CN111996123A - 一种内生真菌红绶曲霉及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种内生真菌红绶曲霉及其应用，属于微生物技术领域。该微生物分类命名为红绶曲霉(Aspergillus nomius)z4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 2019946，保藏日期：2019年11月18日。本发明的红绶曲霉z4采用液态发酵生产果胶酶，并且可以有效降解竹材废弃物中的果胶、半纤维素、木质素、纤维素和蜡质等成分，该微生物可以应用于降解竹粉获得竹纤维中。

Description

一种内生真菌红绶曲霉及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种内生真菌红绶曲霉及其应用。

背景技术

果胶质是一类主要以D-半乳糖醛酸和D-半乳糖醛酸甲酯以α-1,4糖苷键连接而成的多糖，广泛存在于植物细胞壁的初生壁和细胞中间片层，起到将细胞壁粘合在一起的作用。果胶酶是能够分解果胶质的一组酶的总称。果胶酶主要由植物和微生物产生，微生物中细菌、放线菌、酵母以及霉菌均可产生果胶酶。

竹产业是我国林业的四大朝阳产业之一，我国的竹类资源极为丰富，竹子种类、分布范围和竹林面积等都居世界首位。竹子是一种生产期短、产量高、再生性强、易栽培的多年生植物，具有保持水土、净化涵蓄水源、吸收二氧化碳、降低温室效应等特性。竹材中含有40％～60％左右的纤维素，介于阔叶木和针叶木之间，高于一般草类。此外，竹子是一种速生材，生长快，周期短，产量高，合理间伐，可数十年收获而不破坏竹林整体结构。所以开发竹材纤维素在环境问题越来越严重、森林资源明显不足、木材供应越来越紧张的今天和未来，不仅能减少对木材的消耗，也能缓解对环境的压力。因此，竹产业近年来已成为我国林业发展的一个新的经济增长点。然而，竹子细胞壁结构复杂，竹子纤维素和半纤维素、果胶质和木质素之间交联紧密，且木质素含量较高，超过20％。目前，生产上一般通过碱预处理方法去除竹纤维中的半纤维素、果胶和木质素等杂质，处理过程中需使用强碱性的化学试剂，腐蚀性强，对设备仪器要求高，耗水量大，造成严重的环境污染。而利用微生物脱胶制取竹纤维技术均为采用单一生物酶或复合生物酶对竹子进行处理，酶生产成本高，且对设备和工艺条件要求较高。

现有技术中关于微生物产生果胶酶的研究有：白兰芳等(产果胶酶枯草芽孢杆菌的鉴定、发酵条件优化及产物酶学性质的研究,中国畜牧杂志,2011,47(19):63-68.)从柑橘园土样中分离获得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JLSP-13产果胶酶酶活最大为37.6U/mL；王齐玮等(大麻籽内生菌果胶酶的菌株筛选初探,纤维素科学与技术,2015,23(1):55-70.)从大麻籽中筛选到的内生细菌最高酶活为21.8U/mL；赵晓璐(荷叶内生菌的多样性分析及可利用菌株的筛选)从荷叶中筛选出一株内生真菌HY2产果胶酶活为62.9U/mL，表明内生真菌z4发酵后的粗酶液具有较高的酶活，有一定应用价值。但是将微生物应用于竹材脱胶中的研究鲜有报道，因此，寻找一种低能高效且对环境友好的提取竹纤维的方法成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题在于提供一种内生真菌红绶曲霉z4，该菌株分离自野生芦苇枝条中，是一种新的菌株。本发明要解决的另一个技术问题是提供红绶曲霉z4在制备果胶酶制剂中的应用，该菌株产生的果胶酶活力较高，也较稳定。本发明要解决的技术问题还有一个在于提供红绶曲霉z4在降解竹粉中的应用，该菌株产生的果胶酶可以很好的降解竹材中的果胶、半纤维素等成分，可以很好的应用于降解竹材获得竹纤维的应用中。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种内生真菌红绶曲霉，其分类命名为红绶曲霉(Aspergillus nomius)z4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 2019946，保藏日期：2019年11月18日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

红绶曲霉z4，是从芦苇枝条中筛选获得的。

红绶曲霉z4的生物学特征：该菌株在PDA培养基上培养7天后，菌落直径达到6cm左右，菌落正面颜色也随其生长由白色变为黄色再变为绿色，呈半绒毛状，菌落表面有同心圆轮状带和放射状沟纹，反面无色。

红绶曲霉z4菌株ITS鉴定结果如SEQ ID NO.1所示，将测得的ITS序列通过MEGA5.0软件进行系统进化树的构建，进化树显示菌株z4属于红绶曲霉，结合形态学鉴定和ITS分子鉴定结果，该菌株被鉴定为红绶曲霉(Aspergillus nomius)。

