CN112033942B - 一种双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器用于miRNA高灵敏可视化检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器用于miRNA高灵敏可视化检测的方法,包括如下步骤:(1)制备双色量子点硅质体球形核酸(QD2@C‑SNA)比率荧光传感器,双色量子点硅质体球形核酸(QD2@C‑SNA)包括包覆双色量子点的硅质体、与硅质体交联的捕获DNA、与捕获DNA杂交的双DNA酶以及猝灭剂修饰的底物,双色量子点分别置于硅质体亲水内腔和疏水双层中;(2)像荧光传感器中加入靶标miRNA,与QD2@C‑SNA表面的捕获DNA杂交,触发QD2@C‑SNA上双DNA酶自动化行走,介导产生比率荧光信号;(3)检测QD2@C‑SNA的荧光颜色,实现对miRNA的检测和可视化分析。该方法通过双DNA酶行走介导的信号放大实现miRNA快速、高灵敏度检测。
Description
技术领域
本发明涉及miRNA检测方法,特别涉及一种双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器用于miRNA高灵敏可视化检测的方法。
背景技术
微小RNA(miRNA)是一类长约19-23个核苷酸的小分子RNA。miRNA位于基因组非编码区域,进化上高度保守,可在转录后水平对基因进行调节。miRNA在基因表达调控领域起着重要作用,涉及生物个体发育、组织分化、控制细胞的增殖和凋亡、病毒感染、能量代谢、癌症的发生发展等。稳定存在于血清和血浆等体液中的miRNA称为循环miRNA。目前大量生理学和病理学研究表明循环miRNA与多种疾病相关,其表达含量在正常人与疾病患者之间存在显著的差异,可作为一类重要的疾病标志物,适用于疾病的早期诊断、个体化治疗、预后判断等。然而,循环miRNA序列短,序列同源且在体液中丰度低,这些特性对miRNA的高灵敏、高特异性、即时检测特别是可视化检测提出了重大的挑战。
传统的miRNA检测方法有Northern印迹法、微阵列芯片及反转录聚合酶链式反应(PCR)等,这些技术在样品用量、操作简单程度、测量时间及灵敏度等方面各自存在一定的问题,限制了它们在即时检测中的应用。荧光传感器具有制备简单和检测灵敏度高等优点,提供了miRNA低成本、即时检测新平台。比率荧光传感器是同时测量2个及以上发射波长荧光强度及比率的荧光传感新技术。相比于单色荧光传感器,比率荧光传感器通过内部校正,提供更高的信噪比,能够显著提高检测的灵敏度和准确度。更为重要的是,传感器2个及以上发射波长荧光比率变化会导致荧光颜色连续可调,特别适合于高灵敏的可视化检测。量子点是一类无机荧光团,本身具有高亮度、单一波长激发多色发射、抗光漂白性好等优点,同时易于通过多种作用力方式包覆于二氧化硅、水凝胶、脂质体或硅质体中,因而适用于构筑生物相容性好、灵敏度高的比率荧光传感器。
信号放大提供了提高生物分析灵敏度的高效方法。各种基于DNA分子的信号放大方法,包括链式杂交反应(HCR)、滚环扩增反应(RCA)、链式取代反应(SDA)、催化发卡自组装(CHA)和DNA酶步行器等不断开发出来用于生物标志物如DNA/RNA、蛋白质、酶等的高灵敏检测。其中,DNA酶步行器是指利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选出来的特定DNA序列,在特定阳离子辅助下对相应的底物进行剪切,并沿底物轨道自动化行走的信号放大方式。DNA酶步行器具有如下优势:序列合成简单;无需外加酶或者燃料序列能够自驱动;上下臂的设计灵活多变,可以根据底物序列进行调整。基于上述优点,DNA酶步行器提供了一种低成本、高效的信号放大方法,可应用于生物分子包括miRNA的高灵敏检测。
发明内容
发明目的:本发明目的是提供一种高灵敏度、可视化双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器用于miRNA高灵敏可视化检测的方法。
