CN106701762A

CN106701762A - 一种p4hb基因表达的抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN106701762A
Application number: CN201611166551.0A
Authority: CN
Inventors: 夏伟; 叶颖; 王国玉; 庄菊花
Original assignee: Shanghai Seventh Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai Seventh Peoples Hospital
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2036-12-16
Also published as: CN106701762B

Abstract

本发明提供了一种P4HB基因表达的抑制剂，所述抑制剂为具有SEQ ID No1所示核苷酸序列的siRNA分子。本发明提供的抑制剂，通过siRNA分子的核苷酸序列与P4HB基因表达产生的mRNA发生互补结合，从而阻止靶位点P4HB基因的表达成蛋白质，从而使P4HB基因沉默，达到抑制P4HB基因表达的目的。本发明还提供了所述抑制剂在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。本发明提供所述抑制剂与P4HB基因表达产生的mRNA发生互补结合，使P4HB基因沉默，从而使上皮细胞转分化(EMT)能够起到相反的作用。同时，P4HB沉默可以抑制肝癌细胞的体内成瘤。

Description

一种P4HB基因表达的抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种P4HB基因表达的抑制剂及其应用。

背景技术

传统的医药领域，有机化合物和抗体是治疗各类疾病的特效药，而近年来，随着分子生物学在医药领域的应用以及新的治疗理念的提出，在生物体内控制特定的基因表达的功能性核酸作为一种新型医药或诊断药备受关注。

目前，作为新型医药或诊断药的功能性核酸主要有RNAi(RNA interference：RNA干扰)，其药物作用机理主要是RNAi的基因沉默，功能性RNA片段与转录因子等靶物质特异性结合来抑制其功能的核酸适体，或与靶mRNA结合而抑制其翻译的反义核酸，从而特异性地阻碍靶基因的mRNA前体中的多聚腺苷酸化而使其不稳定化后，从而抑制靶基因的表达。具有转录后抑制靶基因的表达的功能性RNA片段的种类主要包括siRNA(smallinterfering RNA，小干扰RNA)、shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA)及miRNA(microRNA，微小RNA)，从功能上，这些均被期待作为下一代的医药或诊断药。

但是肝癌的发生和发展是一个较为复杂的过程，异常表达的基因成千上万，目前还没有找到一种在肝癌组织中起关键作用的基因，并且通过抑制该基因能够遏制肝癌的发生或恶化。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种抑制P4HB基因表达的抑制剂siRNA，可以有效沉闷P4HB的表达，进而抑制肝癌组织的增长。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种P4HB基因表达的抑制剂，所述抑制剂为具有SEQ ID No1所示核苷酸序列的siRNA分子。

本发明还提供了所述抑制剂在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。

优选的，所述的药物包括连接有所述的抑制剂的重组载体。

优选的，所述重组载体的载体为聚乙烯亚胺。

优选的，所述siRNA分子与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:2～4。

优选的，所述药物的剂型为注射剂。

优选的，所述的抑制剂通过下调P4HB基因表达，使细胞中GRP78表达量上调，以及抑制上皮间质转化(EMT)，从而抑制肝细胞癌的发生发展。

本发明提供了一种P4HB基因表达的抑制剂，所述抑制剂为具有SEQ ID No1所示核苷酸序列的siRNA分子。本发明提供的抑制剂，通过siRNA分子的核苷酸序列与P4HB基因表达产生的mRNA发生互补结合，从而阻止靶位点P4HB基因的表达成蛋白质，从而使P4HB基因沉默，达到抑制P4HB基因表达的目的。

本发明还提供了所述抑制剂在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。本发明研究发现P4HB在肝癌组织和细胞系中过度表达的特点，另外肿瘤P4HB水平与疾病的进展和转移呈正相关，并与病人的存活率负相关，P4HB基因过表达能够促进肝癌细胞生长、迁移、侵袭。因此，本发明提供所述抑制剂与P4HB基因表达产生的mRNA发生互补结合，使P4HB基因沉默，从而使上皮细胞转分化(EMT)能够起到相反的作用。同时，P4HB沉默可以抑制肝癌细胞的体内成瘤。