上述内生真菌红绶曲霉在制备果胶酶制剂中的应用。

上述内生真菌红绶曲霉在降解竹粉中的应用。

有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：

(1)本发明的红绶曲霉z4采用液态发酵生产果胶酶，具有酶活力高和稳定的特点，在最适条件下该菌株产生的果胶酶酶活力达到120.39U/mL，说明该菌株可以应用于制备果胶酶制剂的应用中。

(2)本发明红绶曲霉z4可以有效降解竹材废弃物中的果胶、半纤维素、木质素纤维素和蜡质等成分，该微生物可以应用于降解竹粉获得竹纤维的应用中。

附图说明

图1为红绶曲霉z4所产果胶酶酶活性与反应温度之间的线性关系图；

图2为红绶曲霉z4所产果胶酶酶活性与pH值之间的线性关系图；

图3为红绶曲霉z4所产果胶酶的热稳定性结果图；

图4为红绶曲霉z4所产果胶酶的pH稳定性结果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

下列实施中，如无特殊说明，无菌均为高温杀菌(121℃，20min)

筛选培养基配方如下：果胶2g·L^-1、K₂HPO₄ 1g·L^-1、MgSO₄ 0.5g·L^-1、NaNO₃ 3g·L^-1、FeSO₄·7H₂O 0.01g·L^-1、琼脂15g·L^-1。

发酵培养基配方如下：桔皮粉10g·L^-1、(NH₄)₂SO₄ 20g·L^-1、K₂HPO₄·3H₂O 2g·L^-1、KH₂PO₄ 8g·L^-1。

实施例1

菌株的筛选

1、菌株初筛

(1)将新采集的野生芦苇枝条，该野生芦苇枝条产自福建省武夷山市，将芦苇叶子、枝条和根剪成3～4cm长，然后用洗洁精清洗3次后自来水流水冲洗30min，洗净后按照叶子、枝条和根分类放在灭菌后的广口瓶中，紫外灯照射30min；

(2)用70％的乙醇浸没30s(叶子10s)倾去，用无菌蒸馏水冲洗2～3次，接着用2.5％的次氯酸钠溶液浸没5min(叶子3min)倾去，后用无菌蒸馏水冲洗2～3次；

(3)用已灭菌的手术刀将根和茎的外表皮剥离取根茎中间部分，切成0.5cm×0.5cm大小，分别插入PAD培养基中；叶中内生菌的获取是将叶切成0.5cm×0.5cm大小接入PAD培养基中，28℃培养；

(4)待植物组织长出菌丝后，及时用接种环挑取外观不同的菌落转移至新鲜的PDA平板培养基上，编号记录，直至纯化，于斜面培养基上在4℃冰箱保存；

(5)将斜面试管内分离纯化得到的内生菌接种至果胶酶筛选培养基上，28℃，培养3d。注入8～10mL(已灭菌)的1％十六烷基三甲基溴化铵溶液，静置5～8min，倾去十六烷基三甲基溴化铵溶液，再加入1％NaCl溶液，静置5min，以达到固色的作用；

(6)挑选透明圈明显的菌落用游标卡尺测量各菌落直径Dc(cm)和变色圈的直径Dp(cm)，计算变色圈的直径与菌落生长直径的比值(Dp/Dc)，选择Dp/Dc值较大的菌株为初筛菌株；将所得所有初选菌株保存于甘油冻存管中(装有浓度为20％的无菌甘油)，置于-20℃冰箱中保存。

2、菌株的复筛：选择果胶酶酶活力较大的菌株：

采用分光光度法测定果胶酶酶活力，果胶酶酶活定义：在50℃、pH 5.0条件下，1mL酶液1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为1个酶活单位，以(U/mL)表示。果胶酶检测反应体系：含1％果胶(底物)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)1mL。

将菌株初筛得到的Dp/Dc比值较大的菌株活化后接入发酵培养基中，28℃，180r·min^-1培养72h，发酵液于8000rpm，4℃，离心15min，吸取上清液作为粗酶液。

果胶酶检测的反应条件为：将果胶酶检测反应体系置于50℃水浴锅中水浴5min，然后分别加入1mL稀释的粗酶液(灭活的粗酶液为对照)，摇匀，于50℃水浴锅中反应30min，立刻放入沸水浴锅中煮沸5min，反应终止，在冷水流中冷却；分别取2mL反应液于25mL的比色管中，再加入2mL蒸馏水，2.5mL DNS试剂，混匀，于沸水浴锅中煮沸5min，取出，立即流水中冷却，然后加蒸馏水定容到25mL，于540nm处测定吸光度。

通过检测各个菌株的果胶酶活力，最终获得活力较高的菌株。筛选得到的活力较高的菌株在PDA培养基上培养7天后，菌落直径达到6cm左右，菌落正面颜色也随其生长由白色变为黄色再变为绿色，呈半绒毛状，菌落表面有同心圆轮状带和放射状沟纹，反面无色。

