CN111979215A - 一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体 - Google Patents

一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体 Download PDF

Info

Publication number
CN111979215A
CN111979215A CN202010735420.XA CN202010735420A CN111979215A CN 111979215 A CN111979215 A CN 111979215A CN 202010735420 A CN202010735420 A CN 202010735420A CN 111979215 A CN111979215 A CN 111979215A
Authority
CN
China
Prior art keywords
organic solvent
bacillus sphaericus
protease
mutant
mutated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010735420.XA
Other languages
English (en)
Inventor
刘姝
房耀维
卢静
杨杰
杨光
焦豫良
吴新财
张唯
张弘彧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Ocean University
Original Assignee
Jiangsu Ocean University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Ocean University filed Critical Jiangsu Ocean University
Priority to CN202010735420.XA priority Critical patent/CN111979215A/zh
Publication of CN111979215A publication Critical patent/CN111979215A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，其特征在于：将Bacillus sphaericus蛋白酶基因进行如下突变：39位苏氨酸（T）突变为脯氨酸（P），87位谷氨酰胺（Q）突变为脯氨酸（P），108位丝氨酸（S）突变为甘氨酸（G），172位酪氨酸（Y）突变为谷氨酸（E），198位天冬酰胺（N）突变为色氨酸（W），所述Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体基因密码子优化序列如附录1所示，所述Bacillus sphaericus氨基酸序列GenBank收录号为AJ238598.1；本发明公开的Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，相较于突变前，突变酶的有机溶剂耐受性是野生型酶的3.15倍，突变蛋白酶对有机溶剂的耐受性更好，更加适合工业生产的要求。

Description

一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体。
背景技术
蛋白酶是一类水解酶，可以催化蛋白质和多肽中肽键的水解，属于第3类水解酶的第4亚类（EC 3.4），由于蛋白酶在催化反应时具有反应速度快、条件温和、高专一性、高选择性等诸多优点，被广泛的应用于蛋白质、洗涤剂、食品、制药、制革等许多领域，但由于工业应用过程中的苛刻条件如：高温、强酸、强碱及化学有机溶剂等，蛋白酶容易失去活性，在这些极端条件下的低稳定性极大地限制了蛋白酶在各个领域的应用。
近年来，非水酶学迅速发展，进一步拓展了蛋白酶在有机合成领域的应用，与传统的水相催化相比，使用有机溶剂作为催化介质有很多优点：（1）可以提高非极性底物或产物的溶解性；（2）可以进行不能在水相中进行的合成反应，控制反应进行的方向；（3）可以减少产物对酶的反馈抑制作用：（4）可以提高手性化合物不对称反应的对映选择性；（5）有机溶剂介质种类较多，可以根据反应需要选择；（6）可以提高酶使用的连续性；（7）反应所得的产物易于纯化回收；（8）可以控制放反应的的进程，得到特定的反应中间体，帮助研究反应机制。然而大多数天然蛋白酶在有机溶剂中的稳定性极差，易失去活性，这极大的限制了蛋白酶在有机合成领域的应用。目前已有大量的研究表明通过溶剂工程和生物催化工程可以提高酶对有机溶剂的耐受性，但这些方法不仅成本高，且易导致酶活性下降，因此获得天然有机溶剂稳定性蛋白酶或利用蛋白质工程改造蛋白酶，以增加其有机溶剂耐受性，可以显著降低成本，因此本发明基于酶工程尤其是定向进化技术的快速发展，为提高酶的有机溶剂耐受性提供了新的方法：通过利用定点突变、定点饱和突变、DNA-shuffling等技术可以改善酶的有机溶剂耐受性，使之更好的满足工业催化中的需要。
发明内容
本发明提供了一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，通过定点突变改造蛋白酶酶基因，使所编码的蛋白酶的有机溶剂耐受性增加，突变酶的有机溶剂耐受性是野生型酶的3.15倍，更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求，具体技术方案如下：
