CN111995679B - 特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试剂盒 - Google Patents

特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试剂盒。本发明应用P.gingivalis和rHA2免疫小鼠制备了识别P.gingivalis不同位点的单克隆抗体，并从中筛选了配对抗体构建了特异性识别牙龈卟啉单胞菌的双抗夹心ELISA体系。将筛选得到的配对抗体用于制备简易的胶体金试纸条，简易的胶体金试纸条可以快速识别109CFU/mL的P.gingivalis。本发明的优点是简单、快速，可以在2min内出结果，而且结果的判读不需要借助任何仪器设备，肉眼即可观测。

Description

特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试剂盒。
背景技术
牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要致病菌之一，还与心血管、糖尿病和阿尔兹海默症等系统性疾病相关，所以对于牙龈卟啉单胞菌的检测有重要的意义。
当前牙龈卟啉单胞菌的检测主要依靠实时定量PCR，实时定量PCR敏感性和特异性均较好，但是实时定量PCR成本高，检测所需要的时间长，而且需要大型的实验设备以及熟练的技术人员进行操作，不能满足椅旁检测的需求，亟需能够快速、椅旁检测牙龈卟啉单胞菌的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了简单、快速、低成本、肉眼即可判读结果的牙龈卟啉单胞菌检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNo.19951或保藏编号为CGMCCNo.19952的杂交瘤细胞株产生。
本发明还提供了杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.19951或CGMCCNo.19952。
在上述研究的基础上，本发明提供了特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体组合，包括保藏编号为CGMCC No.19951的杂交瘤细胞株的单克隆抗体和保藏编号为CGMCCNo.19952的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
本发明还提供了所述的单克隆抗体或如权利要求3所述的单克隆抗体组合在制备检测牙龈卟啉单胞菌的检测工具中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测工具包括试剂盒、试纸条或芯片。
更重要的是，本发明还提供了所述的单克隆抗体或所述的单克隆抗体组合在制备检测牙龈卟啉单胞菌相关疾病的检测工具中的应用；所述牙龈卟啉单胞菌相关疾病包括但不限于牙周炎、心血管疾病、糖尿病、阿尔兹海默症。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测工具包括试剂盒、试纸条或芯片。
本发明还提供了试剂盒，包括所述的单克隆抗体或所述的单克隆抗体组合。
本发明还提供了试纸条，包括所述的单克隆抗体或所述的单克隆抗体组合。
上述试纸条应用胶体金免疫层析技术，基于抗原抗体反应的检测，胶体金免疫层析基于双抗体夹心ELISA原理，需要两种识别同一抗原不同结合位点的单克隆抗体。首先，杂交瘤技术制备了识别牙龈卟啉单胞菌不同结合位点(单抗E10、E10-2识别P.gingivalis不识别rHA2；单抗C10、F3、F3-2、G3和G3-2既识别P.gingivalis又识别rHA2)的单克隆抗体，双抗体夹心ELISA的方法从制备的单克隆抗体中筛选出了最佳配对抗体，利用配对抗体制备了简易胶体金试纸条，制备的简易胶体金试纸条可以2min内检测109CFU/mL的牙龈卟啉单胞菌。
本发明的关键点在于应用P.gingivalis和rHA2免疫小鼠制备了识别P.gingivalis不同位点的单克隆抗体，并从中筛选了配对抗体构建了特异性识别牙龈卟啉单胞菌的双抗夹心ELISA体系。现有应用的双抗体夹心ELISA原理检测P.gingivalis的试剂盒应用的间接双抗体夹心ELISA的方法，需要包被抗体和检测抗体来自不同物种，由单克隆抗体、多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的抗检测抗体IgG组合；多克隆抗体识别多个抗原表位可能存在交叉反应，而且多克隆抗体数据有限，一旦耗尽，即使用相同的免疫原制备的抗血清也会与之前的抗血清存在差异。本发明中构建的直接双抗体夹ELISA应用的是结合P.gingivalis不同位点的单克隆抗体，其中一种作为包被抗体，检测抗体辣根过氧化物酶标记。单克隆抗体均一性和特异性均较好，而且可以持续再生，随着时间的推移，单克隆抗体的特性不会发生明显的改变。将筛选得到的配对抗体用于制备简易的胶体金试纸条，简易的胶体金试纸条可以快速识别109CFU/mL的P.gingivalis。本发明的优点是简单、快速，可以在2min内出结果，而且结果的判读不需要借助任何仪器设备，肉眼即可观测。
生物保藏说明
杂交瘤细胞株，E10，于2020年06月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19951；
杂交瘤细胞株，G3，于2020年06月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19952。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示血清识别rHA2的效价；
图2示血清识别P.gingivalis的效价；
