CN111999394A - 一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法 - Google Patents

一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，包括以下步骤：1）选取合适孔径、合适粒径硅胶硅胶；2）对选取的硅胶表面进行表面修饰；3）用苯磺酸改性表面的硅胶吸附男性尿液中的尿激酶；4）经过算洗脱得到高纯度的尿激酶。本发明中提取的尿激酶呈现出特异性吸附；选择性好载样量高；提取的尿激酶具有纯度高，提取方法简便。

Description

一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体是一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法。
背景技术
尿激酶为从健康人尿中分离的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白。由分子量分别为33000(LMW-tcu-PA)和54000(HMW-tcu-PA)两部分组成。尿激酶直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统，能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶，后者不仅能降解纤维蛋白凝块，亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，从而发挥溶栓作用。对新形成的血栓起效快、效果好。还能提高血管ADP酶活性，抑制ADP诱导的血小板聚集，预防血栓形成。尿激酶在静脉滴注后，患者体内纤溶酶活性明显提高；停药几小时后，纤溶酶活性恢复原水平。
现有技术中，尿激酶的分离提取一直是重中之重，也是本发明技术点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，包括以下步骤：
1)选取合适孔径、合适粒径硅胶硅胶；
2)对选取的硅胶表面进行表面修饰；
3)用苯磺酸改性表面的硅胶吸附男性尿液中的尿激酶；
4)经过算洗脱得到高纯度的尿激酶。
进一步的，步骤2)中的硅胶表面键合苯基硅烷键合相，然后在此基础上进行磺化。
进一步的，步骤2)中的硅胶表面键合含有苯磺酸基团的硅烷。
进一步的，硅烷的芳基可以采用PhSi(OR)3或PhSiCH3(OR)2或PhSi(CH3)2OR或PhSiCl3或PhSiCH3Cl2或PhSi(CH3)2Cl2或PhC2H4Cl4O2SSi或C11H17ClO5SSi。
进一步的，步骤1)中所选取的硅胶比表面积为400-800m2/g，所述硅胶粒径范围为38-1000um。
进一步的，磺化所用的磺化试剂为SO3或H2SO4或发烟硫酸或ClSO2OH。
进一步的，所述硅胶的改性方法，包括以下步骤：
1)在无水条件下，用甲苯或二甲苯作为溶剂并在110℃条件将硅烷与硅胶置于反应器中，反应时间在12h-20h，反应结束后将反应物置于砂芯漏斗中过滤，并用甲醇将其洗涤干净后于真空干燥箱中干燥；
2)利用步骤1)得到的产物在碱性条件下将苯磺酰氯转化为苯磺酸钠，然后在酸性条件下，将其转化为苯磺酸；
3)将步骤2)得到的产物用水洗涤至pH值为中性，将硅胶用甲醇或者乙醇洗涤后在砂芯漏斗中抽滤，然后将抽滤产物在真空干燥箱中干燥得到表面苯磺酸化硅胶。
进一步的，所述表面苯磺酸化硅胶提取尿激酶的方法如下：
1)将表面苯磺酸化硅胶置于尿液中吸附尿液24h-120h，使其充分吸附；
2)将步骤1)得到的吸附后硅胶在用50mmol/L氨水进行洗脱，然后将洗脱液在饱和硫酸铵溶液中条件下沉淀出，得到尿激酶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中尿激酶呈现出特异性吸附；选择性好载样量高；提取的尿激酶具有纯度高，提取方法简便。
附图说明
图1为尿激酶随时间吸附曲线示意图
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
不同键合量苯磺酸硅胶的制备
1000ml四口烧瓶中加入甲苯450ml，硅胶100g，110℃下搅拌回流脱水2h，降温至50℃，加入苯基三甲氧基硅烷40g。升温至110℃反应18小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用甲醇300ml洗涤，重复甲醇洗涤2-3次，然后干燥。
1000ml反应瓶中投入300ml(98％)浓硫酸，将上述硅胶干燥后投入反应瓶中，70℃反应2h，然后砂芯漏斗过滤，水洗涤至中性，干燥待用。
实施例2：
不同键合量苯磺酸硅胶的制备
1000ml四口烧瓶中加入甲苯450ml，硅胶100g，110℃下搅拌回流脱水2h，降温至50℃，加入苯基三甲氧基硅烷35g。升温至110℃反应18小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用甲醇300ml洗涤，重复甲醇洗涤2-3次，然后干燥。
1000ml反应瓶中投入300ml(98％)浓硫酸，将上述硅胶干燥后投入反应瓶中，70℃反应2h，然后砂芯漏斗过滤，水洗涤至中性，干燥待用。
实施例3：
不同键合量苯磺酸硅胶的制备
1000ml四口烧瓶中加入甲苯450ml，硅胶100g，110℃下搅拌回流脱水2h，降温至50℃，加入苯基三甲氧基硅烷30g。升温至110℃反应18小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用甲醇300ml洗涤，重复甲醇洗涤2-3次，然后干燥。