一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，其特征在于：将Bacillussphaericus蛋白酶基因进行如下突变：39位苏氨酸（T）突变为脯氨酸（P），87位谷氨酰胺（Q）突变为脯氨酸（P），108位丝氨酸（S）突变为甘氨酸（G），172位酪氨酸（Y）突变为谷氨酸（E），198位天冬酰胺（N）突变为色氨酸（W），所述Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体基因密码子优化序列如附录1所示，所述Bacillus sphaericus氨基酸序列GenBank收录号为AJ238598.1。
进一步的，编码Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的基因。
进一步的，携带权利要求2所述基因的质粒和细胞，其中质粒为ppicZalphA，用于克隆的感受态细胞：E. coli DH5α；用于表达的感受态细胞：Pichia Pastoris X33。
一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于：将Bacillus sphaericus蛋白酶基因sph序列进行密码子优化，通过设计引物对编码蛋白酶的基因进行定点突变后表达，具体包括如下步骤：
（1）以质粒ppicZalphA为模板设计引物进行突变；
（2）将突变后的质粒转化进入E. coli DH5α 进行扩增；
（3）以Pichia Pastoris X33表达含突变基因的重组质粒，得到耐有机溶剂性增强的蛋白酶突变体；
（4）将含有编码蛋白酶的基因的重组P. pastoris X33 (ppicZalphA-sph)进行甲醇诱导表达，发酵培养获取蛋白酶粗酶液；
进一步的，所述定点突变的引物如下：
F-T39P：5’-TGGTGTCAACCCATCTCACCCAGACTTGGTTAACAACGT-3’
R-T39P：5’-TCTGGGTGAGATGGGTTGACACCAGTGTCCAAAACAGCA
F-Q87P：5’-GGTGGTTCTGATCCAGCTGGTATCTACGGTGTTGCT-3’
R-Q87P：5’-TAGATACCAGCTGGATCAGAACCACCATCAGCCAA-3’
F-S108G：CAAGGTTTTGTTGGACGGTGGTTCTGGTTACTCCGATGA
R-S108G：CGGAGTAACCAGAACCACCGTCCAACAAAACCTTGTAGGCC
F-Y 172 E：GCTGCTGGTAACTCTGGTGAAGCTCAAGGTACTATTGGATACC
R-Y172 E：AATAGTACCTTGAGCTTCACCAGAGTTACCAGCAGCAGCGAC
F- N198W：CTTGGAGAACGTTCAACAGTGGGGTACTTACAGAGTTGCCGACTA
R-N198W：CGGCAACTCTGTAAGTACCCCACTGTTGAACGTTCTCCAAGGCAG。
进一步的，所述发酵培养具体操作为：将含有编码突变蛋白酶的基因的重组P.pastoris X33 (ppicZalphA-sph)进行甲醇诱导表达，具体为接种单克隆转化子于2mL YPD中，在30℃，200 rpm条件下摇床培养至OD600至2-8，按照1%的量接种于含10mL BMGY的250ml三角瓶的培养基中，于30℃、200rpm条件下培养至OD600为2-6，接着用无菌离心管离心收集菌体，弃去BMGY培养基，用20mL BMMY 悬浮于250ml三角瓶中，于30℃条件下诱导表达，表达时每24h加入终浓度为0.5%或者1%甲醇，并取样，诱导5d，离心取上清，即为蛋白酶粗酶液。
进一步的，所述BMGY液体培养基由酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、甘油10ml/L、0.1mol/L的pH7.0的磷酸钾缓冲液配制，于121℃灭菌20min，待冷却，并加入10×YNB溶液100mL，500×生物素溶液2mL，4℃保存备用。
进一步的，所述BMMY 液体培养基由酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、0.1 mol/L的pH7.0的磷酸钾缓冲液配制，于121℃灭菌20min，待冷却，并加入10×YNB溶液100mL，500×生物素溶液2mL，过滤除菌的甲醇1mL，4℃保存备用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
本发明通过定点突变改造蛋白酶酶基因，使所编码的蛋白酶的有机溶剂耐受性增加；突变酶的有机溶剂耐受性是野生型酶的3.15倍，酶的其它催化特性基本不变，本发明提供的蛋白酶更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求，具有更高的经济价值和社会价值，值得推广。
具体实施方式
本发明为了提供一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，以氨基酸序列GenBank收录号为AJ238598.1为基础进行如下突变：39位苏氨酸（T）突变为脯氨酸（P），87位谷氨酰胺（Q）突变为脯氨酸（P），108位丝氨酸（S）突变为甘氨酸（G），172位酪氨酸（Y）突变为谷氨酸（E），198位天冬酰胺（N）突变为色氨酸（W），所述Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体基因密码子优化序列如附录1所示。
进一步的，本发明还提供了确定突变氨基酸的方法：通过研究Bacillus sphaericus蛋白酶基因，将其在P. pastoris中进行表达，对重组酶进行酶学性质和有机溶剂耐受性研究，并通过分子动力学模拟蛋白酶SPH在不同浓度甲醇溶液中构象的变化，找出与预计溶剂耐受性相关的关键氨基酸，确定关键位点为氨基酸有39位苏氨酸（T），87位谷氨酰胺（Q），108位丝氨酸（S），172位酪氨酸（Y），198位天冬酰胺（N），对其进行突变，进而提高酶的有机溶剂耐受性。