图3示单克隆抗体识别P.gingivalis的特异性；
图4示单克隆抗体识别P.gingivalis的敏感性；
图5示辣根过氧化物酶标记后单克隆抗体识别P.gingivalis的效价；
图6示双抗体夹心ELISA中HRPG3的最佳工作浓度；
图7示双抗体夹心ELISA包被抗体E10的最佳工作浓度；
图8示双抗体夹心ELISA识别P.gingivalis的特异性；
图9示双抗体夹心ELISA识别P.gingivalis的敏感性；
图10示胶体金试纸条识别P.gingivalis的敏感性；
图11示胶体金试纸条识别P.gingivalis的特异性；
图12示单克隆抗体识别P.gingivalis的效价；
图13示单克隆抗体识别rHA2的效价。
具体实施方式
本发明公开了一种特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
Figure BDA0002555017060000031
ELISA相关溶液配制：
PBS：1袋PBS磷酸盐干粉加蒸馏水定容至2L。
PBST(含0.05％Tween-20的PBS)：量取2.5mLTween-20加入到500mLPBS中。
封闭液(5％脱脂奶粉)：称取10g奶粉加入到200mLPBS中。
样品稀释液：5％脱脂奶粉：PBST＝1：15。
细胞培养用液配制：
不完全培养基配制
三蒸水溶解培养基干粉，在超净台中用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，pH调至7.2，4℃备用。
完全培养基
不完全培养基160mL，胎牛血清40mL。
HAT培养基
完全培养基98mL，HAT 2mL。
HT培养基
完全培养基99mL，HT 1mL。
细胞冻存液
胎牛血清90mL，二甲基亚砜(DMSO)10mL。
抗生素添加液
青霉素(2000X)：将100万单位青霉素溶于5mL PBS中；链霉素(2000X)：将1g链霉素溶于4mL PBS中。
50％PEG：
称取2g PEG加入青霉素小瓶中，盖紧橡胶塞后将一个注射器针头置于瓶塞上用来排气，高温高压灭菌(121℃，15min)，不完全培养基在37℃中预热。待PEG温度降至50～60℃时，取2mL不完全培养基加入到PEG中混匀，用封口膜密封瓶口，4℃保存。
单克隆抗体纯化相关试剂配制
萘氏试剂配制：称取8.658g碘化汞钾，加入15mL 20％的NaOH，加蒸馏水定容至50mL。
饱和硫酸铵溶液：用500mL 80℃蒸馏水溶解400～425g硫酸铵，搅拌20min，趁热过滤，冷却后调pH至7.4。
4mg/mL NaOH溶液：称取4g NaOH加蒸馏水定容至100mL。
细菌培养基配制
CDC固体培养基配制：
大豆蛋白胨(北京索莱宝科技有限公司)5g、胰蛋白胨(OXOI公司)15g、酵母提取物(OXOID公司)5g、氯化钠5g、L-半胱氨酸(北京鼎国生物技术有限公司)400mg，加蒸馏水定容至1000mL，混匀，pH调至7.5，加入17g琼脂(OXOID公司)，混匀后封口膜封口，高温高压(121℃，20min)，冷却至50℃加入无菌脱纤维羊血(北京索莱宝科技有限公司)50mL，氯化血红素5mg，维生素K1(国药集团容生制药有限公司)10mg，混匀后倒平板，凝固后4℃保存。
氯化血红素溶液(1mg/mL)：量取NaOH(4mg/mL)2mL，加入称取的100mg氯化血红素，加蒸馏水定容至100mL，摇匀后封口膜封口，高温高压灭菌(121℃,20min)，冷却后4℃保存备用。
BHI液体培养基配制：
脑心浸液(Brain Heart Infusion,BHI)(OXOID公司)37g加蒸馏水定容至1000mL，混匀后封口膜封口，高温高压灭菌(121℃，15min)，冷却至50℃左右，加入氯化血红素5mg，维生素K110mg，混匀，冷却后4℃保存备用。
MSA固体培养基配制：
大豆蛋白胨5g、胰蛋白胨10g、蔗糖(国药集团化学试剂有限公司)50g，葡糖糖(国药集团化学试剂有限公司)1g，磷酸氢二钾4g，琼脂16g，加蒸馏水定容至1000mL，混匀，pH调至7.6，加入1％曲利本兰7.5mL，0.1％结晶紫0.8mL，混匀后封口膜封口，高温高压灭菌(121℃，20min)，冷却至50℃左右，混匀后倒平板，凝固后4℃保存备用。
MSA液体培养基配制：
大豆蛋白胨5g、胰蛋白胨10g、蔗糖50g、葡糖糖1g、三水磷酸氢二钾4g，加蒸馏水定容至1000mL，混匀后封口膜封口，高温高压灭菌(121℃，20min)，冷却后4℃保存备用。
TSBV固体培养基配制：
大豆蛋白胨3g、胰蛋白胨17g、氯化钠5g、葡糖糖2.5g、磷酸氢二钾4g，加蒸馏水水定容至1000mL，混匀，调pH至7.3，加琼脂16g，高温高压灭菌(121℃，20min)，冷却至50℃左右，加入10％细菌培养专用标准马血清(购自平睿生物科技有限公司)100mL，混匀后倒平板，冷却后4℃保存备用。
胶体金制备相关溶液配制
封闭液：5％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)：称取0.5g BSA加入到10mL蒸馏水中。
10％NaCl：称取10gNaCl加蒸馏水定容至100mL。
PB：称取KH2P040.2g和Na2HPO4·12H2O 2.96g加蒸馏水定容至1000mL。
洗涤液：40mL蒸馏水，4mL PB，40μL封闭液。
1％柠檬酸钠：称取1g柠檬酸钠加蒸馏水定容至100mL。
1％氯金酸：称取1g氯金酸加蒸馏水定容至100mL。
1M K2CO3：称取13.8g K2CO3加蒸馏水定容至100mL。
1M HCl：1mL 37％浓盐酸缓慢加入到11mL蒸馏水中，边加边搅拌。
金悬浮液：TRIS-HCL pH(8.0)含1％BSA。
本发明提供的特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
相关材料：
