CN112022858B - 中药单体化合物组合在改善认知功能中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了中药单体化合物在改善老年痴呆患者认知功能中的应用，中药单体化合物包括山奈酚、大黄酚和甘草次酸。本发明的动物实验证明，山奈酚、大黄酚和甘草次酸的两两组合可显著改善老年痴呆小鼠的认知功能和抑郁状态，可作为临床上治疗老年痴呆的候选药物。

Description

中药单体化合物组合在改善认知功能中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及中药单体化合物组合在改善认知功能中的应用。
背景技术
随着社会不断发展，人类寿命延长，老年人占比越来越高，痴呆患者也越来越多，60岁及以上老年人痴呆患病率为5％-8％，并且预计患病人数会持续增长，到2030年将达8200万，2050年将达1.52亿，大部分可归因于生活在低收入和中等收入国家的痴呆患者人数增加。在我国，接近60％的老年人生活在农村，流行病学调查显示农村老年人痴呆的患病率明显高于城市老年人。
痴呆是一种慢性进行性综合征，是在智能已获得相当发展之后，因脑部伤害或疾病所致的继发性智能减退，通常是认知功能(即处理思想的能力)出现比正常年老过程更严重的衰退。它会影响记忆、思考、定向、理解、计算、学习、语言和判断能力，但不会影响意识。认知能力损伤通常伴有情感控制能力、社会行为和动机衰退，或晚于上述几种状况出现。年龄不满18岁不能诊断为痴呆。痴呆是全世界老年人残疾和依赖他人的主要原因之一。它不仅给痴呆症患者而且给其护理者和家庭带来巨大压力。由于痴呆是逐步发病，其早期常常被忽略，常见症状包括健忘、失去时间感、在熟悉的地方迷路。随着痴呆发展到中期，体征和症状更为清晰，对患者的限制更大，包括对最近的时间和人名健忘、在家里迷路、沟通困难增加、需要个人护理人员的帮助、经历行为变化，包括精神恍惚和反复提问。而晚期痴呆患者近乎完全依赖他人照顾，几乎完全不活动，出现严重记忆障碍，身体上的体征和症状越发明显，包括走路困难、无法感知时间和地点、辨认亲戚朋友存在困难、自我护理方面越来越需要协助、行为具有攻击性等。
痴呆存在多种不同形式，其中阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的形式，占痴呆病例的60-70％。其他主要形式包括血管性痴呆(vascular dementia,VaD)、路易体痴呆(dementia of Lewy body，DLB)(神经细胞内出现蛋白质异常聚集)和一组导致额颞叶痴(fronto-temprol dementia，FTD)(大脑额叶恶化)的疾病。不同形式的痴呆之间界线并不分明，混合形式的痴呆常同时存在。
痴呆病因复杂，影响因素诸多，近年来，越来越多的研究表明老年期痴呆的发生发展过程涉及到各种复杂的调控网络及调控因子，因此，针对单一靶点的化合物可能疗效并不显著。临床研究发现作用于多个靶点的药物对于某些疾病的防治可以取得更好的效果。多靶点药物治疗在临床上有三种方式：一是通过联合用药、二是通过复方制剂、三是通过针对多靶点的单一药物分子。因此，从中药复方制剂中寻找新的单体药物并进行组合是有效防治痴呆的重要策略和途径。
山奈酚(kaempferol)是一种黄酮类化合物，又名山奈酚-3，山奈素、山奈黄酮醇，结构式如Ⅰ所示，分子式C15H10O6，相对分子量286.24，CAS号520-18-3。研究表明，山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、防癌抗癌、抑制肥胖等生物活性。
Figure BDA0002700384710000021
大黄酚(chrysophanol)是一种蒽醌类化合物，学名1,8-二羟基-3-羟甲基蒽醌(1,8-Dihydroxy-3-methylanthraquinone)，结构式如Ⅱ所示，分子式C15H10O4，相对分子量254.24，CAS号481-74-3。大黄酚具有广泛的生物活性，如抗心肌缺血，改善脂肪代谢、抗炎、利尿、抗癌及较明显的止咳作用和神经保护作用等。
Figure BDA0002700384710000022
Figure BDA0002700384710000031
甘草次酸(β型)(18beta-glycyrrhetinic acid)是通过前体甘草酸水解得到，结构式如Ⅲ所示，分子式C30H46O4，相对分子量470.68，CAS号471-53-4，具有多种药理活性，包括抗炎、抗菌、改善中枢神经兴奋性、恢复骨髓造血功能、保肝等。
Figure BDA0002700384710000032
目前，三种单体药改善痴呆的相关研究并未见报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种包括山奈酚、大黄酚、甘草次酸中任意两种单体化合物的药物组合，所述药物组合对认知功能改善和老年痴呆治疗具有低毒高效的作用。
本发明的目的之二在于提供含有上述药物组合的治疗药物。
本发明的目的之三在于提供上述药物组合的用途。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种药物组合，所述药物组合是选自以下组中的任意两种单体化合物的组合：山奈酚、大黄酚、甘草次酸；
优选地，山奈酚包括山奈酚、山奈酚衍生物。
优选地，大黄酚包括大黄酚、大黄酚衍生物。
优选地，甘草次酸包括甘草次酸、甘草次酸衍生物。
所述山奈酚衍生物包括具有相同药理活性的山奈酚选择性取代类似物，其可药用的盐或酯。还可包括其可药用的盐的溶剂化物。
所述大黄酚衍生物为具有相同药理活性的大黄酚选择性取代类似物，可药用的盐或酯。还可包括其可药用的盐的溶剂化物。
所述甘草次酸衍生物为具有相同药理活性的甘草次酸选择性取代类似物，可药用的盐或酯。还可包括其可药用的盐的溶剂化物。
进一步，所述甘草次酸属于β型。
进一步，所述药物组合中的两种单体化合物的质量比例是1：1。
根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种改善认知功能的药物，所述药物包括前面所述的药物组合以及药用辅料。
“药用辅料”是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。在本发明提供的药物中添加的药用辅料，能够起到赋形、充当载体或提高稳定性的作用，此外，还具有增溶、助溶或缓控释等重要功能。
典型但非限制性的药用辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂或释放阻滞剂中的一种或多种。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。
本发明的所述药物剂型包括片剂、胶囊剂、溶液剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、针剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、贴剂、缓释制剂、控释制剂或靶向制剂。优选地，所述药物剂型是片剂。
制备片剂时所用药用辅料包括但不限于：
(1)填充剂或稀释剂，即用来增加片剂重量或者体积，从而便于压片，包括淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、无机盐类、甘露醇；
(2)润湿剂或粘合剂，润湿剂是指赋形剂本身无粘性，但能诱发制软材药物的粘性，从而达到制粒、压片的目的的辅料，包括蒸馏水、乙醇；粘合剂是指对无粘性或粘性不足的物料给予粘性，从而使物料聚结成粒的辅料，包括淀粉浆、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚维酮、明胶、聚乙二醇、50％-70％的蔗糖溶液、海藻酸钠溶液；
(3)崩解剂，是指促片剂在胃肠液中迅速破裂成细小颗粒的辅料，包括干淀粉、羧甲淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮；
(4)润滑剂，即助流剂、抗粘剂和润滑剂(狭义)的总称，其中助流剂，指降低颗粒之间摩擦力，从而改善粉体流动性，减少重量差异的辅料；抗粘剂是指防止压片时物料黏着于冲头与冲模表面，以保证压片操作顺利进行以及片剂表面光洁的辅料；润滑剂(狭义)是指降低压片和推出片是药片与冲模壁之间的摩擦力，以保证压片时应力分布均匀，防止裂片的辅料；润滑剂包括：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类如PEG4000、PEG6000、月桂醇硫酸钠。
所述的辅料还可以含有着色剂、矫味剂；着色剂是指是药品具有颜色的辅料，包括药用级或食用级色素，包括叶绿素、焦糖、朱苋菜红、柠檬黄、胭脂红、靛蓝，其含量在药物组合物中不超过0.05％。矫味剂系指药品中用以改善或屏蔽药物不良气味和味道，使病人难以觉察药物的强烈苦味(或其它异味如辛辣、刺激等等)的药用辅料，包括蔗糖、甜橘苷、糖精钠、蛋白糖、山梨醇、阿斯巴甜、乙酰舒泛-k。
本发明的上述药物的制备方法不做严格限制，如可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。
本发明涉及的药物中的活性化合物的剂量水平取决于具体化合物的活性、给药途径、待治疗疾病的严重程度以及待治疗患者的情况和前病史。
本发明的药物的给药途径包括但不限于以下方式：经胃肠道给药，例如口服给药；不经胃肠道给药，例如肌肉注射给药、静脉注射给药或经皮给药。优选口服给药。
根据本发明的第三个方面，本发明还提供了一种包含前面所述的改善认知功能的药物和说明书的药盒。
进一步，所述药盒还可以包括施用药物所需的工具，所述工具可以是注射器、插管等。
根据本发明的第四个方面，本发明还提供了山奈酚、大黄酚或甘草次酸在制备前面所述的药物组合中的应用。
根据本发明的第五个方面，本发明提供了前面所述的药物组合在制备改善认知功能的药物中的应用。
根据本发明的第六个方面，本发明提供了前面所述的药物组合在制备改善抑郁情绪的药物中的应用。
根据本发明的第七个方面，本发明提供了前面所述的药物组合在制备预防或治疗认知功能损伤患者的药物中的应用。
进一步，所述认知功能损伤患者包括老年痴呆患者。
更进一步，所述老年痴呆包括阿尔茨海默病、血管性痴呆、路易体痴呆、导致大脑额叶恶化的疾病。
根据本发明的第八个方面，本发明提供了一种改善认知功能的方法，所述方法包括如下步骤：
将前面所述的药物组合中的一种单体化合物和另一种单体化合物联合施用到需要治疗的对象中，其中两种单体化合物可以同时施用到需要治疗的个体中，也可以分别施用到需要治疗的个体中，还可以依次施用到需要治疗的个体中，例如先施用一种单体化合物，间隔一定时间再施用另一种单体化合物。
本发明的联合用药物的施用对象包括哺乳动物或所述哺乳动物的神经细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。所述对象可以是认知功能损伤的患者，或者为认知功能损伤患者的离体神经细胞。
根据本发明的第九个方面，本发明提供了一种治疗认知功能损伤患者的方法，所述方法包括如下步骤：
将前面所述的药物组合中的一种单体化合物和另一种单体化合物联合施用到需要治疗的对象中，其中两种单体化合物可以同时施用到需要治疗的个体中，也可以分别施用到需要治疗的个体中，还可以依次施用到需要治疗的个体中，例如先施用一种单体化合物，间隔一定时间再施用另一种单体化合物。
本发明的联合用药物的施用对象包括哺乳动物或所述哺乳动物的神经细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。所述对象可以是认知功能损伤的患者，或者为认知功能损伤患者的离体神经细胞。
根据本发明的第十个方面，本发明提供了一种治疗老年痴呆患者的方法，所述方法包括如下步骤：
将前面所述的药物组合中的一种单体化合物和另一种单体化合物联合施用到需要治疗的对象中，其中两种单体化合物可以同时施用到需要治疗的个体中，也可以分别施用到需要治疗的个体中，还可以依次施用到需要治疗的个体中，例如先施用一种单体化合物，间隔一定时间再施用另一种单体化合物。
本发明的联合用药物的施用对象包括哺乳动物或所述哺乳动物的神经细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。所述对象可以是老年痴呆患者，或者为老年痴呆患者的离体神经细胞。
本发明的优点和有益效果：
本发明将山奈酚和甘草次酸、山奈酚和大黄酚、甘草次酸和大黄酚分别联合应用，发现上述药物组合在改善认知功能方面具有协同增效作用。
附图说明
图1显示单体化合物对酶活性的抑制作用统计图，其中，A：山奈酚；B：甘草次酸；C：大黄酚；
图2显示跳台实验结果统计图；
图3显示单体化合物对APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆能力影响的结果图；
图4显示悬尾实验结果统计图，其中，A：5min不动时间；B：后4min不动时间；C：后4min挣扎时间。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1山柰酚、甘草次酸(β型)、大黄酚防治AD作用的活性检测
1、实验材料
CDK/p25、GSK3 beta、GSK3 substrate(signal chem)，甘草次酸(β型)与山奈酚(上海融禾生物科技有限公司)、大黄酚(上海源叶生物科技有限公司)。