本发明提供构建所述Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的方法：通过设计引物对Bacillus sphaericus蛋白酶基因sph进行定点突变后表达，具体为将Bacillus sphaericus蛋白酶基因sph序列进行密码子优化进而基因合成，然后连接到酵母表达质粒ppicZalphA上，获得重组质粒ppicZalphA-sph，以含有Bacillus sphaericus蛋白酶基因sph的质粒为模板，设计引物进行突变并将突变后的质粒导入到表达宿主P. pastoris X33，选取单克隆转化进行诱导表达，得到有机溶剂耐受性提高的突变体；所述用于定点突变的引物是：
F-T39P: 5’-TGGTGTCAACCCATCTCACCCAGACTTGGTTAACAACGT-3’
R-T39P: 5’-TCTGGGTGAGATGGGTTGACACCAGTGTCCAAAACAGCA
F-Q87P: 5’-GGTGGTTCTGATCCAGCTGGTATCTACGGTGTTGCT-3’
R-Q87P: 5’-TAGATACCAGCTGGATCAGAACCACCATCAGCCAA-3’
F-S108G: CAAGGTTTTGTTGGACGGTGGTTCTGGTTACTCCGATGA
R-S108G: CGGAGTAACCAGAACCACCGTCCAACAAAACCTTGTAGGCC
F-Y 172 E: GCTGCTGGTAACTCTGGTGAAGCTCAAGGTACTATTGGATACC
R-Y172 E: AATAGTACCTTGAGCTTCACCAGAGTTACCAGCAGCAGCGAC
F- N198W: CTTGGAGAACGTTCAACAGTGGGGTACTTACAGAGTTGCCGACTA
R-N198W: CGGCAACTCTGTAAGTACCCCACTGTTGAACGTTCTCCAAGGCAG。
本发明为了提供应用基因工程菌发酵生产所述蛋白酶突变体的方法，是将含有编码突变蛋白酶的基因的重组Pichia Pastoris X33 (ppicZalphA-sph)进行甲醇诱导表达，接种单克隆转化子于2mL YPD中，于30℃、200rpm摇床培养，培养至OD600为2-8，以1%的量接种于含10mL BMGY的250ml三角瓶的培养基中，于30℃、200 rpm培养至OD600为2-6，用无菌离心管离心收集菌体，弃去BMGY培养基，用20mL BMMY 悬浮于250ml三角瓶中，30℃诱导表达，每24h加入终浓度为0.5%或者1%甲醇，并取样，诱导5d，离心取上清。
实施例：
实施实例一：突变表达质粒的构建及重组Pichia Pastoris X33的获得
使用在线优化工具JCAT将蛋白酶基因sph按Pichia Pastoris X33的密码子偏好性进行优化，密码子优化后对序列无影响，在N端加上His标签，将Xba I、Ecor I的限制性内切酶酶切位点分别加在C末端和N末端，合成基因，直接连接到质粒PUC57上，根据目的基因及质粒设计验证引物，具体为：
ppicZalphA-F1：ATGGACTCTGAGGACTCTTTGGGT
ppicZalphA-R1：AGAAGCGTAGTCGTCACCAATAGC
对目的基因和质粒进行PCR扩增，使用限制性内切酶Xba I、ECOR I对含有目的基因sph的质粒PUC57-sph及表达质粒ppicZalphA进行双酶切，对酶切产物进行纯化回收，用T4 DNA连接酶将纯化回收的目的片段sph连接到表达质粒ppicZalphA上，参考分子克隆实验指南Hanahan方法转入E. coli DH5α，将重组E. coli DH5α涂布于含有Zecoin（100μg/mL）的低盐LB培养基，37℃过夜培养，筛选出阳性克隆菌株，使用质粒提取试剂盒提取质粒，测序；将测序结果正确的重组质粒命名为ppicZalphA-sph，通过电击转化仪转化至P. pastorisX33感受态细胞中。
通过荧光光谱、紫外-可见光谱、圆二色谱（CD）和分子动力学（MD）模拟，研究不同浓度甲醇溶液对B. sphaericus有机溶剂稳定性蛋白酶SPH活性和构象的影响；随着甲醇浓度的增加，酶分子的结构变得松散，回旋半径增大，使得甲醇分子能够进入酶分子内部，导致芳香族氨基酸周围的微环境发生变化；较多的疏水氨基酸暴露在高浓度甲醇溶液中，蛋白质内部原有的疏水相互作用被破坏，导致酶分子的二级和三级结构发生变化，从而影响蛋白酶在有机溶剂中的酶活性和稳定性；根据分子动力学模拟结果以及PDB建模分析，确定了5个突变位点：39位苏氨酸（T），87位谷氨酰胺（Q），108位丝氨酸（S），172位酪氨酸（Y），198位天冬酰胺（N），因此对这些氨基酸位点进行突变可提高酶的有机溶剂耐受性。
以P. pastoris重组载体ppicZalphA-sph为模板设计引物进行突变，并将突变后的质粒线性化后转化入P. pastoris X33后进行扩增，筛选阳性克隆菌株并对其进行诱导表达得到活性提高的突变体，所述用于定点突变的引物是：
F-T39P：5’-TGGTGTCAACCCATCTCACCCAGACTTGGTTAACAACGT-3’
R-T39P：5’-TCTGGGTGAGATGGGTTGACACCAGTGTCCAAAACAGCA
F-Q87P：5’-GGTGGTTCTGATCCAGCTGGTATCTACGGTGTTGCT-3’
R-Q87P：5’-TAGATACCAGCTGGATCAGAACCACCATCAGCCAA-3’
F-S108G：CAAGGTTTTGTTGGACGGTGGTTCTGGTTACTCCGATGA
R-S108G：CGGAGTAACCAGAACCACCGTCCAACAAAACCTTGTAGGCC
F-Y 172 E：GCTGCTGGTAACTCTGGTGAAGCTCAAGGTACTATTGGATACC