小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14，购于中国协和医科大学细胞中心；BALB/c小鼠(体重18～22g、雌性、6周龄，用于免疫；体重>20g、雌性、>10周龄，用于腹水制备)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
重组牙龈卟啉单胞菌血凝素2(Recombinant Hemagglutinin 2，rHA2)，北京口腔医院研究所制备保存。
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)ATCC33277、381、临床分离菌株，中间普氏菌(Prevotella intermedia，P.intermedia)ATCC25611，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，F.nucleatum)ATCC10953，黏性放线菌(Aggregatibacterviscosus，A.viscosus)ATCC19246，伴放线放线杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans，A.actinomycetemcomitans)ATCC24523，变形链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)血清c型，北京口腔医学研究所保存。
氟氏完全佐剂、氟氏不完全佐剂、HAT、HT、8-氮鸟嘌呤和牛血清白蛋白购自Sigma公司；包被液、终止液、TMB显色液、Tween-20、PBS磷酸盐干粉、氯化血红素和革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；聚乙二醇1500购自北京市旭东化工厂；培养基购自GIBCO；青霉素购自石药集团；链霉素购自华药集团；二甲基亚砜购自北京赛尔曼生物技术公司；胎牛血清购自Biochrom公司，透析袋购自北京拜尔迪有限公司；PBS、DMEM购自Hyclone；甘油购自Amresco公司；硫酸铵、氯化钠、氯金酸、柠檬酸钠、K2CO3、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾购自国药集团化学试剂有限公司；辛酸购自北京化工厂；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；脱脂奶粉购自北京普利莱基因技术有限公司；Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自Proteintech Group；BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记试剂盒购自ProteintechGroup公司；96孔聚苯乙烯酶标板、细胞培养板(96孔、24孔、6孔)、细胞培养瓶(25m2、75m2)、离心管(15mL、50mL)、冻存管购自Corning Costar公司；不相关单克隆抗体D1购自北京点石科创生物技术有限公司；锥形瓶、细胞培养皿、烧杯、眼科剪、止血夹、镊子，细胞筛(200目)、pH试纸、0.22μm微孔膜过滤器等。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1细菌培养
P.gingivalis、P.intermedia、F.nucleatum和A.viscosus在CDC固体培养基上37℃厌氧培养(80％N2，10％H2，10％CO2)5～7d，A.actinomycetemcomitans在TSBV固体培养基上37℃厌氧培养5d，S.mutans在MSA固体培养基上37℃培养2d后，格兰染色镜检证实为纯培养物后，挑取P.gingivalis、P.intermedia、F.nucleatum、A.viscosus和A.actinomycetemcomitans菌落接种BHI液体培养基37℃厌氧条件下培养，S.mutans菌落接种于MSA液体培养基中培养。
实施例2细菌处理
将培养24h的P.gingivalis、P.intermedia、F.nucleatum、A.viscosus、A.actinomycetemcomitans和S.mutans菌液6500g，4℃，离心10min，弃上清，PBS洗两次(7000g，4℃，离心20min)，包被液重悬，测定OD600nm，按照标准曲线计数后稀释。
实施例3杂交瘤技术
免疫
14只六周龄的雌性BALB/c小鼠，免疫前先适应环境3d。用P.gingivalis菌液和rHA2分别免疫小鼠，每种抗原免疫6只小鼠。给小鼠编号，P.gingivalis免疫小鼠编号为1-1到1-6；rHA2免疫小鼠编号为2-1到2-6。2只小鼠用于制备阴性血清。
P.gingivalis处理后测定OD600nm，根据P.gingivalis标准曲线计数结果稀释成1010CFU/mL，腹腔注射200μL/只，每2周免疫一次，第三次免疫后7d取血测定血清效价。
称取2.0mg rHA2抗原，用适量PBS稀释到2mL，加等量弗氏完全佐剂(初次免疫)或弗氏不完全佐剂(第二次免疫、第三次免疫及加强免疫)，吸入注射器中混合，推拉注射器直到抗原充分乳化，充分乳化的抗原成油包水状，滴到水中3min内不分散。颈背部皮下多点注射200μg免疫小鼠。第三次免疫7d后取血测定血清效价。若效价未达到要求(一般为1：104以上)，间隔两周后再进行一次加强免疫。
间接ELISA方法的建立
(1)包被：用包被缓冲液稀释抗原至适当浓度，每孔100μL加入酶标板中，4℃包被过夜。
(2)洗板：弃去板内液体，每孔加入300μL PBST洗涤液，放置1～2min，再甩掉洗涤液，重复3次，将板内残留洗涤液在不脱纤维的吸水纸上拍干。