技术方案:本发明提供一种双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器用于miRNA高灵敏可视化检测的方法,包括如下步骤:
(1)制备双色量子点硅质体球形核酸(QD2@C-SNA)比率荧光传感器,双色量子点硅质体球形核酸(QD2@C-SNA)包括猝灭剂修饰的底物、包覆双色量子点的硅质体、与硅质体交联的捕获DNA和与捕获DNA杂交的双DNA酶,双色量子点分别置于硅质体亲水内腔和疏水双层中;
(2)向荧光传感器中加入靶标miRNA,与QD2@C-SNA表面的捕获DNA杂交,触发QD2@C-SNA上双DNA酶自动化行走,介导产生比率荧光信号;
(3)检测QD2@C-SNA的荧光颜色,实现对miRNA的检测和可视化分析。
进一步地,步骤(1)中所述制备双色量子点硅质体球形核酸QD2@C-SNA比率荧光传感器的方法为:利用薄膜水化超声法制备包覆双色量子点的硅质体球,并化学交联猝灭剂修饰的底物、捕获DNA以及双DNA酶杂交双链,构建双色量子点硅质体球形核酸(QD2@C-SNA)比率荧光传感器。
进一步地,所述双色量子点为红、绿色II-VI族或III-V族量子点;硅质体组成材料包括N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺硅质体前体有机硅烷(CFL)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG);所述捕获DNA为靶标miRNA互补序列,所述DNA酶为金属离子特异性核酸酶,结合于捕获DNA的5’和3’端,所述猝灭剂修饰的底物为包含rA位点的发夹结构DNA;所述猝灭剂为BHQ系列。金属离子根据DNA酶的识别特异性可以为锌离子或者镁离子。
进一步地,步骤(2)加入的靶标miRNA与QD2@C-SNA表面的捕获DNA杂交,将原先结合的双DNA酶取代下来;被释放的双DNA酶分别识别邻近的底物,并结合金属离子后酶活性激活,特异性剪切底物上的rA位点,猝灭剂连接的底物片段被释放;剪切完成之后,DNA酶的上臂率先游离出来并识别下一个邻近的底物,进而带动下臂与该底物结合,实现自驱动行走;QD2@C-SNA表面底物全部被识别剪切后猝灭剂被释放,产生放大的疏水双层中的量子点荧光信号;靶标浓度依赖的疏水双层中的量子点荧光与恒定的亲水内腔中的量子点荧光信号相比较,产生双色量子点比率荧光。
进一步地,步骤(3)中,在紫外灯照射下,QD2@C-SNA荧光传感器加入不同浓度靶标miRNA后产生比率荧光信号,采用肉眼或CCD设备检测荧光颜色,实现靶标miRNA的定性及半定量检测。
有益效果:本发明制备的双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器,将双DNA酶步行器介导的信号放大方法与比率荧光检测技术相结合,实现对miRNA的高灵敏度、可视化检测。检测(行走)时间:40分钟;检测限:0.1飞摩;通过检测荧光颜色变化,直接进行(半)定量分析。
附图说明
图1为基于双DNA酶行走的QD2@C-SNA检测miRNA示意图;
图2为QD2@C-SNA的组成、结构与荧光性质,其中,A图为QD2@C-SNA的组成和结构示意图;B图为透射电子显微镜照片;C图为荧光光谱图;
图3为QD2@C-SNA上单DNA酶、双DNA酶行走时间的比较,其中A图为双DNA酶行走时间,B图为单DNA酶行走时间;
图4为QD2@C-SNA检测miRNA的比率荧光信号响应;
图5为QD2@C-SNA可视化检测miRNA的灵敏度和标准曲线;
图6为QD2@C-SNA检测miRNA的特异性;
图7为QD2@C-SNA检测血清中的循环miRNAs,其中A图为96孔板照片,B图为靶标含量统计柱状图。
具体实施方式
实施例1
捕获DNA、双DNA酶及底物的序列设计
