CN113912726B

CN113912726B - 一种抗cd16和cea抗原的双特异性抗体

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Publication number: CN113912726B
Application number: CN202111323503.9A
Authority: CN
Inventors: 宋海鹏; 刘原源; 于建立; 王准; 曹慧; 古一; 李飞; 张霞; 蒋立仲; 宋亮
Original assignee: Shenzhen Guochuang Nano Antibody Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Guochuang Nano Antibody Technology Co ltd
Priority date: 2021-11-08
Filing date: 2021-11-08
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2041-11-08
Also published as: CN113912726A

Abstract

本发明公开了一种抗CD16抗原的纳米抗体，以及含有两种VHH结构域的双特异性抗体。所述抗CD16抗原的纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。所述双特异性抗体由两条不同序列的重链融合而成，分别识别NK细胞表面的CD16抗原和癌胚抗原CEA。且该双特异性抗体能够显著增强抗体介导的NK细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性。

Description

一种抗CD16和CEA抗原的双特异性抗体

技术领域

本发明公开了一种多肽，更具体地，公开了一种抗体，属于免疫学领域。

背景技术

癌胚抗原(CEA，又称为CEACAM-5或CD66e)是一种具有约180kDa分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员，并且含有经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的7个域。7个域包括单一N端Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域(A1-B1-A2-B2-A3-B3)。CEA最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。CEA的过量表达在许多类型的癌症中观察到，包括结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌。因此，CEA已经被鉴定为肿瘤相关抗原。CEA容易自细胞表面切割，并直接或经由淋巴系统自肿瘤脱落入血流中。由于此特性，已经使用血清CEA的水平作为临床标志物以诊断癌症并筛选癌症。而且，CEA也已被用作肿瘤标记，测量癌症患者血液中升高的CEA的免疫学测定法已在临床上用于癌症的预后和控制。

更重要的是，CEA已成为用于靶向治疗的肿瘤相关抗原。已经报道的使用CEA靶向免疫治疗癌症主要有2种方法。一种方法是使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性，特别是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)，以消除表达CEA的肿瘤细胞。另一种方法是通过抗CEA抗体或抗体片段与药物、毒素、放射性核苷酸、免疫调节剂或细胞因子等效应分子缀合，特异性靶向表达CEA的肿瘤细胞，从而发挥效应分子的治疗作用。我们都知道，自然杀伤细胞(natural killer，NK cells)是机体具有细胞毒性的免疫细胞之一，表达CD56和CD16，在肿瘤的免疫治疗中发挥抗肿瘤效应。NK细胞可以在未致敏的情况下，具有很强的杀伤肿瘤细胞和病毒感染性细胞的活性。一个NK细胞可以裂解体积超过其几倍的肿瘤细胞。最近的研究表明，与活化的T淋巴细胞不同，NK细胞更倾向于杀伤肿瘤干细胞[Ames E，Canter RJ，Grossenbacher SK，et al.NK cells preferentially targettumor cells with a cancer stem cell phenotype.The Journal of Immunology，2015,195(8):4010-4019]。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中发挥抗肿瘤效应的重要机制之一就是ADCC作用。而CD16分子就是NK细胞启动ADCC效应过程中不可或缺的条件，在许多基于抗CD16抗体的肿瘤治疗中，由于只能特异性连接一个抗原靶点，其特异性相对较低，易产生脱靶效应。

双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2种不同的抗原。利用双特异性抗体，可以研发同时针对肿瘤细胞和NK细胞的双特异性抗体，在识别肿瘤细胞抗原，中和肿瘤细胞标志物从而阻断其诱导肿瘤细胞增殖等效应的同时，识别免疫细胞，将免疫细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，如CEA抗原和NK细胞的CD16抗原。

1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H₂)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。

相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。

纳米抗体来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质例如处于极端温度和pH环境中的稳定性，使之可以低成本制造大产量，而且可以克服传统抗体实体肿瘤渗透性差，靶向效应低等固有缺陷。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。

基于在肿瘤治疗领域现有技术出现的单一识别位点或者传统抗体分子较大难以到达作用细胞等问题，本发明的目的就是提供一种同时针对肿瘤细胞和NK细胞的双特异性纳米抗体，在识别癌细胞的CEA抗原，抑制CEA诱导肿瘤细胞增殖等作用的同时，特异性识别NK细胞，将NK细胞引导到肿瘤细胞的附近，加强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗NK细胞表面抗原CD16的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ IDNO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQID NO.3所述氨基酸序列组成。