(3)封闭：每孔加入300μL封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，洗板3次。
(4)加样品：将样品稀释成不同的浓度，按浓度顺序每孔100μL加入酶标板，同时以阴性血清作对照组，37℃温育30min，洗板3次。
(5)加酶标二抗：将辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠IgG用样品稀释液稀释成1：5000，每孔100μL加入酶标板中，37℃温育30min，洗板4次。
(6)显色：每孔100μL TMB显色液加入酶标板，37℃避光显色30min。
(7)终止及测定：每孔加入50μL终止液，测定450nm波长处各孔的OD值。
(8)结果判定：血清OD值(P)，阴性血清组OD值(N)，P/N>2为阳性，即血清OD值大于对照组OD值2倍时的稀释倍数，判定为效价临界值。
血清效价测定
第三次免疫后7d，分别对阴性小鼠和免疫组小鼠行眼眶取血，室温静置1h，冰箱4℃过夜，3000rpm/min离心15min，收集血清，4℃保存。
将P.gingivalis菌液用包被液稀释至5×108CFU/mL，rHA2用包被液稀释至1μg/mL，将稀释好的P.gingivalis菌液或rHA2每孔100μL加入酶标板，4℃包被过夜，洗板3次，封闭后，加1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1：12800，1：25600稀释的血清，阴性血清作对照组。孵育洗板后，加入1：5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，孵育后显色、终止、测定OD450，P/N>2者为阳性，为阳性的最小稀释比例即为血清的效价。
筛选出血清效价高的小鼠进行血清特异性测定。
血清特异性测定
将用包被液稀释至5×108CFU/mL的P.gingivalis、P.intermedia、F.nucleatum、A.viscosus、A.actinomycetemcomitans和S.mutans菌液每孔100μL加入酶标板中，4℃包被过夜，按筛选的效价稀释血清，以阴性血清为对照组，用间接ELISA法测定血清识别P.gingivalis的特异性。
筛选出特异性好的小鼠作为单克隆抗体制备小鼠。
骨髓细胞复苏与培养
使用Sp2/0鼠骨髓瘤细胞系进行融合，为防止培养过程中发生回复突变，融合前一个月将细胞培养在含有8-氮杂鸟嘌呤的培养液中，以清除返祖现象。
融合前10d复苏骨髓瘤细胞。将装有骨髓瘤的冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴锅中迅速融化，然后在超净台中将细胞悬液转移到15mL离心管中，加入8mL不完全培养液，混匀，1000rpm/min离心5min，弃上清，3mL完全培养液将细胞沉淀悬浮，转入培养瓶于CO2培养箱中培养。
当细胞恢复活力后，改用含8-氮鸟嘌呤的培养液培养一周后再换成完全培养液，为使融合时的细胞处于对数生长期，融合前24h，将细胞扩大培养。对数生长期的细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈半致密分布。
融合前用弯头巴氏吸管将细胞轻轻吹下，收集到离心管中，用不完全培养基洗两遍，计数，细胞成活率大于90％者可用于细胞融合。
饲养细胞的制备
融合前一天制备，制备方法如下：
(1)过量麻醉处死小鼠，将小鼠在75％酒精中浸泡5min后移入超净工作台。
(2)将小鼠腹部朝上固定于解剖板上，用镊子夹起小鼠腹部皮肤，剪开一个小口，将皮肤剥开，充分暴露腹膜。
(3)注射器吸取5～8mL不完全培养液注入腹腔，不要刺破腹腔器官，以免发生污染。
(4)轻揉小鼠腹部3min，用注射器将培养液吸出，加到离心管中。重复此步骤，以获取更多腹腔细胞。
(5)1000rpm/min离心5min，弃上清。
(6)用少量培养液将细胞重悬，进行细胞计数。根据计数结果，加适量培养液将细胞浓度调为2×105个/mL，每孔100μL加到96孔细胞培养板中。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
脾细胞悬液制备
(1)过量麻醉处死选中的BALB/c小鼠，75％酒精中浸泡5min。
(2)于解剖台板上固定小鼠，掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏。在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于10mL不完全培养基中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。
(3)将脾脏移入另一个盛有10mL不完全培养基的平皿中，用1mL注射器在脾脏上刺几个孔，用吸满不完全培养液的注射器将脾细胞吸出，然后将脾剪碎，取灭菌200目铜网，罩在100mL烧杯上，固定，使脾细胞全部通过网孔进入烧杯中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。
(4)收获的脾细胞悬液，1000rpm/min，离心5～10min，用不完全培养基离心洗涤1～2次，然后在10mL不完全培养基悬液，细胞计数后备用。每只小鼠可获得1×108～2.5×108个脾细胞。
细胞融合
取50mL HAT培养液，15mL不完全培养液和1mL 50％PEG于37℃水中预热，另备一个盛有37℃水的500mL烧杯。
(1)将1×108脾细胞与2×107～5×107的骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14混合于一支50mL离心管中，补加不完全培养基至30mL，充分混匀。
(2)1000rpm/min离心7min，弃上清。
