CN112006976B - 一种消化道粘膜下注射短肽水凝胶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种消化道粘膜下注射短肽水凝胶及其制备方法与应用。该水凝胶由双亲性的二肽与RGD或Fmoc‑RGD共组装而成，具有刺激响应性、剪切变稀和快速自修复性能，生物相容性好，安全且环保，操作简捷，适合规模化生产，应用于ESD手术填充物方面，隆起效果好，持续时间久，使得手术安全性提高，操作难度与时间减少。此外，还可用于生物纳米材料、药物装载与可控释放、组织修复与再生、细胞支架或肿瘤治疗等领域。

Description

一种消化道粘膜下注射短肽水凝胶及其应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料、可注射凝胶等技术领域，具体涉及一种消化道粘膜下注射短肽水凝胶及其制备方法和应用，该水凝胶具有刺激响应性、剪切变稀和快速自修复性能。

背景技术

内镜粘膜下剥离术(ESD)作为一种先进的治疗技术，主要用于消化道早期癌症和癌前病变的临床诊断与治疗。相较于传统的侵入性手术而言，其一次性切除率高、局部复发率低、创伤小、能有效减轻病人痛苦。然而，由于消化道壁薄，切除难度高，易引发穿孔风险，所以需要注射填充物于粘膜下层(病灶之下)来辅助手术。目前临床上最常用的填充物为生理盐水，但是其支撑性差，体内吸收过快，需要反复注射，费时费力，因此亟待研发出一次注射即可达到支撑性好、持续时间久、生物相容性好的新型填充物，从而大大缩短手术时间、降低操作难度。

近年来，可注射水凝胶在生物医用方面备受关注，因其操作方便、可直达体表病灶部位或通过胃肠镜、微创手术等方式深入体内病变位置，尽可能减少患者创伤和恢复时间，实现快速局部给药，促进药物在病灶部位富集，减少对正常组织的毒副作用，在手术填充物、生物纳米材料、药物装载与可控释放、组织修复与再生、细胞支架或肿瘤治疗等领域具有广泛的应用前景。

目前，可注射水凝胶以原位凝胶为主，即在体外为流动的溶液状，一旦进入体内，在温度、盐离子、酶等内环境因素或外加射线等条件的刺激下实现快速凝胶化。相较于固体模具植入材料，这种液态注射制剂更容易填满各种形状的空腔，对于复杂形状的腔体而言优势尤为明显。然而，液态注射时也可能会流出到周围组织和血管，或因体液稀释等复杂生理环境的影响造成延时成胶等意外结果。而另一种新型的可注射水凝胶刚好可以规避这一不足之处，预成型的固态凝胶在适当的剪切应力作用下粘度降低可流动，撤除应力后又可迅速恢复到凝胶状态。这种可逆的凝胶-溶胶转变过程往往与分子间的氢键、静电相互作用、π-π堆积等弱相互作用力(亦非共价相互作用)的破坏与恢复密切相关。

短肽分子具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，化学结构明确，可以在分子水平上精确、高效地设计与合成，如改变肽序列、按需键接不同官能团等。序列为精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)的三肽RGD作为一种典型的生物活性短肽，能够与多种整合素特异性结合，促进细胞粘附、铺展与扩散。9-芴甲氧羰基(Fmoc)作为肽合成过程中的保护基团，常与短肽特别是二肽键接，以提供额外的氢键、π-π堆积和疏水相互作用，促进二肽组装，维持其构象和功能的稳定性。在适当条件下(pH值、温度、离子浓度等)，两亲性二肽作为多能性组装基元能够通过分子间的多种弱相互作用力，如氢键、范德华力、静电相互作用、π-π堆积、疏水作用等，形成可控的纳米结构，进而构成理化性质和功能可调的水凝胶。因此，短肽分子具有天然的生物源性和可逆非共价相互作用组装的优势，使形成的水凝胶具有剪切变稀和快速自愈合的性质，是制备可注射水凝胶的优质之选，同时也可满足上述手术填充物的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种消化道粘膜下注射短肽水凝胶的制备方法与应用，所述水凝胶具有剪切变稀和快速自修复的性质，生物相容性良好，且具有迅速的温度和离子响应特性，能灵活调控载药和解组装过程，可用于临床手术填充物、生物纳米材料、药物装载与可控释放、组织修复与再生、细胞支架或肿瘤治疗等领域。