在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成。在本发明中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例为纳米抗体6C5。

其次，本发明还提供了一种编码上述纳米抗体的核酸，所述核酸的序列由SEQ IDNO.5所示。

第三，本发明提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pMES4。

第四，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

第五，本发明还提供了一种双特异性纳米抗体，所述双特异性抗体含有第一重链和第二重链，所述第一重链的可变区识别CD16抗原，其可变区序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成；所述第二重链的可变区识别CEA抗原，其可变区序列由SEQ ID NO.6所述氨基酸序列组成。

在一个优选的技术方案中，所述第一重链和第二重链之间设有连接肽，所述连接肽为(G₄S)_n，其中n为1-6之间的整数。

更为优选地，所述n＝4，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

第六，本发明还提供了一种编码上述双特异性抗体的核酸，所述核酸的序列由SEQID NO.9所示。

尤为优选地，在所述双特异性抗体的羧基端还带有抗体恒定区，其恒定区序列如SEQ ID NO.8所述的氨基酸序列所示。

第七，本发明还提供了一种编码上述带有恒定区的双特异性抗体的核酸，所述编码序列由SEQ ID NO.10所示。

第八，本发明提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pFUSEhIgG1-Fc2。

第九，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为HEK293细胞。

最后，本发明还提供了所述抗NK细胞表面抗原CD16的纳米抗体以及上述的双特异性抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明提供的抗CD16纳米抗体具有较高的亲和力，双特异性纳米抗体可以分别识别CEA抗原和NK细胞表面的CD16抗原。在针对LoVo的ADCC细胞毒性实验中，本发明提供的双特异性抗体显示出了优异的细胞毒性，显著增强抗体介导的NK细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性，其杀伤率达到89％，高于CEA抗体和CD16抗体的联合应用，更显著高于两种抗体的单独应用。且本发明提供的双特异性抗体与单独纳米抗体相比具有较长的体内半衰期，这显示出本发明的双特异性抗体在临床治疗CEA抗原阳性的肿瘤以及药物制备领域的应用价值。

附图说明

图1.提取的总RNA电泳鉴定图；

图2.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；

图3.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；

图4.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；

图5.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；

图6.纳米抗体6C5纯化SDS-PAGE图；

图7.Biacore分析纳米抗体6C5亲和力曲线图；

图8.双特异性抗体纯化SDS-PAGE图；

图9.Western blot检测双特异性抗体结果图；

图10.ADCC细胞毒性试验结果图；

图11.双特异性抗体与纳米抗体在兔体内的代谢曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

实施例1.抗CD16单价纳米抗体的制备

1.1羊驼的免疫

选取健康成年羊驼一只，将重组人源CD16抗原(厂家：abcam，货号为ab151819)与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血10ml，用于构建噬菌体展示文库。

1.2驼源淋巴细胞的分离

将采集的羊驼外周血利用骆驼外周血淋巴细胞分离液试剂盒(天津灏洋公司，货号LTS1076)说明书操作进行分离淋巴细胞，每2.5×10⁷个活细胞加入1ml RNA分离试剂，取1ml进行RNA提取，其余-80℃保存。

1.3总RNA提取

将含有淋巴细胞的1ml Tipure Isolation Reagent反复吹打，放置5分钟；加入200μl氯仿，涡旋30秒后继续放置5分钟；4℃，12000g离心15分钟，吸取水相转入新的EP管中；加入等量异丙醇，放置10分钟；4℃，12000g离心10分钟，弃上清；用1ml预冷的70％乙醇洗涤，4℃，7500g离心5分钟，弃上清并干燥5分钟；加入30μl RNase-free水溶解沉淀，调整浓度到1μg/μl进行凝胶电泳检测，结果见图1。

1.4反转录合成cDNA

根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcripor first stand cDNAsynthesis KIT)以1.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。

1.5抗体可变区基因扩增

将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：

CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG

CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

PCR反应条件及程序为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，57℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；72℃ 7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl(图2：M为Trans 2K DNA Marker；1为阴性对照；2为第一轮PCR产物)。第二轮PCR的引物序列如下：

VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

PCR反应条件及程序为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，15个循环；72℃ 7分钟。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物(图3：M为Trans 2K DNA Marker；1为第二轮PCR产物；2为阴性对照)。

1.6载体构建

将pMES4(购自Biovector)与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μl T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μl总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μl水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果(图4：M为Trans 5K plus DNAMarker；1为pMES4载体未酶切质粒；2为pMES4载体双酶切后产物)。

