CN108743581B - 一种环氧含笑内酯的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环氧含笑内酯的用途，所述用途是指以环氧含笑内酯或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备抗炎药物。实验表明：环氧含笑内酯可以降低机体对病原菌感染产生的过度免疫反应，减轻败血症难以控制的危急症状，具有药用价值。

Description

一种环氧含笑内酯的用途

技术领域

本发明涉及一种环氧含笑内酯的用途，属于医药技术领域。

背景技术

败血症是由病原体侵入血液并在其中生长、繁殖，产生大量毒素导致的全身性炎症反应和器官功能紊乱，即合并有细菌感染等情况的系统性炎症反应综合症。败血症表现为感染性的原因引起的全身炎症因子表达量增加，从而造成组织脏器损伤，进而发展为多器官功能障碍和弥漫性血管内凝血，可导致死亡，其发病机制和治疗策略均不同于自身免疫性疾病。败血症治疗较为棘手，它是导致严重感染ICU病人死亡的主要原因之一，美国2011年用于治疗败血症的费用高达200亿美元。美国每年有100万败血症的新发病例，其中有20万人死亡，估计全球每年新增败血症190万例。细菌感染是引起败血症的重要因素，有报道称在75个国家的1.4万败血症感染的ICU病人身上，革兰氏阴性菌的检出率高达62％，耐药性细菌的出现和发展给败血症的治疗带来极大的困难。碳青霉烯类抗生素多年来被誉为人类抵御耐药性细菌的最后一道防线，针对这一类抗生素耐药的细菌引起的治疗压力非常之大，情势严峻。2013年美国疾病预防控制中心(CDC)宣布，耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌与耐药的淋球菌和艰难梭菌是严重威胁公众健康的三种微生物。美国在2012-2013年间有599例耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌感染被确认为紧急感染，其中有351例(58.6％)为肺炎克雷伯菌感染。在美国、中国和希腊，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant klebsiella pneumonia，CRKP)已经成为引起院内感染死亡的重要因素之一，CRKP引起的发病率是耐碳青霉烯类肠杆菌中是最高的。而且严重感染的病人，一般预后不佳，致残率和致死率是病人在恢复阶段难以避免的危险。

目前临床治疗由细菌感染引起的败血症主要依赖抗生素治疗，但是耐药菌的出现揭示了抗生素治疗的方式存在极大的隐患。寻找新的治疗方法或者开发新的药物，势在必行。在严重感染时机体会产生过度免疫应答，过度的炎症反应是导致合并细菌感染和系统性炎症反应综合症的这类败血症病人高死亡率的一个重要因素。控制过度炎症反应亦是治疗败血症的一个有效方向。小鼠急性腹膜炎模型是常用的模拟临床病人败血症的疾病模型，期待从中医药角度寻找新型候选药物和探索更加有效的治疗策略。

环氧含笑内酯(epoxide micheliolide，EMCL)是一种倍半萜类化合物，化学结构式如下：

关于其报道比较少，更没有环氧含笑内酯作为抗炎用途的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环氧含笑内酯的用途，以拓宽环氧含笑内酯的应用范围。

本发明所述的环氧含笑内酯的用途，是指以环氧含笑内酯或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备抗炎药物。该抗炎药物具有免疫调控作用，可用于治疗败血症。

作为优选方案，所述药物可与抗生素或激素联合用药，所述抗生素选自碳青霉烯类抗生素，例如美罗培南，或选自喹诺酮类抗生素，例如左氧氟沙星，所述激素选自临床常用激素地塞米松。

所述环氧含笑内酯可通过化学合成或从植物中提取得到。

作为优选方案，所述环氧含笑内酯是由含笑内酯经氧化而得到，包括以下步骤：

a)取含笑内酯与过氧化物，将其溶于有机溶剂中，让反应混合物在25-30℃搅拌反应12-15小时；

b)经过步骤a)后，将所得反应混合物用饱和亚磷酸钠溶液洗涤以除去过量的过氧化物，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，以除去酸性化合物；最后用饱和食盐水洗涤，除去多余的水分并用无水硫酸钠干燥有机相，经旋蒸得到环氧含笑内酯粗品；

c)采用有机溶剂对环氧含笑内酯粗品进行重结晶，即得到所述环氧含笑内酯。

作为优选方案，步骤a)中，反应混合物中含笑内酯的浓度应该控制在50～70mmol/L之间。

作为优选方案，步骤a)中，有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃或氯仿。

作为优选方案，步骤a)中，过氧化物为间氯过氧苯甲酸、过氧苯甲酸或过氧叔丁醇。

作为优选方案，步骤c)中，重结晶采用的有机溶剂选自石油醚、乙醚、异丙醚、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、正戊烷、二氯甲烷中的至少一种。