为达到本发明的目的，采用以下技术方案：

本发明一方面涉及一种消化道粘膜下注射短肽水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包括N末端均连接着保护基团9-芴甲氧羰基(Fmoc)的二肽以及三肽；所述二肽选自酪氨酸(Y)-亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)、亮氨酸(L)-亮氨酸(L)或酪氨酸(Y)-丙氨酸(A)中的一种或者多种的组合，所述三肽选自RGD和/或Fmoc-RGD，所述二肽和三肽的比例为2-10:2-10。使其通过二肽和三肽之间的氢键、π-π堆积、疏水相互作用和范德华力等非共价相互作用共组装成纳米纤维网络交织而成的水凝胶，具有剪切变稀和快速自修复的性能，经多种规格的注射器针头(如23G，24G，25G，26G)注射后，均能快速恢复成凝胶状态。

在本发明的一个优选实施方式中，所述消化道粘膜下注射短肽水凝胶不含有有机溶剂、引发剂和交联剂中任意一种或者两种或者三种。

在本发明的一个优选实施方式中，所述消化道粘膜下注射短肽水凝胶通过如下步骤制备得到：

(1)将二肽和三肽粉末分别超声溶解于磷酸盐缓冲液中；

(2)将三肽溶液与二肽溶液混匀，室温静置老化18h以上即可得到所需的消化道粘膜下注射短肽水凝胶。

在本发明的一个优选实施方式中，所述二肽溶液的摩尔浓度大于2mM，优选浓度为10-30mM，所述三肽溶液的摩尔浓度为1-15mM。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于：所述三肽溶液与二肽溶液混匀是在水浴加热的条件下进行，水浴加热温度范围为60-90℃，加热时间范围为0.5-10min。

在本发明的一个优选实施方式中，所述消化道粘膜下注射短肽水凝胶内部装载止血剂、抗炎药物、抗癌药物。

本发明另一方面涉及一种注射剂，其含有上述消化道粘膜下注射短肽水凝胶。特别是所述注射剂还包括用于注射所述消化道粘膜下注射短肽水凝胶的注射器针头；优选的，所述注射器针头选自23G，24G，25G，26G。本发明创造性的发现所制备的消化道粘膜下注射短肽水凝胶具有剪切变稀和快速自修复的性能，经多种规格的注射器针头(如23G，24G，25G，26G)注射后，均能快速恢复成凝胶状态。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的短肽水凝胶是由双亲性的二肽与RGD或Fmoc-RGD共组装而成，操作简捷，制备过程中无需引入任何有机溶剂、引发剂和交联剂，安全无毒且环保；

2、本发明所制得的短肽水凝胶外观均匀透明，且具有迅速的温度和离子响应特性，能灵活调控组装和载药以及解组装与药物释放过程；

3、本发明的短肽水凝胶具有剪切变稀和快速自修复的性能，注射完毕即恢复至凝胶态，生物相容性良好，可用作体内注射制剂。

附图说明

图1为实施例1所制得的消化道粘膜下注射短肽水凝胶的实物图。

图2-1为实施例2中制备的消化道粘膜下注射短肽水凝胶在玻璃片表面注射的几何图形照片；图2-2为实施例2中制备的消化道粘膜下注射短肽水凝胶的红外光谱图。

图3为实施例3中制备的消化道粘膜下注射短肽水凝胶的原子力显微镜图片。

图4为实施例4中制备的消化道粘膜下注射短肽水凝胶的表征剪切恢复性的流变测试结果图。

图5为实施例5中制备的载药可注射短肽水凝胶的体外模拟药物释放曲线图。

图6(A)为实施例6中的Fmoc-YL/RGD共组装水凝胶与透明质酸钠注射液(HA)于离体猪胃粘膜下层注射后隆起部位的支撑性测试实验图；图6(B)为实施例6中的Fmoc-YL/RGD共组装水凝胶与生理盐水(NS)于活体猪胃内经内窥镜观测得到的粘膜下层注射隆起高度变化图片。