进一步的，本发明提供的应用，通过所述抑制剂抑制P4HB基因表达使细胞中GRP78表达量上调，GRP78具有抑制肝癌细胞的EMT、迁移和侵袭的作用，同时能够拮抗由P4HB过表达引起的肝癌细胞EMT、迁移和侵袭。

附图说明

图1为实施例1中肝癌细胞系与正常组织细胞中P4HB蛋白的表达量；

图2为实施例2中肝癌细胞系与正常组织细胞中P4HB mRNA的表达量；

图3为实施例3中MTT检测细胞增殖情况；

图4为实施例4中qRT-PCR检测P4HB mRNA表达量；

图5为实施例4中qRT-PCR检测GRP78 mRNA表达量。

图6为实施例4中P4HB和GRP78 mRNA在人肝细胞癌组织中的表达水平相关性分析；

图7为实施例5中Western blot检测P4HB蛋白表达量；

图8为实施例5中Western blot检测上皮标志物E-cadherin、间质标志物N-cadherin和波形蛋白的蛋白表达量；

图9为实施例5中Western blot检测上皮标志物GRP78蛋白表达量；

图10为实施例6中Transwell技术检测细胞迁移的情况图片；

图11为实施例6中HepG2和Huh-7细胞经处理后细胞迁移数量柱状图；

图12为实施例6中Transwell技术检测细胞侵袭的情况图片；

图13为实施例6中HepG2和Huh-7细胞经处理后细胞侵袭数量柱状图；

图14为实施例7中免疫荧光分析E-cadherin的表达量图片

图15为实施例7中免疫荧光分析波形蛋白的表达量图片

图16为实施例8中不同处理的肿瘤图片；

图17为实施例8中肿瘤体积的柱状图；

图18为实施例8中肿瘤重量的柱状图；

图19为实施例9中siRNA治疗组肿瘤体积显著低于载体PEI对照组和空白对照组；

图20为实施例9中siRNA组瘤体病理图；

图21为实施例9中载体对照组瘤体病理图；

图22为实施例9中空白对照组瘤体病理图。

具体实施方式

本发明中，所述抑制剂的核苷酸序列优选利用siRNA靶点寻找工具“siRNAfinder”(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder)根据P4HB基因的mRNA(GeneBank accession no.AF015950)的开放可读框内的靶向特定序列设计而成。所述的siRNA序列在合成前优选进行BLAST检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，侯选siRNA序列在美国NCBI(National Center for Biotechnology Information)的Unigene数据库进行BLAST同源性比对。当siRNA序列只同源于靶基因时，才可以用于下一步的基因功能研究。

本发明对所述siRNA分子的合成没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的siRNA分子合成方法即可。本发明实施例中所述siRNA分子是由上海吉玛制药技术有限公司根据本发明提供的序列合成得到。

本发明中，所述的药物包括连接有所述的抑制剂的重组载体。

本发明对所述重组载体的载体优选为聚乙烯亚胺(PEI)。所述聚乙烯亚胺的分子量优选为700～1000Da，更优选为800Da。本发明对聚乙烯亚胺的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的聚乙烯亚胺即可。本发明中，所述siRNA分子与聚乙烯亚胺的摩尔比优选为1:2～4，更优选为1:3。

本发明中，所述药物的剂型为注射剂。所述注射剂中抑制剂的浓度优选为80～120mg/ml，更优选为100mg/ml。

本发明中所述注射剂还包括注射剂可接受辅料。所述辅料优选包括缓冲液、分散剂、助悬剂、稳定剂、防腐剂和抗氧化剂中的一种或多种。所述注射剂的溶剂为注射用水。

本发明中，所述缓冲液的用量优选以调节体系的pH值在5.0～8.0为准；所述的缓冲液优选为枸橼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。

