CN112029002A - 一种靶向cd19的嵌合抗原受体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向CD19的嵌合抗原受体，属于免疫治疗技术领域。该嵌合抗原受体包括依次串联CD8α分子信号肽、CD19单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内信号转导区以及通过自切割肽P2A连接的IL1RA。本发明选择CD19作为肿瘤靶标，并在此基础上设计新型高效副作用小的CAR序列，细胞因子风暴毒副作用小，抗肿瘤作用更强，CAR‑T细胞体内存活时间更长。
Description
技术领域
本发明是关于免疫学与分子生物学技术领域，特别是一种靶向CD19的嵌合抗原受体。
背景技术
恶性肿瘤是威胁人类健康及生命的一类常见病、多发病，具有发病率高、治疗时间长、费用高、疗效差等特点，给患者及社会都带来了沉重的负担。根治性手术治疗是早期癌症的首选治疗方式，但临床确诊的癌症多数处于进展期（ⅢB、Ⅳ期），失去了手术治疗的机会，5 年的生存率不足5%。化疗和放疗是治疗中晚期癌症的有效方法，但生存期的改善目前仍不乐观。主要是局部控制困难和存在远端转移,同时由于化疗和放疗缺乏特异性，取得疗效的同时也会给患者带来较大的毒副作用。因此，晚期癌症患者多数生活质量差，耗费大量的医疗费用，经济负担非常沉重，亟需一种更加安全有效的治疗方法。
免疫治疗技术是近年来随生物技术迅速发展而兴起的新一代肿瘤治疗技术,专家们一致认为免疫治疗技术是目前已知的唯一一种有望完全杀灭癌细胞的治疗手段，是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法；对手术治疗、放疗和化疗都无能为力的一些晚期肿瘤甚至可以达到完全治愈的效果，代表着当今世界上最先进的肿瘤治疗措施与理念。肿瘤免疫治疗的思路主要是两个方向，一是靶向肿瘤细胞，二是活化免疫细胞。当今肿瘤免疫治疗最有效最有市场前景的主要包括两大类，即CAR-T细胞疗法和免疫检查点抑制剂疗法。
CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy），即嵌合抗原受体T细胞疗法，它是通过基因工程改造和重新设计患者的免疫细胞，让T细胞装载能够识别肿瘤抗原的CAR，然后在体外扩增后输入肿瘤患者体内，使其可以特异性地识别肿瘤细胞，达到消灭肿瘤细胞的效果。CAR-T疗法的一个显著优点：理论上只需通过一次CAR-T细胞注射治疗,就可以达到一劳永逸的治愈效果。CAR-T细胞脱靶效应、CAR-T细胞在体内存活时间及细胞因子风暴副作用风险高的问题限制了CAR-T细胞的临床应用推广。
CD19是簇分化抗原的一种，是B细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原。CD19分布于全体B细胞、毛细胞白血病细胞等恶性B细胞、滤泡树状细胞上，因此是诊断B细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)和鉴定B细胞最好的标记。CD19是目前恶性血液肿瘤研究的最热门靶点之一。已有数款CD19 CAR-T细胞疗法被证实疗效显著，但都存在CAR-T细胞体内存活时间短、细胞因子风暴毒副作用风险高的问题。因而急需在此基础上设计新型高效副作用小的 CAR 序列，来最大限度发挥CAR-T细胞疗法能够精准杀伤、治愈肿瘤的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向CD19的嵌合抗原受体，从CAR序列设计上，解决CAR-T细胞脱靶效应、CAR-T细胞在体内存活时间及细胞因子风暴的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括依次串联CD8α分子信号肽、CD19单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内信号转导区以及通过自切割肽P2A连接的IL1RA。
对于上述嵌合抗原受体，作为优选，所述CD8α分子信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
优选地，所述CD19单链抗体依次包括轻链（VL）、连接区（Linker）和重链（VH），或依次包括重链（VH）、连接区（Linker）和轻链（VL），其中，所述轻链（VL）的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，连接区（Linker）的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，重链（VH）的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，形式为VL-Linker-VH的CD19单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
优选地，所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
优选地，所述跨膜区为ICOS，ICOS的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
优选地，所述胞内信号转导区包含41BB和CD3ζ胞内结构域，所述41BB胞内结构域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示，所述CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。
优选地，所述自切割肽P2A的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
优选地，所述IL1RA的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
优选地，终止密码子用TAA。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明在设计的序列中巧妙地引入IL-1RA基因，不仅不会影响CAR-T的疗效，更有可能大幅度地降低发生细胞因子风暴的风险，使治疗的安全性大大提高，能显著降低细胞因子风暴的设想已经在动物实验中得到验证, CAR-T的疗效也未受到任何影响；
（2）本发明可大幅延长CAR-T细胞在体内的存活时间。由于CAR-T细胞是一种工程化细胞，有可能在输入人体后不久就被免疫系统清除掉，难以起到有效的抗肿瘤效应, 这是CAR-T细胞疗法失败一个潜在的原因。CAR-T的分子设计可能会强烈地影响T细胞的扩增和持久性。本发明将常规CAR-T序列中的CD28跨膜结构域和随之CD28胞内区置换成ICOS跨膜结构域和胞内区，之后联接4-1BB胞内区序列，这种策略可以大大提高CAR-T细胞的持久性和抗肿瘤活性，促使患者体内的CAR-T产生更持久的抗肿瘤能力。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都落入本发明保护范围。实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括依次串联CD8α分子信号肽（CD8α signal peptide）、CD19单链抗体（CD19 scfv）、铰链区（IgG4Hinge）、跨膜区（ICOS TM）、胞内信号转导区（41BB- CD3ζ）以及通过自切割肽P2A连接的IL1RA，其结构为CD8α signal peptide- CD19 scfv- IgG4 Hinge- ICOS TM-41BB- CD3ζ-P2A-IL1RA，终止密码子用TAA，最终序列长度为2760bp。
所述CD8α分子信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述CD19单链抗体依次包括轻链（VL）、连接区（Linker）和重链（VH），其中，所述轻链（VL）的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，连接区（Linker）的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，重链（VH）的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，形式为VL-Linker-VH的CD19单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
所述跨膜区为ICOS，ICOS的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
