CN111973652A - 一种处理细胞老化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种散血草(Ajuga taiwanensisNakai ex Murata)的酒精萃取物，其可显著抑制人类真皮纤维母细胞的老化现象，此外，散血草的酒精萃取物还可抑制丝切蛋白‑1(cofilin‑1)的表现，丝切蛋白‑1是一种参与肌动蛋白动力学与细胞形态的蛋白质。本发明的散血草的酒精萃取物在适当的浓度下，可更有效抑制细胞的老化，且不会过度抑制细胞的生存力与生长。

Description

一种处理细胞老化的方法
技术领域
本发明关于一种散血草(Ajuga taiwanensisNakai ex Murata)的萃取物及其用于治疗细胞衰老的方法。较特别地，该方法包含给予受试者一有效剂量的抗衰老组合物，其中该抗衰老组合物包含台湾散血草的酒精萃取物。
背景技术
细胞衰老是一种不可逆的生理过程，因为染色体端粒会随着细胞的不断分裂而逐渐缺失，除此之外，细胞的形状也会变得较大且扁平，并进入细胞周期的G0期以避免进行DNA复制。尽管无法直接控制老化细胞中端粒的缺失，但是有许多成果已强调可通过帮助老化细胞补充生长因子，或使用生长因子重塑老化细胞的细胞形状，以暂时性逆转其老化的表现型。
通过观察皮肤结构的改变，可以容易地察觉老化的出现，因为此为一种不可逆的生理过程，染色体端粒的缺失伴随着不间断的细胞分裂，会造成细胞的扩大与扁平化。丝切蛋白-1(cofilin-1)，为一种来自肌动蛋白解聚因子(actin de-polymerization factor,ADF)/丝切蛋白家族的分子，在维持细胞形态方面扮演着重要的角色，虽然目前仍不清楚其基本机制，但已有证据显示丝切蛋白-1与细胞的衰老有关。
丝切蛋白-1(cofilin-1，CFL-1)是一种小蛋白质(～19kD)，存在于真核生物中，属于肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor,ADF)/丝切蛋白家族(Wang H,etal.Nucleic acids research,29(8):1653-1660,2001)，肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白家族包含肌动蛋白解聚因子、丝切蛋白-1与丝切蛋白-2，其中丝切蛋白-1与肌动蛋白解聚因子为非肌肉同种型(non-muscle isoforms)。然而，于哺乳细胞中，丝切蛋白-1的表现量较肌动蛋白解聚因子更高，丝切蛋白-1基因的剔除会导致小鼠死亡，这也表示丝切蛋白-1与肌动蛋白解聚因子的功能并非是多余的(Gurniak CB,Perlas E,&WitkeW.,Developmentalbiology 278(1):231-241,2005)；另一方面，抑制肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白家族的蛋白质亦会造成酵母菌、果蝇、非洲爪蟾的囊胚细胞(blastomere)出现非染色体分离的细胞分裂失败(Bamburg JR.,Annual review of cell and developmental biology 15:185-230,1999；BamburgJR,McGough A,&Ono S.,Trends in cell biology 9(9):364-370,1999)。肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白的基本功能是通过解聚或切断肌动蛋白丝(actinfilament)以加速肌动蛋白丝的更新，有趣的是，丝切蛋白-1可增强肌动蛋白的聚合，以利于细胞的移动与其他生理行为，而非破坏肌动蛋白丝(Elam WA,Kang H,&De la Cruz EM.,FEBS letters 587(8):1215-1219,2013)，细胞的流动性、形态、细胞周期进程与细胞分裂均取决于丝切蛋白-1调控肌动蛋白细胞骨架的活性，因此，丝切蛋白-1的过度表现会促进细胞老化，而抑制老化细胞中的丝切蛋白-1表现则可减少老化的表现型。美国专利US 8,574,852揭示了一种方法，其中包含检测细胞或组织样品中的丝切蛋白-1的表现程度，以判定培养的细胞或组织样品的细胞老化情况。