(3)手掌轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状，37℃水浴中预热。
(4)用1mL吸管沿管壁在1min左右内加0.7mL至预热37℃的50％PEG中(pH7.2)，轻轻转动离心管1min。
(5)用吸管在2min内加20mL至预热37℃的不完全培养基；在第一个30s内加1mL，第二个30s内加2mL，剩余17mL在60s内加完。
(6)立即离心(800rpm/min，7min)，弃上清。
(7)加入10mL HAT培养基，轻轻吹吸使细胞悬浮，静置10min，补HAT培养基至50mL。
(8)分装至96孔细胞培养板，每孔100μL；然后将培养板置于37℃，5％CO2培养箱内培养。
(9)5d后用HAT培养基换出1/2培养基。
(10)7～10d后用HT培养基换出HAT培养基。
(11)观察杂交瘤细胞的生长情况，待细胞生长至细胞培养孔孔底面积的1/5以上时，吸取上清进行检测。
杂交瘤细胞筛选
采用间接ELISA，将细胞上清液作为样品，按照“间接ELISA方法”进行操作，筛选效价高、特异性好的杂交瘤细胞进行克隆。
杂交瘤细胞的克隆
本实验采用有限稀释法将杂交瘤细胞克隆化。具体步骤如下：
克隆化前一天或者当天制备饲养细胞。
将待克隆化的杂交瘤细胞反复吹打混匀后，进行细胞计数。根据细胞计数的结果做适当稀释。
取250个活细胞悬浮于4.6mL(终体积)培养液中(平均每0.1mL溶液中包含5个细胞)，接种于96孔培养板中，每孔0.1mL，共36孔。在剩余的1.0mL溶液中加入4mL培养液(平均每0.1mL溶液中包含1个细胞)，接种细胞液至其次的36孔，每孔0.1mL。最后剩余细胞悬液1.4mL，再补加培养液1.4mL(平均每0.1mL溶液中包含0.5个细胞)，接种至最后的24孔，每孔0.1mL。将培养板置于5％CO2，37℃培养箱中培养。
适时地换液、检测。有多孔阳性时，应尽可能地取单克隆孔的细胞再次克隆化，直至所有细胞孔的培养液均为阳性。
杂交瘤细胞的大规模培养与保存
将最后克隆阳性率为100％的细胞进行扩大培养，及时冻存，剩余杂交瘤细胞用于抗体制备。细胞冻存法如下：
杂交瘤细胞扩大培养后，选择形态良好的细胞从培养瓶上吹下来，转入15mL离心管1000rpm/min离心5min，弃上清，加入冻存液，混匀后移入冻存管，分别于4℃放置1h，-20℃放置3h，-80℃过夜后移入液氮中保存。
单克隆抗体腹水的制备：
本实验采用体内诱生腹水的方法制备mAb。
每只BALB/c小鼠腹腔注入石蜡油0.5mL，7～10d后使用。将细胞瓶中培养的阳性杂交瘤细胞吹下来，1000rpm/min离心l0min后弃上清液，收集细胞沉淀。用培养液将细胞沉淀重新悬浮，混匀后将细胞数量调整至106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。从植入细胞后第7d起，每天观察小鼠。待小鼠腹部明显涨大时，用9#针头穿刺腹腔，收集腹水，3000rpm/min离心15min，弃去上层脂肪、石蜡油和下层的沉淀，收集中层的淡黄色清亮液体，分装，-20℃保存备用。
单克隆抗体的纯化：
采用辛酸－饱和硫酸铵法对腹水中的抗体进行纯化。
(1)取5mL腹水加入醋酸－醋酸钠缓冲液(pH4.5)加至18mL，搅拌均匀。
(2)用1mol/LNaOH溶液将上述溶液的pH值调到4.8。
(3)加入165μL正辛酸，边加边搅拌30min。
(4)4℃离心20min，取上清液用1mol/L NaOH溶液调整pH为7.5。
(5)向上清中缓慢地加入等量的饱和硫酸铵溶液(pH7.3)，边加边搅拌，此时硫酸铵的终浓度为50％，搅拌20min后，10000rpm/min，4℃离心30min，将沉淀溶于5.5mL0.02M(pH7.4)的PBS中。
(6)向沉淀悬浮液中缓慢加入4.5mL饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，此时硫酸铵的浓度为45％，搅拌20min后，10000rpm/min，4℃离心30min，将沉淀溶于5mL PBS中。
(7)将沉淀悬浮液移入透析袋，对PBS(pH7.4)透析24h以上，其间更换2～3次透析液。透析以去除铵根离子和硫酸根离子。用萘氏试剂检测透析液无黄色即达到透析终点。
(8)分装，-20℃保存备用或者加入50％甘油保护剂长期保存。
单克隆抗体效价的测定：
(1)包被：P.gingivalis菌液处理后测定OD600nm，根据标准曲线计数后用包被液稀释成5×108CFU/mL，用包被液将rHA2稀释成4μg/mL。酶标板上每孔加入100uL浓度为5×108CFU/mL的P.gingivalis或者4μg/mL的rHA2，贴上封板膜，4℃包被过夜。
(2)洗涤：倒掉孔内液体，每孔300μL PBST洗涤液洗涤，放置1～2min后倒掉洗涤液，在不脱纤维的吸水纸上扣干，重复3次。
(3)封闭：每孔加入300μL 5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h，弃封闭液，洗板3次。
(4)加样：PBST洗涤3次，每孔分别加入100μL用样品稀释液2倍比从1∶1000到1∶128000稀释(mAb起始稀释浓度为0.5mg/mL)的mAb，以不相关mAb D1为阴性对照，每个浓度设置3个复孔，37℃孵育30min。
(5)加酶标二抗：PBST洗涤3次，加入1：5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG100μL/孔，37℃孵育30min。
(6)显色：PBST洗涤4次，每孔加入TMB显色液100μL，室温避光30min。
(7)终止及读数：每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪读取OD450nm结果。
(8)结果判定：计算3个复孔的平均值，实验组(P)/阴性对照(N)>2为阳性。