1000ml反应瓶中投入300ml(98％)浓硫酸，将上述硅胶干燥后投入反应瓶中，70℃反应2h，然后砂芯漏斗过滤，水洗涤至中性，干燥待用。
实施例4：
不同键合量苯磺酸硅胶的制备
1000ml四口烧瓶中加入甲苯450ml，硅胶100g，110℃下搅拌回流脱水2h，降温至50℃，加入2-(4-苯基磺酰氯)乙基三氯硅烷30g。升温至110℃反应18小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用甲醇300ml洗涤，重复甲醇洗涤2-3次，然后干燥。
1000ml反应瓶中投入10mmol氨水水溶液400ml，将上述硅胶干燥后投入反应瓶中，70℃反应2h，然后砂芯漏斗过滤，水洗涤至中性。
1000ml反应瓶中投入1mol盐酸水溶液400ml，将上述硅胶干燥后投入反应瓶中，70℃反应2h，然后砂芯漏斗过滤，水洗涤至中性，干燥待用。
实施例5：
不同键合量苯磺酸硅胶的制备
1000ml四口烧瓶中加入甲苯450ml，硅胶100g，110℃下搅拌回流脱水2h，降温至50℃，加入2-(4-苯基磺酰氯)乙基三氯硅烷25g。升温至110℃反应18小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用甲醇300ml洗涤，重复甲醇洗涤2-3次，然后干燥。
1000ml反应瓶中投入10mmol氨水水溶液400ml，将上述硅胶干燥后投入反应瓶中，70℃反应2h，然后砂芯漏斗过滤，水洗涤至中性。
1000ml反应瓶中投入1mol盐酸水溶液400ml，将上述硅胶干燥后投入反应瓶中，70℃反应2h，然后砂芯漏斗过滤，水洗涤至中性，干燥待用。
实施例6：
不同键合量苯磺酸表面改性硅胶对尿激酶的吸附分离
取实例1-3中色谱硅胶各1公斤，放入男性尿液中，充分吸附，吸附后用水洗涤去掉尿液；收集洗涤后硅胶，用2％NH4OH和1M NaCl洗脱液，按3.5％体积搅拌洗脱1小时，在重复洗脱一次，抽滤收集洗脱液，合并两次洗脱液，加入硫酸铵至饱和；用5mol盐酸(HCl)调节洗脱液至pH值到3，在0-2℃下沉淀6-7小时，过滤收集棕色的尿激酶，抽干后于-18℃保存。
实施例7：
苯磺酸化硅胶表面吸附尿激酶随时间变化曲线，如图1所示；不同键合量苯磺酸化表面改性硅胶对尿激酶吸附的影响。
表1苯基硅烷键合量与吸附尿激酶关系
键合量(g) 40 35 30
吸附量(g) 4.2 4 3.9
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）选取合适孔径、合适粒径硅胶硅胶；
2）对选取的硅胶表面进行表面修饰；
3）用苯磺酸改性表面的硅胶吸附男性尿液中的尿激酶；
4）经过洗脱得到高纯度的尿激酶。
2.根据权利要求1所述的一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，其特征在于，步骤2）中的硅胶表面键合苯基硅烷键合相，然后在此基础上进行磺化。
3.根据权利要求1所述的一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，其特征在于，步骤2）中的硅胶表面键合含有苯磺酸基团的硅烷。
4.根据权利要求2或3所述的一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，其特征在于，硅烷的芳基可以采用PhSi(OR)3或PhSiCH3(OR)2或PhSi(CH3)2OR或PhSiCl3或PhSiCH3Cl2或PhSi(CH3)2Cl2或PhC2H4Cl4O2SSi或C11H17ClO5SSi。
5.根据权利要求1所述的一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，其特征在于，步骤1）中所选取的硅胶比表面积为400-800m2/g，所述硅胶粒径范围为38-1000um。
6.根据权利要求2所述的一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，其特征在于，磺化所用的磺化试剂为SO3或H2SO4或发烟硫酸或ClSO2OH。
7.根据权利要求1～6任一所述的一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，其特征在于，所述硅胶的改性方法，包括以下步骤：
1）在无水条件下，用甲苯或二甲苯作为溶剂并在110℃条件将硅烷与硅胶置于反应器中，反应时间在12h-20h，反应结束后将反应物置于砂芯漏斗中过滤，并用甲醇将其洗涤干净后于真空干燥箱中干燥；
2）利用步骤1）得到的产物在碱性条件下将苯磺酰氯转化为苯磺酸钠，然后在酸性条件下，将其转化为苯磺酸；
3）将步骤2）得到的产物用水洗涤至pH值为中性，将硅胶用甲醇或者乙醇洗涤后在砂芯漏斗中抽滤，然后将抽滤产物在真空干燥箱中干燥得到表面苯磺酸化硅胶。
8.根据权利要求7所述的一种苯磺酸改性硅胶提取尿激酶方法，其特征在于，所述表面苯磺酸化硅胶提取尿激酶的方法如下：
1)将表面苯磺酸化硅胶置于尿液中吸附尿液24h-120h，使其充分吸附；
2）将步骤1）得到的吸附后硅胶在用50mmol/L氨水进行洗脱，然后将洗脱液在饱和硫酸铵溶液中条件下沉淀出，得到尿激酶。
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