R-Y172 E：AATAGTACCTTGAGCTTCACCAGAGTTACCAGCAGCAGCGAC
F- N198W：CTTGGAGAACGTTCAACAGTGGGGTACTTACAGAGTTGCCGACTA
R-N198W：CGGCAACTCTGTAAGTACCCCACTGTTGAACGTTCTCCAAGGCAG；
PCR管中加入ddH2O 22μL， 上游引物和下游引物各1μL，模板DNA 1μL，premix taq 25μL，混合后进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃ 5min，32循环（94℃ 30s、退火30s、72℃ 60s）10℃ 终止；其中退火温度和引物Tm值相关。
扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测后测序：将上述PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳、纯化，并和表达载体ppicZalphA双酶切后，1%的琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段，经电转入感受态P. pastoris X33，将重组菌涂布于含有100μg/mL的博来霉素的YPD平板上，至单菌落产生，挑取多个单菌落用引物进行验证，进行诱导表达。
实施实例二：重组菌的诱导表达
接种单克隆转化子于2mL YPD中，于30℃、200 rpm条件下摇床培养至OD600至2-8，以1%的量接种于含10mL BMGY的250ml三角瓶的培养基中，于30℃、200 rpm条件下培养至OD600为2-6，用无菌离心管离心收集菌体，弃去BMGY培养基，用20mL BMMY 悬浮于250ml三角瓶中，30℃诱导表达，每24h加入终浓度为0.5%或者1%甲醇，并取样，诱导5d，离心取上清，上清即为突变蛋白酶粗酶液。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 江苏海洋大学
<120> 一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 310
<212> PRT
<213> Bacillus sphaericus
<400> 1
Arg Ala Ser Gln Gln Ile Pro Trp Gly Ile Lys Ala Ile Tyr Asn Asn
1 5 10 15
Asp Thr Leu Thr Ser Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ile Asn Ile Ala Val
20 25 30
Leu Asp Thr Gly Val Asn Pro Ser His Pro Asp Leu Val Asn Asn Val
35 40 45
Glu Gln Cys Lys Asp Phe Thr Gly Ala Thr Thr Pro Ile Asn Asn Ser
50 55 60
Cys Thr Asp Arg Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ala Leu
65 70 75 80
Ala Asp Gly Gly Ser Asp Pro Ala Pro Ile Tyr Gly Val Ala Pro Asp
85 90 95
Ala Asp Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu Leu Asp Gly Gly Ser Gly Tyr
100 105 110
Ser Asp Asp Ile Ala Ala Ala Ile Arg His Ala Ala Asp Gln Ala Thr
115 120 125
Ala Thr Gly Thr Lys Thr Ile Ile Ser Met Ser Leu Gly Ser Ser Ala
130 135 140
Asn Asn Ser Leu Ile Ser Ser Ala Val Asn Tyr Ala Tyr Ser Lys Gly
145 150 155 160
Val Leu Ile Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Glu Ala Gln Gly Thr
165 170 175
Ile Gly Tyr Pro Gly Ala Leu Pro Asn Ala Ile Ala Val Ala Ala Leu
180 185 190
Glu Asn Val Gln Gln Trp Gly Thr Tyr Arg Val Ala Asp Tyr Ser Ser
195 200 205
Arg Gly Tyr Ile Ser Thr Ala Gly Asp Tyr Val Ile Gln Glu Gly Asp
210 215 220
Ile Glu Ile Ser Ala Pro Gly Ser Ser Val Tyr Ser Thr Trp Tyr Asn
225 230 235 240
Gly Gly Tyr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val
245 250 255
Ser Gly Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ala Glu Asn Pro Ser Leu Ser Asn
260 265 270
Thr Gln Leu Arg Ser Asn Leu Gln Glu Arg Ala Lys Ser Val Asp Ile
275 280 285
Lys Gly Gly Tyr Gly Ala Ala Ile Gly Asp Asp Tyr Ala Ser Gly Phe