单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定：
(1)从4℃取出试剂盒，室温平衡30min，用PBST将mAb 1∶2000稀释，每孔50μL加入酶标板中。
(2)无需孵育，每孔加入50μL山羊抗小鼠IgG+IgM-HRP，混匀后盖上封板膜，室温孵育1h。
(3)倒掉板内液体，PBST洗板3次，吸水纸拍干。
(4)加入现配的显色液(A：B＝1：100)100μL/孔，室温避光显色15min。
(5)加入终止液100μL/孔。
(6)酶标仪读取OD450结果，OD值最高的孔所对应的HRP标记山羊抗小鼠IgG的类型即此mAb的亚型。
单克隆抗体识别P.gingivalis特异性检测：
(1)包被：测定OD600nm计数后用包被液将稀释至5×107CFU/mL的P.gingivalis、P.intermedia、F.nucleatum、A.actinomycetemcomitans、A.viscosus和S.mutans菌液4℃包被过夜；
(2)封闭。
(3)加样：本发明制得的mAb稀释成适当浓度。
(4)其余操作步骤同上。
(5)结果判定：计算3个复孔的平均值，mAb的OD450nm值为(P)，D1的OD450nm为阴性对照(N)，P/N>2为阳性，表明mAb识别该细菌。
单克隆抗体识别P.gingivalis的敏感性检测：
(1)包被：测定OD600nm计数后，将用包被液十倍比稀释至5×108到50CFU/mL的P.gingivalis ATCC33277、381和P.gingivalis临床菌株的菌液4℃包被过夜。
(2)其余操作步骤同上。
(3)结果判定：实验以3个复孔的平均值计算，mAb的OD450nm值为(P)，D1的OD450nm为阴性对照(N)，P/N>2为阳性，表明mAb识别该浓度的P.gingivalis。
实施例4配对抗体的筛选及双抗体夹心ELISA的建立
辣根过氧化物酶标记单克隆抗体
(1)从-20℃中取出HRP标记试剂盒，室温条件下平衡30min。
(2)稀释本发明制得的mAb，使mAb的浓度在0.5～5mg/mL之间，mAb的浓度越低HRP标记就越充分。
(3)打开辣根过氧化酶瓶盖，加入PBS将其溶解，混匀后等体积分装于EP管内，加入待标记的mAb，向每10μL待标记的抗体中加入1μL反应启动液，使用移液枪反复吹打几次以充分混匀，避免产生气泡，室温放置3h。
(4)向反应的EP管中加入反应终止液，比例为每10μL抗体加入1μL反应终止液，充分混匀，室温放置1h。
(5)终止完成后，加入等体积的产物保护液，充分混匀，置于-20℃保存。
直接ELISA测定辣根过氧化物酶标记后抗体效价
(1)包被：P.gingivalis的培养处理后，测定OD600nm，根据标准曲线计数后用包被液将P.gingivalis菌液稀释至5×108CFU/mL，酶标板中每孔加入100μL，4℃包被过夜。
(2)洗板：弃去板内液体，每孔加入300μL PBST洗涤液，放置1～2min，再甩掉洗涤液，将板内残留洗涤液在不脱纤维的吸水纸上拍干，重复3次。
(3)封闭：每孔加入300μL封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，洗板3次。
(4)加HRP标记mAb：将HRP标记mAb 1：200、1：400、1：800、1：1600稀释，按浓度顺序每孔100μL加入酶标板，以不包被抗原但加入HRP标记mAb作为阴性对照组，每个浓度设置3个复孔，37℃孵育30min，洗板3次。
(5)显色：每孔100μL TMB显色液加入酶标板中，室温避光显色30min。
(6)终止及测定：每孔加入50μL终止液，测定450nm波长处各孔的OD值。
(7)结果判定：计算3个复孔的平均值，加入HRP标记mAb为实验组(P)，以不包被P.gingivalis但加入HRP标记mAb作为阴性对照组(N)，P/N>2为阳性，表明在该稀释倍数时HRP标记mAb可识别P.gingivalis，保持阳性的最大稀释倍数即为HRP标记mAb的效价。
双抗体夹心ELISA筛选配对抗体
(1)包被：用包被缓冲液稀释包被mAb至5μg/mL，酶标板中每孔加入100μL，4℃包被过夜。
(2)洗板：弃去板内液体，每孔加入300μL PBST洗涤液，放置1～2min，再甩掉洗涤液，重复3次，将板内残留洗涤液在不脱纤维的吸水纸上拍干。
(3)封闭：加入300μL/孔封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，洗板3次。
(4)加抗原：加入用样品稀释液稀释到5×108CFU/mL的P.gingivalis菌液，以不加P.gingivalis菌液为阴性对照组，100μL/孔，设置3个复孔，37℃温育30min，洗板3次。
(5)加HRP标记mAb：将HRP标记mAb稀释成1：800，每孔100μL加入酶标板，37℃温育30min，洗板4次。
(6)显色：每孔加入100μL TMB显色液，室温避光显色30min。
(7)终止及测定：每孔加入50μL终止液，测定450nm波长处各孔的OD值。
(8)结果判定：计算3个复孔的平均值，加P.gingivalis菌液为实验组(P)，不加P.gingivalis菌液为对照组(N)，P/N>2为阳性，表明包被的mAb和检测的HRP标记的mAb可以配对，配对抗体可以识别P.gingivalis。
确定辣根过氧化物酶标记单克隆抗体的最佳工作浓度
(1)包被：用包被缓冲液稀释包被mAb至5μg/mL，每孔100μL加入酶标板中，4℃包被过夜。
(2)洗板
(3)封闭
(4)加样
(5)加HRP标记mAb：将HRP标记mAb稀释成1：200、1：400、1：800、1：1600，按浓度顺序以每孔100μL加入酶标板，每个浓度设置3个复孔，37℃温育30min，洗板4次。
(6)其余操作步骤同上。