本发明中，所述防腐剂在注射剂中的质量浓度优选为：0.02％～0.2％(w/v)，更优选为0.1～0.15％，最优选为0.12％；所述的防腐剂为尼泊金甲酯钠、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯中的一种。

本发明中，所述分散剂在注射剂中的质量百分含量优选为0.5％～15％(w/v)，更优选为1％～10％，最优选为5％；所述的分散剂优选为聚乙烯吡咯烷酮；

本发明中，所述助悬剂在注射剂中的质量百分含量优选为0.2％～20％(w/v)，更优选为0.5％～15％，最优选为10％；所述的助悬剂优选为羧甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；

本发明中，所述稳定剂在注射剂中的质量百分含量优选为0.01％～0.2％(w/v)，更优选为0.08～0.15％，最优选为0.08％；所述稳定剂的种类为RNAstable(R)稳定剂。所述RNAstable(R)稳定剂购自Qiagen.德国。

本发明中，所述抗氧化剂在注射剂中的质量百分含量优选为0.02％～0.5％(w/v)，更优选为0.08～0.3％，最优选为0.15％；所述的抗氧化剂优选为连二亚硫酸钠。

本发明中，所述的抑制剂通过下调P4HB基因表达，使细胞中GRP78表达量上调，抑制上皮细胞转分化，从而抑制肝细胞癌的发生发展。

本发明中，所述抑制剂抑制肝癌细胞发生增殖、迁移和侵袭，并且还能抑制肿瘤的形成。所述肝癌细胞包括Huh-7细胞、HepG2细胞、PLC5细胞、Hep3B细胞、SK-Hep-1细胞。

本发明中，所述注射剂的使用方法优选1次/3日，每次注射0.1ml/Kg。

下面结合实施例对本发明提供的一种P4HB基因表达的抑制剂及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将人肝癌细胞Huh-7、HepG2、PLC5、Hep3B、SK-Hep-1细胞和正常肝细胞L02细胞系，用含100U/ml双抗，10％胎牛血清的DMEM全培养基进行培养48h，培养环境为：37℃、5％CO₂、100％湿度；约2d换液一次，每天采用显微镜观察细胞的增殖数量，当细胞呈对数期增长时，采用Western blot方法分别检测各细胞系P4HB的表达量：具体步骤如下：

①细胞准备

细胞转染24h后，Western blot法检测各组细胞蛋白量的表达情况；

②相关液体配制

A.2M Tris-HCl(pH 8.8)100m1

称取24.2gTris碱；加50mlddH2O；缓慢加浓盐酸至pH 8.8(约4m1)；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加ddH₂O至100ml。

B.1M Tris-HCl(pH 6.8)100m1

称取12.1g Tris碱；加50ml ddH₂O至pH6.8(约8ml)，让溶液冷却至室温，pH将会升高，加ddH₂O至总量为100ml。

C.50％甘油100ml

取50m1100％甘油；加入50ml ddH₂O。

D.1％溴酚蓝10ml

称取100mg溴酚蓝；加ddH₂O至l0ml，搅拌直到完全溶解；过滤除去聚合的染料。

E.lmol/L DTT储存液

用l0ml 0.0lmol/L乙酸钠溶液(pH 5.2)溶解1.545g DTT，过滤除菌后-20℃保存。

F.丙烯酰胺储存液100ml

30％(W/V)丙烯酰胺，0.8％(W/V)双丙烯酰胺。29.2g丙烯酰胺；0.8g双丙烯酰胺(戴手套通风柜操作，加ddH₂O至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，石蜡膜封口，过滤后于4℃避光保存。

G.10％SDS 10g

SDS于100ml纯水中，缓缓搅拌使其完全溶解，室温保存。

H.电泳缓冲液

称取3.0gTris，甘氨酸14.4g，溶于900ml纯水中，充分混匀，溶解后加入10％SDS10ml，定容至1000ml，混匀后室温保存。

转移缓冲液

称取Tris2.4g，甘氨酸11.5g，溶于700ml纯水中，充分溶解后，加入甲醇200ml，定容到1000ml，室温保存。

J.RIPA裂解液

50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，溶解混匀后于4℃保存备用，临用前加入蛋白酶抑制剂(cocktail，1000×)至所需浓度。

