CN111973614A - 烟酰胺单核苷酸在制备预防、改善和/或治疗囊卵巢综合症的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及烟酰胺单核苷酸在制备预防、改善和/或治疗囊卵巢综合症的药物中的应用。本发明采用来曲唑联合高脂饲料构建PCOS大鼠模型，研究烟酰胺单核苷酸对PCOS的保护作用，实验结果显示烟酰胺单核苷酸干预可明显改善PCOS大鼠卵泡发育情况，黄体数量增多，颗粒细胞层厚，恢复大鼠动情周期，降低体重和空腹血糖，降低血清雄激素、黄体生成素、胰岛素、胰岛素抵抗指数水平，增加乳酸和ATP的分泌，改善卵巢能量代谢情况。

Description

烟酰胺单核苷酸在制备预防、改善和/或治疗囊卵巢综合症的 药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及烟酰胺单核苷酸在制备预防、改善和/或治疗囊卵巢综合症的药物中的应用。

背景技术

多囊卵巢综合征(PCOS)是青春期和育龄期妇女常见的内分泌代谢紊乱性疾病，是女性月经不调及不孕的主要原因。在育龄期妇女中，PCOS的患病率为5-10％，是排卵障碍性不孕的主要原因，比例高达75％，且早期自然流产在PCOS中的发生率为20-41％。其主要临床表现为高雄激素血症、稀发排卵或无排卵、多囊卵巢、月经紊乱、胰岛素抵抗、血脂异常、多毛、痤疮等。PCOS还容易发生Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、抑郁、焦虑等，可见PCOS是一种多系统内分泌紊乱性疾病，严重影响女性生殖健康和心理健康，需长期防治。

由于PCOS临床表现高度异质，且其病因与发病机制尚未完全阐明，目前尚无根治方法，国际上较为公认的PCOS治疗共识在临床应用上也尚存争议。国内外专家共识提倡PCOS患者无论有无生育需求，首先均应进行生活方式调整，戒烟、戒酒、减轻体重至正常范围等基础治疗，从而减轻月经紊乱、多毛、痤疮等症状，改善胰岛素抵抗。目前治疗方案主要有：饮食管理和体育锻炼、药物治疗、手术，目的主要在于减轻高雄激素引起的症状、预防远期生殖与代谢并发症，有生育需求的妇女则需进行促排卵治疗。中国PCOS专家推荐短效口服避孕药(首选达英-35)可用于高雄激素血症的治疗，但其疗程尚无明确标准；PCOS患者还存在糖脂代谢异常，国内指南中二甲双胍仅应用于糖耐量异常患者，且并未将妊娠妇女列为适应人群；手术治疗，但是术后易出现盆腔粘连及卵巢早衰；在当今快节奏生活方式下，规范饮食、加强体育锻炼，依从性低，较难有效改善患者症状。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了烟酰胺单核苷酸在制备预防、改善和/或治疗囊卵巢综合症的药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了烟酰胺单核苷酸在制备预防、改善和/或治疗囊卵巢综合症的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，烟酰胺单核苷酸能够恢复规律动情周期。