中草药被认为可用于维持与调节生理状况，包含老化细胞的替换补充。散血草(Ajuga.taiwanensis)，属于唇形科植物，是一种多年生的草本植物，主要可见于中国大陆、台湾、马来西亚和非洲，散血草整株可用于抗发炎、缓解肿胀与发红，在台湾，散血草亦被用于治疗山羊、抗利尿剂、疟疾与发炎相关疾病，已知散血草中含有植固醇(sitosterol)、酚醛化合物(Ardekani MS,et al.,Journal of Essential Oil Bearing Plants 13(1):45-51,2010；Manguro LOA,et al.,Journal of Asian natural products research 9(7):617-629,2007)和不同种类的新环戊烷二萜(neo-clerodane diterpenes)(Chiou et al.,Phytochemistry 80:64-69(2012；Castro et al.,J Nat Prod 74:1036-1041,2011)与植物脱皮固醇(phytoecdysteroid)(Chan et al.,Chem Pharm Bull.53:836-838)。然而，目前没有任何证据或公开信息揭示散血草具有抗老化、美白或保湿的作用。于本发明中，已由数据证实散血草可有效抑制丝切蛋白-1的表现，并且减少老化相关的半乳糖苷酶(senescence associated-galactosidase,SA-β-gal)的表现，表示散血草具有预防与/或治疗细胞老化的功效。
发明内容
一方面，本发明提供一散血草酒精萃取物(an alcohol extract ofA.taiwanensis,ATE)，可于人类真皮纤维母细胞(human dermal fibroblasts,HDF)的细胞模型中暂时逆转老化的表现型并减少其丝切蛋白-1的表现，其中人类真皮纤维母细胞的细胞模型是通过细胞群倍加数(population doubling level,PDL)公式来评估其老化现象。
于本发明的一实施例中，本发明的散血草酒精萃取物是通过高效液相层析(highperformance liquid chromatography,HPLC)分析其组成，显示其中包含一活性化合物，为8-O-乙酰哈巴苷(8-O-acetylharpagide)。
于本发明的一实施例中，所述散血草酒精萃取物(ATE)于抑制人类真皮纤维母细胞的老化现象具有显著的效果。
于本发明的一较佳实施例中，细胞群倍加数为3.32x log(Xe/Xb)+S，其中Xb为细胞培养起始时的细胞数量；Xe是细胞培养结束时的细胞数量；S是开始时间点的细胞群倍加数。
于本发明的另一较佳实施例中，细胞群倍加数公式为n＝3.32(log UCY–log I)+X，其中n是继代培养结束时的最终细胞群倍加数；UCY是于此时点的细胞产出量；I是继代培养接种时的细胞数；X是用于进行继代培养的接种细胞的加倍水平。
于本发明的一实施例中，本发明的散血草酒精萃取物(ATE)可抑制丝切蛋白-1(CFL-1)的表现，丝切蛋白-1为一种参与肌动蛋白动力学与细胞形态学的蛋白质，且于老化细胞中表现较高，除此之外，本发明的散血草酒精萃取物亦可恢复老化细胞中的长寿基因沉默信息调节因子-1(sirtuin-1，SIRT1)的表现。
于本发明的其他实施例中，亦评估了散血草酒精萃取物的次分层(sub-fraction)的抗老化效果，其中该散血草酒精萃取物的次分层包含乙酸乙酯可溶层、正丁醇可溶层与水可性层。
另一方面，本发明提供了一种抗老化组合物，其包含一散血草酒精萃取物(analcohol extract of A.taiwanensis,ATE)。
于本发明的一实施例中，将老化的人类真皮纤维母细胞经不同浓度的散血草酒精萃取物的次分层处理24小时，再进行老化相关的半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色分析，显示经散血草酒精萃取物的次分层处理可改善老化现象。
于本发明的另一实施例中，经散血草酒精萃取物处理后，可提升细胞的生长速率。
于本发明的一实施例中，散血草酒精萃取物可抑制或限制细胞周期检查点分子的表现，包含p53蛋白(p53)、p27蛋白(p27)与老化相关分子丝切蛋白-1。
附图说明
图1显示了散血草酒精萃取物(ATE)的HPLC分析结果。
