CN111971563B - 用于优化硼中子俘获疗法的效应的癌病变组织评估 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用含有BSH相关药物的硼制剂和含有BPA的硼制剂，用于预测BNCT的响应的方法、试剂盒等，所述方法和试剂盒的特征在于检查样品的癌细胞中的CD44、翻译相关因子和/或LAT1表达。当样品的癌细胞中的CD44或翻译相关因子表达高时，可以预测使用含有BSH相关药物的硼制剂的BNCT很可能是响应的。当样品的癌细胞中的LAT1表达高时，可以预测使用含有BPA的硼制剂的BNCT很可能是响应的。

Description

用于优化硼中子俘获疗法的效应的癌病变组织评估
技术领域
本发明涉及用于预测硼中子俘获疗法（BNCT）的效果的方法及其试剂盒。
背景技术
BNCT是通过以下治疗癌症的方法：向癌症患者施用含有硼的试剂（硼试剂），将硼原子选择性地掺入癌细胞内，并且向受影响的区域照射中子。在这种方法中，硼试剂中的硼原子俘获中子，并且分裂成α粒子（氦原子核）和锂原子核。癌细胞被α粒子的能量选择性地破坏。目前，对硼苯基丙氨酸（BPA）主要在BNCT中用作硼试剂。然而，存在许多癌，其未被发现对于使用常规BPA的BNCT产生足够的结果，或者迄今为止未被视为对于BNCT的良好适应症。
为了预测BPA的给药效果，已通过PET成像评估了F-BPA的组织聚集，利用了氟的放射性同位素与之化学结合的F-BPA以与BPA相同的方式从氨基酸转运蛋白例如LAT1吸收（参见例如，非专利文献1至5）。然而，由于可用于PET成像的设施有限以及试剂的价格高昂，预测效果并非易事。另外，还没有发现评估除BPA外的硼试剂摄取到细胞内的有效手段。
引用列表
非专利文献
非专利文献1：EJNMMI Res. 2014 Dec 20；4（1）: 70. doi: 10.1186/s13550-014-0070-2. eCollection 2014 Dec.
非专利文献2：J Nucl Med. 2004 Feb；45（2）:302-8.
非专利文献3：J Nucl Med. 2005 Nov；46（11）:1858-65.
非专利文献4：Ann Nucl Med. 2016 Dec；30（10）:749-755. Epub 2016 Sep 1.
非专利文献5：Appl Radiat Isot. 2009 Jul；67（7-8 Suppl）:S348-50. doi:10.1016/j.apradiso.2009.03.061. Epub 2009 Mar 27.
发明概述
待解决的问题
已需要对于癌执行有效的BNCT，所述癌未被发现通过使用常规BPA的BNCT产生足够的结果，或者迄今为止未被视为对于BNCT的良好适应症。为此，需要容易地预测不同于BPA的硼试剂的效果的方法。还需要对于每种癌/病例选择最佳的硼制剂。
解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明人进行了深入研究，并且已发现某些硼试剂，包含含有碱性氨基酸残基的肽和巯基十一氢十硼酸酯（BSH）的复合物、以及含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，通过经由CD44的途径进入癌细胞内，并且BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物靶向细胞中的翻译系统，导致本发明的完成。
即，本发明提供了下述内容。
（1）一种方法，其用于预测将包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH引入癌细胞内的效率，该方法包括检查样品中的癌细胞中的CD44表达。
（2）根据（1）的方法，其中所述含有碱性氨基酸残基的肽含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基，并且长度为2至20个氨基酸。
（3）根据（1）或（2）的方法，其中通过免疫染色检查CD44的表达。
（4）一种试剂盒，其用于预测将包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH引入癌细胞内的效率，该试剂盒包括用于检查CD44表达的手段。
（5）一种用于预测癌细胞对硼中子俘获疗法（BNCT）的敏感性的方法，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，该方法包括检查样品中的癌细胞中的CD44表达。
（6）根据（5）的方法，其中所述含有碱性氨基酸残基的肽含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基，并且长度为2至20个氨基酸。
（7）根据（5）或（6）的方法，其中通过免疫染色检查CD44的表达。
（8）一种用于测定癌细胞对BNCT的敏感性的试剂盒，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，该试剂盒包括用于检查抗CD44抗体表达的手段。
（9）一种用于预测BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物在癌细胞中的停留时间的方法，该方法包括检查样品中的癌细胞中的翻译相关因子表达。
（10）根据（9）的方法，其中所述翻译相关因子是选自eIF4A、eIF4E、eIF4G、eEF2、eRF3、pS6和PABPc1的一种或多种。
（11）根据（9）或（10）的方法，其中所述BSH衍生物是含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH。
（12）根据（11）的方法，其中所述含有碱性氨基酸残基的肽含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基，并且长度为2至20个氨基酸。
（13）根据（9）至（12）中任一项的方法，其中通过免疫染色检查翻译相关因子的表达。
（14）一种用于预测BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物在癌细胞中的停留时间的试剂盒，该试剂盒包括用于检查翻译相关因子表达的手段。
