CN111979216A - 一种苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法 - Google Patents

一种苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，属于分析化学技术领域，解决了尿激酶的分离提取的问题，其包括的步骤为：选取合适孔径、合适粒径树脂；对选取的树脂表面进行表面磺酸化修饰；用苯磺酸改性表面的树脂吸附男性尿液中的尿激酶；经过洗脱得到高纯度的尿激酶；本发明对尿激酶呈现出特异性吸附，本发明选择性好载样量高，本方法提取的尿激酶具有纯度高，提取的尿激酶纯度可以达到95%以上，提取方法简便的特性。

Description

一种苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体是涉及一种苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法。
背景技术
尿激酶为从健康人尿中分离的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白。由分子量分别为33000(LMW-tcu-PA)和54000(HMW-tcu-PA)两部分组成。尿激酶直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统，能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶，后者不仅能降解纤维蛋白凝块，亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，从而发挥溶栓作用。对新形成的血栓起效快、效果好。还能提高血管ADP酶活性，抑制ADP诱导的血小板聚集，预防血栓形成。尿激酶在静脉滴注后，患者体内纤溶酶活性明显提高；停药几小时后，纤溶酶活性恢复原水平。
然而尿激酶的分离提取一直是重中之重，因此，本发明需要提供一种苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，旨在解决尿激酶的分离提取问题。
发明内容
针对现有技术存在尿激酶的分离不足，本发明实施例的目的在于提供一种苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，经过本发明方法提取的尿激酶纯度可以达到95％以上，以解决上述背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，包括以下步骤：
步骤1)选取合适孔径、合适粒径树脂；
步骤2)对选取的树脂表面进行表面磺酸化修饰；
步骤3)用苯磺酸改性表面的树脂吸附男性尿液中的尿激酶；
步骤4)经过洗脱得到高纯度的尿激酶。
作为本发明进一步的方案，步骤3)中苯磺酸改性表面的树脂为苯磺酸表面改性的苯乙烯-而乙烯苯共聚物(PS)树脂球，苯磺酸表面改性的苯乙烯-而乙烯苯共聚物(PS)树脂球的制备方法，是将树脂表面进行磺化，得到磺酸化树脂。
作为本发明进一步的方案，所述苯乙烯-而乙烯苯共聚物通过磺酸化得到苯磺酸键合相树脂，其磺酸化所用方法中，磺酸化的磺化试剂是SO3、浓H2SO4、发烟H2SO4和ClSO2OH中的一种或多种。
作为本发明进一步的方案，所述苯磺酸表面改性的树脂球参数，其指标是比表面积为400-800m2/g，树脂粒径范围为38-1000μm。
所述的苯乙烯-二乙烯苯共聚(PS)树脂表面磺酸化，具体步骤如下：
S1、首先将树脂在二氯乙烷中充分溶胀2小时，后将浓度为98％的浓硫酸加入到反应瓶中，回流反应4小时，反应结束后将反应物置于砂芯漏斗中过滤，用水洗涤至中性。
S2、将步骤S1得到的产物投入到已放置好乙醇的反应瓶中，在80℃反应16小时，反应结束后将反应物置于砂芯漏斗中过滤。
S3、将步骤S2得到的产物用同产物质量的二氯乙烷洗涤3次，将树脂用甲醇洗涤后在砂芯漏斗中抽滤，然后将抽滤产物在真空干燥箱中干燥。
表面苯磺酸化树脂，用于提取男性尿液中尿激酶，具体步骤如下：
a)、将表面苯磺酸化树脂置于尿液中吸附尿液24-120小时，使其充分吸附。
b)、将步骤a)得到的吸附后树脂在用50mmol/L氨水进行洗脱，然后将洗脱液在饱和硫酸铵溶液中用盐酸pH值为3条件下6-7小时沉淀出，滤出尿激酶，并在-18℃条件下保存得的到尿激酶。
综上所述，本发明实施例与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明对尿激酶呈现出特异性吸附，本发明选择性好载样量高，本方法提取的尿激酶具有纯度高，提取的尿激酶纯度可以达到95％以上，提取方法简便的特性。
为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为发明实施例中尿激酶随时间吸附曲线的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1：
不同键合量苯磺酸树脂的制备
1000ml四口烧瓶中加入二氯乙烷400ml，树脂100g，溶胀2h，加入浓硫酸500ml。升温至84℃反应4小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用水洗涤至中性。
1000ml反应瓶中投入300ml乙醇，将上述树脂干燥后投入反应瓶中，70℃反应6h，然后砂芯漏斗过滤，用300ml甲醇洗涤，重复甲醇洗涤2次，干燥待用。
实施例2：
不同键合量苯磺酸树脂的制备
1000ml四口烧瓶中加入二氯乙烷400ml，树脂100g，溶胀2h，加入浓硫酸450ml。升温至84℃反应4小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用水洗涤至中性。
1000ml反应瓶中投入300ml乙醇，将上述树脂干燥后投入反应瓶中，70℃反应6h，然后砂芯漏斗过滤，用300ml甲醇洗涤，重复甲醇洗涤2次，干燥待用。
实施例3：