1.7电转化及库容测定

取10μl纯化后的连接产物，加入到含有50μl大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定(图5：M为Trans 2K DNA Marker；17为阴性对照；1-16为随机挑选的单克隆PCR鉴定产物)。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。引物序列如下：

MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG；

GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG。

1.8噬菌体扩增

取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD₆₀₀＝0.5。取出10ml菌液加入4×10¹⁰VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。

测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD₆₀₀＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。

噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100

1.9纳米抗体筛选

通过ELISA方法以抗原筛选阳性克隆。以抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。

1.10纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化

挑选噬菌体ELISA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。

通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，筛选出抗CD16的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(Complementary Determining Regions，CDR)。

本发明筛选到的一个优选实施方案的纳米抗体被命名为“6C5”。通过DNA测序，所述纳米抗体6C5重链核酸序列为SEQ ID NO.5所示，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，其中第1-25位氨基酸序列为FR1，第26-33位氨基酸序列为CDR1，第34-50位氨基酸序列为FR2，第51-58位氨基酸序列为CDR2，第59-96位氨基酸序列为FR3，第97-106位氨基酸序列为CDR3，第107-117位氨基酸序列为FR4。

实施例2.纳米抗体6C5的制备

2.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)

将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1:1000比例接种于5ml新鲜的LB-A培养基，37℃ 200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μl转化于100μl感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μl，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。

2.2纳米抗体的诱导表达

挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1:100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD₆₀₀＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5ml的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0ml TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5ml的上清(周质提取物)。

2.3纳米抗体的纯化和鉴定

将IMAC Sepharose(GE公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30分钟，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1M)，按照约8秒/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6秒/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6秒/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测(图6:M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为诱导表达后原液；2-6为洗涤液；7为纯化后的纳米抗体6C5)。

实施例3.纳米抗体与抗原的亲和活性测定

3.1芯片抗原偶联

将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5，pH 4.0)配制成20μg/ml的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。

3.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化

采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30μl/分钟。进样条件均为120秒，30μl/分钟。再生条件均为30秒，30μl/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/ml，150μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，20μg/ml，10μg/ml，2μg/ml。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/ml分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。

3.3亲和力测试

按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60秒，30μl/min；解离时间：600秒；再生条件：30秒，30μl/min)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200分钟。

3.4结果分析

选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数(见图7)。抗CD16纳米抗体6C5的亲和力数值为6.680E-11。

实施例4.抗CEA和CD16双特异性纳米抗体的制备

pFUSE hIgG1-Fc2载体(青岛捷世康生物，货号JR442)上自表达人源IgG1的Fc片段，将双特异性抗体连入pFUSE hIgG1-Fc2，即可获得带有恒定区的双特异性抗体。具体操作为：抗CEA纳米抗体的氨基酸序列参照中国发明专利CN106946989A中的纳米抗体11C12的氨基酸序列。选取抗CEA纳米抗体11C12和抗CD16纳米抗体6C5进行蛋白融合表达，将两个抗体的重链可变区利用柔性多肽(GGGS)₄连接后送往华大基因公司进行基因合成。合成后的基因两端保留EcoRⅠ和BglⅡ两个限制性内切酶位点，且连接在pUC57载体上获得pUC57-11C12-(GGGS)₄-6C5。利用EcoRⅠ和BglⅡ将融合纳米抗体的目的片段切割下来，通过T4连接酶连接入pFUSE hIgG1-Fc2载体，构建重组质粒pFUSE hIgG1-Fc2-11C12-(GGGS)₄-6C5，转化DH5α感受态后利用无内毒素大提试剂盒(天根公司)提取质粒。转染人293细胞，采用Protein A层析的方法从293细胞的培养上清中纯化双特异性纳米抗体，并将纯化后的双特异性纳米抗体进行SDS-PAGE分析(图8：M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为纯化后的双特异性纳米抗体)。

