CN111996247A - 糖酵解抑制剂及其在修复内皮细胞损伤中的应用 - Google Patents

糖酵解抑制剂及其在修复内皮细胞损伤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测血管内皮细胞状况的试剂盒、用于治疗血管内皮细胞异常的药物、用于治疗血管内皮细胞相关疾病的包括含糖酵解抑制剂药物和用于治疗血管内皮细胞相关疾病的其他药物的试剂盒。本发明还提供了PFKFB3酶检测试剂在制备用于检测血管内皮细胞状况和糖酵解抑制剂在制备用于治疗受试者的血管内皮细胞异常中的药物或试剂盒中的应用。本发明可根据血管内皮细胞状态来判断健康状况或预后前景，还可通过糖酵解抑制剂来治疗血管内皮细胞异常，减少例如癌症化疗后及造血干细胞移植后的并发症，减少治疗风险，提高生活质量，降低病死率，减少医疗费用，从而提高对血管内皮细胞异常有关的疾病等的临床诊疗水平并改善预后。

Description

糖酵解抑制剂及其在修复内皮细胞损伤中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及糖酵解抑制剂及其在修复内皮细胞损伤中的应用。
背景技术
血管内皮细胞(Endothelial cells，ECs)是位于血管内膜的单层扁平上皮细胞，构成血管内壁。在心血管系统中，血管内皮细胞具有维持血管完整性、调节血管运动、抗凝与促凝以及与造血细胞相互作用等多方面功能。因此，血管内皮细胞作为血管壁与血液之间的天然屏障，对于保持血液循环流动状态和维持人体正常的生理功能发挥着重要调控作用。
动物研究表明，造血干细胞的自我更新和多向分化能力受到骨髓微环境的严格调控。血管内皮细胞作为骨髓微环境的重要组分，对维持造血稳态起着重要调控作用。第一，骨髓血管内皮细胞组成血管网络，参与机体稳态和代谢调节，将氧气、营养物质和其他组分输送到靶器官，同时也为造血干细胞的归巢和进入循环系统提供了途径。第二，骨髓血管内皮细胞通过与造血干细胞的直接作用及通过细胞因子的间接作用，调控造血干细胞的自我更新和分化。第三，骨髓血管内皮细胞形成机械屏障，阻止来自循环系统的成熟红细胞和血小板进入骨髓，以维持骨髓缺氧的稳态环境，并调节造血和骨生成。第四，骨髓血管内皮细胞提供造血干细胞的锚定位点，形成骨髓血管微环境，有助于大部分造血干细胞维持静息状态和骨髓驻留。
在一些情况中，虽然化疗和造血干细胞移植是恶性血液疾病的有效治疗方式，但是化疗后造血抑制和移植后植入功能不良等仍是血液病患者的严重并发症，严重影响患者生活质量、增加医疗费用、病死率极高，是导致血液病患者治疗失败的重要原因之一。植入功能不良是指受者在移植后28天，三系中的二系以上仍未达到供者来源造血细胞的稳定植入(中性粒细胞≤0.5×109/L、血小板≤20×109/或血红蛋白≤70g/L)，患者细胞为完全供者嵌合。由于导致化疗或移植后植入功能不良的发病机制及其关键靶点尚未阐明，所以目前移植后植入功能不良患者的临床治疗以促进造血细胞生长的细胞因子类药物和血制品输注等对症治疗为主，缺乏针对性，疗效亟待提高。因此，促进化疗后血液病患者造血恢复的新靶点的发现及新方案的研发是亟待解决的重要临床科学问题。
骨髓血管内皮损伤参与了化疗后的造血抑制和移植后的植入功能不良等疾病的发生。临床研究发现，化疗后患者存在骨髓血管内皮细胞的损伤和造血抑制。在化疗所致造血损伤的小鼠模型中，抑制血管内皮细胞导致小鼠骨髓造血恢复延迟，表明骨髓血管内皮细胞在促进造血干细胞损伤后再生修复中具有关键作用。此外，本发明人的系列工作也证实，骨髓血管内皮细胞数量和功能异常所致造血干细胞损伤参与了移植后植入功能不良的发生。临床试验证实，移植前骨髓血管内皮细胞数量减少是移植后植入功能不良发生的独立危险因素，移植前修复受损的骨髓血管内皮细胞能够减少移植后植入功能不良的发生。由于化疗后的造血抑制和移植后的植入功能不良患者目前尚无有效的治疗手段，只能通过输注生长因子和血制品等进行对症治疗。因此，促进血液病患者血管内皮细胞损伤恢复的新靶点的发现及新方案的研发，对于化疗后的造血抑制和移植后的植入功能不良患者的治疗，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明人经过研究发现，糖酵解升高是血管内皮细胞异常例如化疗后造血抑制或移植后植入功能不良等的重要特征，血管内皮细胞糖酵解关键酶PFKFB3升高可以作为血管内皮细胞状态的生物标志物，用于诊断受试者例如患者的血管内皮细胞是否正常，并且糖酵解抑制剂可以用于治疗血管内皮细胞异常相关疾病。