图2A-2E显示了建立一人类真皮纤维母细胞(HDF)细胞模型用于评估老化现象；(A)使用细胞群倍加数公式模拟人类真皮纤维母细胞株的生长；(B)使用免疫荧光染色检测人类真皮纤维母细胞的肌动蛋白细胞骨架的分布与细胞形态；(C)年轻人类真皮纤维母细胞与老化人类真皮纤维母细胞的细胞形态比较；(D)年轻人类真皮纤维母细胞与老化人类真皮纤维母细胞间的细胞周期差异；(E)年轻人类真皮纤维母细胞与老化人类真皮纤维母细胞中的老化相关分子p53与丝切蛋白-1(CFL-1)的表现。
图3显示了散血草酒精萃取物(ATE)的细胞毒性结果；使用不同浓度的散血草酒精萃取物处理人类真皮纤维母细胞，以检测散血草酒精萃取物是否具有细胞毒性与其半抑制浓度值(IC50值)。
图4A-4G显示散血草酒精萃取物(ATE)的抗衰老作用；人类真皮纤维母细胞与不同浓度的散血草酒精萃取物共培养，并进行老化相关的半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色，同时，由硫酸钡(BeSO4)或D-半乳糖所诱导的老化细胞也经不同浓度的散血草酒精萃取物处理，以观察其老化相关的半乳糖苷酶(SA-β-gal)表现量的改变；(A)年轻人类真皮纤维母细胞与经不同浓度的散血草酒精萃取物处理的老化人类真皮纤维母细胞间的老化相关的半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色结果比较；(B)老化相关的半乳糖苷酶染色结果的定量；(C)年轻人类真皮纤维母细胞与经不同浓度(50、100μg/ml)的散血草酒精萃取物处理的老化人类真皮纤维母细胞的细胞生长曲线；(D)经散血草酒精萃取物(100μg/ml)处理的老化人类真皮纤维母细胞的细胞周期分布；(E)老化人类真皮纤维母细胞经散血草酒精萃取物处理后其老化相关的半乳糖苷酶表现量；(F)由硫酸钡所诱导的老化细胞经散血草酒精萃取物处理后其老化相关的半乳糖苷酶表现量；(G)由D-半乳糖所诱导的老化细胞经散血草酒精萃取物处理后其老化相关的半乳糖苷酶表现量。
图5A-5D分别显示了散血草酒精萃取物(ATE)对老化相关分子p53蛋白与p27蛋白的抑制效果，以及其对长寿标记沉默信息调节因子-1(SIRT1)的提升效果。(A)进行西方墨点法分析以评估散血草酒精萃取物(50、100μg/ml)于降低人类真皮纤维母细胞中的丝切蛋白-1(CFL-1)、p53蛋白(p53)、p27蛋白(p27)表现量的效果；(B)经不同浓度的散血草酒精萃取物(50、100μg/ml)处理的人类真皮纤维母细胞中，其西方墨点法结果的丝切蛋白-1(CFL-1)、p53蛋白(p53)、p27蛋白(p27)表现量定量结果；(C)进行西方墨点法分析以评估散血草酒精萃取物(50、100μg/ml)于提升人类真皮纤维母细胞中的沉默信息调节因子-1(SIRT1)表现量的效果；(D)经不同浓度的散血草酒精萃取物(50、100μg/ml)处理的人类真皮纤维母细胞中，其西方墨点法结果的沉默信息调节因子-1(SIRT1)表现量定量结果。
图6A-6F分别显示了散血草酒精萃取物次分层(ATEsub-fraction)的细胞毒性评估结果，与经散血草酒精萃取物次分层处理后的细胞的细胞增值速率；人类真皮纤维母细胞经不同浓度的散血草酒精萃取物次分层处理，包含乙酸乙酯可溶层(ATE-EA)、正丁醇可溶层(ATE-BuOH)与水可溶层(ATE-H2O)，以检测这三种散血草酒精萃取物次分层是否对人类真皮纤维母细胞具有细胞毒性，以及对其细胞增殖的影响。
图7A-7E显示散血草酒精萃取物次分层的散血草酒精萃取物的正丁醇可溶层(ATE-BuOH)、散血草酒精萃取物的乙酸乙酯可溶层(ATE-EA)、散血草酒精萃取物的水可溶层(ATE-H2O)的抗老化效果。(A)人类真皮纤维母细胞经不同浓度散血草酒精萃取物的正丁醇可溶层(ATE-BuOH)处理后其老化相关的半乳糖苷酶(SA-β-gal)表现量；(B)人类真皮纤维母细胞经不同浓度散血草酒精萃取物的乙酸乙酯可溶层(ATE-EA)处理后其老化相关的半乳糖苷酶表现量；(C)人类真皮纤维母细胞经不同浓度散血草酒精萃取物的水可溶层(ATE-H2O)处理后其老化相关的半乳糖苷酶表现量；(D)通过西方墨点法评估人类真皮纤维母细胞经不同浓度的散血草酒精萃取物的正丁醇可溶层、散血草酒精萃取物的乙酸乙酯可溶层、散血草酒精萃取物水可溶层处理后其丝切蛋白-1(CFL-1)与p53的表现量；(E)经散血草酒精萃取物的正丁醇可溶层、散血草酒精萃取物的乙酸乙酯可溶层、散血草酒精萃取物的水可溶层处理过的人类真皮纤维母细胞与对照组人类真皮纤维母细胞之间的沉默信息调节因子-1(SIRT1)、p53蛋白(p53)、丝切蛋白-1(CFL-1)表现量的西方墨点结果的定量比较。