K.0.01％考马斯亮蓝染液10mg

考马斯亮蓝R2500.25g，先加入10ml冰醋酸酸，45ml无水乙醇，搅拌至充分溶解后，定容至100ml，过滤后于4℃避光保存。

L.TTBS洗涤液

100ml 10×TBS+900ml ddH2O+1ml Tween-20。

M.丽春红染液

丽春红 0.025g

冰醋酸 50m1

ddH₂O 5m1

N.脱色液

甲醇 45m1

冰醋酸 l0ml

ddH₂O 45m1

O.5×Sample buffer

(pH调为6.8，在调pH后再加溴酚蓝、甘油)

③蛋白样品的制备

A.将用于细胞裂解的所有物品及液体放入0℃冰盒预冷。

B.按照碧云天生产Western及IP细胞裂解液说明书配制细胞裂解液。取适当量的裂解液，在使用前数min内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

C.将24孔板中的培养基倒掉，用预冷的PBS洗涤细胞三遍，每孔加入裂解液100u1，用枪吹打数下，使细胞裂解液与细胞充分接触，然后放于装满碎冰的大托盘中，冰育40min，并放在摇床上不停摇动。

D.将细胞混合液转移到1.5ml离心管，放入超低温高速离心机离心，条件为：4℃、14000g，5min，吸取上清液至干净无菌1.5ml离心管中；

E.用nanodrop 1000测定蛋白浓度，单位为mg/ml值，标注好，-80℃低温冰箱保存。

F.将上清转移至另-EP管中，-20℃保存。

④SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-polyacrylamide gel eletrophoresis，SDS-PAGE)

SDS-PAGE凝胶配制

根据碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制说明书配制10％分离胶(下层胶)，5％浓缩胶(上层胶)。

a.10％分离胶配制：按表1进行配制。

表1 SDS-PAGE凝胶分离胶加样表

按上述表格所列加入15ml离心管后，振荡器充分混匀，用1000ul加样枪沿两层玻璃板间隙内缓慢注入5ml，用双蒸水封胶，室温下聚合60min，当胶凝固后，吸取上层双蒸水，并尽可能用滤纸吸干。

b.5％浓缩胶配制：按表2进行配制。

表2 SDS-PAGE凝胶浓缩胶加样表

振荡器充分混匀，用1000ul加样枪注入两侧玻璃板间隙，并迅速插入梳子，室温下聚合约30min，拔出梳子，以备电泳。

样品处理

分别取各组同等质量蛋白样本，稀释至等体积，98℃水浴锅中5min，使蛋白变性，冷却后加入碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液3ul。

上样与电泳

上样：冷却到室温后，用10ul微量加样器把蛋白样品缓慢加入加样孔，每孔约10ul。并加彩色预染蛋白质分子量标准约5ul。

电泳：上层浓缩胶条件为：100V，30min；下层分离胶为：200V，30min，待样品中的溴酚蓝迁移至胶的底端附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳，本实验观察到绿色蛋白条带出现并拉开距离即可停止电泳。

⑤转膜(Transfer)

本实验选用PVDF膜，通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜上。具体步骤如下：

A.戴上干净手套，切割以目的蛋白所在为中心区域大小约4cm×2.5cm矩形PVDF膜，分离凝胶与PVDF膜，并在PVDF膜右上角剪一小三角，标示为膜的蛋白面，并浸泡事先准备好的预冷转膜液中。

B.剪6张滤纸及一张PVDF膜，其大小与凝胶大小一致，泡入转膜液中10min，注意PVDF膜事先需甲醇浸湿，且不能超过15s，再移至转膜液中。

C.在转膜板中按照从阴极到阳极顺序依次放：三层滤纸，凝胶，PVDF膜，三层滤纸，并保证各层之间无气泡。

D.转模板放入转膜电泳槽中电泳，恒定电流300mA，60min。注意，转膜电泳槽装置需放入冰浴中进行，对抗转移时产热。

⑥染色(Staining)