靶标选择为非小细胞肺癌病人血清中的三个miRNA标志物:miRNA-21、miRNA-25和miRNA-196a。针对这三个靶标,分别设计合成了相应的捕获DNA(DNA1-3),双DNA酶(DNAzyme1-3和DNAzyme 1-3’)和相应的底物(substrate 1-3),其序列列于表1。如表所示,DNA 1-3中的加粗部分为对应的靶标互补序列,单下划线部分为与DNAzyme的杂交序列,双下划线部分为与DNAzyme’的杂交序列;DNAzyme 1-3的单下划线部分为与DNA1-3的杂交序列,斜体部分为DNAzyme的上下臂及酶活中心序列;DNAzyme 1’-3’的双下划线部分为与DNA1-3的杂交序列,斜体部分为DNAzyme’的上下臂及酶活中心序列;substrate 1-3中的rA为对应的DNA酶剪切位点,斜体部分为对应的DNA酶的上下臂互补序列。miRNA-21-1mut为靶标miRNA-21的单碱基突变序列。
表1靶标miRNA、捕获DNA、DNA酶及其底物的序列
实施例2
双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器(QD2@C-SNA)的制备
双色量子点硅质体(QD2@C)通过薄膜水化超声方法制备得到:取3μL的绿色油溶性CdSe/ZnS量子点溶液(4mg/mL),200μL的CFL(2.5mM),200μL的DPPC(2.5mM)和100μL的DSPE-PEG(2.5mM)溶于2mL三氯甲烷中,在45℃条件下旋转蒸发成膜,加入9μL的红色水溶性CdSe/ZnS量子点溶液(4mg/mL)与2mL的PBS缓冲液(25mM,pH7.4),在55℃条件下水化至薄膜脱落,超声30min处理,分步离心得到QD2@C。
分别取5μL捕获DNA,DNAzyme和DNAzyme’(浓度均为1.5mM)置于离心管中,在37℃水浴锅中杂交反应1h,得到15μL浓度0.5mM的捕获DNA与双DNA酶杂交双链。向1mL的QD2@C溶液(2mg/mL)中加入20μL的EDC溶液(100mM),20μL的Sulfo-NHS溶液(50mM),5μL的捕获DNA与双DNA酶杂交双链(0.5mM)和150μL的底物(0.5mM),搅拌反应4h,离心洗涤后分散于1mL的PBS缓冲液中,得到浓度为2mg/mL的QD2@C-SNA。
对QD2@C-SNA的组成结构、尺寸形貌及荧光性质进行表征,结果见图2。如图2A所示,一定比例的CFL、DPPC和DSPE-PEG组成硅质体球形骨架,水溶性红色量子点和油溶性绿色量子点分置于硅质体亲水内腔和疏水双层中;捕获DNA与双DNA酶杂交双链以及底物交联于硅质体球表面,形成球形核酸。图2B为QD2@C-SNA的透射电子显微镜成像照片,结果显示QD2@C-SNA呈直径为~120纳米的球形,内部包覆了大量的双色量子点,单分散性良好。图2C为QD2@C与QD2@C-SNA的荧光光谱对比图,结果显示偶联核酸后620nm处的红色荧光保持恒定,510nm处的绿色荧光猝灭,绿色/红色荧光强度比从2∶1变为1∶2,由此表明高密度核酸的成功偶联。
实施例3
QD2@C-SNA上双DNA酶行走的时间
加入2μL靶标miRNA(100fM)至100μL的QD2@C-SNA缓冲液(2mg/mL)中,在37℃条件下反应30min,加入Zn2+至终浓度为200mM后,每隔10min测量一次荧光光谱。
双DNA酶行走机制的QD2@C-SNA的绿色量子点荧光强度变化如图3A所示。Zn2+加入后,随着时间的延长,绿色量子点荧光逐渐增强,并在40min左右荧光信号达到最大值,表明QD2@C-SNA上双DNA酶完成行走的时间为40min。图3B给出了单DNA酶行走机制的对照实验结果。结果显示在QD2@C-SNA上单DNA酶完成行走需要60min,表明双DNA酶行走更快(节省1/3时间),利于实现快速、高灵敏的miRNA检测。
实施例4
QD2@C-SNA检测miRNA的比率荧光信号响应