290 295 300
Gly Phe Ala Arg Val Gln
305 310

Claims (8)

1.一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，其特征在于：将Bacillus sphaericus蛋白酶基因进行如下突变：39位苏氨酸（T）突变为脯氨酸（P），87位谷氨酰胺（Q）突变为脯氨酸（P），108位丝氨酸（S）突变为甘氨酸（G），172位酪氨酸（Y）突变为谷氨酸（E），198位天冬酰胺（N）突变为色氨酸（W），所述Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体基因密码子优化序列如附录1所示，所述Bacillus sphaericus氨基酸序列GenBank收录号为AJ238598.1。
2.根据权利要求1所述的一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，其特征在于：编码Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，其特征在于：携带权利要求2所述基因的质粒和细胞，其中质粒为ppicZalphA，用于克隆的感受态细胞：E. coli DH5α；用于表达的感受态细胞：Pichia Pastoris X33。
4.一种如权利要求1所述的Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于：将Bacillus sphaericus蛋白酶基因sph序列进行密码子优化，通过设计引物对编码蛋白酶的基因进行定点突变后表达，具体包括如下步骤：
（1）以质粒ppicZalphA为模板设计引物进行突变；
（2）将突变后的质粒转化进入E. coli DH5α 进行扩增；
（3）以Pichia Pastoris X33表达含突变基因的重组质粒，得到耐有机溶剂性增强的蛋白酶突变体；
（4）将含有编码蛋白酶的基因的重组P. pastoris X33 (ppicZalphA-sph)进行甲醇诱导表达，发酵培养获取蛋白酶粗酶液。
5.根据权利要求4所述的一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于：所述定点突变的引物如下：
F-T39P：5’-TGGTGTCAACCCATCTCACCCAGACTTGGTTAACAACGT-3’
R-T39P：5’-TCTGGGTGAGATGGGTTGACACCAGTGTCCAAAACAGCA
F-Q87P：5’-GGTGGTTCTGATCCAGCTGGTATCTACGGTGTTGCT-3’
R-Q87P：5’-TAGATACCAGCTGGATCAGAACCACCATCAGCCAA-3’
F-S108G：CAAGGTTTTGTTGGACGGTGGTTCTGGTTACTCCGATGA
R-S108G：CGGAGTAACCAGAACCACCGTCCAACAAAACCTTGTAGGCC
F-Y 172 E：GCTGCTGGTAACTCTGGTGAAGCTCAAGGTACTATTGGATACC
R-Y172 E：AATAGTACCTTGAGCTTCACCAGAGTTACCAGCAGCAGCGAC
F- N198W：CTTGGAGAACGTTCAACAGTGGGGTACTTACAGAGTTGCCGACTA
R-N198W：CGGCAACTCTGTAAGTACCCCACTGTTGAACGTTCTCCAAGGCAG。
6.根据权利要求4所述的一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于：所述发酵培养具体操作为：将含有编码突变蛋白酶的基因的重组P. pastoris X33 (ppicZalphA-sph)进行甲醇诱导表达，具体为接种单克隆转化子于2mL YPD中，在30℃，200 rpm条件下摇床培养至OD600至2-8，按照1%的量接种于含10mL BMGY的250ml三角瓶的培养基中，于30℃、200rpm条件下培养至OD600为2-6，接着用无菌离心管离心收集菌体，弃去BMGY培养基，用20mL BMMY 悬浮于250ml三角瓶中，于30℃条件下诱导表达，表达时每24h加入终浓度为0.5%或者1%甲醇，并取样，诱导5d，离心取上清，即为蛋白酶粗酶液。
7.根据权利要求6所述的一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于：所述BMGY液体培养基由酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、甘油10ml/L、0.1mol/L的pH7.0的磷酸钾缓冲液配制，于121℃灭菌20min，待冷却，并加入10×YNB溶液100mL，500×生物素溶液2mL，4℃保存备用。
8.根据权利要求6所述的一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于：所述BMMY 液体培养基由酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、0.1 mol/L的pH7.0的磷酸钾缓冲液配制，于121℃灭菌20min，待冷却，并加入10×YNB溶液100mL，500×生物素溶液2mL，过滤除菌的甲醇1mL，4℃保存备用。