转膜后的凝胶用考马斯亮蓝染色，观察蛋白的残留情况。或者用丽春红染色液对PVDF膜进行染色观察转膜的效果。TTBS溶液漂洗2-3次，每次3-5min，去除丽春红或考马斯亮蓝，进行后续的Western检测。

⑦封闭(Blocking)

把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，洗涤3遍，每遍5min，以洗去膜上的转膜液。加入封闭液，并放入4℃冰箱封闭过夜。注意整个过程PVDF膜不能干燥，并使液体完全覆盖蛋白膜。

⑧孵育(Incubation)

一抗孵育(Primary antibody incubation)

次日下午用TBST洗涤三次，每次5min，加入兔抗人β-Actin单克隆抗体(工作浓度为1：5000)，封闭放入4℃冰箱过夜。

二抗孵育(Secondary antibody incubation)

隔夜回收一抗，用TTBS洗涤3次，每次5min，吸尽洗涤液，加入Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(工作浓度为1：1000)，室温下在侧摆摇床上摇动孵育60min。回收二抗。用TTBS洗涤4次，每次5min。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

⑨目的蛋白检测(Detection ofproteins)

A.BeyoECL Plus工作液的配制：等体积混合50ul BeyoECL Plus A液和B液，室温放置备用。工作液宜在临检测前配制。

B.Western二抗孵育后，并进行数次洗涤后，用平头镊将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白面)，然后置于一洁净保鲜膜上。

C.根据膜的大小，按每10平方厘米膜加1ml BeyoECL Plus工作液的比例，滴加BeyoECL Plus工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1-2min。

D.取膜，弃BeyoECLPlus工作液，用吸水纸吸去过多的液体。将膜放在两片保鲜膜中间，随后进行压片检测或荧光成像仪检测。

E.压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片1min，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片30s，1，3，5min，然后一起显影定影观察结果。

F.荧光成像仪检测：将膜放置到Kodak Image station 2000MM荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。采用仪器自带软件Kodak Molecular Imaging SoftwareStandard Edition V5.0.1.30分析结合的抗体，并采用光密度分析进行量化。

各细胞系的P4HB的表达量如图1所示。

图1为Western blot检测P4HB蛋白在肝癌细胞系包括Huh-7，HepG2，PLC5，Hep3B，和SK-Hep-1与正常组织中的表达量；由图1可以看出，人肝癌细胞Huh-7，HepG2，PLC5，Hep3B和SK-Hep-1中P4HB的表达量明显高于正常干细胞L02细胞系中P4HB的表达量，P4HB在肝癌细胞中呈上调表达，说明P4HB的表达与肝癌的发生有直接联系。

实施例2

将人肝癌细胞Huh-7、HepG2、PLC5、Hep3B、SK-Hep-1细胞和正常肝细胞L02细胞系进行细胞收集，试剂盒法提取RNA，提取的RNA调整浓度后进行PCR检测。P4HB基因的PCR正向引物为：5’-GGAATGGAGACACGGCTTC-3’；P4HB的PCR反向引物：5’-TTCAGCCAGTTCACGATGTC-3’。所述PCR的反应程序如表3所示。

表3 PCR的反应程序

qRT-PCR后得到人肝癌细胞Huh-7、HepG2、PLC5、Hep3B、SK-Hep-1细胞和正常肝细胞L02细胞系的P4HB基因的表达情况如图2所示。

由图2可以看出，以正常组织中P4HB基因的表达量为基准，肝癌细胞Huh-7，HepG2，PLC5，Hep3B和SK-Hep-1细胞的P4HB的mRNA的表达量明显高于正常组织中P4HB基因的表达量。