在本发明的一些具体实施方案中，烟酰胺单核苷酸能够改善卵泡发育情况。

在本发明的一些具体实施方案中，烟酰胺单核苷酸使得颗粒细胞层增厚。

在本发明的一些具体实施方案中，烟酰胺单核苷酸使卵巢黄体数量增多，体重、空腹血糖降低。

在本发明的一些具体实施方案中，烟酰胺单核苷酸能够改善生殖内分泌水平，降低血清雄激素、黄体生成素、胰岛素、胰岛素抵抗指数水平。

在本发明的一些具体实施方案中，烟酰胺单核苷酸能够改善卵巢组织代谢产物水平，使乳酸、ATP生成量增多。

在本发明的一些具体实施方案中，烟酰胺单核苷酸能够促进卵泡发育。

在本发明的一些具体实施方案中，烟酰胺单核苷酸能够改善生育情况。

在本发明的一些具体实施方案中，烟酰胺单核苷酸改善卵巢能量代谢情况。

现有研究认为下丘脑-垂体分泌功能亢进可引发PCOS患者寡排卵或无排卵，并最终导致不孕。PCOS患者血清LH水平升高和FSH/LH比率升高，LH升高可导致卵泡膜细胞中雄激素合成增加，最终导致雄激素水平过高。睾酮能够促进始基卵泡的起始生长和生长卵泡内膜细胞即颗粒细胞的增生，当雄激素水平过高时会引起性激素反馈调节垂体分泌促性腺激素的功能紊乱，引发调控卵泡发育的促性腺激素、性激素水平及其受体表达的失衡，最终导致卵泡发育障碍，卵巢卵泡募集过多，但成熟受阻，窦前卵泡数目增多，优势卵泡无法生成而导致不孕。此外，PCOS患者体内胰岛素水平升高也可使LH升高，进而促进卵巢和肾上腺分泌雄激素。PCOS胰岛素抵抗患者机体可代偿性分泌胰岛素，进而发生高胰岛素血症。胰岛素水平升高可促进卵泡膜细胞生成更多的雄激素，过量的雄激素拮抗雌激素，使卵泡颗粒细胞凋亡增加，卵泡闭锁，卵巢呈多囊样改变，促进PCOS的发生。

在正常卵泡发育过程中，卵巢颗粒细胞为卵母细胞发育提供代谢产物和能量，卵母细胞与颗粒细胞之间的能量代谢在卵母细胞的正常发生中发挥重要作用。已有研究证实，颗粒细胞能量代谢异常是女性排卵异常、生育能力下降甚至不孕的重要原因。在正常卵泡发育过程中，卵巢颗粒细胞通过其细胞膜上的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)摄取周围组织的葡萄糖，经过糖酵解生成丙酮酸和乳酸供能。颗粒细胞的增殖活力与葡萄糖、丙酮酸、乳酸浓度密切相关，正常或高于生理浓度葡萄糖、丙酮酸、乳酸联合培养颗粒细胞，细胞增殖活力旺盛，说明其具备较高的糖酵解速率。体外培养卵泡的培养液中丙酮酸浓度与卵泡体积密切相关，低浓度丙酮酸培养卵泡直径较正常组低。随着卵泡直径和卵泡液的增加，卵泡液中乳酸含量也逐渐增加，乳酸含量在排卵前卵泡LH峰后达到最高，而卵泡中葡萄糖含量与卵泡直接呈负相关，卵泡越大葡萄糖浓度越低。研究发现，乳酸脱氢酶(LDH)的活性和水平也随着患者的年龄和卵泡直径的增加而增加。

能量代谢途径在PCOS患者卵泡发育中的作用机制尚不明确，但是已有研究显示PCOS的发生与卵泡发育的能量代谢异常密切相关。卵巢局部的糖代谢受损导致颗粒细胞和卵母细胞的能量供应不足，最终可诱发排卵障碍。研究发现，PCOS患者的卵泡与正常组相比需要更多的丙酮酸来维持生长，PCOS患者卵泡液中糖蛋白浓度显著升高而丙酮酸乳酸浓度显著下降。PCOS患者高雄激素可诱发卵泡液内糖酵解紊乱，较高的雄激素可抑制卵巢颗粒细胞乳酸脱氢酶(LDH)水平表达，包括LDHA和LDHB，阻断糖酵解途径，减少乳酸生成，使卵母细胞供能不足，卵泡成熟缺陷。这说明PCOS患者的卵泡需要较高浓度的丙酮酸乳酸刺激才能维持正常发育，然而高雄激素和高胰岛素又可降低乳酸的生成，最终导致PCOS卵泡发育停滞或闭锁。

当颗粒细胞的能量代谢途径异常或关键酶缺失时，会出现卵泡发育异常甚至发育停滞。通过对小鼠的卵巢研究发现，PCOS组卵巢中LDH、己糖激酶和磷酸果糖激酶的表达较正常组显著下降。此外，提高PCOS患者体外培养的闭锁卵泡的乳酸和丙酮酸含量可基本恢复卵泡发育；反之，降低乳酸和丙酮酸含量，卵泡发育停滞，且在一定范围内，乳酸丙酮酸含量越高卵泡发育越好。胰岛素抵抗也可以影响颗粒细胞葡萄糖的消耗和乳酸生成，研究显示，PCOS大鼠颗粒细胞中IRS-1和GLUT4表达水平降低，导致细胞对葡萄糖的利用率下降以及乳酸生成显著降低，说明胰岛素抵抗干扰了颗粒细胞正常的能量代谢方式。

