CN109696503A - 一种植物叶片中代谢物的检测方法及其应用 - Google Patents

一种植物叶片中代谢物的检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物叶片中代谢物的检测方法及其应用。本发明的方法包括以下步骤：步骤一，取水稻叶片在液氮中研磨成粉状；步骤二，利用混合溶剂提取叶片中化合物，提取温度为70℃，提取时间为30分钟，并在提取液中加入烷烃和核糖醇标样用于校准出峰时间及不同批次的差异；步骤三，将提取液加入到气相色谱质谱联用仪中检测提取液中化合物种类及数量；步骤四，利用公共质谱库对化合物进行定性定量分析。本发明实现了水稻叶片代谢物的高通量检测，有助于推动水稻抗逆高产育种进程；同时利用此方法检测到磷酸烯醇式丙酮酸及α‑酮戊二酸与水稻耐低氮显著相关。

Description

一种植物叶片中代谢物的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及化合物检测方法技术领域，具体涉及一种植物叶片中代谢物的检测方法及其应用，特别涉及一种水稻叶片中代谢物的检测方法及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)不仅是世界上最重要的粮食作物之一，同时也是植物学家和育种学家研究的模式植物。一方面全球人口增加提高了对粮食的需求，另一方面，人类过多的活动打破了生态环境原有的平衡，全球气温升高，土壤盐碱化、干旱、高温等逆境严重影响了作物产量。为了满足日益增长的粮食需求，培育适应各种不同逆境，能在逆境下维持高产稳产的水稻品种成为育种家的主要目标。而随着分子生物学理论及技术的发展，开发抗逆/高产新基因和与目标性状紧密相关的分子标记，通过分子标记辅助选择优良品种对水稻品种的高效选育具有重要理论及实践意义。
水稻抗逆及高产性状是受数量性状位点(Quantitative Trait Loci，QTL)控制的复杂性状。随着分子生物学技术的快速发展，迄今大量水稻抗逆相关QTL及功能基因已相继报道，如AtAmt1.1、AlaAT和NADH-glutamate synthase等基因被报道参与植物耐低氮反应，SKC1则参与了水稻的耐盐反应等。然而，大量研究表明，虽然相关QTL及功能基因的研究取得长足进展，但相关结果能在育种实践中应用的还很少有报道。究其原因，这与水稻耐低氮的复杂遗传机制有关，仅通过相关QTL挖掘、基因或者蛋白表达差异筛选功能基因尚不足以满足目标性状改良的需求。研究表明，mRNA表达量变化与基因表达量的变化并非直接相关，如基因表达量虽然变化，但酶活未必做出相应改变，进而对表型的影响不得而知。
代谢组学研究则很大程度弥补了仅基因或者蛋白水平研究的不足，相比于其它分子标记，代谢物不仅是基因表达的下游产物，且其变化是生物系统对基因、环境变化的最终响应，与植物表型关系更为直接；同时大量研究证明代谢物的预测力及遗传力显著高于其它表型性状，尤其是高于产量、抗逆性等复杂数量性状。科学家认为代谢物标记的开发有助于高效提高水稻育种效率，而抗逆相关代谢物标记的开发和应用对抗逆水稻品种的选育具有重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何开发与植物耐逆相关的代谢标记物。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种植物中代谢物的提取方法。
本发明提供的植物中代谢物的提取方法包括如下步骤：将植物材料与提取溶剂混匀，加热，得到提取液；
所述提取溶剂是将无水甲醇和三氯甲烷混匀得到的溶液；
所述无水甲醇和所述三氯甲烷的体积比为3:1，该比例有利于浸提出更多的化合物。
进一步的，所述加热的条件为70℃加热15分钟，该条件有利于浸提出更多的化合物。