基于上述发现并为了解决上述一个或多个问题，本发明在第一方面提供了一种用于检测受试者的血管内皮细胞状况的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测PFKFB3酶的检测试剂。
本发明在第二方面提供了一种用于治疗受试者的血管内皮细胞异常的药物，其特征在于，所述药物包含糖酵解抑制剂。
本发明在第三方面提供了一种用于治疗受试者的血管内皮细胞相关疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一药物和第二药物，所述第一药物为权利要求3至5中任一项所述的药物，所述第二药物为除了所述第一药物之外的用于治疗所述血管内皮细胞相关疾病的其他药物。
本发明在第四方面提供了用于检测PFKFB3酶的检测试剂在制备用于检测受试者的血管内皮细胞状况的药物或试剂盒中的应用。
本发明在第五方面提供了糖酵解抑制剂在制备用于治疗受试者的血管内皮细胞异常中的药物或试剂盒中的应用。
本发明通过PFKFB3酶检测可以测定血管内皮细胞状态，从而诊断受试者的血管内皮细胞是正常还是异常以及异常的程度，由此对受试者例如患者或潜在患者的健康状况或预后(例如化疗或移植后患者的造血重建)前景做出判断。本发明还可以通过糖酵解抑制剂来治疗血管内皮细胞异常，例如可以解决化疗后造血抑制和移植后植入功能不良的问题，降低血液病患者的严重并发症，提高患者生活质量、减少医疗费用，减少血液病患者治疗失败的风险，降低血液病患者目前极高的病死率，从而提高对例如造血抑制和移植后植入功能不良患者的临床诊疗水平，改善化疗和异基因造血干细胞移植患者的预后。
附图说明
图1显示，糖酵解关键酶PFKFB3在PGF患者骨髓血管内皮细胞中高表达。其中，SSC表示侧向散射光；FSC表示前向散射光；BMMNCs表示骨髓单个核细胞；CD45dim表示CD45弱阳性；PGF表示移植后植入功能不良。
图2显示，5-FU诱导人骨髓血管内皮细胞损伤及糖酵解升高。其中，CTL表示对照；5FU表示5-氟尿嘧啶；ANNEXIN V表示膜联蛋白V，7-AAD表示7-氨基放线菌素D。
图3显示，PFKFB3抑制剂3PO(3-(3-吡啶-炔基)-1-(4-吡啶)-2-丙烯-1-酮(3-(3-pyridi-nyl)-1-(4-pyridinyl)-2-propen-1-one)能修复5FU诱导的人骨髓血管内皮细胞损伤。
图4显示，5-FU诱导小鼠造血抑制及骨髓血管内皮细胞损伤。其中，PBS表示磷酸盐换缓冲盐水。
图5显示，PFKFB3抑制剂3PO能修复5-FU诱导的小鼠骨髓血管内皮细胞损伤并促进造血恢复。
图6显示，PFKFB3抑制剂3PO能修复PGF患者的骨髓血管内皮细胞损伤。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。但是，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如上所述，本发明人经过研究发现，糖酵解升高是血管内皮细胞异常例如化疗后造血抑制或移植后植入功能不良等的重要特征，血管内皮细胞糖酵解关键酶PFKFB3升高可以作为血管内皮细胞状态的生物标志物，用于诊断受试者例如患者的血管内皮细胞是否正常，并且糖酵解抑制剂可以用于治疗血管内皮细胞异常相关疾病。