作为进一步优选方案，步骤c)中，重结晶采用的有机溶剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂、正己烷/丙酮混合溶剂或乙酸乙酯/二氯甲烷混合溶剂。

本发明所述药物的剂型不限，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都可以，例如可选自：片剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、酊剂、口服液、气雾剂、口含剂、冲剂、丸剂、散剂等常见剂型或纳米制剂等缓释剂型。

本发明所述药物中，除了含有主要活性成分(环氧含笑内酯)之外，还可含有少量的且不影响有效活性成分的次要成分和/或药学上可接受的载体，例如：可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及各种制剂所必要的辅料等。

本发明中术语的定义如下：

术语“药学上可接受的盐”是指环氧含笑内酯与药学上可接受的无机酸或有机酸所形成的盐，所述无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述有机酸包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、1,5-萘二磺酸、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、氨基酸；所述“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比。

术语“互变异构体”是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体，例如：烯醇与相应的酮。

术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，例如：顺反异构体、对映异构体、构象异构体等。

术语“前体化合物”是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转化为环氧含笑内酯，从而发挥其药理作用的化合物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明发现：在用来模拟败血症的动物模型中，EMCL能在致死性剂量的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)诱导的小鼠急性腹膜炎模型中，明显提高小鼠的生存率；在革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性腹膜炎模型中，用EMCL进行干预可以下调败血症小鼠血清中炎性细胞因子和趋化因子(IL-6、TNF-α、IFN-β和MCP-1)的表达量。在参与炎症反应的重要固有免疫细胞(单核/巨噬细胞、树突状细胞)中，EMCL可以抑制PI3K/Akt和NF-κB信号通路的活化，从而下调白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、趋化因子(MCP-1)、干扰素β(IFN-β)和白细胞介素10(IL-10)等炎症因子的表达量。以上结果表明EMCL能够通过抑制LPS诱导的过度炎症反应，从而减少因过度炎症反应引起的机体损伤，甚至死亡。在CRKP感染导致的败血症治疗中，EMCL可以通过调控宿主免疫反应从而降低机体对病原菌感染产生的过度免疫反应，减轻败血症等系统性炎症反应综合症难以控制的危急症状，具有药用价值。以环氧含笑内酯或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分可用于制备抗炎药物，尤其是可用于制备结合免疫抑制达到抗炎目的的药物，该药物单独使用或与抗生素、激素联合用药可用于治疗败血症。

附图说明

图1为环氧含笑内酯(EMCL)提高耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)感染小鼠的生存期的结果；其中：*p<0.05，**p<0.01，ns无显著差异。

图2为环氧含笑内酯(EMCL)降低LPS诱导的血清中细胞因子的分泌的结果；其中：(a)IL-6，(b)TNF-α，(c)IL-1β，(d)MCP-1，(e)IFN-β，(f)MIP-2，(g)IL-10，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图3为环氧含笑内酯(EMCL)在小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞中抑制LPS诱导的炎症因子的表达的结果；其中：(a)IL-6，(b)TNF-α，(c)IL-1β，(d)MCP-1，(e)IFN-β，(f)IL-10，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

下面结合附图和实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

(1)环氧含笑内酯的制备

a)在25mL的双颈瓶中加入含笑内酯(1.23g,4.6mmol)及间氯过氧苯甲酸(1.27g,7.34mmol)，然后加入100mL二氯甲烷，反应混合物在室温条件下搅拌过夜，TLC监测反应。

b)反应结束之后，将反应混合物用10mL饱和Na₂SO₃液洗涤2次以除去过量的过氧化物，然后用10mL饱和NaHCO₃液洗涤1次，以除去酸性化合物；最后用10mL饱和食盐水洗涤1次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，在35℃旋蒸抽干得到环氧含笑内酯粗品；

c)对环氧含笑内酯粗品进行重结晶：将1.2g环氧含笑内酯粗品加入石油醚/乙酸乙酯按体积比1:1形成的混合溶剂中，加热(30℃)使溶解，然后自然冷却使析晶，过滤，得到环氧含笑内酯(呈无色晶体状)1.06g，得率为80.9％，经HPLC检测纯度大于99.8％。HRMS(ESI)[M+H⁺]＝265.1403。分子式为C₁₅H₂₀O₄；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.26–6.05(m,1H),5.56–5.39(m,1H),4.03(td,J＝10.6,2.5Hz,1H),2.81(s,1H),2.45–2.13(m,4H),2.05–1.75(m,4H),1.64(ddd,J＝12.3,10.8,5.2Hz,1H),1.46(d,J＝1.7Hz,3H),1.37(d,J＝14.0Hz,1H),1.28(d,J＝2.6Hz,3H)。