图8A-8C分别显示了经散血草酒精萃取物、散血草酒精萃取物正丁醇可溶层、散血草酒精萃取物水可溶层与水(作为对照组)处理后的小鼠的p53表现量的改变。(A)肝脏与皮肤组织的p53蛋白(p53)免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)结果；(B)皮肤中p53蛋白的免疫组织化学染色的染色强度定量结果；(C)肝脏中p53蛋白的免疫组织化学染色的染色强度定量结果。
图9A-9C分别显示了经散血草酒精萃取物、散血草酒精萃取物正丁醇可溶层、散血草酒精萃取物水可溶层与水(作为对照组)处理后的小鼠的丝切蛋白-1表现量的改变。(A)肝脏与皮肤的丝切蛋白-1免疫组织化学染色结果；(B)肝脏中丝切蛋白-1的免疫组织化学染色的染色强度定量结果；(C)皮肤中丝切蛋白-1的免疫组织化学染色的染色强度定量结果。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文中所使用的技术和科学名词与本发明所属技术领域中具通常知识者所理解的具有相同含意。
如本文中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”与“该”包括其复数形式，除非上下文中另有明确定义，因此，举例来说，若提及“一样品”，应包含本领域技术人员所知的复数个此样品与其等同物。
本发明中所使用的医药组合物可通过使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式进行配置，该载体包含赋形剂和助剂，有助于将活性化合物加工成药用的制剂，而适当的制剂取决于所选的给药途径。
实施例
将于以下实施例中进一步说明和描述本发明的其他特征与优点，本文中所描述的示例仅用于说明，而非用于限制本发明。
实施本发明将用到包含细胞生物学的常规技术和细胞培养的技术，此应属于本领域的常规技术，此类技术应已于相关文献中充分解说。
人类真皮纤维母细胞(Human dermal fibroblast,HDF)模型
人类真皮纤维母细胞(
Figure BDA0002506947910000061
PCS-201-010TM)是以标准培养条件(37℃下，空气湿度为95％与浓度5％(v/v)的CO2)培养于含2wt％胎牛血清的纤维母细胞生长试剂-低血清(Fibroblast Growth Kit-Low serum(ATCC PCS-201-041))中，人类真皮纤维母细胞每48小时培养一次，每次继代后细胞会变老。细胞群倍加数(PDL)公式是根据美国培养中心(American Type of Culture Center,ATCC)规范，细胞群倍加数为3.32 x log(Xe/Xb)+S，其中Xb为细胞培养起始时的细胞数量；Xe是细胞培养结束时的细胞数量；S是开始时间点的细胞群倍加数，而该细胞群倍加数公式为n＝3.32(log UCY–log I)+X，其中n是继代培养结束时的最终细胞群倍加数；UCY是于此时点的细胞产出量；I是继代培养接种时的细胞数；X是用于进行继代培养的接种细胞的加倍水平。
散血草酒精萃取物及其次分层(sub-fraction)的制备
将干燥的散血草地上部分研磨后，以乙醇水溶液(80％(v/v))进行萃取，并于减压下进行浓缩，得到一粗萃取物(即为散血草酒精萃取物ATE)。将该粗萃取物悬浮于水中，并依次与乙酸乙酯(EA)与正丁醇(BuOH)进行分层，以分别获得乙酸乙酯可溶、正丁醇可溶与水可溶的次分层，各层皆会用于接下来的实验。
细胞生长曲线分析
首先，将人类真皮纤维母细胞(105个细胞)接种于60mm的培养皿中，并培养于37℃且空气湿度为95％与浓度5％(v/v)的CO2环境下24小时，接着以浓度为50和100μg/ml的散血草酒精萃取物处理人类真皮纤维母细胞共24小时，之后每天各组的细胞经胰蛋白酶消化后进行细胞数计数，持续7天。
细胞存活率试验(MTT assay)