烟酰胺单核苷酸(NMN)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)的前体，其主要生理功能主要通过提供NAD⁺来实现。高脂饮食或衰老过程中，NAD⁺在多个器官水平明显降低，NMN可恢复年龄或高脂饮食诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠的NAD⁺含量并改善葡萄糖耐受不良。肥胖雌性大鼠补充NMN可降低自身体重，改善后代卵母细胞发育，这可能与补充NMN引起的NAD⁺水平升高有关。且有研究发现，老年大鼠补充NMN可使体内NAD⁺含量增加，改善其卵泡质量与生育能力。

NAD⁺作为沉默信息调控因子SIRT1的激活物，其含量严格调控SIRT1的活性，与SIRT1的反应速率直接相关，进而影响细胞的增殖与分化。SIRT1与胰岛素分泌密切相关，激活SIRT1可增强胰岛β细胞的胰岛素释放、改善胰岛素敏感性，并减少炎症和氧化应激对胰岛素的损害，从而维持葡萄糖稳态。NMN可通过激活SIRT1来增强胰岛素敏感性，并恢复与氧化应激、炎症反应相关的基因表达。在缺血再灌注损伤中，NMN可通过刺激SIRT1来增强糖酵解信号通路从而保护心脏。Sirtuins(SIRT1、SIRT3和SIRT6)的卵巢表达和卵巢储备呈正相关，表明这些蛋白可能是卵巢衰老的潜在标志物，也是延缓该器官衰老的目标分子。SIRT1基因缺失的小鼠出生后无法存活，雄性和雌性SIRT1^-/-小鼠均不育，而SIRT1转基因小鼠显示寿命延长，抑制了卵泡发育和性成熟的延迟。研究显示，表达脱乙酰基酶缺陷型SIRT1突变体的小鼠发情周期受损，LH波动减少，排卵减少。

本发明实验结果表明，PCOS大鼠补充NMN可以调控糖酵解途径改善卵巢能量代谢、卵泡发育，增强生育力。PCOS大鼠补充NMN后可恢复规律动情周期，卵巢黄体数量增多，体重、空腹血糖降低。同时改善PCOS大鼠生殖内分泌水平，降低血清雄激素、胰岛素、胰岛素抵抗指数水平。PCOS大鼠补充NMN后还可改善卵巢组织代谢产物水平，使乳酸、ATP生成量增多，最终促进卵泡发育，改善PCOS大鼠生育情况。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示NMN干预PCOS大鼠恢复规律动情周期；其中动情周期图(M，Metaestrus，发情后期；E，Estrus，发情期；P，Proestrus，发情前期；D，Dioestrus，发情间期)；

图2示NMN干预后大鼠体重变化；**p<0.01，差异有统计学意义；结果表明：NMN可降低PCOS大鼠体重；与对照组相比，PCOS大鼠体重明显升高，且有统计学意义；NMN连续腹腔注射28天后，观察大鼠体重差异，发现NMN干预可明显降低PCOS大鼠体重，且差异有统计学意义；

图3示NMN干预后大鼠空腹血糖变化；**p<0.01，差异有统计学意义；结果表明：NMN可使PCOS大鼠空腹血糖明显降低；与对照组相比，PCOS大鼠空腹血糖明显升高，且有统计学意义；NMN连续腹腔注射28天后，观察大鼠空腹血糖差异，发现NMN干预可明显降低PCOS大鼠空腹血糖，且差异有统计学意义；

图4示NMN干预后卵巢湿重变化；A：NMN干预后左卵巢湿重变化情况；B：NMN干预后右卵巢湿重变化情况；**p<0.01，差异有统计学意义；结果表明：NMN干预后卵巢湿重变化；与对照组相比，PCOS大鼠左卵巢湿重和有卵巢湿重明显升高，且有统计学意义；NMN连续腹腔注射28天后，观察大鼠卵巢湿重差异，发现NMN干预可明显降低PCOS大鼠左卵巢湿重，且差异有统计学意义，而右卵巢湿重无明显降低；