具体实施方式

为进一步阐述本发明的技术方案和实用效果，下面结合附图和几种典型的具体实施方式来详细说明本发明，而非用来限制本发明。

实施例1

称取14.23mg Fmoc-YA粉末溶于1mL PBS缓冲液(pH≈8)中，再经过涡旋、超声以及70℃水浴加热6min使其完全溶解为澄清透明的溶液，最后于室温静置10分钟即成凝胶，继续静置过夜即可得到30mM的Fmoc-YA可注射水凝胶，其实物图如图1所示，外观澄清透明，质地均匀。

实施例2

称取6.92mg RGD溶于1mL的PBS缓冲液中，再称取20.66mg Fmoc-YL粉末加入1mL的PBS缓冲液中，经涡旋、超声以及75℃水浴加热5min使其溶解，然后分别量取0.5mL的上述RGD溶液与Fmoc-YL溶液等比例混合均匀，最后于室温静置过夜即可得到均匀透明的Fmoc-YL(20mM)与RGD(10mM)共组装的可注射水凝胶。用盛有上述水凝胶的注射器在玻璃载玻片表面注射出规则的几何形状，如图2-1所示，表明该水凝胶具有良好的可注射性。此外，RGD除了具有促进细胞粘附、铺展及增殖扩散的功能外，出人意料的，本发明发现RGD本身带有多个可提供氢键结合位点的基团，可与Fmoc-二肽分子共组装，从而增强凝胶内部的氢键作用与可注射性能。如图2-2所示为Fmoc-YL(20mM)与RGD(10mM)共组装的可注射水凝胶与单独的Fmoc-YL(20mM)凝胶的红外光谱图，结果显示单独的Fmoc-YL凝胶中氨基甲酸酯峰出现在1691cm^-1处，而Fmoc-YL与RGD共组装凝胶中红移到了1688cm^-1的位置，同时共组装凝胶中1639cm^-1处的酰胺I带相较于单独的Fmoc-YL凝胶而言有一定程度的展宽和增强现象，说明引入RGD与Fmoc-YL共组装后系统氢键作用增强。

实施例3

称取5.68mg Fmoc-RGD溶于1mL的PBS缓冲液中，再称取20.02mg Fmoc-FL粉末加入1mL的PBS缓冲液中，经过震荡、超声以及80℃水浴加热4min使其溶解，然后分别量取0.5mL的上述两种溶液等比例混合均匀，最后于室温静置过夜即可得到均匀透明的Fmoc-FL(20mM)与Fmoc-RGD(5mM)共组装的可注射水凝胶。之后，取样并用原子力显微镜观察其微观形貌，得到如图3所示的纳米纤维网络。

实施例4

称取3.46mg RGD溶于1mL的PBS缓冲液中，再称取20.66mg Fmoc-YL粉末加入1mL的PBS缓冲液中，经涡旋、超声以及85℃水浴加热3min使其溶解，之后分别量取0.5mL的上述两种溶液等比例混合均匀，最后于室温静置过夜即可得到均匀透明的Fmoc-YL(20mM)与RGD(5mM)共组装的可注射水凝胶。用流变仪对上述共组装水凝胶进行分段剪切恢复测试，即设置应变参数为100％与0.1％交替振幅扫描，结果如图4所示，表明该水凝胶具有剪切变稀和快速自修复的性能。