例如，本发明人通过一些实验发现，骨髓血管内皮细胞糖酵解关键酶PFKFB3升高，可以作为移植后植入功能不良患者的生物标志物：转录组测序及前瞻性临床配对研究发现，植入功能不良患者的骨髓血管内皮细胞的糖代谢关键酶PFKFB3等的表达显著升高。
本发明人通过体外研究发现，降低糖酵解能够修复移植后植入功能不良患者的骨髓内皮细胞损伤：给予体外培养的植入功能不良患者的骨髓内皮细胞以糖酵解抑制剂例如3PO处理，与对照组相比，3PO处理组，凋亡下降，细胞数增多，迁移增加，成管能力增强。
本发明人通过体外研究和小鼠实验还发现，化疗后骨髓内皮细胞中的糖代谢关键酶PFKFB3表达增高：给予体外培养的健康供者的骨髓内皮细胞以氟尿嘧啶(最常用的诱导骨髓血管内皮细胞损伤的化疗药)处理，结果发现，与对照组相比，氟尿嘧啶组骨髓血管内皮细胞，凋亡增加，迁移减少，糖酵解增加。给予C57/BL6小鼠以氟尿嘧啶处理，构建经典骨髓抑制小鼠模型。结果发现，在化疗后第7天小鼠的造血损伤最严重，表现为骨髓造血组织减少，骨髓血管内皮细胞凋亡增加，外周血常规(白细胞，血红蛋白和血小板)明显下降；而第14天时小鼠的造血损伤有所恢复。本发明人还发现与第0天相比，在化疗后第7天(即造血损伤最严重时)小鼠骨髓血管内皮细胞中糖酵解关键酶PFKFB3的表达水平显著增高，在第14天时有所恢复。
本发明人进一步通过体外和小鼠研究发现，抑制糖酵解能修复化疗后骨髓内皮细胞损伤，促进造血恢复：体外实验发现，与氟尿嘧啶组相比，氟尿嘧啶和3PO联合处理组凋亡减少，迁移水平增加。小鼠实验发现，给予3PO处理，能够减轻化疗所致骨髓血管内皮细胞凋亡的增加，骨髓造血组织减少，并促进外周血常规(白细胞，血红蛋白和血小板)的恢复。
于是本发明在第一方面提供了一种用于检测受试者的血管内皮细胞状况的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测PFKFB3酶的检测试剂。在一些优选的实施方式中，所述检测试剂为用于检测PFKFB3酶的表达量或活性的检测试剂；优选的是，所述PFKFB3酶的表达量为蛋白表达量和/或基因表达量；更优选的是，所述检测试剂选自由PFKFB3酶底物、PFKFB3酶基因特异性序列、抗PFKFB3酶蛋白的抗体组成的组。
本发明在第二方面提供了一种用于治疗受试者的血管内皮细胞异常的药物，其特征在于，所述药物包含糖酵解抑制剂。
在一些优选的实施方式中，所述糖酵解抑制剂为PFKFB3酶活性抑制剂(例如抑制PFKFB3酶的活性的活性抑制剂和与PFKFB3酶竞争底物结合位点使得PFKFB3酶的酶促活性无法充分发挥的竞争性抑制剂)或PFKFB3酶表达抑制剂。
内皮细胞糖酵解关键酶PFKFB3的抑制剂主要包括：3PO、PFK-158(3PO衍生物；CASNo.：1462249-75-7；分子式：C18H11F3N2O)和具有如下式子的苯氧基吲哚(Phenoxyindole)等：
Figure BDA0002654122310000051
3PO及其衍生物如PFK-158等主要通过与Fru-6-P(果糖-6-磷酸)竞争，抑制PFKFB3，而不抑制PFK-1活性。在多种人源恶性血液肿瘤和癌细胞系中，3PO可显著地减缓其细胞增殖(IC50＝1.4-24μM)；苯氧基吲哚则直接与PFKFB3的ATP结合袋作用，从而抑制PFKFB3酶活性。与其他糖酵解抑制剂(如2DG(2-脱氧葡萄糖)等)相比，PFKFB3的抑制剂3PO及其衍生物PFK-158等，比较安全，因为它们只是部分且一过性的抑制糖酵解，不会引起糖酵解依赖的健康组织和器官的系统性损伤。
于是，在另一些优选的实施方式中，所述PFKFB3酶活性抑制剂为Fru-6-P竞争抑制剂，优选的是，所述PFKFB3酶活性抑制剂选自由3PO、3PO类似物如PFK-158、2DG和Phenoxyindole组成的组；最优选的是，所述PFKFB3酶活性抑制剂为3PO。