图5示NMN干预后大鼠生殖激素水平变化；A：大鼠血清睾酮水平；B：大鼠血清黄体生成素水平；C：大鼠血清卵泡刺激素水平；D：大鼠血清黄体生成素/卵泡刺激素比值；E：大鼠血清胰岛素水平；F：HOMA-IR：稳态水平胰岛素抵抗指数，HOMA-IR＝FBG×INS/22.5；**p<0.01，差异有统计学意义；结果表明：NMN干预后激素水平变化：PCOS大鼠血清雄激素水平明显高于对照组，补充NMN可明显降低PCOS大鼠血清雄激素水平，差异有统计学意义；PCOS大鼠LH水平与对照组无明显差异，补充NMN可降低PCOS大鼠血清LH；各组大鼠血清FSH水平无明显差异；PCOS大鼠LH/FSH比值与对照组相比差异无统计学意义，NMN干预后可降低LH/FSH比值，差异有统计学意义；PCOS大鼠血清胰岛素水平以及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)与对照组相比明显升高，NMN干预可明显降低胰岛素水平以及HOMA-IR，差异有统计学意义；

图6示NMN干预后大鼠卵巢代谢产物改变；A：NMN干预后卵巢组织乳酸含量变化；B：NMN干预后卵巢组织丙酮酸含量变化；C：NMN干预后卵巢组织ATP生成量变化；**p<0.01，差异有统计学意义；结果表明：NMN干预后卵巢糖代谢相关产物变化：PCOS大鼠卵巢乳酸水平明显降低，NMN干预后乳酸水平升高；而PCOS患者卵巢丙酮酸水平升高，NMN干预后丙酮酸生成量降低；PCOS大鼠卵巢组织ATP含量降低，NMN干预后ATP含量升高，差异均有统计学意义；

图7示卵巢HE染色结果；各组卵巢切片HE染色扫描结果图；各组卵巢切片HE染色10倍和20倍镜下卵泡及卵母细胞的形态；其中，CL：黄体；GC：颗粒细胞；与对照组相比，PCOS组卵巢结构紊乱，卵泡和黄体明显减少，而窦房卵泡则明显增加；与对照组相比，颗粒细胞排列松散，颗粒细胞层变薄；NMN治疗后，本发明发现NMN组的黄体数量明显增加，而窦房卵泡明显减少，并且颗粒细胞层增加；

图8示各组代谢产物聚类分析；

图9示卵巢代谢箱式图；其中，图9A：NMN干预后卵巢组织乳酸含量变化；图9B：NMN干预后卵巢组织丙酮酸含量变化；图9C：NMN干预后卵巢组织ATP生成量变化；**p<0.01，差异有统计学意义；结果表明：NMN干预后卵巢糖代谢相关产物变化：PCOS大鼠卵巢乳酸水平明显降低，NMN干预后乳酸水平升高；而PCOS患者卵巢丙酮酸水平升高，NMN干预后丙酮酸生成量降低；PCOS大鼠卵巢组织ATP含量降低，NMN干预后ATP含量升高，差异均有统计学意义。

具体实施方式

本发明公开了烟酰胺单核苷酸在制备预防、改善和/或治疗囊卵巢综合症的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实验材料：

1实验动物：选取5周龄，体重150-180的雌性SD大鼠(购自长沙市天勤生物技术有限公司)，共计39只。正式造模前分笼喂养(4-5只每笼)，适应性喂养1周。实验环境温度20-26℃，相对湿度40-70％，日夜时间分配均匀，均12h，自行取食及饮水。

2饲料：

高脂饲料：购自南京市玄武区森堡生物制品中心。

普通饲料：购自南华大学实验动物中心。

3相关溶液及药物配制：

(1)1％羧甲基纤维素钠(CMC)：称1g CMC，加入100mL超纯水中，置于磁力搅拌器上，温度为60°，转速500r/min，搅拌至CMC完全溶解呈透明。

(2)4％多聚甲醛：先配0.01MPBS缓冲液2L，称80g多聚甲醛，加入2L 0.01M PBS缓冲液中，置于磁力搅拌器上，温度为50℃，转速500r/min，搅拌至多聚甲醛完全溶解呈透明。

实验方案：

(1)PCOS大鼠模型的构建及鉴定：

①5周龄SD雌性大鼠适应性喂养一周后随机分为对照组和模型组。模型组大鼠用来曲唑1mg/kg.d，溶于1％羧甲基纤维素钠中连续灌胃30天，同时予以高脂饲料喂养。对照组予以普通饲料喂养。模型构建第21天开始，连续采集阴道脱落细胞涂片10天，初步判断模型构建是否成功；