更进一步的，所述植物材料为植物叶片；所述植物叶片在混匀前还包括将植物叶片置于液氮中研磨成粉状的步骤。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了一种高灵敏度、高通量的植物中代谢物的检测方法。
本发明提供的植物中代谢物的检测方法包括如下步骤：
1)按照上述方法提取植物材料中的代谢物，得到提取液；
2)将所述提取液离心，收集上清液；
3)采用气相色谱质谱联用技术检测所述上清液中的化合物，实现对植物中代谢物的检测。
上述方法中，所述步骤1)中，所述植物材料为植物叶片。
上述方法中，所述步骤2)中，所述离心的条件为12000ppm离心20分钟，该条件有利于降低检测过程中噪音的影响。
上述方法中，所述步骤3)中，所述采用气相色谱质谱联用技术检测所述上清液中的化合物的方法包括如下步骤：将所述上清液、用于校准离子出峰时间的烷烃标准物和用于校准不同批次样品的标准物(内标)混匀，得到待检测溶液；采用气相色谱质谱联用技术检测所述待检测溶液中的化合物。
进一步的，所述用于校准离子出峰时间的烷烃标准物可为正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷烃、正二十四烷和正三十二烷。所述用于校准不同批次样品的标准物可为核糖醇标准物。
更进一步的，各个烷烃标准物和所述核糖醇标准物在所述待检测溶液中的浓度均为1mg·mL-1。
采用气相色谱质谱联用技术检测所述待检测溶液中化合物的检测条件具体如下：高纯氦气(纯度>99.999％)作载气；色谱条件：色谱柱为VF-5MS，规格为30m×0.25mm×0.25μm，柱温为70℃保持1分钟，然后以每分钟7℃升温至325℃，保持15分钟；恒线速度模式，线速度为36.5cm/min，柱流量为1ml/min；进样口温度设定为250℃；进样量为1μL；质谱条件：EI离子源，离子源温度为250℃；离子化能量为70eV；连接线温度为300℃；全扫描方式进行扫描，其扫描范围为50-650m/z。
所述检测可为定量检测或定性检测，所述定性检测和定量检测的方法均可为现有技术中的常用方法。
在本发明的具体实施例中，所述定性分析是采用公共数据库进行分析。所述公共数据库可为公共质谱库NIST(http://www.nist.gov/)或德国马普植物生理所质谱库(http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/gmd/msri/gmd_msri.html)。具体分析方法如下：如果植物中某物质的出峰时间和质荷比与标准质谱库中某已知化合物的出峰时间和质荷比均相同，则该植物中含有所述化合物。所述化合物可为公共数据库中任意一种已知化合物。所述定量分析为相对定量分析，具体分析方法如下：以所有样品混合提取物中已定性的每种物质的出峰面积为基准，通过分析不同植物样品中各化合物与混合样品中对应化合物的峰面积比值，计算植物中该化合物的相对含量。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法的新用途。
本发明提供了上述方法在开发与植物耐逆性相关的代谢标记物中的应用。
本发明还提供了上述方法在筛选耐逆植物品种中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了磷酸烯醇式丙酮酸和/或α-酮戊二酸的新用途。
本发明提供了磷酸烯醇式丙酮酸和/或α-酮戊二酸在调控植物耐逆性中的应用。
本发明还提供了磷酸烯醇式丙酮酸和/或α-酮戊二酸在作为植物耐逆性标记物中的应用。
上述方法或应用中，所述植物耐逆性为植物耐低氮性。
上述方法或应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻。
为了解决上述技术问题，本发明最后还提供了一种开发与植物耐逆性相关的代谢标记物的方法。
本发明提供的开发与植物耐逆性相关的代谢标记物的方法包括如下步骤：