(7)结果判定：计算3个复孔的平均值，以OD450nm值在1左右为HRP标记mAb的最佳工作浓度。
确定包被抗体的最佳工作浓度
(1)包被：用包被缓冲液稀释包被mAb至5、2.5、1.25μg/mL，按浓度顺序加入酶标板(100μL/孔)，4℃包被过夜。
(2)洗板
(3)封闭
(4)加样
(5)加HRP标记mAb：将HRP标记mAb稀释成9.75μg/mL，每孔100μL加入酶标板中，每个浓度设置3个复孔，37℃孵育30min，洗板4次。
(6)其余操作步骤同上。
(7)结果判定：计算3个复孔的平均值，以OD450nm值在1左右为mAb的最佳工作浓度。
双抗体夹心ELISA识别牙龈卟啉单胞菌的特异性
(1)包被：用包被缓冲液稀释包被mAb至5μg/mL，每孔100μL加入酶标板中，4℃包被过夜。
(2)洗板
(3)封闭
(4)加样：将P.gingivalis、P.intermedia、F.nucleatum、A.viscosus、A.actinomycetemcomitans和S.mutans菌液用样品稀释液稀释到5×108CFU/mL，以不加菌液为阴性对照，100μL/孔，设置3个复孔37℃孵育30min，洗板3次。
(5)加HRP标记mAb：将HRP标记mAb稀释至9.75μg/mL，每孔100μL加入酶标板中，37℃孵育30min，洗板4次。
(6)其余操作步骤同上。
(7)结果判定：计算3个复孔的平均值，以加入菌液为实验组(P)，以不加菌液为对照组(N)，P/N>2为阳性，表明双抗体夹心ELISA体系可以识别该细菌。
双抗体夹心ELISA识别牙龈卟啉单胞菌的敏感性
(1)包被：用包被缓冲液稀释包被mAb至5μg/mL，酶标板中每孔加入100μL，4℃包被过夜。
(2)洗板
(3)封闭
(4)加样：将P.gingivalis菌液用样稀稀释到5×108～5×104CFU/mL，以不加菌液为阴性对照，按浓度顺序加入酶标板，100μL/孔，每个浓度设置3个复孔，37℃温育30min，洗板3次。
(5)加HRP标记mAb：将HRP标记mAb稀释至9.75μg/mL，酶标板中每孔加入100μL，37℃孵育30min，洗板4次。
(6)其余操作步骤同上。
(7)结果判定：计算3个复孔的平均值，以加入菌液为实验组(P)，以不加菌液为对照组(N)，P/N>2为阳性，表明双抗体夹心ELISA体系可以识别该浓度的P.gingivalis。
实施例5胶体金试纸条的制备及其敏感性和特异性的测定
IgG-gold的制备
(1)取1个5mL试管，加入2mL胶体金溶液；
(2)加入适量1M K2CO3把pH调整为7；
(3)加入最小蛋白浓度120％的IgG，室温混匀15min
(4)加入5％BSA 20μL，室温混匀10min；
(5)将溶液均分在两个2mL的离心管内，8000rpm离心6min，轻轻吸除上清；
(6)用含5％BSA的洗涤液重悬后，再次8000rpm离心6min，轻轻吸出上清，在200μL金悬浮液中重新悬浮松散的胶体金沉淀，并集中到新EP管中；
(7)加等量甘油，充分混匀；
(8)-20℃保存备用。
试纸条的组装
(1)NC膜：从胶体金卡式专用底板上将NC膜相应位置的纸条揭下，贴上NC膜。
(2)划线：将稀释好的mAb E10、山羊抗小鼠IgG(1mg/mL)，分别用台式划膜喷金一体机划在NC膜的T线、C线位置。
(3)烘干：划好线后在恒温恒湿的孵育箱中37℃过夜。
(4)组装样品垫和吸水垫：分别揭下样品垫和吸水垫相应位置的纸条，将样品垫和吸水垫贴在相应位置。
(5)切条：切条机上切条，常温干燥保存。
检测胶体金试纸条识别牙龈卟啉单胞菌的敏感性
(1)细菌处理：将培养24h的细菌，离心6500g，4℃，离心10min后弃上清，在细菌BHI培养液中重悬，测定OD600nm计数后，将P.gingivalis稀释成109、5×108、108、5×107、107、5×106、106、5×105CFU/mL，分别加入96孔细胞培养板中(150μL/孔)。以BHI培养液做阴性对照。
(2)加金标抗体：在胶体金试纸条上加入稀释到适当浓度的金标抗体。
(3)将试纸条置于96孔细胞培养板中，开始计时并观察结果。
(4)结果判定：2min内，细菌组T线和C线显色，对照组仅C线显色，为阳性；细菌组和对照组均C线显色，为阴性。C线不显色说明样品未正确通过试纸条。
检测胶体金试纸条识别牙龈卟啉单胞菌的特异性
(1)细菌处理：将培养24h的细菌，离心6500g，4℃，离心10min后弃上清，在细菌BHI培养液中重悬，P.gingivalis、P.intermedia、F.nucleatum、A.viscosus、A.actinomycetemcomitans和S.mutans菌液稀释至109CFU/mL分别加入96孔细胞培养板中(150μL/孔)。以培养液做阴性对照。
(2)加金标抗体：在胶体金试纸条上加入稀释到适当浓度的金标抗体。
(3)将试纸条置于96孔细胞培养板中，开始计时并观察结果。
(4)结果判定：2min内，细菌组T线和C线显色，对照组仅C线显色，为阳性；细菌组和对照组均C线显色，为阴性。C线不显色说明样品未正确通过试纸条。
效果例1特异性识别牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体的制备及其识别P.gingivalis的敏感性和特异性