②模型构建成功后，收集各组大鼠血液，分离血清，通过放射免疫方法测定血清中生殖激素(LH、FSH、T、Insulin)含量。收集卵巢和胰腺固定，经脱水、透明、透蜡和包埋制备石蜡切片，HE染色分析卵巢卵泡和胰岛形态学变化，测定卵泡直径变化，计算窦状卵泡数量变化，反应模型复制效果。

(2)检测NMN干预对PCOS大鼠卵泡发育的影响：

①模型构建成功后对大鼠进行分组，分别分为PCOS组(模型组)和NMN组(实验组)。实验组给药方案为：NMN溶于生理盐水，以500mg/kg.d腹腔注射给药，持续时间时间21天。在治疗12天开始采集阴道脱落细胞涂片，连续10天。第22天开始禁食12小时，结束后测FBG,在安乐死后进行取材分析；

②收集血液，分离血清，通过放射性免疫方法测定血清中生殖激素(LH、FSH、T、Insulin)含量。收集卵巢和胰腺固定，经脱水、透明、透蜡和包埋制备石蜡切片，HE染色分析卵巢卵泡和胰岛形态学变化，测定卵泡直径变化，计算窦状卵泡数量变化；

(3)分析NMN对PCOS模型大鼠糖酵解的影响:

①NMN用上述方法处理完模型大鼠后，收集各组大鼠卵巢，使用液相色谱对样本进行分离，采集负离子MEM模式数据一套(暂不进行技术性重复)，每隔8个样本加入一个QC样本。主要对样本中糖代谢产物进行相对定量分析，得到峰面积。所使用的色谱柱为购自Waters公司的UPLC BEH Amide色谱柱(1.7μm，2.1*100mm)。质谱条件：轰击能量：35eV，15张二级图谱每50ms。ESI离子源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Pa，辅助气压：60Pa，气帘气压：30Pa，温度：550℃，喷雾电压：5500V(正离子模式)或-4500V(负离子模式)。最后使用Analyst software软件对糖代谢类物质的MRM原始数据进行提取，得到各个代谢产物的峰面积，并进行T-检验和倍数分析，最后绘制箱状图和层次聚类分析；

统计学方法：本发明所有数据均重复三次以上。定量资料用均数±标准差表示，应用SPSS 20软件对数据进行统计学分析，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，P≤0.05为差异有统计学意义。

本发明采用来曲唑联合高脂饲料构建PCOS大鼠模型，研究烟酰胺单核苷酸对PCOS的保护作用，实验结果显示烟酰胺单核苷酸干预可明显改善PCOS大鼠卵泡发育情况，黄体数量增多，颗粒细胞层厚，恢复大鼠动情周期，降低体重和空腹血糖，降低血清雄激素、黄体生成素、胰岛素、胰岛素抵抗指数水平，增加乳酸和ATP的分泌，改善体能能量代谢情况。

本发明提供的烟酰胺单核苷酸在制备预防、改善和/或治疗囊卵巢综合症的药物中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 PCOS-IR大鼠模型制备

5周龄SD大鼠适应性喂养一周后，随机分为对照组和模型组，模型组于第8天开始用来曲唑1mg/kg·d,溶于1％羧甲基纤维素钠(CMC)中连续灌胃30天，同时予以高脂饲料喂养。对照组普通饲料喂养。给药20天后监测SD大鼠阴道图片，根据动情周期初步判断模型是否构建成功。对模型构建成功的SD大鼠进行分组，分别分为PCOS组(模型组)和NMN组(实验组)。

实施例2阴道涂片制作

将大鼠仰卧位固定，用移液枪吸取20μL无菌生理盐水，将生理盐水打入阴道内约1cm，移液管反复吹吸3次，吸出10μL液体均匀涂抹于载玻片上，晾干。每张载玻片上滴加1-2滴瑞氏-吉姆萨染液，2min后滴加同剂量的0.01M磷酸氢二钠缓冲液，摇晃玻片使两种液体混合均匀，静置10min，双蒸水冲洗染液。待干燥后，二甲苯染液中透明并用中性树脂封片，镜检。

