00μl；DB-5弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；气化温度280℃；程序升温：初始温度60℃，保留1min，然后以10℃/min升至280℃，保留3min；载气为氦气，分流比10:1载气流速0.8ml/min；峰面积归一化法计算各化合物相对含量；紫外检测器条件：波长，254nm；带宽，16nm；稀释因子：1.0000。
MS条件为离子源：EI，电子能量70eV；MS离子源温度：230℃；MS四极杆温度：150℃；采集模式：全扫描，扫描范围20～650amu；检索谱库：NIST谱库；得到高产组和低产组代谢表达谱。
将获得的高产组和低产组代谢表达谱按相对含量进行排序，采用方差分析，选择具有含量显著性差异的化合物。
高产组和低产组代谢表达谱图的结果见表1和表2。
从高产组和低产组代谢表达谱中筛选两种含量达显著性差异的化合物，具体的，高产组角鲨烯(保留时间为17.718min)的相对含量为4.07％，低产组角鲨烯(保留时间为17.232min)的相对含量为35.87％；保留时间为17.227min的化合物A在高产组中相对含量为31.85％，低产组中没有检测到。
表1高产组样本的色谱峰信息
Figure BDA0002673280550000061
Figure BDA0002673280550000071
Figure BDA0002673280550000081
表2低产组样本的色谱峰信息
Figure BDA0002673280550000082
Figure BDA0002673280550000091
本发明提供的油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法，方案科学、取样方法简单、分析方法便捷快速，适合应用于油茶良种选育和遗传改良。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)选择至少3株单株产果量大于平均产量50％的油茶品种作为高产组；选择至少3株单株产果量小于平均产量50％的油茶品种作为低产组；
2)从高产组或低产组的每个油茶单株上分别在上部、中部和下部3处各采集4～6个嫩芽，采集的嫩芽以组为单位混合，得到高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品；
3)将所述高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品用醇溶剂提取3～4次，合并提取液，去除溶剂后，得到高产组深褐色膏状物或低产组深褐色膏状物；
4)将所述高产组深褐色膏状物或低产组深褐色膏状物经稀释后采用气相-质谱联用分析，得到高产组代谢表达谱或低产组代谢表达谱；
5)比对所述高产组代谢表达谱和低产组代谢表达谱中差异化合物，选择含量达到显著性差异水平的化合物作为标识物来选育高产油茶品种。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中采集嫩芽的时间为5月份。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述高产组嫩芽样品或低产组嫩芽样品的质量和醇溶剂的体积比为100g：900～1100mL。
4.根据权利要求1或3所述方法，其特征在于，步骤3)中所述醇溶剂为无水甲醇、无水乙醇、无水丙二醇和丁醇中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述气相-质谱联用分析时，GC条件如下：
进样量：2.00μl；DB-5弹性石英毛细管柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm；气化温度280℃；程序升温：初始温度60℃，保留1min，然后以10℃/min升至280℃，保留3min；载气为氦气，分流比10:1载气流速0.8ml/min；峰面积归一化法计算各化合物相对含量；紫外检测器条件：波长254nm；带宽16nm；稀释因子1.0000。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述气相-质谱联用分析时，MS条件如下：
离子源：EI，电子能量70eV；MS离子源温度：230℃；MS四极杆温度：150℃；采集模式：全扫描，扫描范围20～650amu；检索谱库：NIST谱库。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5)中所述差异化合物包括角鲨烯或化合物A；
在高产组中，保留时间17.718min的角鲨烯，相对含量为4.07％；
在低产组中，保留时间17.232min的角鲨烯，相对含量为35.87％；
在高产组中，保留时间17.227min的化合物A，相对含量为31.85％，而在低产组中没有检测到。
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