实施例3

将P4HB siRNA与载体lipofectamine^TM2000的连接是物理连接，通过lipofectame^TM2000带有的正电荷将带有负电荷的siRNA物理包封在lipofectamnie内的。siRNA与lipofectamine混匀后，即实现了物理接连。

用P4HB抑制剂siRNA分子、对照siRNA、P4HB载体和空载体分别转染HepG2和Huh-7细胞24小时。得到处理后的HepG2和Huh-7细胞。具体采用商品化的载体lipofectaminTM2000进行转染，步骤如下：

先将装有1OD(3.0nmol)siRNA的干粉的Ep管在台式离心机上瞬时离心4s，然后缓慢打开管盖，溶解时加入150ul DEPC处理水后盖上盖子，震荡溶解，使其siRNA终浓度为20uM。为避免多次冻溶，将其分装入0.1ml EP管，每管约15ul，标注种类、日期，放入-80℃冰箱备用。

准备工作：首先向准备好的Ep管内分别加入150ul左右的opti-MEM培养基；接着分别加入6ul的siRNA和对照组siRNA；然后将36ul Lipofectamine^TM 2000和900ul opti-MEM混匀后的混合液，将混合液静置5min，分别取出150ul混合液加入到含siRNA和对照组siRNA管内，然后混匀，静置20min；

转染：分别在制备的lipofectamine-saRNA溶液中取100ul加入到对应的Huh-7、HepG2细胞孔中，例如从siRNA管分别取出100ul(共三次)加入到siRNA组各孔细胞中，以此类推到对照组的管，最终每孔中siRNA的浓度约为80nM。

换液：转染后培养6h，弃细胞培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，每孔加入500μl的DMEM全培养基，继续培养48h。

转染后，将细胞接种于24孔板，每孔2×10⁴个细胞，细胞培养箱培养72小时。在不同时间点(12h、24h、48h和72h)，去除培养基，采用MTT试剂盒分析细胞相对活性，加样后，用分光光度计在550nm波长下测量每孔细胞的OD值。

MTT检测细胞增殖情况如图3所示。由图3可以看出，P4HB siRNA组细胞相对系对细胞数显著低于两个对照组(对照siRNA组、对照载体组)，说明通过siRNA下调P4HB表达水平，可抑制细胞增殖。P4HB组细胞相对数量最高，说明，通过向细胞内转染P4HB基因，上调P4HB表达水平，可促进肿瘤细胞增殖。

实施例4

对实施例3处理得到的HepG2和Huh-7细胞检测P4HB和GRP78基因进行qRT-PCR检测。

分别提取肝癌细胞的总RNA，分别取1ugRNA采用Moloney murine leukemia virus(M-MLV)逆转录，合成cDNA，然后根据SYBR Green reaction mix(Applied Biosystems,USA)操作指南进行加样，在型号为anABI Prism 7900HT荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR。

P4HB的PCR正向引物为：5’-GGAATGGAGACACGGCTTC-3’；

P4HB的PCR反向引物：5’-TTCAGCCAGTTCACGATGTC-3’。

GRP78的PCR正向引物为：5’-GCCTGTATTTCTAGACCTGCC-3’；

GRP78的PCR反向引物5’-TTCATCTTGCCAGCCAGTTG-3’；

以β-actin基因作为内参基因；

所述β-actin基因的PCR正向引物为：5’-AGCGCGGCTACAGCTTCA-3’；所述β-actin基因的PCR反向引物为5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’。

PCR体系扩增的程序如表4所示。

表4 PCR体系扩增的程序

qRT-PCR检测P4HB mRNA表达量如图4所示；qRT-PCR检测GRP78 mRNA表达量如图5所示。图6为P4HB和GRP78 mRNA在人肝细胞癌组织中的表达水平相关性分析。

由图4可知，P4HB siRNA可显著下调P4HB基因表达水平，P4HB

siRNA组P4HB mRNA相对表达水平显著高于对照siRNA组(control siRNA)，P4HB载体组(向细胞内转染P4HB基因)的P4HB mRNA表达水平显著高于载体对照组(controlvector组)。说明可通过转染siRNA下调P4HB表达水平，转染P4HB上调P4HB表达水平。