实施例3腹主动脉采血及卵巢、胰腺组织取材

大鼠给药期满后开始处理，处理前禁食12小时。所有大鼠进行称重，尾静脉采血测空腹血糖。水合氯醛进行腹腔麻醉(6％浓度，0.6-0.7ml/100g体重)。麻醉成功，将大鼠固定于解剖台上，呈仰卧位，腹部剃毛，消毒后，用剪刀沿大鼠的腹主正中线逐层剪开，打开腹腔后，寻找腹主动脉，腹主动脉位于脊柱前面，以及腹腔静脉(比腹主动脉粗，色深黑)旁，用镊子或者止血钳轻轻分离血管周围的脂肪组织和筋膜组织等，清晰暴露血管。暴露后，先用血管钳在远心端进行血管结扎，将采血针针尖朝下，入针角度约30°左右，朝向心端方向刺入，速度要快速，操作要平稳，避免穿破血管以及引起血液迸溅，深度以8mm左右为宜，进针后将采血针另一端插入采血管，采集10ml左右，用另一把止血钳夹腹主动脉的近心端。拔出采血针。采血后，在大鼠下腹部沿子宫输卵管找到卵巢，仔细分离被膜及脂肪，称重，-80℃保存或放入4％多聚甲醛固定。胰腺组织放入4％多聚甲醛固定。

实施例4组织切片制备及形态学分析

制备卵巢和胰腺石蜡切片，用HE染色分析各组卵巢卵泡和胰岛形态学变化。①石蜡包埋：左侧卵巢(胰腺)组织4％多聚甲醛固定2天，自来水冲洗12小时，在50℃恒温箱中，70％、80％、90％梯度乙醇溶液依次脱水30min；95％乙醇溶液20min,重复一遍；100％乙醇溶液20min，重复一遍；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明10min；分别放入低熔点石蜡液30min、高熔点石蜡液40min，进行包埋，将包埋好的组织放入冷冻台降温后放入4℃冰箱保存。②石蜡切片：将制备好的蜡块置于切片机夹物台上，装好切片刀，调整夹物台，使蜡块与切片刀平行，切片参数调至4μm，摇动螺旋进行切片，毛笔挑起蜡带放入42℃水中展平切片，载玻片捞起切片，做好标号，依次放入载玻片架，于37℃温箱中烘片过夜。③染色：将装有石蜡切片的载玻片架依次放入二甲苯Ⅱ10min，二甲苯Ⅰ5min脱蜡，然后依次于100％、95％、90％、80％、70％乙醇各3min行水合，双蒸水冲洗1min，放入快速苏木素染液5min染色，双蒸水冲洗3min，放入1％盐酸乙醇分化20s，双蒸水冲洗30s，70％乙醇脱水2min，碱乙醇反蓝10s，然后依次80％、90％、95％乙醇各脱水2min，伊红染液30s，95％乙醇2min脱色兼脱水，95％、100％乙醇脱水2min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明2min，最后中性树脂封片。

实施例5生殖激素含量测定

实验结束后，收集各组大鼠的血液制备血清，通过放射免疫发检测血清中LH、FSH、T、FINS含量变化。

实施例6卵巢糖酵解代谢产物靶向分析

使用液相色谱对样本进行分离，采集负离子MEM模式数据一套(暂不进行技术性重复)，每隔8个样本加入一个QC样本。主要对样本中糖代谢类产物进行相对定量分析，得到峰面积。所使用的色谱柱为购自Waters公司的UPLC BEHAmide色谱柱(1.7μm，2.1*100mm)。质谱条件：轰击能量：35eV，15张二级图谱每50ms。ESI离子源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Pa，辅助气压：60Pa，气帘气压：30Pa，温度：550℃，喷雾电压：5500V(正离子模式)或-4500V(负离子模式)。最后使用Analyst software软件对糖代谢类物质的MRM原始数据进行提取，得到各个代谢产物的峰面积，并进行T-检验和倍数分析，最后绘制箱状图和层次聚类分析。

效果例

1.NMN干预PCOS大鼠恢复规律动情周期：(图1)

表1治疗后动情周期

2.NMN可降低PCOS大鼠体重。与对照组相比，PCOS大鼠体重明显升高，且有统计学意义；NMN连续腹腔注射28天后，观察大鼠体重差异，发现NMN干预可明显降低PCOS大鼠体重，且差异有统计学意义。(图2)

表2初始体重(g)

Ctrl	PCOS	NMN
			174.8	181.9	177
167.2	166.9	177.6
			154.4	167	174
158.5	175.9	160.6
			150.3	175.5	173.3
151.1	166.5	182.5
			173.1	175	173.9
161.3	172.6	181.3
			180.5	168.7	181.3
165.3	180.4	183.8
			161.2	173.8	167.5
150.9	168.7	184.1
			170.5	171.5	159.8