本发明在第三方面提供了一种用于治疗受试者的血管内皮细胞相关疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一药物和第二药物，所述第一药物为权利要求3至5中任一项所述的药物，所述第二药物为除了所述第一药物之外的用于治疗所述血管内皮细胞相关疾病的其他药物例如用于给癌症患者进行化学治疗所需的化疗剂如5-氟尿嘧啶等。所述第一药物可以与常规化疗药物联合使用，从而解决化疗导致的血管内皮细胞异常。
本发明在第四方面提供了用于检测PFKFB3酶的检测试剂在制备用于检测受试者的血管内皮细胞状况的药物或试剂盒中的应用。
本发明在第五方面提供了糖酵解抑制剂在制备用于治疗受试者的血管内皮细胞异常中的药物或试剂盒中的应用。
在一些优选的实施方式中，在本发明前述各方面分别所述的试剂盒、药物或应用中，在提及血管内皮细胞异常的情况下，所述血管内皮细胞异常为骨髓血管内皮细胞异常；优选的是，所述血管内皮细胞异常为糖酵解异常增高性血管内皮异常；更优选的是，所述血管内皮细胞异常选自化疗后造血抑制、造血干细胞移植后植入功能不良性骨髓血管内皮细胞异常、糖尿病并发性血管内皮细胞异常和缺血性疾病性血管内皮细胞异常组成的组，所述缺血性疾病例如为缺血性心脏病或进行性动脉粥样硬化等缺血性疾病。
在一些优选的实施方式中，本发明前述各方面分别所述的试剂盒、药物或应用中，在提及受试者的情况下，所述受试者为哺乳动物；优选的是，所述受试者为人类受试者，更优选的是，所述人类受试者的血管内皮细胞尤其是骨髓血管内皮细胞具有CD34+CD309+CD133+表型；可选的是，所述受试者是小鼠受试者，更优选的是，所述小鼠受试者的血管内皮细胞尤其是骨髓血管内皮细胞具有CD144+表型。
在一些具体的优选实施方式中，所述受试者为化疗后造血抑制患者或移植后植入功能不良患者。
在一些优选的实施方式中，在采用本发明的药物或者治疗试剂盒治疗后，所述受试者的骨髓微环境中会呈现出选自以下的一种或多种情况：骨髓内皮细胞损伤减轻、造血组织增多或造血恢复等好转反应。
本发明对糖酵解抑制剂的使用浓度或用量没有特别的限制，只要能够实现例如上述好转反应并且所述受试者能够耐受或可接受(相对于所述抑制剂的大剂量可能带来的影响更优先选择实现所述好转反应)即可，例如在所述抑制剂为3PO的情况下，使用浓度例如可以为5至15μM，例如10μM。本领域技术人员在本申请公开内容的教导下，有能力根据具体情况选择合适的浓度。
在一些特别优选的实施方式中，本发明提供了一种在化疗后造血抑制或移植后植入功能不良患者中检测骨髓血管内皮细胞状况或有效修复受损骨髓血管内皮细胞的方法。本发明人发现，糖酵解升高是化疗后造血抑制或移植后植入功能不良患者受损骨髓血管内皮细胞的重要特征，骨髓血管内皮细胞糖酵解关键酶PFKFB3升高可以作为化疗后造血抑制或移植后植入功能不良等疾病骨髓血管内皮细胞损伤的生物标志物，而且通过糖酵解抑制剂3PO，降低上述疾病受损的骨髓血管内皮细胞中异常升高的糖酵解，实现了降低骨髓血管内皮细胞因移植或化疗所致的凋亡，修复其受损的功能，促进骨髓造血恢复。
实施例
下文将通过实施例的方式对本发明进行进一步的说明，但是这些实施例仅仅出于说明目的而不是限定目的，本发明的保护范围不限于这些实施例。
一般方法：
人骨髓标本处理(骨髓单个核细胞提取)
骨髓血液标本1：1加入淋巴细胞分离液(GE Healthcare Milwaukee,WI,USA)，以1800rpm在室温离心18分钟。轻轻吸取中间层白色雾状混合液，即单个核细胞，用PBS洗两遍，待检测或培养。患者骨髓1：1加入淋巴细胞分离液(GE Healthcare Milwaukee,WI,USA)，以1800rpm在室温梯度离心18分钟。轻轻吸取中间层白色雾状混合液，即单个核细胞，用1×PBS洗两遍。把骨髓单个核细胞种在纤维结合蛋白(fibronectin)(Sigma,St.Louis,MO,USA)预先包被好的24孔板中，加入内皮细胞诱导培养基EGM-2-MV-SingleQuots(Lonza,Walkersville,MD,USA)和10％胎牛血清，37℃培养7天，每四天换一次液。
人骨髓血管内皮细胞体外培养及鉴定
提前用Fibronectin将24孔细胞培养板包被24h；取骨髓单个核细胞1×106种板于24孔板，加入含10％FBS的EGM-2培养基500μL；放入37度含5％CO2的孵箱培养；第四天换液；培养至第七天，贴壁细胞即为人骨髓血管内皮细胞，消化并收集细胞，利用流式抗体(CD34-percp，CD45-V500，CD309-PE，CD133-APC)标记，CD34+CD45dimCD309+CD133+细胞为人骨髓血管内皮细胞
细胞迁移实验
在迁移小室中接种培养第7天骨髓血管内皮细胞的细胞悬液(5×104/100μL，无血清培养基)；下室加入600μL含10％FBS的EGM-2培养基；放入37℃含5％CO2的孵箱培养24h；轻轻吸干迁移小室和下室中的培养基；小室内和下室均加入4％预冷多聚甲醛，使其充分接触小室膜上的细胞，固定30min；去除多聚甲醛，加入0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍；普通显微镜下拍照观察，随机五个视野，计数。
流式细胞仪检测细胞凋亡
用流式管取骨髓单个核细胞1×106/200μL每管；加入骨髓血管内皮细胞表面流式抗体(人骨髓血管内皮细胞：CD34-FITC，CD45-V500，CD309-PE；小鼠骨髓血管内皮细胞：CD144-PE)，37℃孵育15min；加入2mL PBS洗1遍细胞，1500rpm×5min；用结合缓冲液(Binding buffer)制成1×106/200μL的细胞悬液；加入Annexin-V和7-AAD，室温孵育15min；加入200μL结合缓冲液震荡混匀，4h内上机检测。流式图像分析采用Diva 7.0软件。
流式检测骨髓血管内皮细胞蛋白表达
用流式管取骨髓单个核细胞或培养后的骨髓血管内皮细胞1×106/200μL每管，加入骨髓血管内皮细胞细胞表面流式抗体(CD34-percp 2μL，CD45-V5002μL，CD309-PE 5μL，CD133-APC 2μL，)，37℃孵育15min；加入100μL试剂A(Reagent A，固定培养基(Fixationmedium))，室温孵育15min；加入1mLPBS，离心14000rpm×1min，弃上清，加入100μL试剂B(Reagent B，Perm培养基(Permmedium))吹打混匀；加入一抗(PFKFB3 1μL等)，混匀，室温孵育15min。加入1mLPBS，离心14000rpm×1min，弃上清，加入100μL Reagent B(Permmedium)吹打混匀；加入FITC-二抗1μL，混匀，室温孵育15min。加入1mLPBS，离心14000rpm×1min，弃上清，加入200μL 1×PBS，震荡混匀，4h内上机检测。流式图像分析采用Diva 7.0软件(美国BD公司)；划门策略：侧向角(SSC)与前向角(FSC)中选取全部骨髓单个核细胞，CD45-/dim细胞群内圈出CD34+细胞，再进一步圈出CD309+CD133+细胞即为骨髓血管内皮细胞。抗体货号：单克隆抗体：CD34-percp(B246900，Biolegend)，CD45-V500(560777，BD Horizon)，CD309-PE(560494，BD Phagrmingen)，CD133-APC(130-113-184，Miltenyi)，PFKFB3(ab181861,abcam)。
培养基中乳酸检测
收集细胞培养皿中的培养基，离心14000rpm×1min，弃沉淀。按照南京建成生物工程研究所，乳酸(lactic acid)测定试剂盒(测血清、组织等)(比色法)(A019-2-1)说明书，将1mL的酶工作液和0.2mL的显色剂，依次加入0.02mL样品或标准品或双蒸水中。混匀，37℃水浴10min，加入终止液2mL。混匀，波长530nm，双蒸水调零，测各孔吸光度值。
培养基中葡萄糖检测
