CN111996152A - 一种对暗黑鳃金龟有杀虫活性的肠杆菌属菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对暗黑鳃金龟有杀虫活性的肠杆菌属菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20449。

Description

一种对暗黑鳃金龟有杀虫活性的肠杆菌属菌株

技术领域

本发明涉及一种对暗黑鳃金龟有杀虫活性的肠杆菌属菌株。

背景技术

在微生物防治农业害虫方面，以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)来防治地下害虫暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)为主。而拓宽防治害虫的微生物种类，可以增加生物农药的选择，有利于延缓害虫的抗药性或交叉抗性。

发明内容

本发明之一提供了一种肠杆菌属(Enterobacter)的菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20449。

对本发明的肠杆菌菌株遗传改良后得到的工程菌可以赋予其更优和/或更多的性能，例如可以结合菌株自身的特性，根据实际应用增加和/或拓宽其杀虫和/或抗虫的性能，或使其兼具抗菌的性能。即通过对本发明的菌株遗传改良，使其兼具如上性能中的至少一种。由于该工程菌株以本发明的肠杆菌菌株为改造对象，即向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，遗传改良后的菌株仍然为肠杆菌。

因此，本发明之二提供了一种对本发明之一所述的菌株进行遗传改良后得到的工程菌。例如，所述遗传改良后的工程菌可以为转入携带有功能基因的质粒后所得到的工程菌株，也可以为将功能基因重组到野生菌株的基因组中得到的工程菌株。

因此，在一个具体实施方式中，所述工程菌通过向如本发明之一所述的菌株转入功能基因得到。

在一个具体实施方式中，所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和用于增强所述菌株防治为害植物害虫效果的基因中的至少一种。

虽然转基因倍受部分群体质疑，然而将肠杆菌菌株进行遗传改良后得到的工程菌并不直接供人类或动物食用。而且在将其投放市场进行商业化之前，需要首先通过国家有关部门的安全性评价，以避免产生安全性问题。根据工程菌的安全性结论以及国家有关部门的批准，然后对其合理使用。

本发明之三提供了一种组合物，所述组合物包含如本发明之一所述的菌株或如本发明之二所述的工程菌。

在一个具体实施方式中，所述组合物的剂型为悬浮剂、油悬剂、粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂中的至少一种。

本发明之四提供了如本发明之一所述的菌株、如本发明之二所述的工程菌和如本发明之三所述的组合物中的至少一种在用于防治暗黑鳃金龟中的应用。

在本发明中没有特殊说明的情况下，本发明中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。

附图说明

图1为IPPBiotE33菌株基于16S rDNA的系统发育树。

菌株保藏

本申请筛选的微生物IPPBiotE33菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20449，保藏日期为2020年07月27日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为肠杆菌(Enterobacter sp.)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本申请做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本申请的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本申请的精神和范围下可以对本申请技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本申请的保护范围内。

如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。

TSB培养基购自sigma，货号为T8907-1KG。

实施例1

细菌分离纯化

1.1田间花生种植与蛴螬接种

在河北廊坊实验基地试验田选取1亩地种植花生，在播种前选取五点在田间深埋304不锈钢网箱以限制后续接种的蛴螬向周边扩散。播种时，每穴播种3粒花生种子，每3天浇一次水。在花生结荚期接种已经饥饿处理48h的暗黑鳃金龟三龄幼虫，每个网箱15头，在接种暗黑鳃金龟幼虫后的7d时取样，每个网箱点3个重复采集花生根际土。

1.2田间根际土壤采集及处理

花生根际土采集及处理如下：

完整取出花生根系，抖落花生根上的非根际土，仅留下与根表距离<1mm的根际土，用无菌剪刀剪下带有根际土的花生根系，将根系放至无菌的50mL离心管中，加入1×PBS缓冲液，直至没过整个花生根系，浸泡静置15min后，涡旋震荡15S，将花生根系取出后，用100目筛过滤掉根际土壤悬液中的须根、杂质等，然后离心3200g，15min，在去掉部分上清后，用留下的5mL上清重新悬浮离心沉淀物(根际土)，得到根际土壤悬液。将该根际土壤悬液用于根际细菌的分离。

1.3根际可培养细菌的分离

参照Bai等人的文章(Bai et al.,2015)，使用TSB根际细菌分离培养基对根际土壤悬液中的可培养细菌进行分离：将根际土壤悬液进行10倍梯度稀释，选取稀释10⁷、10⁸、10⁹三个梯度进行涂板，每个重复涂40μL土壤悬液，于30℃恒温培养箱中培养1天，1个平板计作1个重复，每个梯度3个重复。一周后，发现稀释至10³时，每个平板上生长的菌落量较大，且十分密集，难以挑取单菌落进行再次培养；稀释至10⁵时，每个平板上生长的菌落过少；只有稀释至10⁴时，每个平板上生长的菌落数量在100-300个之间，因此选用该稀释梯度挑取菌落。挑取300个单菌落使用TSB平板进行纯化培养，以此方式纯化培养3次，得到纯化的分离菌株。

对每株分离菌株进行编号。

实施例2

分离菌株对暗黑鳃金龟杀虫活性测定

将从实施例1中各编号下的分离菌株分别转接到5mL TSB试管中，30℃培养12h活化，然后转接到相应固体培养基(15cm培养皿)上，30℃培养12h，收集菌体，将获得菌体重悬于20mL无菌水中。通过菌落计数的方法确定菌液浓度。