(2)环氧含笑内酯片剂的制备

将10g环氧含笑内酯与87.5g辅料(白湖精:乳糖＝7:3，质量比)混合之后，加入95％的乙醇制粒，干燥，整粒(过筛)，加入硬脂酸钠2.5g混合均匀后压片，每片重200mg，其中环氧含笑内酯的含量为10mg。

(3)环氧含笑内酯粉针剂的制备

将1g环氧含笑内酯与5g甘露醇溶解于170mL的注射用水中，初次混匀之后，定容到200mL，过滤所得到的溶液，装入西林瓶中，每瓶1mL，冻干，密封、灭菌，即得到每支含有5mg环氧含笑内酯的冻干粉针剂。

(4)环氧含笑内酯胶囊剂的制备

将15g环氧含笑内酯与135g辅料(白湖精:乳糖＝7:3，质量比)混合之后，加入95％的乙醇制粒，干燥，整粒(过筛)，装入胶囊中，每粒重150mg，其中环氧含笑内酯的含量为15mg。

(5)对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiellapneumonia，CRKP)感染小鼠的生存期延长实验

1、样品制备

将制得的环氧含笑内酯用二甲基亚砜(DMSO)溶解成40mg/mL的储存溶液，进一步用PBS(磷酸盐缓冲溶液)稀释成1mg/mL工作溶液。EMCL体内实验治疗用量为5mg/kg。腹腔注射CRKP(1.5×10⁸CFU/只)构建小鼠败血症模型。左氧氟沙星(LVX)和美罗培南(MEM)标准品按照美国临床与实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的指导进行溶解和稀释。

2、实验方法

将培养所得对数生长期的CRKP菌液用无菌生理盐水稀释到实验浓度，CRKP菌液的最小致死剂量为1.5×10⁸CFU/只，腹腔注射雌性C57BL/6J小鼠(6-8周龄)，构建小鼠急性腹膜炎模型(常用的模拟败血症小鼠模型)。实验分组及处理方式如下：CRKP(1.5×10⁸CFU/只)组，PBS(0.2mL/只)组，EMCL(5mg/kg)组，CRKP+无效药物美罗培南(10mg/kg)组，CRKP+有效治疗药物左氧氟沙星(75mg/kg)组，CRKP+EMCL(5mg/kg)组，CRKP+EMCL(5mg/kg)+无效药物美罗培南(10mg/kg)组。

3、测定及统计方法

连续观察7天并记录每组小鼠的存活情况和生存状态，用Sigmaplot软件绘制生存曲线，采用Log-Rank检验进行生存分析。

4、实验结果

实验结果如图1所示：单独注射PBS和EMCL的小鼠无死亡情况且生理状态良好。CRKP模型组小鼠的生存率在20小时内迅速下降到25％。与CRKP模型组相比，EMCL治疗组和左氧氟沙星(敏感的有效治疗药物)治疗组小鼠的生存率分别为50％(p<0.05)和87.5％(p<0.01)。美罗培南(耐药的无效药物)治疗组小鼠的生存率在45小时内下降到25％，与CRKP模型组小鼠之间无统计学区别。但当美罗培南与EMCL联合使用时，小鼠的生存率大幅度提升，达到62.5％(与CRKP模型组相比，p<0.05)。与CRKP模型组小鼠相比，EMCL治疗组、左氧氟沙星治疗组以及EMCL与美罗培南联合治疗组小鼠的生理状态更好，具体表现在治疗组小鼠的嗜睡、蜷缩、立毛等行为明显减轻，活跃程度升高。此部分结果表明：EMCL能够缓解致死剂量的CRKP引起的疾病表现，显著提高小鼠的生存率，并能显著延长小鼠的存活期。即环氧含笑内酯(EMCL)对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)感染小鼠具有保护作用。

(6)EMCL对小鼠败血症模型抗炎活性的测试实验

1、样品制备

将制得的环氧含笑内酯用二甲基亚砜(DMSO)溶解成40mg/mL的储存溶液，进一步用PBS(磷酸盐缓冲溶液)稀释成1mg/mL工作溶液。EMCL体内实验治疗用量为5mg/kg或者10mg/kg。以10mg/kg小鼠体重的LPS诱导急性腹膜炎模型(模拟败血症)。体内抗炎活性实验的阳性对照药物选用临床常用于治疗的激素地塞米松(DXM)，用PBS将DXM稀释成工作溶液(7mg/kg)后使用。

2、实验方法

C57BL/6J小鼠(n＝5/组)造模后，按照分组情况，将不同剂量的EMCL(5mg/kg或10mg/kg)、地塞米松(DXM)单独或联合注射入小鼠的腹腔进行治疗。2h以后，摘取小鼠眼球取血。腹腔注射PBS(0.2mL/只)作为阴性对照。