收集细胞培养皿中的培养基，离心14000rpm×1min，弃沉淀。按照南京建成生物工程研究所，葡萄糖(Glu)测试盒(F006-1-1)说明书，将1mL检测试剂，依次加入0.01mL样品或标准品或双蒸水中。混匀，37℃水浴10min。混匀，双蒸水调零，测各孔505nm波长吸光度值。
流式检测小鼠骨髓血管内皮细胞蛋白表达
用流式管取小鼠骨髓细胞1×106/200μL每管，加入小鼠骨髓血管内皮细胞细胞表面流式抗体(CD144-PE 2μL)，37℃孵育15min；加入100μL Reagent A(Fixation medium)，室温孵育15min；加入1mL1×PBS，离心14000rpm×1min，弃上清，加入100μL Reagent B(Perm medium)吹打混匀；加入一抗(PFKFB31μL等)，混匀，室温孵育15min。加入1mL1×PBS，离心14000rpm×1min，弃上清，加入100μL Reagent B(Perm medium)吹打混匀；加入FITC-二抗1μL，混匀，室温孵育15min。加入1mL1×PBS，离心14000rpm×1min，弃上清，加入200μLPBS，震荡混匀，4h内上机检测。流式图像分析采用Diva 7.0软件(美国BD公司)；
实施例1：检测移植后植入功能不良患者骨髓血管内皮细胞糖酵解相关蛋白的表达
为了验证糖酵解异常是否参与了移植后植入功能不良的发生，本研究利用流式分选(图1A)结合微量建库的转录组测序分析移植后植入功能不良与植入功能良好患者的骨髓血管内皮细胞，结果显示，相对于移植后植入功能良好患者，糖酵解相关基因(如SLC2A3、HK1、HK2、HK3、PFKFB2、PFKFB3、PFKFB4等)在移植后植入不良患者的骨髓血管内皮细胞中表达显著增高(图1B)。随后，本发明人开展前瞻性临床配对研究，通过流式方法测定糖酵解关键酶PFKFB3的蛋白表达。流式结果显示移植后植入功能不良患者骨髓血管内皮细胞的糖酵解关键酶PFKFB3表达显著增高(图1C)。这些结果提示，糖酵解异常参与了移植后植入功能不良患者骨髓血管内皮细胞的损伤。
实施例2：体外实验显示受损的骨髓血管内皮细胞糖酵解异常
为了进一步研究人骨髓血管内皮细胞在损伤前后功能和糖酵解水平的变化，本发明人通过化疗药5-FU处理，构建人骨髓血管内皮细胞体外损伤模型。本发明人的实验发现，化疗药5-FU处理之后，人骨髓血管内皮细胞的细胞数目显著减少(图2A)，凋亡显著增加(图2B和2C)，迁移能力减弱(图2D)。同时，本发明人还发现，损伤的人骨髓血管内皮细胞葡萄糖的消耗(图2E)和乳酸的生成(图2F)显著增高以及糖酵解相关基因(糖酵解关键酶PFKFB3)表达增高(图2G)。
实施例3：体外实验显示糖酵解抑制剂可以减低人骨髓血管内皮细胞损伤
糖酵解抑制剂3PO(10μM)能减低化疗药(5-FU)处理损伤所致的骨髓血管内皮细胞异常增高的糖的消耗和乳酸的生成(图3A和3B)，使其恢复到接近(二甲基亚砜)组(对照组，亦记为CTL组)的水平。另外，3PO处理组比5-FU组的细胞数有显著增加(图3C)。同时相比5-FU组，骨髓血管内皮细胞的凋亡比例在3PO组有显著降低(图3D)。而且，相比5-FU组，3PO组的迁移能力明显增加(图3E)。
实施例4：小鼠体内实验显示受损的骨髓血管内皮细胞糖酵解异常
为了进一步验证糖酵解在骨髓血管内皮细胞损伤中的作用，本发明人通过5-氟尿嘧啶(5FU)处理(250mg/kg，尾静脉注射)，构建小鼠骨髓血管内皮细胞损伤的体内模型。本发明人的实验发现，在化疗后第7天小鼠的造血损伤最严重，表现为外周血常规(白细胞血、红蛋白和血红蛋白)明显下降(图4A、4B和4C)，骨髓造血组织减少(图4D)，骨髓血管内皮细胞凋亡增加(图4E)；而第14天时小鼠的造血损伤有所恢复(图4A-4E)。本发明人还发现，与第0天相比，在化疗后第7天(即造血损伤最严重时)小鼠骨髓血管内皮细胞中糖酵解关键酶PFKFB3的蛋白表达水平显著增高，在第14天时有所恢复(图4F)。