配制多个100μL浓度为2mg/mL的QD2@C-SNA缓冲液(Zn2+浓度为200mM),等体积加入不同浓度的靶标miRNA(浓度分别为0fM、0.05fM、0.1fM、0.5fM、1fM、2fM、5fM、10fM、20fM、50fM、100fM、200fM),在37℃条件下反应70min后,测量荧光光谱。
靶标浓度依赖的QD2@C-SNA荧光光谱如图4所示。随着靶标miRNA浓度的不断增加,绿色量子点荧光逐渐恢复,红色量子点荧光保持恒定,绿色/红色荧光强度比从初始的1∶2变成2∶1,说明QD2@C-SNA为比率荧光传感器。
实施例5
QD2@C-SNA比率荧光传感器可视化检测miRNA的灵敏度和标准曲线
96孔板1-2行、3-4行、5-6行分别设定为miRNA-21、miRNA-25、miRNA-196a检测用。微孔中预置100μL浓度为2mg/mL的相应的QD2@C-SNA缓冲液(25mM,pH7.4,200mM Zn2+),等体积加入不同浓度的对应靶标,浓度从低到高依次为0fM、0.05fM、0.1fM、0.5fM、1fM、2fM、5fM、10fM、20fM、50fM、100fM、200fM,在37℃条件下反应70min后,肉眼观察微孔颜色变化,或利用CCD设备对微孔板进行成像。
微孔板检测结果如图5所示。对于三个靶标miRNA-21、miRNA-25、miRNA-196a,随着浓度的增加,QD2@C-SNA溶液的颜色均逐渐从红变黄再变绿。肉眼观察到靶标浓度<0.5飞摩为红色,1.0-10飞摩为黄色,20-200飞摩为绿色,可用于靶标miRNA半定量分析。对成像照片采用Image J软件进行绿色/红色强度比分析,绘制得到三种靶标miRNA的检测标准曲线,以三倍标准差计算出该可视化分析方法对miRNA的检测限均为0.1fM,线性范围为0.1fM-100fM,相关系数≥0.99。
实施例6
QD2@C-SNA检测miRNA的特异性
96孔板微孔中预置100μL浓度为2mg/mL的miRNA-21检测用QD2@C-SNA缓冲液(25mM,pH7.4,200mM Zn2+),分别等体积加入浓度均为100fM的miRNA-25、miRNA-196a、miRNA-21-1mut以及miRNA-21溶液,反应70min后,利用CCD设备对微孔板成像。无miRNA加入的微孔作为阴性对照。
微孔板检测结果如图6所示。相比于红色显示的对照组,分别加入miRNA-25,miRNA-196a和miRNA-21-1mut均不导致溶液颜色变化,只有靶标miRNA-21导致溶液变为绿色。
Image J图像分析结果显示,miRNA-25和miRNA-196a不导致绿色/红色强度比发生变化,miRNA-21-1mut仅导致荧光比率从1∶2变为1.5∶2,而靶标miRNA-21会导致荧光比率变为2∶1,说明该可视化分析方法检测miRNA具有高的特异性。
实施例7
QD2@C-SNA检测血清中的循环miRNAs
血清样本为正常人和非小细胞肺癌患者两种血清。提取血清试剂盒为血清/血浆miRNA提取分离试剂盒(DP503)。提取血清的步骤按照试剂盒中的说明书操作,分别提取正常人和非小细胞肺癌患者血清中总miRNA,浓缩20倍溶于无RNA酶的纯水中。
微孔板设定1-3列为正常人血清检测用,4-6列为非小细胞肺癌患者血清检测用,三个靶标分行设定同实施例5。预置相应QD2@C-SNA的微孔中分别加入2μL不同血清中提取的总miRNA溶液,反应70min,在紫外灯照射下肉眼观察微孔溶液颜色变化,或利用CCD设备对微孔板进行成像。
微孔板检测结果如图7所示。肉眼观察到正常人血清中三个循环miRNA均显示红色,而非小细胞肺癌患者血清中三个循环miRNA均显示绿色,定性检测结果为非小细胞肺癌患者血清中三个循环miRNA表达均显著上调。对微孔板照片进行Image J图像分析,可得到不同血清样本中三个循环miRNA导致的绿色/红色强度比,与图5中三个靶标检测标准曲线相对照,可计算出每微升正常人血清和非小细胞肺癌患者血清中3个靶标miRNA的拷贝数,在表2中列出。定量结果表明,相比于正常人血清,非小细胞肺癌患者血清中循环miRNA-21、miRNA-25、miRNA-196a分别上调了4.4倍,10.4倍和7.4倍。