(1)对植物材料甲和植物材料乙分别进行正常处理和逆境胁迫处理，分别得到正常处理后的植物材料甲、正常处理后的植物材料乙、胁迫处理后的植物材料甲和胁迫处理后的植物材料乙；
所述植物材料甲具有性状A，所述植物材料乙具有与所述性状A相反的性状；
(2)按照上述方法分别检测所述正常处理后的植物材料甲、所述正常处理后的植物材料乙、所述胁迫处理后的植物材料甲和所述胁迫处理后的植物材料乙中的代谢物，分别得到所述正常处理后的植物材料甲、所述正常处理后的植物材料乙、所述胁迫处理后的植物材料甲和所述胁迫处理后的植物材料乙中各代谢物的相对含量；
若某一代谢物在所述植物材料甲中的含量变化值和在所述植物材料乙中的含量变化值有显著差异，并使得其在所述胁迫处理后的植物材料甲和所述胁迫处理后的植物材料乙中的相对含量有显著差异，则该代谢物即为与该植物耐逆性相关的代谢标记物；
某一代谢物在所述植物材料甲中的含量变化值为该代谢物在所述胁迫处理后的植物材料甲中的相对含量与该代谢物在所述正常处理后的植物材料甲中的相对含量的比值。
某一代谢物在所述植物材料乙中的含量变化值为该代谢物在所述胁迫处理后的植物材料乙中的相对含量与该代谢物在所述正常处理后的植物材料乙中的相对含量的比值。
进一步的，所述代谢物相对含量的检测方法包括如下步骤：将正常处理组及逆境胁迫处理组的所有样品分别取样并等量混合，得到混样，以混样中的化合物含量作为基准，计算不同样品中代谢物的相对含量。具体计算方法如下：按照前述方法提取混样中的代谢物并上柱分离检测所含物质的出峰面积，其余各样品中的代谢物相对含量为该样品中某代谢物的出峰面积与混样中对应代谢物的出峰面积的比值。
更进一步的，所述植物耐逆性具体为植物耐低氮性；
所述逆境胁迫具体为低氮胁迫；
所述性状A具体为耐低氮；与所述性状A相反的性状具体为氮敏感；
所述植物材料甲具体为耐低氮材料；所述耐低氮材料具体为G9；
所述植物材料乙具体为氮敏感材料；所述氮敏感材料具体为蜀恢527；
所述植物具体为水稻；
所述代谢标记物具体为磷酸烯醇式丙酮酸和/或α-酮戊二酸。
本发明提供了一种水稻叶片中代谢物的检测方法，本发明采用GC-MS联用技术检测水稻叶片中的代谢物质，分离能力强，灵敏度高，操作简单，能实现水稻叶片中化合物的高通量检测。该方法共可检测到包括氨基酸类、糖类和有机酸等在内的140余种化合物。本发明的方法除了可以实现代谢物的高效检测外，还为水稻品种的改良提供了代谢物水平的参考依据，并且还有助于推动相关功能候选基因的挖掘，促进水稻育种进程。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置五次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的蜀恢527是水稻育种生产实践中广泛推广应用的恢复系品种，记载于文献“王玉平，李仕贵，黎汉云，高克铭，高配合力水稻恢复系蜀恢527的选育与利用，杂交水稻，2014,19(4):12-14”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的G9是以蜀恢527为轮回亲本进行杂交选育后代中，筛选到的优良株系。G9的具体选育过程如下：以蜀恢527为母本，爷驼崽为父本进行杂交，得到杂交子代，然后从杂交子代中，选择具有较高产量性状的杂交子代作为父本，以蜀恢527为母本连续回交，回交2代自交7代后，选择具有稳定的且较高产量性状的植株，即得到G9。
下述实施例中的烷烃标准物(不同分子量的烷烃：正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷烃、正二十四烷和正三十二烷)购自sigma公司。
下述实施例中的核糖醇标准物购自sigma公司。
实施例1、一种水稻叶片中代谢物的检测方法及与水稻耐低氮相关的代谢物的获得
一、实验材料的选取及处理
1、实验材料的选取