于一实施例中，使用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)进行细胞存活率试验，首先将人类真皮纤维母细胞接种于96孔盘中(每孔2000个细胞)，每一孔经不同浓度的散血草酒精萃取物处理24小时候，再替换为0.5mM的MTT无血清培养基，并培养于37℃培养箱中4小时，之后将培养基去除，并加入二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)形成紫色结晶，最后，使用ELISA分析仪(TECAN)测量其在570nm波长下的OD值。
于另一实施例中，进行相同的程序以评估散血草酒精萃取物的乙酸乙酯可溶层(ATE-EA)、正丁醇可溶层(ATE-BuOH)与水可溶层(ATE-H2O)对人类真皮纤维母细胞的细胞毒性。
老化相关的半乳糖苷酶(senescence associated-galactosidase,SA-β-gal)染色
先于37℃下以0.2wt％戊二醛加2wt％甲醛固定细胞5分钟，接着以磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,PBS)冲洗，再将染色溶液(1mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-吡喃半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside)、5mM的铁氰化钾(potassium ferricyanide)、5mM的亚铁氰化钾(potassium ferrocyanide)、150mM的氯化钠(NaCl)、1mM的氯化镁(MgCl2)、40mM的柠檬酸(citric acid,pH 6.0))加入至培养皿中，并共同培养于37℃共24小时。染色的细胞可于光学显微镜下使用数字相机(Olympus,Center Valley,PA,USA)观察，通过计算每100个随机选择的细胞中，呈阳性染色结果细胞所占比例来进行定量。
西方墨点法
使用含有1wt％蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(Thermo Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)制备蛋白质裂解物。将等量的总蛋白质进行SDS/PAGE电泳后，转染至硝酸纤维素膜(PALL Co.,Port Washington,NY,USA)，并将之与阻断缓冲液(blocking buffer,含4wt％脱脂牛奶的TBS-T)于室温下处理1小时，再与初级抗体于4℃下杂合过夜，最后再与带有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)的二级抗体反应。使用增强型化学发光试剂(Enhanced Chemiluminescence reagent,Bio-Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA,USA)增强信号强度，并以Image-Quant LAS-4000影像系统(GE Healthcare,Chicago,IL,USA)纪录。
实施例1、散血草酒精萃取物散血草酒精萃取物的色层分析
通过高效液相层析分析进行散血草酒精萃取物的化学分析，于Hitachi 5160上操作
Figure BDA0002506947910000081
star RP-18的封端管住(5μm)(150 x 4.6mm)进行，其流动相由溶剂A(0.2wt％磷酸，H3PO4)与溶剂B(甲醇，MeOH)组成，采用以下的梯度顺序：0-5分钟，30％的溶剂B；5-20分钟，30-60wt％的溶剂B；20-30分钟，60-80wt％的溶剂B；30-35分钟，80％的溶剂B，采1.0ml/min的流速注入，进样量和UV检测器分别设置为10μl与203nm。结果显示，散血草酒精萃取物中含有一主要成分，称为8-O-乙酰哈巴苷(8-O-acetylharpagide)(图1)。
实施例2、建立人类真皮纤维母细胞(HDF)细胞模型