由图5和图6可知，P4HB基因表达水平与GRP78基因表达水平呈负相关。下调P4HB基因表达水平，GRP78基因表达水平升高，上调P4HB基因表达水平，GRP78基因表达水平下降。

实施例5

针对实施例3处理得到的肝癌组织HepG2和Huh-7细胞，分别提取P4HB蛋白、GRP78、E-钙粘素、N-钙粘素、波形蛋白和β-actin蛋白进行Western blot分析。

将HepG2和Huh-7细胞样本放入在RIPA裂解液，存于-80℃，待用。HepG2和Huh-7细胞经PBS洗去培养基后，采用含有全蛋白酶抑制剂的裂解液。然后每个样本分别取20ug总蛋白，进行加样，分析采用SDS-PAGE胶进行电泳，PVDF膜进行转膜。转膜后分别与抗P4HB、抗GRP78、抗E-钙粘素、抗N-钙粘素、抗波形蛋白、抗β-actin蛋白在4℃过夜孵育，之后，PBS洗去液体，采用辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1小时。采用VersaDoc5000密度仪测量PVDF膜上蛋白条带的密度，进一步量化分析。

图7为Western blot检测P4HB蛋白表达量，图8为Western blot检测上皮标志物E-cadherin、间质标志物N-cadherin和波形蛋白的蛋白表达量，图9为Western blot检测上皮标志物GRP78蛋白表达量。

由图7可知，P4HB siRNA可显著下调P4HB蛋白表达水平，P4HB

siRNA组P4HB蛋白相对表达水平显著高于对照siRNA组(control siRNA)，P4HB载体组(向细胞内转染P4HB基因)的P4HB蛋白表达水平显著高于载体对照组(control vector组)。说明可通过转染siRNA下调P4HB蛋白表达水平，转染P4HB上调P4HB蛋白表达水平。

由图9可知，P4HB蛋白表达水平与GRP78蛋白表达水平呈负相关。下调P4HB蛋白表达水平，GRP78蛋白表达水平升高，上调P4HB蛋白表达水平，GRP78蛋白表达水平下降。

由图8可知，下调P4HB表达水平(P4HB siRNA组)，E-cadherin蛋白表达水平相对对照组(control siRNA组)升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平相对对照组(controlsiRNA组)下降；上调P4HB表达水平(P4HB vector组)，E-cadherin蛋白表达水平相对对照组(control siRNA组)下降，N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平相对对照组(controlsiRNA组)升高。

E-cadherin蛋白表达降低、N-cadherin和Vimentin蛋白升高是肿瘤细胞EMT过程的表现，EMT是促进肿瘤细胞转移、侵袭力、耐药、辐射抵抗的重要因素。因此，说明可通过下调P4HB表达水平，降低肿瘤EMT，从而降低肿瘤的恶性表现。

实施例6

细胞迁移和侵袭力分析

采用8um膜的Transwell室分析细胞迁移和侵袭能力。迁移能力：将1×10⁵个细胞加到不含胎牛血清的DMEM培养基中，然后加到Transwell室上部，Transwell室下部加满生长培养基。24小时，刮去室上部的细胞，迁移到室下部的细胞进行固定，用0.1％浓度的结晶紫染色，成像。

分析侵袭能力：Transwell室的膜上覆盖一层基质胶(Matrigel)，余方法同迁移能力方法。

图10为Transwell技术检测细胞迁移的情况图片；

图11为HepG2和Huh-7细胞经处理后细胞迁移数量柱状图。

图12为Transwell技术检测细胞侵袭的情况图片；

图13为HepG2和Huh-7细胞经处理后细胞侵袭数量柱状图。

由图10～13的结果说明通过P4HB siRNA下调P4HB表达水平，可降低肿瘤细胞迁移和侵袭能力。

实施例7

转染后的各组(P4HB siRNA组、control siRNA组、P4HB vector组和controlvector组)细胞接种于2-井室的细胞培养玻片上，24h后，各组细胞内分别加入抗-E-candherin或抗-vimentin抗体，在4℃孵育12h后，用PBS洗去抗体，然后加入FITC连接的二抗，室温孵育1h，去培养液，用DAPI染色，然后用SP2 MP共聚焦显微镜观察、拍照、分析。