本发明申请人在多年多点耐低氮水稻材料选育中发现：在不同年份实验中，水稻材料G9在低氮环境中的产量显著高于水稻材料蜀恢527，并且相比于对照环境，水稻材料G9产量基本维持稳定或者仅为小幅降低，而蜀恢527产量则表现为显著降低。说明相比于蜀恢527，水稻材料G9具有较强的耐低氮能力。选用耐低氮性有显著差异的水稻材料蜀恢527和G9作为实验材料筛选与水稻耐低氮相关的代谢标记物。
2、实验材料的处理
低氮处理组：将水稻材料G9和蜀恢527分别种植在低氮条件(低氮条件：氮肥施用量为正常氮肥施用量的1/3)的水田中，按照常规方法进行培育与田间管理；
对照处理组：将水稻材料G9和蜀恢527分别种植在正常条件(正常条件：正常氮肥施用量为每公顷307公斤尿素)的水田中，按照常规方法进行培育与田间管理。
二、水稻叶片中代谢物的提取方法
在水稻灌浆期分别随机取G9和蜀恢527同等叶位的叶片若干，迅速置于液氮中，将叶片样品在液氮环境下(在预冷过的研钵中)研磨成均匀粉状。称取粉状叶片材料，记录粉状叶片材料的质量，并将其加入到1mL提取溶剂(提取溶剂是将无水甲醇和三氯甲烷按照体积比为3:1比例混匀得到的溶液)中，在恒温混匀仪中70℃加热15分钟，得到提取液。
同时以无水甲醇和三氯甲烷体积比分别为1:1、2:1、3:1、5:1、10:1的提取溶剂、提取时间为5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟作为对照。
三、水稻叶片中代谢物的检测方法
1、待检测溶液的制备
将提取液12000ppm离心20分钟，收集上清液。将上清液与不同分子量烷烃标准物(C12、C14、C16、C18、C24、C32)和核糖醇标准物混匀(各烷烃标准物和核糖醇标准物的终浓度均为1mg·ml-1)，即得待检测溶液。其中，不同分子量烷烃标准物作为离子峰保留时间(retention time index，RI)参照，用于校准离子出峰时间；核糖醇标准物作为化合物定量分析的内标，用于校准不同批次样品。同时以如下不同的离心时间：10分钟、15分钟、20分钟、30分钟作为对照。
2、化合物检测
采用气相色谱质谱(GC-MS)联用技术对步骤1制备的待检测溶液中的化合物进行检测。气相色谱质谱(GC-MS)联用仪的型号为GCMS-TQ8040(岛津公司，日本)。GC-MS检测条件为：高纯氦气(纯度>99.999％)作载气；色谱条件：色谱柱为VF-5MS，规格为30m×0.25mm×0.25μm，柱温为70℃保持1分钟，然后以每分钟7℃升温至325℃，保持15分钟；恒线速度模式，线速度为36.5cm/min，柱流量为1ml/min；进样口温度设定为250℃；进样量为1μL；质谱条件：EI离子源，离子源温度为250℃；离子化能量为70eV；连接线温度为300℃；全扫描方式进行扫描，其扫描范围为50-650m/z。
3、化合物定性定量分析
采用公共质谱库NIST(http://www.nist.gov/)、德国马普植物生理所质谱库(http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/gmd/msri/gmd_msri.html)进行定性定量分析。
定性分析方法如下：根据样品中不同化合物的出峰时间及质荷比，比对标准质谱库中化合物的相关信息(出峰时间及质荷比)，若样品中某物质的出峰时间和质荷比与标准质谱库中某已知化合物的出峰时间和质荷比均相同，则该植物叶片中含有该化合物，以实现化合物的定性检测。
定量分析方法如下：将对照处理组及低氮处理组的所有样品分别取样并等量混合的样品(混样)中的化合物含量作为基准，计算不同样品中代谢物的相对含量。具体如下：按照前面述及方法提取混样中代谢物并上柱分离检测所含物质的出峰面积，其余待分析样品中的代谢物含量则通过样品与混样对应物质的峰面积比值计算其相对含量。
四、结果与分析
1、代谢物种类检测结果