所述胞内信号转导区包含41BB和CD3ζ胞内结构域，所述41BB胞内结构域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示，所述CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.9所示。
所述自切割肽P2A的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
所述IL1RA的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
本实施例中，该靶向CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 湖南利华生物科技有限公司
<120> 一种靶向CD19的嵌合抗原受体
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 2
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggactaagt tggaaata 318
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acaggctcca cctctggatc cggcaagccc ggatctggcg agggatccac caagggcgag 60
gtgaaa 66
<210> 4
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact 60
gtctcagggg tctcattacc cgactatggt gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag 120
ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt agtgaaacca catactataa ttcagctctc 180
aaatccagac tgaccatcat caaggacaac tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac 240
agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac tactgtgcca aacattatta ctacggtggt 300
agctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 5
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggactaagt tggaaataac aggctccacc tctggatccg gcaagcccgg atctggcgag 360
ggatccacca agggcgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 420
cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 480
tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 540
accacatact ataattcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 600
agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 660
gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 720
gtcaccgtct cctca 735
<210> 6
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgaattcct ggggggacca 60
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 120
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360
gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 600
gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660
aagagcctct ccctgtctct gggtaaa 687
<210> 7
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgttctggt tacccatagg atgtgcagcc tttgttgtag tctgcatttt gggatgcata 60
cttatttgtt ggcttacaaa aaagaagtat tcatccagtg tgcacgaccc taacggtgaa 120
tacatgttca tgagagcagt gaacacagcc aaaaaatcta gactcacaga tgtgacccta 180
<210> 8
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtggtggtg gttctaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 60
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 120
gaagaaggag gatgtgaact g 141
<210> 9
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtggtggtg gttctagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 60
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 120
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct 180
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 240
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 300
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgc 354
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 11
<211> 531
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggaaatct gcagaggcct ccgcagtcac ctaatcactc tcctcctctt cctgttccat 60
tcagagacga tctgccgacc ctctgggaga aaatccagca agatgcaagc cttcagaatc 120
tgggatgtta accagaagac cttctatctg aggaacaacc aactagttgc tggatacttg 180
caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag atagatgtgg tacccattga gcctcatgct 240
ctgttcttgg gaatccatgg agggaagatg tgcctgtcct gtgtcaagtc tggtgatgag 300
accagactcc agctggaggc agttaacatc actgacctga gcgagaacag aaagcaggac 360
aagcgcttcg ccttcatccg ctcagacagt ggccccacca ccagttttga gtctgccgcc 420
tgccccggtt ggttcctctg cacagcgatg gaagctgacc agcccgtcag cctcaccaat 480
atgcctgacg aaggcgtcat ggtcaccaaa ttctacttcc aggaggacga g 531
<210> 12
<211> 2760
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacta agttggaaat aacaggctcc acctctggat ccggcaagcc cggatctggc 420
gagggatcca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 480
tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 540
agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 600
gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 660
aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 720
tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 780
tcagtcaccg tctcctcaga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct 840
gaattcctgg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 900
atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 960
gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1020
gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1080
tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 1140
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc 1200
ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1260
taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1320
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 1380
gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1440
cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtaaaatgtt ctggttaccc 1500
ataggatgtg cagcctttgt tgtagtctgc attttgggat gcatacttat ttgttggctt 1560
acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga 1620
gcagtgaaca cagccaaaaa atctagactc acagatgtga ccctaggtgg tggtggttct 1680
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1740
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1800
gaactgggtg gtggtggttc tagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1860
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1920
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag 1980
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 2040
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 2100
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 2160
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 2220
ggacctatgg aaatctgcag aggcctccgc agtcacctaa tcactctcct cctcttcctg 2280
ttccattcag agacgatctg ccgaccctct gggagaaaat ccagcaagat gcaagccttc 2340
agaatctggg atgttaacca gaagaccttc tatctgagga acaaccaact agttgctgga 2400
tacttgcaag gaccaaatgt caatttagaa gaaaagatag atgtggtacc cattgagcct 2460
catgctctgt tcttgggaat ccatggaggg aagatgtgcc tgtcctgtgt caagtctggt 2520
gatgagacca gactccagct ggaggcagtt aacatcactg acctgagcga gaacagaaag 2580
caggacaagc gcttcgcctt catccgctca gacagtggcc ccaccaccag ttttgagtct 2640
gccgcctgcc ccggttggtt cctctgcaca gcgatggaag ctgaccagcc cgtcagcctc 2700
accaatatgc ctgacgaagg cgtcatggtc accaaattct acttccagga ggacgagtaa 2760
Claims (9)
1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括依次串联CD8α分子信号肽、CD19单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内信号转导区以及通过自切割肽P2A连接的IL1RA。
2.如权利要求1所述的一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8α分子信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD19单链抗体依次包括轻链（VL）、连接区（Linker）和重链（VH），或依次包括重链（VH）、连接区（Linker）和轻链（VL），其中，所述轻链（VL）的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，连接区（Linker）的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，重链（VH）的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，形式为VL-Linker-VH的CD19单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
4.如权利要求1所述的一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
5.如权利要求1所述的一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述跨膜区为ICOS，ICOS的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
6.如权利要求1所述的一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述胞内信号转导区包含41BB和CD3ζ胞内结构域，所述41BB胞内结构域的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.8所示，所述CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。
7.如权利要求1所述的一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述自切割肽P2A的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
8.如权利要求1所述的一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述IL1RA的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
9.如权利要求1所述的一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：终止密码子用TAA。
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