以无菌水为阴性对照，用未经稀释的高浓度菌液进行初筛。根据初筛结果，确定IPPBiotE33菌株对暗黑鳃金龟具有杀虫活性。

接下来对IPPBiotE33菌株进行复筛：

将胡萝卜擦丝，清水冲洗，晾干。将IPPBiotE33菌株的菌液设置6个浓度梯度。取适量晾干的萝卜丝浸泡于各个浓度梯度下的菌液中，约20min后取出萝卜丝，均匀放于6孔生测板中，每孔约4-5条，剩余菌液拌于土。将拌好的土均匀分装至6孔生测板中，每个6孔板用土60g，每孔接入1头初孵2日龄幼虫，共接种20头，放至于温度25±1℃，RH(65±5)％，光照周期16L﹕8D的培养箱中饲养，每个浓度设置3个重复。其中，以无菌水(0cfu/mL)为阴性对照。每天检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。7d后调查死/活虫数，计算平均死亡率、校正死亡率，原始结果见表1。

表1

使用PoloPlus软件分析死亡率得出LC₅₀值，结果为3.97×10⁷cfu/g，95％置信区间为3.01×10⁷至3.87×10¹⁰cfu/g。

实施例3

IPPBiotE33菌株的鉴定

参照分子克隆中提取革兰氏阴性细菌的所述方法提取IPPBiotE33基因组DNA。用细菌16S rDNA通用引物：27F(如SEQ ID No.1所示)和1492R(如SEQ ID No.2所示)扩增IPPBiotE33的16S rDNA序列，得到的1.3kb左右多片段。经试剂盒纯化进行TA克隆，转化大肠杆菌得到的克隆子，经过菌液PCR验证正确后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得序列为1298bp(如SEQ ID No.3所示)。所测序列提交EzBioCloud网站进行同源性比较，采用MEGA6.0构建系统发育树(图1)。根据图1的系统发育树可知，其与肠杆菌属的菌株亲缘关系较近，因此，本发明的IPPBiotE33的系统分类为肠杆菌属(Enterobacter)细菌。

将IPPBiotE33菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20449，保藏日期为2020年07月27日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为肠杆菌属(Enterobacter)细菌。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种对暗黑鳃金龟有杀虫活性的肠杆菌属菌株

<130> LHA2060581

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

cggttacctt gttacgactt 20

<210> 3

<211> 1298

<212> DNA

<213> 肠杆菌(Enterobacter sp.)

<400> 3

cttcttttgc aacccactcc catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta 60

ttcaccgtgg cattctgatc tacgattact agcgattccg acttcatgga gtcgagttgc 120

agactccaat ccggactacg acgcacttta tgaggtccgc ttgctctcgc gaggtcgctt 180

ctctttgtat gcgccattgt agcacgtgtg tagccctact cgtaagggcc atgatgactt 240

gacgtcatcc ccaccttcct ccagtttatc actggcagtc tcctttgagt tcccggccga 300

accgctggca acaaaggata agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatttcaca 360

acacgagctg acgacagcca tgcagcacct gtctcagagt tcccgaaggc accaatgcat 420

ctctgctaag ttctctggat gtcaagagta ggtaaggttc ttcgcgttgc atcgaattaa 480

accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattca tttgagtttt aaccttgcgg 540

ccgtactccc caggcggtcg acttaacgcg ttagctccgg aagccacgcc tcaagggcac 600

aacctccaag tcgacatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc 660

cccacgcttt cgcacctgag cgtcagtctt cgtccagggg gccgccttcg ccaccggtat 720

tcctccagat ctctacgcat ttcaccgcta cacctggaat tctacccccc tctacaagac 780

tctagcctgc cagtttcgaa tgcagttccc aggttgagct cggggatttc acatccgact 840

tgacagaccg cctgcgtgcg ctttacgccc agtaattccg attaacgctt gcaccctccg 900

tattaccgcg gctgctggca cggagttagc cggtgcttct tctgcgagta acgtcaatcg 960

acgaggttat taacctcatc gccttcctcc tcgctgaaag tgctttacaa cccgaaggcc 1020

ttcttcacac acgcggcatg gctgcatcag gcttgcgccc attgtgcaat attccccact 1080

gctgcctccc gtaggagtct ggaccgtgtc tcagttccag tgtggctggt catcctctca 1140

gaccagctag ggatcgtcgc ctaggtgagc cgttacccca cctactagct aatcccatct 1200

gggctcatcc gatggcaaga ggcccgaagg tccccctctt tggtcttgcg acgttatgcg 1260

gtattagcca ccgtttccag tagttatccc cctccatc 1298

Claims (7)

1.一种肠杆菌属(Enterobacter)的菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20449。

2.一种对权利要求1所述的菌株进行遗传改良后得到的工程菌。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌通过向如权利要求1所述的菌株转入功能基因得到。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和用于增强所述菌株防治为害植物害虫效果的基因中的至少一种。

5.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的菌株或如权利要求2至4中任意一项所述的工程菌。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为悬浮剂、油悬剂、粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂中的至少一种。

7.如权利要求1所述的菌株、如权利要求2至4中任意一项所述的工程菌和如权利要求5或6所述的组合物中的至少一种在用于防治暗黑鳃金龟中的应用。

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