以P.gingivalis和rHA2为抗原分别免疫6只小鼠，P.gingivalis免疫小鼠编号为1-1到1-6，rHA2免疫小鼠编号为2-1到2-6，每2周免疫一次，共免疫三次，选择血清效价大于1：104且仅识别P.gingivalis的小鼠作为单克隆抗体制备小鼠，其中小鼠1-6和小鼠2-5识别P.gingivalis的效价均>1：25600，且只识别P.gingivalis，因此取小鼠1-6和2-5的脾细胞与骨髓瘤细胞融合在HAT培养基上培养获得杂交瘤细胞后，间接ELISA的方法进行筛选，对仅识别P.gingivalis的杂交瘤细胞亚克隆，检测全部为阳性后扩大培养、冻存。将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内诱生腹水，纯化后得到单克隆抗体。其中P.gingivalis免疫小鼠制备的单克隆抗体命名为E10和E10-2；rHA2免疫小鼠命名为C10、F3、F3-2、G3和G3-2。间接ELISA的方法检测P.gingivalis以及口腔内常见的细菌P.intermedia、F.nucleatum、A.viscosus、A.actinomycetemcomitans和S.mutans，结果mAb与P.intermedia、F.nucleatum、A.viscosus、A.actinomycetemcomitans和S.mutans均无交叉反应，仅识别P.gingivalis。间接ELISA的方法检测P.gingivalis ATCC33277、381和P.gingivalis临床菌株，mAb E10和E10-2可以识别>5×106CFU/mL的P.gingivalis ATCC33277，识别>5×105CFU/mL的P.gingivalis临床菌株，识别>5×107CFU/mL的P.gingivalis 381。mAb C10、F3、F3-2、G3和G3-2均识别>5×105CFU/mL的P.gingivalis ATCC33277；mAb C10、F3、F3-2和G3均识别>5×106CFU/mL的P.gingivalis 381；mAb C10、F3、F3-2和G3均识别>5×105CFU/mL的P.gingivalis临床菌株。mAb G3-2识别>5×107CFU/mL的P.gingivalis381；mAb G3-2识别>5×106CFU/mL的P.gingivalis临床菌株。
表1血清抗P.gingivalis抗体的特异性
Figure BDA0002555017060000151
Figure BDA0002555017060000161
注：红色显示小鼠仅识别P.gingivalis，与P.intermedia、F.nucleatum、A.viscosus、A.actinomycetemcomitans和S.mutans均无交叉反应。
表2单克隆抗体亚型鉴定
Figure BDA0002555017060000162
注：加粗显示为OD450最高值，对应HRP山羊抗小鼠IgG类型为mAb相应的亚型。
效果例2辣根过氧化物酶标记后单克隆抗体识别P.gingivalis的效价以及配对抗体的筛选，双抗体夹心ELISA的建立、最佳工作浓度的确定、识别P.gingivalis的特异性和敏感性
辣根过氧化物酶标记试剂盒标记单克隆抗体后，直接ELISA的方法测定辣根过氧化物酶标记后单克隆抗体识别P.gingivalis的效价，从中筛选可以配对的单克隆抗体。单克隆抗体E10和辣根过氧化物酶标记的G3为最佳配对，单克隆抗体E10最佳包被浓度为5μg/mL，辣根过氧化物酶标记的G31：800稀释为最佳工作浓度。双抗体夹心ELISA可以识别>5×107CFU/mL的P.gingivalis，与P.intermedia、F.nucleatum、A.viscosus、A.actinomycetemcomitans和S.mutans无交叉反应。
表3配对抗体的P/N值
Figure BDA0002555017060000171
注：加粗数据为P/N最高值，对应的包被抗体和HRP标记抗体为最佳配对抗体。
效果例3胶体金试纸条制备及其检测P.gingivalis的特异性和敏感性
还原法制备胶体金粒子，胶体金粒子直径约28nm，最佳pH为7，标记体系中最小蛋白标记浓度为60μg/mL，制备的胶体金试纸条可以识别109CFU/mL的P.gingivalis，与P.intermedia、F.nucleatum、A.viscosus、A.actinomycetemcomitans和S.mutans无交叉反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCCNo.19951或保藏编号为CGMCC No.19952的杂交瘤细胞株产生。
2.杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.19951或CGMCC No.19952。
3.特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体组合，其特征在于，由保藏编号为CGMCCNo.19951的杂交瘤细胞株的单克隆抗体和保藏编号为CGMCC No.19952的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体组成。
4.如权利要求1所述的单克隆抗体或如权利要求3所述的单克隆抗体组合在制备检测牙龈卟啉单胞菌的检测工具中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测工具包括试剂盒、试纸条或芯片。
6.如权利要求1所述的单克隆抗体或如权利要求3所述的单克隆抗体组合在制备检测牙龈卟啉单胞菌相关疾病的检测工具中的应用；所述牙龈卟啉单胞菌相关疾病为牙周炎、心血管疾病、糖尿病、阿尔兹海默症。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测工具包括试剂盒、试纸条或芯片。
8.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的单克隆抗体或如权利要求3所述的单克隆抗体组合。
9.试纸条，其特征在于，包括如权利要求1所述的单克隆抗体或如权利要求3所述的单克隆抗体组合。
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