菌株的ITS鉴定结果如SEQ ID NO.1所示，测得的ITS序列通过MEGA5.0软件进行系统进化树的构建，进化树显示菌株属于红绶曲霉。结合形态学鉴定和ITS分子鉴定结果，该菌株被鉴定为红绶曲霉(Aspergillus nomius)，命名为红绶曲霉z4。红绶曲霉z4已于2019年11月18日保存于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心，430072)，其保藏号为：CCTCC NO:M 2019946。

为研究菌株产生果胶酶的最适温度和pH值，做了如下检测试验。在pH值为5.0时，检测30～70℃温度范围内的菌株产果胶酶的酶活性，结果如图1所示。由图1可知，酶活性随着温度的升高，先升高后降低，在40-55℃时酶活性较好，在温度为45℃时，酶活性达到最大值，说明菌株产果胶酶的最适温度为45℃。在温度为45℃时，检测pH值为3～7范围内的果胶酶酶活性，结果如图2所示。由图2可知，酶活性随着pH值的升高，也是呈现先升高后降低的变化趋势，在pH范围值为5.5-6.0时酶活性较好，在pH值为6时，菌株产果胶酶活性达到最大值。在最适温度和pH值条件下菌株产果胶酶的酶活性达到120.39U/mL。

果胶酶在不同温度和pH值下稳定性的实验方案如下：

酶的热稳定性试验：将稀释100倍的粗酶液，分别在20℃、30℃，40℃，50℃，60℃、70℃的水浴下保温2h，然后取出来在最适温度和pH(45℃，pH6.0)下测定酶活力，考察果胶酶的温度稳定性，结果如图3所示。由图3可知，酶活力随着温度的升高，先升高后降低，酶活性在30-40℃温度范围内较高，说明果胶酶在该温度范围内较稳定。

酶的pH稳定性试验：将粗酶液分别用不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)的缓冲液稀释100倍，在常温下放置24h，然后在最适的温度和pH(45℃，pH6.0)下测酶活，考察果胶酶的pH稳定性。由图4可知，酶活力随着pH值的升高，也是呈现先升高后降低的变化趋势，在pH范围值为5-6时酶活力较好，说明果胶酶在该pH范围内较稳定。

实施例2

红绶曲霉z4在竹粉降解中的应用

将红绶曲霉z4活化后接种至马铃薯培养基中，30℃，150rpm振荡培养48h获得种子液。将种子液按照10％的接种量接种至竹粉降解培养基中，30℃，150r/min振荡培养4d。测定发酵前后竹粉成分的降解情况，测定结果见表1。

竹粉降解培养基(g/L)：竹粉20.0，酵母膏10.0，NaCl 2，KH₂PO₄ 1，MgSO₄ 0.3，发酵初始pH自然。

表1竹粉不同成分的降解率

	脂蜡	果胶	半纤维素	木质素	纤维素
						降解率(％)	1.41	68.45	33.57	9.33	2.28

由表1可以看出，经过红绶曲霉z4发酵处理后，竹粉中的果胶降解率达到68.45％，而半纤维素、木质素纤维素和蜡质等也有不同程度的降解。由此可见，本发明红绶曲霉z4能够有效降解竹粉中的果胶成分。

序列表

<110> 武夷学院

<120> 一种内生真菌红绶曲霉及其应用

<130> 100

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 602

<212> DNA

<213> Aspergillus nomius

<400> 1

gtgtgtatac gtagagactg aggaggacat taccgagtgt agggttccta gcgagcccaa 60

cctcccaccc gtgtttactg taccttagtt gcttcggcgg gcccgccgca aggccgccgg 120

ggggcatccg cccccgggcc cgcgcccgcc ggagacacca cgaactctga acgatctagt 180

gaagtctgag ttgattgtat cgcaatcagt taaaactttc aacaatggat ctcttggttc 240

cggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataactagtg tgaattgcag aattccgtga 300

atcatcgagt ctttgaacgc acattgcgcc ccctggtatt ccggggggca tgcctgtccg 360

agcgtcattg ctgcccatca agcacggctt gtgtgttggg tcgtcgtccc cccctccggg 420

gggggacggg ccctaaaggc agcggcggca ccgcgtccga tcctcgagcg tatggggctt 480

tgtcacccgc tctgtaggcc cggccggcgc ttgccgaacg caaaacaacc attctttcca 540

ggttgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa gcatatcata gggcggaagg 600

aa 602

Claims (3)

1.一种内生真菌红绶曲霉，其分类命名为红绶曲霉(Aspergillus nomius)z4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 2019946，保藏日期：2019年11月18日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

2.权利要求1所述的内生真菌红绶曲霉z4在制备果胶酶制剂中的应用。

3.权利要求1所述的内生真菌红绶曲霉z4在降解竹粉中的应用。

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