不同键合量苯磺酸树脂的制备
1000ml四口烧瓶中加入二氯乙烷400ml，树脂100g，溶胀2h，加入浓硫酸400ml。升温至84℃反应4小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用水洗涤至中性。
1000ml反应瓶中投入300ml乙醇，将上述树脂干燥后投入反应瓶中，70℃反应6h，然后砂芯漏斗过滤，用300ml甲醇洗涤，重复甲醇洗涤2次，干燥待用。
实施例4：
不同键合量苯磺酸树脂的制备
1000ml四口烧瓶中加入二氯乙烷400ml，树脂100g，溶胀2h，加入浓硫酸350ml。升温至84℃反应4小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用水洗涤至中性。
1000ml反应瓶中投入300ml乙醇，将上述树脂干燥后投入反应瓶中，70℃反应6h，然后砂芯漏斗过滤，用300ml甲醇洗涤，重复甲醇洗涤2次，干燥待用。
实施例5：
不同键合量苯磺酸树脂的制备
1000ml四口烧瓶中加入二氯乙烷400ml，树脂100g，溶胀2h，加入浓硫酸300ml。升温至84℃反应4小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用水洗涤至中性。
1000ml反应瓶中投入300ml乙醇，将上述树脂干燥后投入反应瓶中，70℃反应6h，然后砂芯漏斗过滤，用300ml甲醇洗涤，重复甲醇洗涤2次，干燥待用。
实施例6：
不同键合量苯磺酸树脂的制备
1000ml四口烧瓶中加入二氯乙烷400ml，树脂100g，溶胀2h，加入浓硫酸250ml。升温至84℃反应4小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用水洗涤至中性。
1000ml反应瓶中投入300ml乙醇，将上述树脂干燥后投入反应瓶中，70℃反应6h，然后砂芯漏斗过滤，用300ml甲醇洗涤，重复甲醇洗涤2次，干燥待用。
实施例7：
不同键合量苯磺酸树脂的制备
1000ml四口烧瓶中加入二氯乙烷400ml，树脂100g，溶胀2h，加入浓硫酸200ml。升温至84℃反应4小时，降温至室温，用砂芯漏斗过滤，用水洗涤至中性。
1000ml反应瓶中投入300ml乙醇，将上述树脂干燥后投入反应瓶中，70℃反应6h，然后砂芯漏斗过滤，用300ml甲醇洗涤，重复甲醇洗涤2次，干燥待用。
实施例8：
不同键合量苯磺酸表面改性树脂对尿激酶的吸附分离
取实例1-7中色谱树脂各1公斤，放入男性尿液中，充分吸附，吸附后用水洗涤去掉尿液；收集洗涤后树脂，用2％NH4OH和1M NaCl洗脱液，按3.5％体积搅拌洗脱1小时，在重复洗脱一次，抽滤收集洗脱液，合并两次洗脱液，加入硫酸铵至饱和；用5mol盐酸(HCl)调节洗脱液至pH值到3，在0-2℃下沉淀6-7小时，过滤收集棕色的尿激酶，抽干后于-18℃保存。
实施例9：
参见表1所示，磺酸化硫酸量与吸附尿激酶关系，不同键合量苯磺酸化表面改性树脂对尿激酶吸附的影响，如图1所示，为不同键合量与尿激酶吸附曲线。
表1
Figure BDA0002584079840000061
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理，仅是本发明的优选实施方式。本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）选取合适孔径、合适粒径树脂；
步骤2）对选取的树脂表面进行表面磺酸化修饰；
步骤3）用苯磺酸改性表面的树脂吸附男性尿液中的尿激酶；
步骤4）经过洗脱得到高纯度的尿激酶。
2.根据权利要求1所述的苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，其特征在于，步骤3）中苯磺酸改性表面的树脂为苯磺酸表面改性的苯乙烯-而乙烯苯共聚物树脂球。
3.根据权利要求2所述的苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，其特征在于，苯磺酸表面改性的苯乙烯-而乙烯苯共聚物树脂球的制备方法，是将树脂表面进行磺化，得到磺酸化树脂。
4.根据权利要求3所述的苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，其特征在于，苯乙烯-而乙烯苯共聚物通过磺酸化得到苯磺酸键合相树脂，其磺酸化所用方法中，磺酸化的磺化试剂是SO3、浓H2SO4、发烟H2SO4和ClSO2OH中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，其特征在于，苯磺酸表面改性的树脂球参数，其指标是比表面积为400-800m2/g，树脂粒径范围为38-1000μm。
6.根据权利要求3所述的苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，其特征在于，苯乙烯-二乙烯苯共聚树脂表面磺酸化，步骤如下：
S1、首先将树脂在二氯乙烷中充分溶胀2小时，后将浓度为98%的浓硫酸加入到反应瓶中，回流反应4小时，反应结束后将反应物置于砂芯漏斗中过滤，用水洗涤至中性；
S2、将步骤S1得到的产物投入到已放置好乙醇的反应瓶中，在80℃反应16小时，反应结束后将反应物置于砂芯漏斗中过滤；
S3、将步骤S2得到的产物用同产物质量的二氯乙烷洗涤3次，将树脂用甲醇洗涤后在砂芯漏斗中抽滤，然后将抽滤产物在真空干燥箱中干燥。
7.根据权利要求6所述的苯磺酸改性树脂提取尿激酶方法，其特征在于，表面苯磺酸化树脂，用于提取男性尿液中尿激酶，步骤如下：
a）、将表面苯磺酸化树脂置于尿液中吸附尿液24-120小时，使其充分吸附；
b）、将步骤a）得到的吸附后树脂在用50mmol/L氨水进行洗脱，然后将洗脱液在饱和硫酸铵溶液中用盐酸pH值为3条件下6-7小时沉淀出，滤出尿激酶，并在-18℃条件下保存得的到尿激酶。
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