建立人类真皮纤维母细胞细胞模型，使用细胞群倍加数公式(PDL)评估老化现象(图2A)。老化的人类真皮纤维母细胞会变得扁平、变大(图2C)，且增殖速度缓慢，细胞骨架也随着继代代数增加而扩大(图2B)，此外，除了细胞生长速度与细胞形态的改变以外，针对年轻细胞和老化细胞的细胞周期分布也进行了评估，年轻的人类真皮纤维母细胞其G1/G0阶段比为72.8％，而老化的人类真皮纤维母细胞的G1/G0阶段比则为89.1％(图2D)，结果显示，老化细胞中进入细胞停滞期的细胞比例有增加。另外，亦进行了老化相关的半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色，以证实代数Pn+12的人类真皮纤维母细胞已确实进入了老化阶段，也进一步评估P6、P8、P10与P12代数的人类真皮纤维母细胞中p53与丝切蛋白-1等老化相关分子的表现量，其中p53于P12代人类真皮纤维母细胞中表现最强，而丝切蛋白-1的表现量随着人类真皮纤维母细胞的衰老而增加(图2E)。
实施例3、散血草酒精萃取物散血草酒精萃取物的细胞毒性
采用MTT试验分析散血草酒精萃取物对人类真皮纤维母细胞的细胞毒性，结果如图3显示，经低浓度散血草酒精萃取物处理过的人类真皮纤维母细胞，其细胞的存活率甚至有略微提高，此外，散血草酒精萃取物的半致死浓度(IC50)约为1500μg/ml，因此于本发明的后续实验中，浓度选用为50μg/ml与100μg/ml。
实施例4、散血草酒精萃取物散血草酒精萃取物的抗老化作用
在建立了年轻与老化的细胞模型与确定散血草酒精萃取物没有毒性后，进一步检测散血草酒精萃取物的抗老化功能。首先，将人类真皮纤维母细胞以50、100μg/ml的散血草酒精萃取物处理，并进行老化相关的半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)分析。其结果显示，相较于对照组，经处理的老化细胞其老化相关的半乳糖苷酶表现量有显著性的下降(图4A)，从定量结果中可更明显的观察到两种浓度的散血草酒精萃取物均可降低其表现量(图4B)，且以100μg/ml组别的抑制效果更佳。
接着，检测经散血草酒精萃取物处理的老化细胞的细胞生长速率，结果显示经散血草酒精萃取物处理的老化细胞，其生长速率明显高于对照组，且50与100μg/ml的浓度都能达到相同的效果(图4C)，虽然无法将老化细胞的生长速率恢复到正常细胞的水平，但也显示散血草酒精萃取物的处理可有效的减缓老化，并增加细胞的生长。
除了进行老化相关的半乳糖苷酶染色分析与观察生长速率的改变之外，本发明还进一步的评估细胞周期的复原。结果显示，经散血草酒精萃取物处理后，人类真皮纤维母细胞的G1/G0阶段比率从85.2％减少至75.3％，接近年轻组的73.5％(图4D)，此表示散血草酒精萃取物可促进人类真皮纤维母细胞恢复分裂与生长。且通过老化相关的半乳糖苷酶表现量分析结果显示，散血草酒精萃取物的处理可降低老化人类真皮纤维母细胞内的老化相关的半乳糖苷酶表现量(图4E)。
此外，亦使用其他的老化模型测试散血草酒精萃取物的抗老化功效，例如由硫酸钡(BeSO4)与D-半乳糖所诱导的老化细胞，如上述步骤所述，使用不同浓度的散血草酒精萃取物处理此两种老化细胞模型24小时，并检测及定量其老化相关的半乳糖苷酶的表现量。结果显示，经散血草酒精萃取物处理的细胞的表现量皆显著性的降低(图4F-4G)。
实施例5、人类真皮纤维母(HDF)细胞经散血草酒精萃取物处理后的的分子表现
老化的人类真皮纤维母细胞经散血草酒精萃取物处理后可恢复生长能力，并提高其生长速率，重新进入细胞分裂周期，因此，进一步评估包含p53蛋白、p27蛋白等表现于细胞周期检查点的分子，以及老化相关分子丝切蛋白-1。结果显示，给予50、100μg/ml散血草酒精萃取物后，可显著性地降低p53蛋白(p53)、p27蛋白(p27)、丝切蛋白-1的表现量(图5A、5B)。
另一方面，亦检测了长寿标记沉默信息调节因子-1(SIRT1)的表现量。由西方墨点法的结果显示，散血草酒精萃取物(50、100μg/ml)可提升人类真皮纤维母细胞的沉默信息调节因子-1(SIRT1)表现量(图5C)，且从其定量结果可见，于提升沉默信息调节因子-1(SIRT1)表现量的抗老功效方面，呈现继量依赖性(图5D)。
实施例6、散血草酒精萃取物的次分层对人类真皮纤维母细胞(HDF)的细胞毒性与经其处理后的人类真皮纤维母细胞(HDF)的细胞增殖率
将散血草酒精萃取物悬浮于水中，并依次与乙酸乙酯(EA)与正丁醇(BuOH)进行分层，而分别获得乙酸乙酯可溶(ATE-EA)、正丁醇可溶(ATE-BuOH)与水可溶(ATE-H2O)的散血草酒精萃取物次分层。使用MTT试验，进行散血草酒精萃取物次分层对人类真皮纤维母细胞的细胞毒性检测。如图6A-6C的结果显示，散血草酒精萃取物的乙酸乙酯可溶层、散血草酒精萃取物的正丁醇可溶层、散血草酒精萃取物的水可溶层等三种散血草酒精萃取物的次分层对人类真皮纤维母细胞皆不具细胞毒性，即使已使用到最高剂量处理，其细胞存活率仍约为80％。