2、实验方法
2.1山柰酚对CDK5/p25酶活性的检测
(1)冰上解冻CDK5/p25酶，Histone H1 Protein，kinase assay buffer III(5×缓冲液)和DTT(0.1M)以及ATP(10mM)，并且以上试剂在整个实验过程中需要一直放置在冰上。
(2)将5×的缓冲液用去离子水配置成1×的缓冲液，并在其中加入DTT，DTT在1×缓冲液中的浓度为50μM。
(3)将1μL/孔5×待测化合物加入到白色微孔板后1000转离心1min；阳性对照孔(Pos.Ctrl)：1×/孔化合物稀释溶剂；空白对照孔(Blank)：1μL/孔1×缓冲液。
(4)CDK5/p25酶完全解冻后，使用1×的缓冲液将酶稀释到1ng/μL，取2μL/孔加入到白色微孔板中，此时每孔中的CDK5/p25酶量为2ng；空白对照孔加入2μL/孔1×缓冲液；此步骤请在冰上进行，加完后，微孔板在离心机上1000转离心1min。
(5)配制Histone H1 Protein/ATP混合液：Histone H1 Protein/ATP混合液：取40μL的Histone H1(1mg/ml)加入1μL 2mM ATP和39μL的2×缓冲液(注意此处是按比例稀释)，此时ATP浓度为25μM，Histone H1浓度为0.5mg/ml；此步骤请在冰上进行。
(6)取2μL/孔Histone H1 Protein/ATP的混合溶液到白色微孔板中，此时HistoneH1 Protein浓度为0.1mg/mL，ATP浓度为10μM，加完后微孔板1000转离心1min。
(7)离心完毕后，给微孔板贴上膜，压紧贴膜，在25℃中孵育10min。
(8)将Promega的试剂盒中需要用的ADP-GloTM reagent和Kinase Detection相关试剂平衡到室温，并按照说明书将Kinase Detection buffer和Kinase DetectionSubstrate混合备用。
(9)结束孵育后，取5μl/孔ADP-GloTM reagent加入到白色微孔板中，微孔板1000转离心1min，25℃中孵育40min。
(10)结束孵育后，取Kinase Detection混合液10μL/孔加入到微孔板后，1000转离心1min，25℃中孵育30min。
(11)结束孵育后在读板器上进行化学发光检测，读取发光值(RLU)。
(12)酶活率计算：％Enzyme Activity＝(RLU(Sample)-RLU(Blank))/(RLU(Pos.Ctrl)-RLU(Blank))×100％。
2.2甘草次酸(β型)对GSK3β酶活性的检测
(1)冰上解冻GSK3β酶，GSK3 Substrate，kinase assay buffer III(5×缓冲液)和DTT(0.1M)以及ATP(10mM)，并且以上试剂在整个实验过程中需要一直放置在冰上。
(2)将5×的缓冲液用去离子水配置成1×的缓冲液，并在其中加入DTT，DTT在1×缓冲液中的浓度为50μM。
(3)将1μL/孔5×待测化合物加入到白色微孔板中，微孔板在离心机上1000转离心1分钟；阳性对照孔(Pos.Ctrl)：1μL/孔化合物稀释溶剂；空白对照孔(Blank)：1μL/孔1×缓冲液。
(4)GSK3β酶完全解冻后，使用1×的缓冲液将酶稀释到0.5ng/μL，取2μL/孔加入到白色微孔板中，此时每孔中的CSK酶量为1ng；空白对照孔加入2μL/孔1×缓冲液，加完后，1000转离心1min。
(5)配制GSK3 Substrate/ATP混合液：CSK3 Substrace/ATP混合液：取79uL的CSK3Substrace(0.5mg/mL)加入1uL5mM ATP，此时ATP浓度为62.5μM，CSK3 Substrace浓度为0.5mg/mL；此步骤在冰上进行。
(6)取2μL/孔GSK3 Substrate/ATP的混合溶液到白色微孔板中，此时GSK3Substrate浓度为0.2mg/mL，ATP浓度为25μM，1000转离心1min；(7)离心完毕后，给微孔板贴上膜，压紧贴膜，在25℃中孵育1h。
(8)将Promega的试剂盒中需要用的ADP-GloTM reagent和Kinase Detection相关试剂平衡到室温，并按照说明书将Kinase Detection buffer和Kinase DetectionSubstrate混合备用。