实施例5.Western blot检测双特异性抗体的功能

将重组CEA抗原(华大基因合成，GenBank:CAE75559.1)和重组CD16抗原(厂家：abcam，货号为ab151819)进行SDS-PAGE，而后进行转膜，恒流电泳45min，电流大小为23mA(电流为膜面积的1倍)；电泳结束后5％脱脂奶粉室温封闭5h；TBST洗膜三次后，对NC膜进行一抗孵育，抗体稀释度(抗体初浓度为1mg/ml)为1:2000，4℃孵育过夜；洗膜三次后对NC膜进行二抗孵育，二抗使用HRP标记的兔抗羊驼VHH(厂家：金斯瑞，货号为A01861)或HRP标记的兔抗人IgG(厂家：abcam，货号为ab6759)，室温孵育2h；洗膜三次后对NC膜进行DAB显色，室温显色10min后使用蒸馏水终止反应。结果见图9所示。双特异性抗体可同时结合CEA抗原和CD16抗原，而11C12只能结合CEA抗原，6C5只能结合CD16抗原。

实施例6.ADCC细胞毒性试验

6.1白细胞分离

取静脉血2ml，放入加有抗凝剂的试管中，轻轻混匀。将试管直立静置于室温或37℃温箱中30-60min，待红细胞自然沉降。此时可见试管中的悬液分3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈灰白色的白细胞层(PMBC)。用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中。加入无Ca²⁺、Mg²⁺Hank’s液至离试管口3cm处，混匀，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，相同方法洗涤两次。沉淀细胞用适量10％-20％灭活小牛血清的Hank’s液重悬，计数，配成所需的细胞浓度的悬液，一般常用2×10⁶/ml。

6.2肿瘤细胞的培养

将高表达CEA的LoVo细胞(人结肠癌细胞，浙江省医学科学院实验动物中心赠与)在含10％胎牛血清中的RPMI-1640培养基中培养至75-80％的密度，弃培养基，用预热至37℃的PBS洗涤细胞2次，加2ml胰蛋白酶-EDTA溶液，室温放置5min，加2ml含10％胎牛血清的培养基终止反应，采用一次性的无菌吸管反复吹打细胞至单细胞悬液，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，PBS再洗涤两次，计数后，用培养基重悬细胞至2×10⁶个/ml备用。

6.3细胞毒性试验

取重悬肿瘤细胞10μl(2×10⁴个)，加入含0.1％BSA的RPMI-1640培养基30μl，然后分别加入不同的抗体10μl(1mg/ml)，37℃孵育30min，然后加入5×10⁵个(效应细胞/靶细胞＝25)PMBC，体积为250μl，37℃孵育4h，以水平离心机2000r/min离心10min，取上清采用Roche细胞毒性检测试剂盒检测上清中LDH的活性以换算成肿瘤细胞的死亡程度，试剂盒的货号为：11644793001。结果如图10所示。

如图10所示，纵坐标为LoVo细胞的死亡率，横坐标1-6号样本依次为PMBC+双特异性抗体、PMBC+11C12+6C5、PMBC+11C12、PMBC+6C5、单纯的PMBC和单纯的PBS组。本发明提供的双特异性抗体为柱1，其显著增强抗体介导的NK细胞杀伤LoVo细胞的活性，显示出了优异的细胞毒性，杀伤率高达89％(横坐标6种样本的杀伤率依次为89％、74％、55％、49％、15％和3％)，高于抗CEA纳米抗体11C12和抗CD16纳米抗体6C5的联合应用，更显著高于两种抗体的单独应用，这显示出本发明的双特异性抗体在临床治疗CEA抗原阳性的肿瘤的应用价值。

实施例7.双特异性纳米抗体在家兔血浆中的代谢

本实施例以新西兰兔为对象，进行药物代谢动力学的初步研究，每6只新西兰兔为一组，采取背部皮下给药，双特异性纳米抗体和抗CEA纳米抗体11C12和抗CD16纳米抗体6C5的给药剂量均为1nmol/kg。给药后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、120h、144h进行耳缘静脉采血，分离血清进行抗体滴度的测定，绘制药物滴度时间曲线，结果见图11所示。

结果显示纳米抗体在72h后基本已经代谢完毕，纳米抗体处于较低水平，而双特异性抗体在72h后仍然具有明显滴度，具有治疗效果。使用GraphPad Prism软件分析药物代谢动力学参数，结果见表1。

表1.纳米抗体和双特异性抗体的家兔体内药物代谢动力学参数

表1中，t_max是指抗体滴度达到最大时的时间；t_1/2是指抗体达到最大浓度后代谢掉一半时的时间。从表中可以看到，双特异性抗体在新西兰兔体内的半衰期长达48小时，明显长于纳米抗体的24小时和双纳米抗体给药的36小时。