对于细胞增殖率，细胞增殖试验是通过于24小时至72小时计数有经散血草酒精萃取物的次分层处理过或未经处理的细胞数目来进行判定。于各个时间点使用血球计数盘计算细胞数，并将每个时间点所得的细胞数目与初始接种(即0小时)的细胞数进行比较，以获得比率，试验结果显示，不同浓度(最高至100μg/ml)的散血草酒精萃取物的次分层皆不会引起明显的细胞死亡和抑制细胞增殖速率(图6D-6F)。
实施例7、散血草酒精萃取物散血草酒精萃取物次分层的抗老化作用
于本实施例也评估散血草酒精萃取物次分层的抗老化作用，使用散血草酒精萃取物的乙酸乙酯可溶层、散血草酒精萃取物的正丁醇可溶层、散血草酒精萃取物的水可溶层处理人类真皮纤维母细胞，并进行老化相关的半乳糖苷酶(SA-β-gal)的活性定量以检测此三种次分层的抗老效果。如图7A-7C的结果显示，散血草酒精萃取物的次分层也同样具备抗老化效果。除此之外，亦使用西方墨点法检测，于经散血草酒精萃取物次分层处理过的人类真皮纤维母细胞与未经处理的人类真皮纤维母细胞内，长寿标记沉默信息调节因子-1(SIRT1)与老化标记p53蛋白(p53)、丝切蛋白-1(CFL-1)的表现情形(图7D)，其定量结果显示，散血草酒精萃取物次分层可显著性地提升人类真皮纤维母细胞中沉默信息调节因子-1(SIRT1)的表现量，并降低p53蛋白(p53)、丝切蛋白-1(CFL-1)的表现量，且以散血草酒精萃取物水可溶层为最有效的一散血草酒精萃取物次分层(图7E)。
实施例8、经散血草酒精萃取物散血草酒精萃取物及其次分层处理过的小鼠的p53与丝切蛋白-1表现量的改变
11-12个月龄的Balb/C小鼠一般被视为中年的动物模型，因此使用此模型检测散血草酒精萃取物、及其次分层散血草酒精萃取物水可溶层与散血草酒精萃取物正丁醇可溶层对于中年动物的抗老效果。将小鼠共分为4组：对照组、散血草酒精萃取物、散血草酒精萃取物水可溶层及散血草酒精萃取物正丁醇可溶层实验组，并分别进行每天两次且每周五天共一个月的喂食，每一组皆含有2只小鼠，每只小鼠的施用剂量如下：35mg/kg的散血草酒精萃取物与7mg/kg的散血草酒精萃取物正丁醇可溶层、散血草酒精萃取物水可溶层。完成处理后，将小鼠牺牲以进行p53蛋白(p53)与丝切蛋白-1(CFL-1)的免疫组织化学染色。如图8A-8C与图9A-9C所示，肝脏与皮肤的免疫组织化学染色结果与对照组相比下，散血草酒精萃取物及其次分层可显著性的降低老化分子标记p53蛋白(p53)与丝切蛋白-1的表现量，然而，组内相较之下，散血草酒精萃取物正丁醇可溶层对p53蛋白(p53)的抑制能力较弱。

Claims (10)

1.一种散血草的酒精萃取物，其特征在于，该萃取物包含乙酰哈巴苷。
2.如权利要求1所述的酒精萃取物，其特征在于，该酒精萃取物是通过将散血草地上部以乙醇水溶液进行萃取制备而得。
3.如权利要求1所述的酒精萃取物，其特征在于，进一步包含一种或多种的酒精萃取物的次分层。
4.如权利要求3所述的酒精萃取物，其特征在于，该次分层包含该酒精萃取物的乙酸乙酯可溶层、正丁醇可溶层与水可溶层。
5.一种抗老化组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的酒精萃取物作为一抗老化剂。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，该组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
7.一种预防与/或治疗老化的方法，其特征在于，包含给予受试者一有效剂量的如权利要求5所述的抗老化组合物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该抗老化组合物用于抑制丝切蛋白-1的表现。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该抗老化组合物用于抑制p53蛋白、p27蛋白、活性氧类或其组合的表现。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该抗老化组合物用于提升沉默信息调节因子-1的表现。
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