水稻叶片中代谢物的检测结果表明：在使用如下参数条件：无水甲醇和所述三氯甲烷的体积比为3:1的提取溶剂、提取时间为15分钟、离心时间为20分钟对水稻叶片中代谢物进行提取和检测时，无论在耐低氮水稻材料G9中还是氮敏感水稻材料蜀恢527中均检测到包括氨基酸、糖、有机酸、酯类及甾醇类等在内的共142种化合物。其中氨基酸及其衍生物共24种，有机酸类物质共62种，糖类及其衍生物共21种，核酸类物质共6种，激素类物质共5种，其它小分子物质共24种。
24种氨基酸及其衍生物分别如下：脯氨酸、络氨酸、鸟氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、组氨酸、丙氨酸、氨基乙酸、酪胺、天门冬素、焦谷氨酸、高丝氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苯基丙氨酸、缬氨酸、3-亚磺酰-丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸盐、O-乙酰-丝氨酸、N-乙酰-丝氨酸、甲硫氨酸砜。
62种有机酸类物质分别如下：3-羟基异丁酸、壬二酸、琥珀酸、异柠檬酸、3-羟基丙酸、甘油酸、甲基延胡索酸、苏氨酸盐、肉豆蔻酸、尿香草扁桃酸、月桂酸、乙醛酸、2-羟基异丁酸、乳酸、4-羟基苯甲酸、苯酯乙酸、己二酸、甲基丁二酸、核糖酸、十七烷酸、3-甲基-4-羟基苯甲酸、6-磷酸-葡萄糖酸、柠檬酸、安息香酸、4-羟基苯丙氨酸、2-氨基庚二酸、葡萄糖二酸、2-氨基己二酸、γ-羟基丁酸、原儿茶酸、犬尿胺酸、2-酮-异戊酸、莽草酸、乳清酸、3-脱氢莽草酸、5-氨基乙酰丙酸、柠苹酸、尿酸、2-酮-异己酸、苹果酸、3-磷酸-甘油酸、4-氨基安息香酸、酒石酸、3-氨基丙酸、谷氨酸盐、丙酮酸、2-羟基谷酸、3-羟基谷酸、3-甲基-2-戊酮酸、3-羟基氨基苯甲酸、戊二酸、3-磷酸-甘油酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、草酸、2-磷酸-甘油酸、丙二酸、磷酸烯醇式丙酮酸、5-氨戊酸、3-氨基-戊二酸、硬脂酸、2-氨基丁酸；21种糖类及其衍生物为核糖、核酮糖、木酮糖、木糖、来糖、海藻糖、7-磷酸景天庚糖、果胶糖、2-磷酸甘油、蔗糖、山梨糖、阿糖醇、乳糖、赤鲜酮糖、阿洛糖、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、苏糖醇、纤维醇、甘油。
6种核酸类物质分别如下：尿嘧啶、鸟苷、腺苷、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤。
5种激素类物质分别如下：烟酸酯、针叶醇、吲哚-3-乙酸、烟酰胺、色胺。
24种其它小分子物质分别如下：尿素、羟脯氨酸、十八醇、5-甲基硫腺苷、尸胺、对苯二酚、乙醇胺、O-磷酸乙醇胺、甘氨酰甘氨酸、二氢尿嘧啶、磷酸组胺醇、磷酸、5-甲氧基色胺、吡哆醇、泛酸酯、吡哆醛、葡萄糖酸酯、半乳糖醛酸酯、十六醇、甘醇酸酯、磷酸二羟基丙酮、谷氨酸-5-甲酯、尿狗酸酯、胆固醇。
而在其他参数条件下提取和检测叶片中的化合物时，检测到的化合物种类较少，或者化合物的峰型不好，因此检测植物叶片中的代谢物时的最优参数条件如下：无水甲醇和所述三氯甲烷的体积比为3:1的提取溶剂、提取时间为15分钟、离心时间为20分钟，在上述条件下有利于浸提出更多的化合物、降低检测过程中噪音的影响。
2、代谢物含量检测结果
在低氮处理下，G9(耐低氮)中有较多的化合物的相对含量显著高于蜀恢527(氮敏感)中的相对含量，并且在G9和蜀恢527中含量差异显著的化合物里，其在G9中的平均含量相比于蜀恢527提高了95％。表明在低氮逆境下，水稻叶片中较多化合物的积累有利于植物渡过不良逆境，来维持正常的生长。
进一步分析发现，相对于对照环境下生长的水稻，低氮逆境诱导G9和蜀恢527中绝大多数化合物含量显著增加；比较G9和蜀恢527中低氮逆境下化合物的变化特点，发现G9中化合物含量提高比例显著高于蜀恢527。再一次表明代谢物含量增加是水稻适应低氮逆境的主要方式之一。