序列表

<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司

<120> 一种抗CD16和CEA抗原的双特异性抗体

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 2

Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 3

Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 351

<212> DNA

<213> Lama pacos

<400> 5

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggagga gtggtgcagc ccggcggctc tctgaggctg 60

agctgcgccg cctctggctt caccttcgac gactacggca tgagctgggt gaggcaggcc 120

ccaggcaagg agcgtgagtg ggtggccggc atcaactgga acggcggcag cacaggctat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acccgaggac acagccgtgt attactgcgc caggggcagg 300

agcctgctgt tcgactactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc a 351

<210> 6

<211> 115

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Gly Arg Trp Asp Arg Leu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Lys Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ala His Asn Gly Arg Gly Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 252

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Gly Arg Trp Asp Arg Leu

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser Thr Gly

180 185 190

Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Thr Lys Leu Lys

210 215 220

Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala His Asn Gly Arg Gly

225 230 235 240

Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 8

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 9

<211> 756

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggagga gtggtgcagc ccggcggctc tctgaggctg 60

agctgcgccg cctctggctt caccttcgac gactacggca tgagctgggt gaggcaggcc 120

ccaggcaagg agcgtgagtg ggtggccggc atcaactgga acggcggcag cacaggctat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acccgaggac acagccgtgt attactgcgc caggggcagg 300

agcctgctgt tcgactactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc aggaggagga 360

ggatcaggtg gaggtggaag cggaggagga ggttctggag gtggaggaag ccaggtgcag 420

ctgcaggagt ctggaggagg cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgca 480

gcctctggat tcaccttcag tagctatacc gggaggtggg accgcttggc tccagggaag 540

gagcgcgagt tggtcgcaac tattactagt actggtggta gtacaaatta tgcagactcc 600

gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aatgccaaga acacgatata tctgcaaatg 660

acgaaactga aacctgacga cacggccgtg tattactgtg tcgcccataa tggtaggggc 720

tacttcggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctca 756

<210> 10

<211> 1437

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggagga gtggtgcagc ccggcggctc tctgaggctg 60

agctgcgccg cctctggctt caccttcgac gactacggca tgagctgggt gaggcaggcc 120

ccaggcaagg agcgtgagtg ggtggccggc atcaactgga acggcggcag cacaggctat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acccgaggac acagccgtgt attactgcgc caggggcagg 300

agcctgctgt tcgactactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc aggaggagga 360

ggatcaggtg gaggtggaag cggaggagga ggttctggag gtggaggaag ccaggtgcag 420

ctgcaggagt ctggaggagg cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgca 480

gcctctggat tcaccttcag tagctatacc gggaggtggg accgcttggc tccagggaag 540

gagcgcgagt tggtcgcaac tattactagt actggtggta gtacaaatta tgcagactcc 600

gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aatgccaaga acacgatata tctgcaaatg 660

acgaaactga aacctgacga cacggccgtg tattactgtg tcgcccataa tggtaggggc 720

tacttcggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctcagaca aaactcacac atgcccaccg 780

tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 840

gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 900

gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 960

acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1020

ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1080

ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1140

tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1200

gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1260

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1320

aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1380

cacgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1437

Claims

1.一种抗NK细胞表面抗原CD16的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ IDNO.4所述氨基酸序列组成。

3.一种编码权利要求2所述纳米抗体序列的核酸，其特征在于，所述核酸的序列由SEQID NO.5所示。

4.一种含有权利要求3所述的核酸的表达载体，其特征在于，所述载体为pMES4。

5.一种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

6.一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体含有第一重链和第二重链，所述第一重链的可变区识别CD16抗原，其可变区序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成；所述第二重链的可变区识别CEA抗原，其可变区序列由SEQ ID NO.6所述氨基酸序列组成。

7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一重链和第二重链之间设有连接肽，所述连接肽为（G₄S）_n，其中n为1-6之间的整数。

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其特征在于，所述n=4，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

9.一种编码权利要求8所述双特异性抗体的核酸，所述序列由SEQ ID NO.9所示。

10.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，在所述双特异性抗体的羧基端还带有抗体恒定区，其恒定区序列如SEQ ID NO.8所述的氨基酸序列所示。

11.一种编码权利要求10所述双特异性抗体的核酸，所述序列由SEQ ID NO.10所示。

12.一种含有权利要求11所述核酸的表达载体，其特征在于，所述载体为pFUSE hIgG1-Fc2。

13.一种含有权利要求12所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293细胞。

14.权利要求1或2所述的抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。

15.权利要求6-8，10任一所述的抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。