(9)结束孵育后，取5μL/孔ADP-GloTM reagent加入到白色微孔板中，1000转离心1min，25℃中孵育40min。
(10)结束孵育后，取Kinase Detection混合液10μL/孔加入到微孔板中，1000转离心1min，25℃中孵育30min。
(11)结束孵育后在读板器上进行化学发光检测，读取发光值(RLU)；(12)酶活率计算：％Enzyme Activity＝(RLU(Sample)-RLU(Blank))/(RLU(Pos.Ctrl)-RLU(Blank))×100％。
2.3大黄酚对CNR1酶活性的检测：本次实验利用钙通量法检测大黄酚CNR1受体的激动作用。
3、结果
实验结果如图1所示，山柰酚可以作用于CDK5/p25抑制其活性，IC50为2.321μM；甘草次酸(β型)作用于GSK3β并且抑制其活性，IC50为8.06μM；大黄酚可提高CNR1的活性，其EC50为1.383×102μM。
实施例2单体化合物对APP/PS1小鼠被动回避反应能力的影响
1、实验材料
1.1动物
39周龄雄性APP/PS1小鼠及野生型C57/BL6J小鼠(SPF级)，购于上海南方模式生物科技股份有限公司(SCXK(沪)2017-0010)，饲养于山东中医药大学实验动物中心动物房内，温度控制在18～23℃，湿度控制在50％～60％，12h明暗循环，给予自由饮食，所有动物实验程序均由山东中医药大学实验动物中心动物批准(SYXK(鲁)20170022)。
1.2试剂药品
多奈哌齐(丹麦灵北药厂)、易倍申盐酸美金刚片(卫材药业有限公司)。
1.3实验仪器
YLS-3TB型跳台记录仪(济南益延科技发展有限公司)：箱体为上盖开放两侧不透光的塑料长方体尺寸为22×28×36cm(宽×长×高)，底面为不锈钢网栅，网栅间距为1.5cm(可通36v电压)。站台为一圆形塑料板，直径为8cm，将站台放于箱体中央。通过SuperMazeV3.0行为视频分析系统对小鼠行为进行采集分析。
2、实验方法
2.1给药方法
本实验选用美金刚胺与多奈哌齐联合用药，给药剂量为Donepezil(1.0mg/kg/d)+Memantine(2.8mg/kg/d)；山柰酚(Kaempferol，K)，甘草次酸(β型)(18beta-glycyrrhetinic acid，B)、大黄酚(Chrysophanol，R)给药剂量均为50mg/kg/d；单体组合剂量为50mg/kg/d，TFSⅠ组成：【山奈酚(Kaempferol)∶甘草次酸(β型)(18-beta-Glycyrrhetinic acid)＝1∶1，K+B】，TFSⅡ组成：【山奈酚(Kaempferol)∶大黄酚(Chrysophanol)＝1∶1，K+R】，TFSⅢ组成：【甘草次酸(β型)(18-beta-Glycyrrhetinicacid)∶大黄酚(Chrysophanol)∶＝1∶1，B+R】，TFS组成：【山奈酚(Kaempferol)∶甘草次酸(β型)(18-beta-Glycyrrhetinic acid)∶大黄酚(Chrysophanol)＝1∶1：1】。药物均溶解于0.5％CMC-Na中。每次按0.01mL/g体重的体积给药，正常溶剂对照组和模型溶剂对照组则以等体积灌胃。连续给药30天。
2.2跳台实验
(1)训练期(5min/只)：给药1h后将小鼠(按每组一只的顺序，同时检测2-4只)放置在跳台实验装置内先适应3min，将小鼠都放置在安全台上，然后通60-80V电压，电流0.8-1.5mA，小鼠受到电击后会逃离到安全台上，再从安全台上跳下，以两前足同时碰到铜栅为错误反应，记录各组小鼠5min内第1次跳下平台的潜伏期及跳下平台受电击的次数，记录5min内小鼠的错误次数，以此作为小鼠的学习成绩，并且录像。
检测期(5min/只)：次日9:30开始再次进行测试，将小鼠放置在安全台上，通60-80V电压，电流0.8-1.5mA，实验时间为5min(无需适应)。数据统计：记录各组小鼠5min内第1次跳下平台的潜伏期及跳下平台受电击的次数，记录5min内小鼠的错误次数，以此作为小鼠的记忆成绩，并且录像。
2.3统计方法
所有数据均采用“Mean±S.D.”的表达方式，两组间比较采用Student`s T-test，多组间与对照组比较采用Dunnett T-test，多组间比较采用Newman-Keuls MultipleComparison Test，采用Graphpad 8.0.1软件分析，P<0.05被认为具有统计学意义。
3、实验结果