3、测定及统计方法

取小鼠血清，采用ELISA方法检测血清中细胞因子的分泌量，各组实验结果以方差分析方法(ANOVA)进行统计分析。

4、实验结果

实验结果如图2所示：与LPS模型组比较，不同剂量的EMCL(5mg/kg和10mg/kg)均可以降低小鼠血清中TNF-α和MCP-1的表达量。EMCL在低剂量时(5mg/kg)亦可以下调小鼠血清中IL6和IFN-β的表达量，说明EMCL降低LPS诱导的败血症小鼠模型血清中细胞因子的分泌。DXM治疗组和EMCL与DXM联合治疗组血清中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β、MCP-1、IFN-β和IL-10的表达量均明显低于LPS模型组中相关因子的表达量。就血清中IL-6的表达量而言，DXM与EMCL(5mg/kg)联合治疗组的表达量低于DXM治疗组的表达量(p<0.05)，亦显著低于EMCL(5mg/kg或10mg/kg)治疗组IL-6的表达量。与LPS模型组相比，单独DXM治疗并不能下调血清中MIP-2的表达量，只有在DXM与EMCL(5mg/kg)联合使用时才能降低MIP-2的表达量。虽然IL-10是属于抑炎性的细胞因子，但是死亡的败血症患者的临床资料显示过高的IL-10水平与高死亡率正相关。所以，EMCL下调大多数炎症因子的同时，对于IL-10也有下调作用，可能对于机体而言具有一定的保护作用。

此部分结果表明：EMCL能够降低小鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-α、IFN-β、IL-10和MCP-1的表达量，且在下调IL-6和MIP-2的表达量时，EMCL表现出了与DXM联合应用的潜力。说明环氧含笑内酯对败血症具有显著的抗炎作用。

(7)EMCL对细菌感染模拟物LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞Raw264.7的炎症反应的调控作用实验

1、样品制备

将制得的环氧含笑内酯用二甲基亚砜(DMSO)溶解成20mmol/L的储存溶液，进一步用无血清的DMEM细胞培养基进一步稀释成为0、10、20、30、40μmol/L梯度浓度的样品溶液；以100ng/mL的脂多糖(LPS)作为细胞水平实验的刺激物。

2、实验方法

将小鼠巨噬细胞Raw264.7(购于ATCC)在37℃，5％CO₂培养箱中常规培养于含有DMEM培养液的24孔板中。在Raw264.7细胞培养基中同时加入LPS(100ng/mL)和不同浓度的EMCL(0μM-40μM)，作用不同时间点后，收集细胞培养上清和细胞总RNA。

3、测定及统计方法

分别进行ELISA方法和qRT-PCR方法检测各孔细胞培养上清中细胞因子的分泌情况，各组实验结果采用T检验进行统计学分析，数据用平均数

±标准差(SD)表示。

4、实验结果

实验结果如图3所示：在Raw264.7细胞中，EMCL能够降低细胞培养上清中LPS诱导的IL-6、TNF-α、MCP-1、IFN-β和IL-10的表达量。同时EMCL也能下调IL-1β的转录水平(即mRNA的表达量)，说明环氧含笑内酯能明显抑制LPS诱导Raw264.7的炎性细胞因子水平，具有抗炎调控作用。

综上所述：本发明所述的环氧含笑内酯能明显抑制小鼠巨噬细胞Raw264.7在LPS诱导下的细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β、MCP-1和IL-10)的生成，尤其是能抑制败血症模型中的试验小鼠血清中的细胞因子IL-6、IFN-β、TNF-α和MCP-1等的生成；且提高了败血症模型中的试验小鼠的生存率和存活期。因此，本发明所述的环氧含笑内酯可作为活性成分用于制备抗炎药物，尤其可用于制备治疗败血症的抗炎药物，具有明显的临床应用价值。

Claims (5)

1.一种环氧含笑内酯的用途，其特征在于：以环氧含笑内酯作为活性成分用于制备抗炎药物，所述抗炎药物用于治疗败血症。

2.一种环氧含笑内酯的用途，其特征在于：以环氧含笑内酯作为活性成分用于制备治疗败血症的药物。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述环氧含笑内酯具有免疫调控作用：在CRKP感染导致的败血症治疗中，通过调控宿主免疫反应从而降低机体对病原菌感染产生的过度免疫反应。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述环氧含笑内酯是由含笑内酯经环氧化后得到，或者所述环氧含笑内酯是从植物中提取得到。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物中还包括与环氧含笑内酯联合用药的抗生素或激素，所述抗生素为美罗培南或左氧氟沙星，所述激素选自地塞米松。

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