CN202010735420.XA 2020-07-28 2020-07-28 一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体 Pending CN111979215A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010735420.XA CN111979215A (zh) 2020-07-28 2020-07-28 一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010735420.XA CN111979215A (zh) 2020-07-28 2020-07-28 一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111979215A true CN111979215A (zh) 2020-11-24

Family

ID=73444437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010735420.XA Pending CN111979215A (zh) 2020-07-28 2020-07-28 一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111979215A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1768137A (zh) * 2003-01-30 2006-05-03 诺和酶股份有限公司 枯草杆菌酶
CN103275958A (zh) * 2011-08-01 2013-09-04 南京工业大学 一种耐有机溶剂碱性蛋白酶
CN109777796A (zh) * 2017-11-13 2019-05-21 江苏澳新生物工程有限公司 一种催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1768137A (zh) * 2003-01-30 2006-05-03 诺和酶股份有限公司 枯草杆菌酶
CN103275958A (zh) * 2011-08-01 2013-09-04 南京工业大学 一种耐有机溶剂碱性蛋白酶
CN109777796A (zh) * 2017-11-13 2019-05-21 江苏澳新生物工程有限公司 一种催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108913671B (zh) 一种ω-转氨酶突变体及其应用
US20180251748A1 (en) Arginine Deiminase Mutant with Improved Enzyme Activity and Temperature Stability and Application Thereof
CN111979163B (zh) 一种重组罗氏真氧菌及其制备方法和应用
CN108624576B (zh) 一种l-氨基酸脱氨酶的突变体及其制备方法与应用
CN108865962B (zh) 一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌
CN112626057B (zh) 一种嵌合型植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用
CN106755044B (zh) 高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF及其构建和应用
CN109321549A (zh) 一种比酶活提高的肝素酶i的定向改造酶及分子改造方法和表达工程菌
CN113563481A (zh) 一种能同时降解黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的融合酶的突变体构建方法及其应用
CN114134134B (zh) L-苏氨酸醛缩酶突变体及其在合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸中的应用
CN109321541B (zh) 一种l-氨基酸氧化酶的突变体
CN112359032B (zh) 突变型酯酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用
US11098287B2 (en) 17β-hydroxysteroid dehydrogenase mutants and application thereof
CN110184259B (zh) 一种厌氧芽孢杆菌来源普鲁兰酶突变体及其应用
CN111979215A (zh) 一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体
CN110592119A (zh) 一种来源于类芽孢杆菌新型普鲁兰酶及其基因与应用
CN112481320B (zh) 一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法
CN112409493B (zh) 一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用
CN114644987A (zh) 一种提高l-苹果酸生产水平和发酵强度的黑曲霉菌株、方法及应用
CN109777816B (zh) 硫酸软骨素abc酶蛋白的制备方法及其应用
CN108690837B (zh) 一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法及热稳定性提高的醇脱氢酶
CN112280760A (zh) 一种谷氨酸脱氢酶突变体及其应用
CN112442474B (zh) 一种(-)γ-内酰胺的制备方法
CN110699345A (zh) 一种卤醇脱卤酶突变体及其应用
CN105255922B (zh) 一种海藻酸裂解酶sha-5基因及其原核表达载体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination