CN111991381B - 猩红808在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种猩红808在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用，特别是与抗肿瘤药物合用治疗多药耐药肿瘤，恢复肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。猩红808能显著提高过表达ABCB1的肿瘤多药耐药细胞如KB‑C2对部分传统化疗药物如阿霉素和紫杉醇的敏感性，并显著增强过表达ABCG2的肿瘤多药耐药细胞如NCI‑H460/MX20、S1‑M1‑80对部分传统化疗药物如米托蒽醌和拓扑替康的敏感性。逆转耐药作用机理研究表明猩红808通过抑制ABCB1和ABCG2转运蛋白的表达，增加化疗药物在肿瘤多药耐药细胞中的蓄积水平从而发挥逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。对猩红808的逆转耐药作用及机理研究可为其作为逆转耐药剂的研究提供理论支持。

Description

猩红808在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用
技术领域
本发明涉及医药领域,特别是一种猩红808在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用，特别是与抗肿瘤药物合用治疗多药耐药肿瘤，恢复肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，属于制药领域。
背景技术
目前，化学治疗是临床上治疗癌症的主要手段之一。但是，在临床上发现的肿瘤多药耐药的现象严重的影响了化疗药物的作用，癌细胞对功能和结构不同的抗癌药物产生耐药性，使其不能有效地抑制肿瘤生长和转移。这种癌细胞对不同类型的抗癌药物产生抗药性的现象称为多药抗药性（multi-drug resistance，MDR）。肿瘤细胞一旦产生耐药性，就会对化疗药物的作用不敏感，使得化疗药物不能发挥完全的杀死肿瘤细胞的作用，即使大部分肿瘤细胞被杀死，但是残留的肿瘤细胞还是会继续生长，造成肿瘤复发。MDR 是肿瘤治疗失败的主要原因之一。MDR 在肿瘤细胞耐药中占据主要的地位，已经成为肿瘤研究的热点课题之一。研究者对MDR的机制进行了深入研究，最重要机制之一是ABC（ATP-bindingcassette）转运蛋白超家族的过表达，其利用ATP驱动的能量使多种抗癌药物流出胞外。
虽然肿瘤耐药的研究已取得了长足进步，但由于恶性肿瘤的发病机制非常复杂，要达到真正治愈还需要漫长的过程，并且单独针对P-糖蛋白不能解决全部问题。因此，在寻找高效低毒的P-糖蛋白逆转剂的同时，也应努力寻找作用于其他耐药靶点的逆转剂。
中国专利CN103520146A公开了千金子素1在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用，其中，千金子素1可应用于制备肿瘤细胞的ABCB1的特异性抑制剂。并且清楚阐明了其作用机制是通过抑制ABCB1的外排作用。
中国专利CN103483413B公开了 一类多氧孕甾烷化合物及用途，其中，化合物POP65能够逆转由转运体ABCG2所介导的MDR。化合物POP 86和87能够逆转ABCG2 ABC转运体所介导的MDR。
猩红808 (Scarlet 808)，2-羟基-3-苯胺羰基-1-偶氮苯基-萘，分子式为C23H17N3O2，可溶于DMSO、甲醇、氯仿及二氯甲烷。808猩红在20世纪初作为常见的偶氮类红色化学染料被大量合成，常用于涂料、油墨、油漆、皮革等化工产品的着色。猩红808在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效的肿瘤多药耐药逆转剂，即本发明提供了猩红808 (Scarlet 808)在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用，所述的肿瘤多药耐药逆转为ABCB1和 ABCG2所介导的。要解决的技术问题是猩红808作为多药耐药逆转剂的新应用，特别是与抗肿瘤药物合用治疗发生多药耐药的肿瘤,提高肿瘤细胞对抗癌药的敏感性的作用，增强抗癌药物的效果。
本发明提供的在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用，猩红808 的结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
本发明提供的猩红808在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用是在制备用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性制剂的应用，即能够逆转或抑制至少一种ABC转运体所介导的肿瘤多药耐药性。
所述的转运体为ABCB1和ABCG2中的一种或两种。
所述的抗肿瘤药物为ABCB1或ABCG2的底物。优选地，所述抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇、米托蒽醌、拓扑替康中的一种或多种。
所述的肿瘤细胞为人口腔鳞癌上皮耐药细胞、人非小细胞肺癌耐药细胞或人结肠癌耐药细胞中的一种或多种。优选地，所述的肿瘤细胞为KB-C2、NCI-H460-MX20或S1-M1-80中的一种或多种。
本发明提供了猩红808在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用。MTT实验证明猩红808显著提高过表达ABCB1的肿瘤多药耐药细胞KB-C2对部分传统化疗药物如阿霉素和紫杉醇的敏感性，并显著提高过表达ABCG2的肿瘤多药耐药细胞NCI-H460/MX20、S1-M1-80对部分传统化疗药物如米托蒽醌和拓扑替康的敏感性。逆转耐药作用机理研究表明猩红808通过抑制ABCB1和ABCG2转运蛋白的表达，增加化疗药物在肿瘤多药耐药细胞中的蓄积水平从而发挥逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。对猩红808的逆转耐药作用及机理研究可为其作为逆转耐药剂的研究提供理论支持。
附图说明
图1 为猩红808对本发明中细胞模型的增殖抑制活性。
图2 为猩红808对抗肿瘤药物在肿瘤多药耐药中蓄积水平的影响。
图3 为猩红808对抗肿瘤药物在肿瘤多药耐药中外排的影响。
图4 为猩红808 对多药耐药细胞中ABCB1和ABCG2蛋白表达水平及mRNA水平的影响。
图5为猩红808能够降低耐药细胞中ABCB1和ABCG2耐药蛋白mRNA的水平。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明，应当理解的是本发明并不局限于下述实施方式。
实施例1 ：MTT 实验
MTT法又称MTT比色法。利用MTT实验检测猩红808对亲本细胞（parent plant ）和耐药细胞（Resistant cells）的增殖抑制活性。取对数期生长亲本细胞以及对应的耐药细胞细胞，弃去旧培养基，并利用预热的PBS 轻轻润洗细胞，弃去 PBS 后加入胰酶于37℃条件下消化1 min。消化完成后加入预热的 DMEM 完全培养基终止消化并收集至 50 mL 离心管中，然后对细胞进行计数。将细胞按照比例稀释至 2.5×104个/mL，以每孔 200 μL 的体积均匀铺至 96 孔板中（每孔细胞数为5000 个），并放入培养箱中培养6 h，使其贴壁。待细胞贴壁之后，加入一定浓度梯度的猩红808，在含有 5% CO2 的 37℃培养箱中培养 72 h后，加入 4 mg/ml的 MTT 溶液 20 μL，继续培养 4 h，取出 96 孔板，弃去全部上清，每孔加入150 μL 的 DMSO，混匀为均匀的紫色溶液，使用酶标仪在 490 nm 处测量 OD 值。细胞增殖率计算方法：（OD 加药组-OD 空白组）/（OD 对照组-OD 空白组） ×100%。猩红808对细胞的抑制率计算方法：100%-细胞增值率。 IC50 值采用 Graphpad 5.00软件进行计算，并使用该软件绘制增殖曲线。结果如图1所示，对于KB-3-1及其耐药细胞KB-C2、转染空载体的HEK293/pcDNA3.1 人类胚胎肾细胞及其转染 ABCB1基因的 HEK293/ABCB1 耐药细胞,在小于2.5 μM 的猩红808 的作用下，将会产生小于 20%的增殖抑制活性，也就是不会对细胞增殖产生显著的影响，故我们采用1 μM 和 2.5 μM 的猩红808 进行接下来的逆转研究。而H460及其耐药细胞NCI-H460/MX20、S1及其耐药细胞S1-M1-80、HEK293/pcDNA3.1及其转染ABCG2基因的 HEK293/ABCG2 耐药细胞采用1 μM 和 5 μM 的猩红808 进行接下来的逆转研究。
实施例2：逆转实验
取处于对数生长期且状态良好的亲本细胞和耐药细胞，分别以每孔 5000 个的细胞数量种板，每孔中培养基含量为200 μL。培养6 h 贴壁后，吸走40 μL 培养基，加入一定浓度的猩红808。继续培养两小时后，加入按照适宜浓度梯度稀释的化疗药物20 μL，培养72h 后加入 MTT，按照上述方法进行检测。耐药倍数计算方法：IC50耐药细胞/IC50亲本细胞对照组。结果如表1-5所示，猩红808能够降低耐药细胞的IC50，并且对亲本细胞无影响。
表1 猩红808 联合化疗药对KB-3-1及KB-C2细胞增殖的影响
aRF：Resistant Fold，耐药倍数
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表2 猩红808 联合化疗药对HEK293/pcDNA3.1及HEK293/ABCB1细胞增殖的影响
aRF：Resistant Fold，耐药倍数
Figure 553417DEST_PATH_IMAGE004
表3 猩红808 联合化疗药对NCI-H460及NCI-H460/MX20细胞增殖的影响
aRF：Resistant Fold，耐药倍数
Figure 329612DEST_PATH_IMAGE006
表4 猩红808 联合化疗药对S1及S1-M1-80细胞增殖的影响
aRF：Resistant Fold，耐药倍数
Figure 906087DEST_PATH_IMAGE008
表5 猩红808联合化疗药对HEK293/pcDNA3.1及HEK293/ABCG2-482-G2细胞增殖影响
aRF：Resistant Fold，耐药倍数
Figure 894772DEST_PATH_IMAGE010
实施例3：利用流式细胞术检测猩红808对化疗药物在肿瘤多药耐药细胞中蓄积水平的影响 采用PhA和ADR作为荧光标记的底物研究猩红808对两种耐药蛋白在肿瘤多药耐药细胞中蓄积的影响。取处于对数生长期的、并且状态良好的细胞，经胰酶消化、离心重悬、细胞计数制备成终浓度为 1×104个/mL 的细胞悬液，以每孔 1 mL（每孔10000个细胞）均匀地铺在24孔板中，并于6 h贴壁后进行接下来的加药处理。孔板设置以亲本细胞 KB-3-1、NCI-H460 及 S1 为阴性对照，阳性逆转剂对照分别为 ABCB1 特异性逆转剂 verapamil及 ABCG2 特异性逆转剂Ko143。首先与耐药细胞 KB-C2孔中分别加入猩红808（终浓度为 1μM 和 2.5 μM）和阳性逆转剂对照 verapamil，在耐药细胞 NCI-H460/MX20 和 S1-M1-80中加入猩红808（终浓度为 1 μM 和 5 μM）和 Ko143，于 37℃孵育 2 h。孵育结束后于 KB-3-1和KB-C2 细胞中加入终浓度为10 μM的ADR于，NCI-H460、NCI-H460/MX20、S1和 S1-M1-80 细胞中加入终浓度为10 μM 的PhA，继续孵育2 h。孵育结束后，弃去上清，使用预冷的PBS 缓冲液小心清洗细胞2次，然后每孔加入 1 mL 的 0.25%胰酶消化细胞，收集到1.5 mLEP管中，上机检测，根据峰图的中位值计算药物蓄积的百分比，间接反映药物蓄积的水平。结果如图2所示，猩红808能够增加化疗药在耐药细胞中的蓄积，但是对亲本细胞无显著的影响。
实施例4：利用流式细胞术检测猩红808对化疗药物在肿瘤多药耐药细胞中泵出水平的影响 采用PhA和ADR作为荧光标记的底物研究猩红808对两种耐药蛋白在肿瘤多药耐药细胞中泵出的影响。取处于对数生长期的、并且状态良好的细胞，经胰酶消化、离心重悬、细胞计数制备成终浓度为1×104个/mL的细胞悬液，以每孔1 mL（每孔10000个细胞）均匀地铺在24孔板中，并于6 h贴壁后进行接下来的加药处理。孔板设置以亲本细胞 KB-3-1NCI-H460 及S1为阴性对照，阳性逆转剂对照分别为 ABCB1特异性逆转剂verapamil及ABCG2特异性逆转剂Ko143。首先于耐药细胞 KB-C2孔中加入终浓度为10 μM 的ADR,于NCI-H460 和NCI- H460/MX20 细胞中加入终浓度为10μM 的PhA，孵育2 h。孵育结束后，弃去培养基，以预冷的 PBS 清洗细胞2次，在KB-C2孔中加入上述只含有猩红808（终浓度为1 μM 和2.5 μM）或阳性逆转剂对照verapamil的培基。在耐药细胞 NCI-H460/MX20 和S1-M1-80中加入猩红808（终浓度为 1 μM 和 5 μM）和阳性逆转剂对照Ko143培基。随后弃去上清，使用预冷的PBS 缓冲液小心清洗细胞，使用0.25%胰酶消化细胞，收集至1.5 mL EP管中，上机检测，根据峰图的中位值计算药物蓄积的百分比，间接反映药物蓄积的水平。结果如图3所示，猩红808能够降低化疗药在耐药细胞中的外排，但是对亲本细胞无显著的影响。
实施例5：利用Western blot法评价猩红808对ABCB1和ABCG2蛋白表达水平的影响
(1) 细胞处理：将处于对数生长期的亲本和耐药细胞,用胰酶消化后制成细胞悬液并计数。将细胞悬液以每孔2ml的体积均匀接种至6孔板细胞培养皿中，37℃，5% CO2培养箱中培养；第二天待细胞大致长满后加入不同浓度的猩红808处理，对照组加等量的DMSO,继续培养72 h。
(2) 细胞总蛋白的提取：将6孔板从培养箱取出后依次放置于冰盒上，用冰凉的PBS清洗细胞2-3次，用洁净的细胞刮板轻轻刮取底壁上的细胞，PBS重悬并转移至1.5 mlEP 管中，于4°C、3000 rpm条件下离心5 min后弃去上清；根据细胞的多少加入30-50 μl总蛋白提取裂解液（按照cocktail : RIPA裂解液=1 : 200，PMSF(100 mM) : RIPA裂解液=1 :100比例配制），用移液枪混合均匀后将其放在-80°C冰箱中裂解2个小时之上，裂解后取出用涡旋振荡器震荡，5 min/次，总共6次；最后将蛋白放置于冷冻离心机中，在4°C、12000rpm条件下持续离心15 min后吸取所得上清即为细胞总蛋白。
(3) 制胶：清洗灌胶玻璃板并验漏；通风橱内加入10 μL TEMED后立即灌胶，用移液枪缓慢加适量异丙醇压平胶面；约40 - 60 min后，分离胶完全凝固，用吸水纸巾去除胶上层异丙醇；配制上层4%浓缩胶，并将 1.5mm 梳子垂直插入其中，约30 min上层胶完全凝固后，在 1 × running 蛋白电泳缓冲液中轻轻地拔除梳子，并去除梳子孔内气泡。
(4) 上样：快速加入Marker和处理好的蛋白样品，于第一个孔内加入5 μLMarker，等量的1×上样缓冲液按照给药浓度从低到高的顺序依次加入；在空孔中加入等量的1 ×上样缓冲液来有效避免边缘效应的干扰。
(5) 电泳：检查并安装好电泳仪，将电泳初始电压调节为60 V，观察当样品条带跑至浓缩胶以下后，可以将电压调节到100 V继续电泳；当溴酚蓝染料跑至分离胶最底端处，即可切断电源，停止电泳。
(6) 转膜：转膜之前提前将PVDF膜浸泡于甲醇中使其激活，并将激活后的PVDF膜、滤纸和海绵浸泡在冰浴的1× Transfer缓冲液中。取出玻璃板内的跑胶，切去上层胶，保留完整的下层胶，快速将下层胶置于1× Transfer缓冲液中。在转膜装置中按照：正极（白色）-海绵-4层滤纸-胶-PVDF膜-4层滤纸-海绵-负极（黑色）的顺序依次摆放，并于转膜槽中放置一个冰盒，安装好电转仪，在200 mA电流下转膜约2 h。
(7) 封闭：封闭液即5%脱脂奶粉，转膜结束后，将PVDF膜取出并按照Marker指示切下实验所需目的条带，将其完全浸泡在封闭液中，置于摇床上缓慢封闭约2 h。
(8) 免疫反应：1) 一抗孵育：封闭结束后，将加入特异性一抗的条带置于杂交袋中密封，4°C缓慢平摇过夜，一抗浓度按照1:1000或1：500的比例用BSA进行稀释；2) 洗涤：用镊子将目的条带从杂交袋中取出置于装有1 × TBST清洗盒中，室温摇床上快速洗涤，10min/次，共洗4次；3) 二抗孵育：将一抗充分清洗干净后加入二抗，用1 × TBST将二抗稀释到 1:2000 的浓度，吸取1 ml的二抗稀释液加到目的条带上，摇床上室温孵育1 h；4) 洗涤：回收二抗并在室温摇床上快速洗涤，10 min/次，共洗4次。
(9) ECL显色：将蛋白条带放入显影专用暗盒中，按条带顺序依次正面摆好，将ECLA液和B液1:1的1比例混合均匀，在每个条带上均匀加入200 μL的放光液；裁剪合适大小胶片置于膜上，暗室曝光；曝光后将胶片进行显影、定影，用清水冲洗干净后晾干；用图像分析软件进行定量分析。
结果如图4所示，猩红808能够降低耐药细胞中ABCB1和ABCG2耐药蛋白的表达水平。
实施例6：利用qRT-PCR实验评价猩红808对ABCB1和ABCG2 mRNA水平的影响
（1）总RNA的提取
1）将本实验中的细胞模型分别按照1×104个/mL密度接种于6孔板，孵育24小时待细胞贴壁后，更换含10% FBS的新鲜培养基，分别给予不同浓度的猩红808，24小时后胰酶消化细胞转移至EP管中，2000 rpm离心5分钟，用PBS清洗一次；准备处理后的细胞，用预冷的PBS 缓冲液清洗细胞 2 次，弃上清；
2）加入1 mL TRIzol试剂，吹打混合均匀，充分裂解，室温静置10分钟；向离心管中加入200 μL氯仿试剂，剧烈震荡 20秒，置室温静置 10分钟，4℃ 12000 rpm转速离心15分钟。离心后能看到上层为透明的水相，中间层为分界相，底层为氯仿相，取适量上清液置于新的 1.5 mL 离心管中；
3）在上清液中加入500 μL异丙醇，上下颠倒混匀50 次，-20℃下静置 2小时，4℃12000 rpm 转速离心15分钟，弃去上清液；
加入200 μL 75%乙醇洗涤RNA一次，静置 5分钟，4℃ 12000 rpm 转速离心5分钟，弃上清；
4）在通风橱中快速干燥RNA，待乙醇挥发完全，加入无酶水20 μL，溶解RNA；
5）Nanodrop2000核酸检测仪测定 RNA 浓度。
（2）mRNA的逆转录
1）在1.5 mL的无RNA酶EP管中加入下列试剂：
试剂 用量
RNA模板 2 μg
Random Hexamer Primer (60 μM) 2 μL
去核酶水 补足至13 μL
上述体系65℃条件下变性10分钟，将其置于冰上3分钟。
2）再在上述13 μL的反应体系中加入下列试剂：
试剂 用量
5×RT Reaction Buffer 4 μL
RNase Inhibitor (40 U/μL) 0.5 μL
RT Primer Mix 2 μL
RT Transcriptase (20 U/μL) 0.5 μL
总体积 20 μL
将上述体系涡旋振荡混合均匀，离心，25℃反应10分钟，85℃反应分钟终止反应。
（3）qRT-PCR反应
1）将qRT-PCR所需试剂放在冰上融化；
2）在BIO-RAD公司 PCR仪配套的八连管中加入以下试剂：
试剂 用量
Forward Primer (10 μM) 0.6 μL
Reverse Primer (10 μM) 0.6 μL
2×SuperReal PreMix Plus 10 μL
50×Rox Reference Dye 0.4 μL
cDNA模板（100 ng/μL） 1 μL
无核酶水 7.4 μL
3）将八连管的盖子盖紧，用离心机离心；
4）将样品放入PCR仪中，进行扩增；拷贝数据，计算RNA水平。
结果如图5所示，猩红808能够降低耐药细胞中ABCB1和ABCG2耐药蛋白mRNA的水平。因此，可以推断猩红808可能通过降低耐药细胞中ABCB1和ABCG2耐药蛋白的mRNA水平和蛋白表达，从而实现逆转耐药的作用。

Claims (4)

1.一种猩红808在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用；该应用是在制备用于逆转或抑制ABC转运体介导的肿瘤细胞多药耐药性的制剂方面的应用；所述的猩红808能够逆转ABC转运体介导的肿瘤细胞的多药耐药；
所述的肿瘤细胞为人口腔鳞癌上皮耐药细胞、人非小细胞肺癌耐药细胞或人结肠癌耐药细胞中的一种或多种；
所述的多药耐药药物为阿霉素、紫杉醇、米托蒽醌、拓扑替康中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的ABC转运体为ABCB1和ABCG2中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述猩红808的浓度为1~5μM。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞为KB-C2、NCI-H460-MX20或S1-M1-80中的一种或多种。
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