实验结果如图2所示，K+R(山奈酚和大黄酚)联合给药可以减少APP/PS1小鼠的跳台错误次数，提高小鼠的被动回避反应能力，且两种药物联合应用具有协同增效作用，与单独使用单体化合物相比，联合应用后结果差异具有统计学意义，P<0.05。
实施例3单体化合物对APP/PS1小鼠空间学习记忆能力的影响
1、实验材料
1.1动物：同实施例2。
1.2试剂药品：同实施例2。
1.3实验仪器：Morris水迷宫包括以下三个部分：SuperMaze V3.0动物行为视频分析系统(上海欣软信息科技有限公司)、实验装置由迷宫宫体(水池)、视频采集系统组成：宫体直径100cm，迷宫壁高出水面30cm，安全平台(圆形，直径10cm，表面粗糙以利于动物抓住)匿藏于0.5-1cm的水面下，水温为22℃±2℃。
2、实验方法
2.1给药方法同实施例2。
2.2水迷宫实验
实验前将水池接满自来水，高度以超过安全平台1～2cm为限。有形状颜色不同的纸片悬挂于水迷宫墙壁上，注意：实验全程中室内物体位置须保持固定。关闭室内日光灯，打开电脑以及图像采集软件，将安全平台置于水池的第四象限中心位置，并使实物位置与程序中虚拟位置统一。在程序中设置动物组别，设置动物游泳时间(90s)和站台停留时间(10s)。
2.2.1训练期(90s/只，4次/天，共5天)：给药2h后(11：00)开始训练，训练时每次将动物从不同入水点分别放入水池中，头朝池壁。记录动物自入水到爬上站台所需的时间，作为潜伏期；并记录动物在水中的游泳轨迹，作为分析动物搜索目标时所采用的策略的依据。动物爬上站台后，让其在站台上站立10s；若动物在90s内未找到站台或未能爬上站台，则将动物引领至站台上站立10s，以形成记忆，之后将动物从站台上取下。统计每只动物每天4个入水点的平均逃避潜伏期(未爬上站台者潜伏期以90s计算)、游泳距离、游泳速度、在外环区域的游泳时间，每日进行组间统计比较，并绘制波动曲线以观察趋势。
2.2.2测试期(90s/只，1天)：最后一天训练24h后开始训练，将站台从其所在位置移走，将动物从平台对侧象限边缘的中点放入水池中，记录动物初次探索游过原站台位置的时间、90s内探索游过原站台所在位置区域的次数和动物在站台所在目标象限的游泳时间。
2.3统计方法：同实施例2。
3、实验结果
实验结果如图3所示，K+B(山奈酚和甘草次酸(β型))可以提高APP/PS1小鼠的目标象限的停留时间，说明K+B可一定程度提高APP/PS1小鼠的学习记忆能力，且K+B联合用药具有协同增效作用，与单独使用单体化合物相比，联合应用后结果差异具有统计学意义，P<0.05。
实施例4对APP/PS1小鼠抑郁样行为的影响
1、实验材料
1.1动物：同实施例2。
1.2试剂药品：同实施例2。
1.3实验仪器：由小鼠悬尾箱、摄像头视频合成装置、计算机数据采集系统构成。悬尾箱尺寸为30×30×70cm(内径，长×宽×高)，材料为双层铝塑板，内壁为白色。
2、实验方法
2.1给药方法同实施例2。
2.2悬尾实验
检测(5min/只)：小鼠给药30min后用医用胶带将小鼠尾部后1/3处用胶带固定，悬挂于悬尾箱内的挂钩上，头部距离台面15cm，进行摄像，摄像背景与小鼠毛色呈明显反差，黑色小鼠采用白色背景。每只进行5分钟的测试，前1分钟为适应期，从第2分钟开始录制视频。利用小动物行为学分析软件，记录小鼠后四分钟(2-5min)的小鼠的摇摆(不动)状态、挣扎状态、攀爬状态的总时长(s)、时长(s)、时间比(％)。
2.3统计方法：同实施例2。
3、实验结果
实验结果如图4所示，K+R(山奈酚和大黄酚)联合给药，B+R(甘草次酸(β型)和大黄酚)联合给药可以减少APP/PS1小鼠5min内和后4min内的不动时间，增加后4min内的挣扎时间，说明单体化合物联合给药后可以一定程度的改善APP/PS1小鼠的抑郁样行为，且单体化合物的联合用药具有协同增效效果，与单独使用单体化合物相比，联合应用后结果差异具有统计学意义，P<0.05。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.山奈酚和大黄酚的药物组合在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用，山奈酚和大黄酚的质量比例是1：1。
2.山奈酚和大黄酚的药物组合在制备改善抑郁情绪的药物中的应用，山奈酚和大黄酚的质量比例是1：1。
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