深入分析发现，除了广为报道的参与植物氮代谢的谷氨酸及谷氨酸盐等化合物被检测到在G9中含量显著高于蜀恢527外，利用本发明方法，磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate)及α-酮戊二酸(2-oxoglutarate)被检测到不仅在耐低氮材料G9中的相对含量显著高于氮敏感材料蜀恢527，且在低氮处理下增加幅度显著高于其它化合物。低氮环境下，G9中磷酸烯醇式丙酮酸及α-酮戊二酸的相对含量分别是蜀恢527中相对含量的1.5倍和1.9倍，统计分析达到显著。表明该两种化合物在水稻耐低氮中的重要作用。
综上所述，本发明的方法可实现与植物耐低氮相关代谢物的高效检测，有助于推动水稻抗逆分子机理及育种工作的有效开展。

Claims (10)

1.一种植物中代谢物的提取方法，包括如下步骤：将植物材料与提取溶剂混匀，加热，得到提取液；
所述提取溶剂是将无水甲醇和三氯甲烷混匀得到的溶液；
所述无水甲醇和所述三氯甲烷的体积比为3:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述植物材料为植物叶片；
或，所述加热的条件为70℃加热30分钟。
3.一种植物中代谢物的检测方法，包括如下步骤：
1)按照权利要求1或2所述的方法提取植物材料中的代谢物，得到提取液；
2)将所述提取液离心，收集上清液；
3)采用气相色谱质谱联用技术检测所述上清液中的化合物，实现对植物中代谢物的检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述植物材料为植物叶片；
或，所述离心的条件为12000ppm离心20分钟。
5.权利要求3或4所述的方法在开发与植物耐逆性相关的代谢标记物中的应用；
或，权利要求3或4所述的方法在筛选耐逆植物品种中的应用。
6.磷酸烯醇式丙酮酸和/或α-酮戊二酸在调控植物耐逆性中的应用；
或，磷酸烯醇式丙酮酸和/或α-酮戊二酸在作为植物耐逆性标记物中的应用；
或，检测植物叶片中磷酸烯醇式丙酮酸和/或α-酮戊二酸含量的物质在鉴定植物耐逆性中的应用。
7.根据权利要求1或2所述的方法或权利要求3或4所述的方法或权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻；或，所述植物耐逆性为植物耐低氮性。
8.一种开发与植物耐逆性相关的代谢标记物的方法，包括如下步骤：
(1)对植物材料甲和植物材料乙分别进行正常处理和逆境胁迫处理，分别得到正常处理后的植物材料甲、正常处理后的植物材料乙、胁迫处理后的植物材料甲和胁迫处理后的植物材料乙；
所述植物材料甲具有性状A，所述植物材料乙具有与所述性状A相反的性状；
(2)按照权利要求3或4所述的方法分别检测所述正常处理后的植物材料甲、所述正常处理后的植物材料乙、所述胁迫处理后的植物材料甲和所述胁迫处理后的植物材料乙中的代谢物，分别得到所述正常处理后的植物材料甲、所述正常处理后的植物材料乙、所述胁迫处理后的植物材料甲和所述胁迫处理后的植物材料乙中各代谢物的相对含量；
若某一代谢物在所述植物材料甲中的含量变化值和在所述植物材料乙中的含量变化值有显著差异，并使得其在所述胁迫处理后的植物材料甲和所述胁迫处理后的植物材料乙中的相对含量有显著差异，则该代谢物即为与该植物耐逆性相关的代谢标记物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述植物耐逆性为植物耐低氮性；
所述逆境胁迫为低氮胁迫；
所述植物材料甲为耐低氮材料；
所述植物材料乙为氮敏感材料。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻；
或，所述代谢标记物为磷酸烯醇式丙酮酸和/或α-酮戊二酸。
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