实施例5

配制盐酸阿霉素浓度为0.4mg/mL的PBS溶液，称取3.46mg RGD溶解于1mL的PBS缓冲液(100mM，pH≈8)中，再称取20.66mg Fmoc-YL粉末加入前述RGD溶液中，经过反复涡旋、超声以及75℃水浴加热使其溶解，然后分别量取0.5mL的盐酸阿霉素溶液与0.5mL的RGD和Fmoc-YL溶液混合均匀。最后于室温静置过夜即可得到盐酸阿霉素装载浓度为0.2mg/mL的Fmoc-YL(20mM)与RGD(5mM)共组装的可注射水凝胶。取0.2mL的上述可注射载药凝胶于4mL的pH约为7.4的PBS缓冲液(1×)中，并置于37℃环境下做体外模拟药物释放实验，得到图5的药物释放曲线。

实施例6

根据实施例4制备Fmoc-YL/RGD(20mM/5mM)共组装水凝胶，分别量取2mL的Fmoc-YL/RGD水凝胶和透明质酸钠注射液(HA，10mg/mL)注射进新鲜的离体猪胃里，并置于37℃水浴浸泡1小时，然后取出在两种填充剂的隆起部位表面放置重约5g的螺母，检测其力学支撑性能，拍摄照片如图6(A)所示，Fmoc-YL/RGD水凝胶相较于透明质酸钠注射液而言支撑性更好。接下来是活体猪胃内窥镜手术模拟实验，分别注射5mL的生理盐水(NS)和Fmoc-YL/RGD(20mM/5mM)水凝胶于粘膜下层，1小时后观察到生理盐水的粘膜隆起高度明显降低，几乎全部扩散或被吸收，而Fmoc-YL/RGD的隆起高度却无明显变化，表明Fmoc-YL/RGD共组装水凝胶支撑性更好，持续时间更久，结果如图6(B)所示。

应当注意的是，上述实施例仅作为对本发明的示例性描述，而非用来限制本发明，在不脱离本发明核心的情况下，任意简单的变形、修改或本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均需落入本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种消化道粘膜下注射短肽水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包括三肽以及N末端连接着保护基团9-芴甲氧羰基(Fmoc)的二肽；所述二肽选自酪氨酸(Y)-亮氨酸(L)，所述三肽选自RGD，所述二肽和三肽的摩尔比例为2-10:2-10。

2.根据权利要求1所述的消化道粘膜下注射短肽水凝胶，其特征在于，所述消化道粘膜下注射短肽水凝胶不含有有机溶剂、引发剂和交联剂中任意一种或者两种或者三种。

3.根据权利要求1或2所述的消化道粘膜下注射短肽水凝胶，所述消化道粘膜下注射短肽水凝胶通过如下步骤制备得到：

(1)将Fmoc-二肽和三肽粉末分别超声溶解于磷酸盐缓冲液中；

(2)将三肽溶液与Fmoc-二肽溶液混匀，室温静置老化18h以上即可得到所需的消化道粘膜下注射短肽水凝胶。

4.根据权利要求3所述的消化道粘膜下注射短肽水凝胶，其特征在于：所述Fmoc-二肽溶液的摩尔浓度大于2mM，所述三肽溶液的摩尔浓度为1-15mM。

5.根据权利要求4所述的消化道粘膜下注射短肽水凝胶，其特征在于：所述Fmoc-二肽溶液的摩尔浓度为10-30mM。

6.根据权利要求4所述的消化道粘膜下注射短肽水凝胶，其特征在于：所述三肽溶液与Fmoc-二肽溶液混匀是在水浴加热的条件下进行，水浴加热温度范围为60-90℃，加热时间范围为0.5-10min。

7.根据权利要求1所述的消化道粘膜下注射短肽水凝胶，所述消化道粘膜下注射短肽水凝胶内部装载止血剂、抗炎药物或抗癌药物。

8.一种注射剂，其含有权利要求1-7任意一项所述的消化道粘膜下注射短肽水凝胶。

9.根据权利要求8所述的注射剂，其包括用于注射所述消化道粘膜下注射短肽水凝胶的注射器针头。

10.根据权利要求9所述的注射剂，其所述注射器针头选自23G，24G，25G或26G。

11.权利要求8-10任一项所述的注射剂在制备可注射手术填充物、生物纳米材料、药物递送、组织修复、细胞支架或肿瘤治疗的制剂中的应用。

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