实施例5：小鼠体内实验显示糖酵解抑制剂可以减低骨髓血管内皮细胞损伤
在5-氟尿嘧啶处理(250mg/kg，尾静脉注射)后的第5天，7天和9天，分别给予3PO处理(25mg/kg，腹腔注射)。用小鼠骨髓血管内皮细胞细胞表面流式抗体CD144-PE标记后，用膜联蛋白V(ANNEXIN V)和7-AAD标记细胞后，进行流式分析，可以看出，给予3PO能够减轻化疗所致骨髓血管内皮细胞凋亡的增加(图5A)，组织染色显示，3PO能够缓解5-FU所致骨髓造血组织减少(图5B)，外周血常规检测显示，3PO能够缓解5-FU所致白细胞、血小板和血红蛋白的减少(图5C、5D和5E)。
实施例6：糖酵解的抑制剂可以修复移植后植入功能不良患者受损的骨髓血管内皮细胞
为了探究糖酵解在移植后植入功能不良患者受损的骨髓血管内皮细胞中的作用，本发明人用糖酵解抑制剂来处理移植后植入功能不良患者受损的骨髓血管内皮细胞。结果发现，糖酵解抑制剂3PO(10μM)都能减低损伤所致的骨髓血管内皮细胞异常增高的糖的消耗和乳酸的生成(图6A和6B)。同时骨髓血管内皮细胞的凋亡比例在糖酵解抑制剂3PO组有显著降低(图6C)。对于迁移能力，糖酵解抑制剂3PO组比DMSO组迁移的细胞数有显著增加(图6D)。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种用于检测受试者的血管内皮细胞状况的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测PFKFB3酶的检测试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为用于检测PFKFB3酶的表达量或活性的检测试剂；优选的是，所述PFKFB3酶的表达量为蛋白表达量和/或基因表达量；更优选的是，所述检测试剂选自由PFKFB3酶底物、PFKFB3酶基因特异性序列、抗PFKFB3酶蛋白的抗体组成的组。
3.一种用于治疗受试者的血管内皮细胞异常的药物，其特征在于，所述药物包含糖酵解抑制剂。
4.根据权利要求所述的药物，其特征在于，所述糖酵解抑制剂为PFKFB3酶活性抑制剂。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述PFKFB3酶活性抑制剂为Fru-6-P竞争抑制剂；另外优选的是，所述PFKFB3酶活性抑制剂选自由3PO、3PO类似物(如PFK-158)和苯氧基吲哚组成的组。
6.一种用于治疗受试者的血管内皮细胞相关疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一药物和第二药物，所述第一药物为权利要求3至5中任一项所述的药物，所述第二药物为除了所述第一药物之外的用于治疗所述血管内皮细胞相关疾病的其他药物。
7.用于检测PFKFB3酶的检测试剂在制备用于检测受试者的血管内皮细胞状况的药物或试剂盒中的应用。
8.糖酵解抑制剂在制备用于治疗受试者的血管内皮细胞异常中的药物或试剂盒中的应用。
9.根据权利要求1至8所述的试剂盒、药物或应用，其特征在于：
所述血管内皮细胞异常为骨髓血管内皮细胞异常；
优选的是，所述血管内皮细胞异常为糖酵解异常增高性血管内皮细胞异常；
更优选的是，所述血管内皮细胞异常选自由移植后植入功能不良患者的血管内皮细胞异常、造血抑制和化疗后骨髓血管内皮细胞异常、糖尿病并发性血管内皮细胞异常和缺血性疾病性血管内皮细胞异常组成的组。
10.根据权利要求1至8所述的试剂盒、药物或应用，其特征在于，所述受试者为哺乳动物；优选的是，所述受试者为人类受试者，更优选的是，所述人类受试者的血管内皮细胞尤其是骨髓血管内皮细胞具有CD34+CD309+CD133+表型；可选的是，所述受试者是小鼠受试者，更优选的是，所述小鼠受试者的血管内皮细胞尤其是骨髓血管内皮细胞具有CD144+表型。
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