表3治疗前体重(g)

表4 NMN干预后体重变化(g)

Ctrl	PCOS	NMN
			241.3	407.3	312.6
242.9	410.2	323.1
			244.3	410.4	324.7
244.8	411.1	331.9
			245.8	424.5	334.5
249.2	427.4	337.7

3.NMN可使PCOS大鼠空腹血糖明显降低。与对照组相比，PCOS大鼠空腹血糖明显升高，且有统计学意义；NMN连续腹腔注射28天后，观察大鼠空腹血糖差异，发现NMN干预可明显降低PCOS大鼠空腹血糖，且差异有统计学意义。(图3)

表5空腹血糖(mmol/L)

4.NMN干预后卵巢湿重变化。与对照组相比，PCOS大鼠左卵巢湿重和有卵巢湿重明显升高，且有统计学意义；NMN连续腹腔注射28天后，观察大鼠卵巢湿重差异，发现NMN干预可明显降低PCOS大鼠左卵巢湿重，且差异有统计学意义，而右卵巢湿重无明显降低。(图4A～B)。

表6

5.NMN干预后激素水平变化：

PCOS大鼠血清雄激素水平明显高于对照组，补充NMN可明显降低PCOS大鼠血清雄激素水平，差异有统计学意义；PCOS大鼠LH水平与对照组无明显差异，补充NMN可降低PCOS大鼠血清LH；各组大鼠血清FSH水平无明显差异；PCOS大鼠LH/FSH比值与对照组相比差异无统计学意义，NMN干预后可降低LH/FSH比值，差异有统计学意义；PCOS大鼠血清胰岛素水平以及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)与对照组相比明显升高，NMN干预可明显降低胰岛素水平以及HOMA-IR，差异有统计学意义。(图5A～图5F)

表7

6.NMN干预后卵巢糖代谢相关产物变化：PCOS大鼠卵巢乳酸水平明显降低，NMN干预后乳酸水平升高；而PCOS患者卵巢丙酮酸水平升高，NMN干预后丙酮酸生成量降低；PCOS大鼠卵巢组织ATP含量降低，NMN干预后ATP含量升高，差异均有统计学意义。(图6A～图6C)

表8 Lactate(uM/g)

Ctrl	PCOS	NMN
			12.41789621	8.21559564	6.949412332
11.34631987	4.37578448	8.6385684
			12.98210811	5.867888765	8.650155314
11.06192621	4.561521064	11.92519061
			11.21054273	4.980802433	9.267606241
9.162977498	6.208577238	9.485765888
			9.991130109	6.319016046	8.532426451
—	—	11.40295014
			—	—	7.324992523
—	—	9.789294094
			—	—	6.213912112
—	—	11.29485715

表9 Pyruvate(uM/g)

表10 ATP

Ctrl	PCOS	NMN
			0.016421222	0.012931373	0.011783928
0.016504049	0.010644644	0.015867287
			0.018081831	0.011186863	0.014622411
0.01945776	0.011949634	0.018331625
			0.016074988	0.011690158	0.012712013
0.013182941	0.013014479	0.013249824
			0.013952039	0.009943786	0.013111466
—	—	0.012823739
			—	—	0.01407351
—	—	0.014455759
			—	—	0.011327778
—	—	0.019482652

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.烟酰胺单核苷酸在制备预防、改善和/或治疗囊卵巢综合症的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，烟酰胺单核苷酸能够恢复规律动情周期。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，烟酰胺单核苷酸能够改善卵泡发育情况。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，烟酰胺单核苷酸使得颗粒细胞层增厚。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，烟酰胺单核苷酸使卵巢黄体数量增多，体重、空腹血糖降低。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，烟酰胺单核苷酸能够改善生殖内分泌水平，降低血清雄激素、黄体生成素、胰岛素、胰岛素抵抗指数水平。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，烟酰胺单核苷酸能够改善卵巢组织代谢产物水平，使乳酸、ATP生成量增多。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，烟酰胺单核苷酸能够促进卵泡发育。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，烟酰胺单核苷酸能够改善生育情况。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，烟酰胺单核苷酸改善卵巢能量代谢情况。

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