图14和图15分别为免疫荧光分析E-cadherin和波形蛋白的表达量图片。

实施例8

将裸鼠分成两组，其中一组在裸鼠的右侧皮下种植含有抑制剂siRNA重组载体转染后的HepG2细胞，种植5×10⁶个细胞/只；另一组小鼠在相同部位注射相同剂量的对照siRNA转染的HepG2细胞。将两组裸鼠在相同的环境条件下饲养37天，分别从两组裸鼠体内取出肿瘤组织。测量肿瘤体积，称量肿瘤重量，并做记录。图16为肿瘤图片；对不同处理得到的裸鼠体内产生的肿瘤体积情况如图17所示；不同处理得到的裸鼠体内产生的肿瘤重量如图18所示。

由图16～17可知，通过siRNA下调P4HB表达水平的瘤细胞植入裸鼠体内后，发展为瘤组织的体积、重量均显著低于对照组。说明该siRNA可以抑制肿瘤的发生发展。

实施例9

将P4HB抑制剂与PEI、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸盐缓冲液、羧甲基纤维素钠、连二亚硫酸钠和注射用水配置成注射剂，注射剂中P4HB抑制剂的终浓度为100mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为5％，连二亚硫酸钠0.15％，注射剂的pH值为6.8。移植瘤长径大小约0.5cm的肝细胞癌移植瘤裸鼠作为研究对象，进行静脉注射小鼠，按照每千克小鼠注射10ml的注射液，每三天注射一次。实验组为5只，对照组分为PEI载体对照组和空白对照组(生理盐水注射)，均为同批移植瘤裸鼠，载体对照组注射同等体积的载体PEI溶液，空白对照组注射同等体积的生理盐水。结果如图19和图20所示。

图19显示siRNA治疗组肿瘤体积显著低于载体PEI对照组和空白对照组(生理盐水组)。说明以PEI为载体的siRNA通过静脉注射，可以显著抑制肿瘤的增长。

图20为siRNA组瘤体病理图。由图20可知，图片中有可见片状坏死红染(如黑色箭头所示处)，其他部分瘤细胞结构模糊、核固缩、核染色变深、核仁边界不清。

载体对照组和空白对照组病理图如图21和图22所示。由图21和22中可知，图片中可见瘤细胞呈增殖状态(如灰色箭头所示处)，坏死较少。图20～图22经过比较，说明siRNA可促使肿瘤组织内细胞坏死，抑制肿瘤组织发生发展。

由以上实施例可知，本发明设计合成的靶向P4HB的siRNA，采用Lipofectamine2000转染肝癌Hep G2细胞系，然后通过RT-PCR和western blot分别检测Hep G2细胞内靶基因mRNA和蛋白表达水平，结果说明本研究设计的siRNA可以有效沉默P4HB的表达，进一步负向调控肝癌的EMT过程，及抑制肝癌组织的增长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第七人民医院

<120> 一种P4HB基因表达的抑制剂及其应用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagatgaact gtaatacgca a 21

Claims

1.一种P4HB基因表达的抑制剂，为具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的siRNA分子。

2.权利要求1所述的抑制剂在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物包括连接有权利要求1所述的抑制剂的重组载体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组载体的载体为聚乙烯亚胺。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，siRNA分子与聚乙烯亚胺的摩尔比为1：2～4。

6.根据权利要求2～5任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂通过下调P4HB基因表达，使细胞中GRP78表达量上调，以及抑制上皮间质转化，从而抑制肝细胞癌的发生发展。