表2正常人血清和肺癌患者血清中三种循环miRNA的含量
Claims (5)
1.一种双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器用于miRNA高灵敏可视化检测的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)制备双色量子点硅质体球形核酸(QD2@C-SNA)比率荧光传感器,双色量子点硅质体球形核酸(QD2@C-SNA)包括猝灭剂修饰的底物、包覆双色量子点的硅质体、与硅质体交联的捕获DNA和与捕获DNA杂交的双DNA酶,双色量子点分别置于硅质体亲水内腔和疏水双层中;所述猝灭剂修饰的底物为包含rA位点的发夹结构DNA;所述猝灭剂为BHQ系列;
(2)向荧光传感器中加入靶标miRNA,与QD2@C-SNA表面的捕获DNA杂交,触发QD2@C-SNA上双DNA酶自动化行走,介导产生比率荧光信号;
(3)检测QD2@C-SNA的荧光颜色,实现对miRNA的检测和可视化分析。
2.根据权利要求1所述的双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器用于miRNA高灵敏可视化检测的方法,其特征在于:步骤(1)中所述制备双色量子点硅质体球形核酸QD2@C-SNA比率荧光传感器的方法为:利用薄膜水化超声法制备包覆双色量子点的硅质体球,并化学交联猝灭剂修饰的底物、捕获DNA以及双DNA酶杂交双链,构建双色量子点硅质体球形核酸(QD2@C-SNA)比率荧光传感器。
3.根据权利要求2所述的双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器用于miRNA高灵敏可视化检测的方法,其特征在于:所述双色量子点为红、绿色II-VI族或III-V族量子点;
硅质体组成材料包括N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺硅质体前体有机硅烷(CFL)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG);所述捕获DNA为靶标miRNA互补序列,所述双DNA酶为金属离子特异性核酸酶,结合于捕获DNA的5’和3’端。
4.根据权利要求1所述的双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器用于miRNA高灵敏可视化检测的方法,其特征在于:步骤(2)加入的靶标miRNA与QD2@C-SNA表面的捕获DNA杂交,将原先结合的双DNA酶取代下来;被释放的双DNA酶分别识别邻近的底物,并结合金属离子后酶活性激活,特异性剪切底物上的rA位点,猝灭剂连接的底物片段被释放;剪切完成之后,DNA酶的上臂率先游离出来并识别下一个邻近的底物,进而带动下臂与该底物结合,实现自驱动行走;QD2@C-SNA表面底物全部被识别剪切后猝灭剂被释放,产生放大的疏水双层中的量子点荧光信号;靶标浓度依赖的疏水双层中的量子点荧光与恒定的亲水内腔中的量子点荧光信号相比较,产生双色量子点比率荧光。
5.根据权利要求1所述的双色量子点硅质体球形核酸比率荧光传感器用于miRNA高灵敏可视化检测的方法,其特征在于:步骤(3)中,在紫外灯照射下,QD2@C-SNA荧光传感器加入不同浓度靶标miRNA后产生比率荧光信号,采用肉眼或CCD设备检测荧光颜色,实现靶标miRNA的定性及半定量检测。
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CN112033942A (zh) | 2020-12-04 |
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