（15）一种用于预测癌细胞对BNCT的敏感性的方法，所述BNCT使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物，该方法包括检查样品中的癌细胞中的翻译相关因子表达。
（16）根据（14）的方法，其中所述翻译相关因子是选自eIF4A、eIF4E、eIF4G、eEF2、eRF3、pS6和PABPc1的一种或多种。
（17）根据（15）或（16）的方法，其中所述BSH衍生物是含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH。
（18）根据（17）的方法，其中所述含有碱性氨基酸残基的肽含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基，并且长度为2至20个氨基酸。
（19）根据（15）至（18）中任一项的方法，其中通过免疫染色检查翻译相关因子的表达。
（20）一种用于确定癌细胞对BNCT的敏感性的试剂盒，所述BNCT使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物，该试剂盒包括用于检查翻译相关因子表达的手段。
（21）一种用于预测BNCT有效的可能性的方法，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，该方法包括：检查样品中的癌细胞中的CD44表达；并且预测CD44的表达越高，使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH的BNCT有效的可能性越高。
（22）一种用于预测BNCT有效的可能性的试剂盒，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，该试剂盒包括用于检查CD44表达的手段。
（23）一种用于预测BNCT有效的可能性的方法，所述BNCT使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物，该方法包括：检查样品中的癌细胞中的翻译相关因子表达；并且预测翻译相关因子的表达越高，使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物的BNCT有效的可能性越高。
（24）一种用于预测BNCT有效的可能性的试剂盒，所述BNCT使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物，该试剂盒包括用于检查翻译相关因子表达的手段。
（25）一种用于选择用于BNCT的硼制剂的方法，其包括以下步骤：
（a）检查样品中的癌细胞中的CD44表达和LAT1表达；然后
（b）当CD44的表达高于LAT1的表达时，选择含有以下的硼制剂：包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，并且当LAT1的表达高于CD44的表达时，选择含有BPA的硼制剂。
（26）一种用于选择用于BNCT的硼制剂的试剂盒，该试剂盒包括用于检查CD44表达的手段和用于检查LAT1表达的手段。
（27）一种用于选择用于BNCT的硼制剂的方法，其包括以下步骤：
（a）检查样品中的癌细胞中的翻译相关因子表达和LAT1表达；然后
（b）当翻译相关因子的表达高于LAT1的表达时，选择含有BSH、包含BSH的复合物和/或BSH衍生物的硼制剂，并且当LAT1的表达高于翻译相关因子的表达时，选择含有BPA的硼制剂。
（28）一种用于选择用于BNCT的硼制剂的试剂盒，该试剂盒包括用于检查翻译相关因子表达的手段和用于检查LAT1表达的手段。
发明效果
根据本发明，提供了用于预测当包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH用作硼试剂时的BNCT的效果的方法和试剂盒。结果，通过对于癌使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、以及含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，能够扩展BNCT适应症病例并且改善BNCT响应率，所述癌未被发现对于使用常规BPA的BNCT产生足够的结果，或者迄今为止未被视为对于BNCT的良好适应症。另外，本发明的方法和试剂盒无需专门仪器或程序，并且可以容易地用于普通医院和实验室中。此外，根据本发明，提供了用于对于每种癌/病例选择最佳硼制剂的方法和试剂盒。即，通过检查各种硼制剂的初始靶蛋白的表达模式，可以确定用于每种癌/病例的最佳硼制剂组合和剂量，并且可以改善BNCT响应率。因此，根据本发明，可以扩展BNCT的潜力，可以降低发现病例方面的失败，并且可以实现BNCT的个性化医学。
附图简述
[图1]图1是显示了BSH-3R、BSH-11R和BSH/A6K复合物摄取到表达CD44的癌细胞和CD44敲减的癌细胞内的图解。shControl代表其中CD44基因未被敲减的恶性脑肿瘤细胞系（对照），而shCD44#1和shCD44#2代表其中CD44基因被敲减的恶性脑肿瘤细胞亚系。上部分是确认CD44敲减的结果。中部分是用抗BSH抗体的对照和CD44敲减细胞亚系的荧光免疫染色图像。下部分是当使用BSH-11R时，对照和CD44敲减细胞亚系的抗BSH抗体染色强度的细分（相对数目）。
[图2]图2是显示了BSH-11R靶向癌细胞中的翻译系统的免疫沉淀模式。
[图3]图3是显示了BSH-11R靶向癌细胞中的翻译系统的免疫沉淀模式。
[图4]图4是显示了当癌细胞用BSH-11R预处理并经受BNCT时，翻译系统的破坏的曲线图。实线指示18S核糖体RNA的相对量的对数，虚线指示CD44 mRNA的相对量的对数，而点线指示TAZ mRNA的相对量的对数。
[图5]图5显示了检查各种癌样本中的LAT1和CD44表达的结果（该图中的上部分）。对于每种类型的恶性脑肿瘤检查了LAT1和CD44的表达（该图中的下部分）。在图5中，表达强度越高，红色越强，而表达强度越低，绿色越强。当表达强度中等时，它以黑色指示。在该图中，一条线显示了一个样本中的表达。
[图6]图6显示了对于每种类型的乳腺癌检查LAT1和CD44表达的结果。在图6中，表达强度越高，红色越强，而表达强度越低，绿色越强。当表达强度中等时，它以黑色指示。在该图中，一条线显示了一个样本中的表达。
实施方案的描述
在第一个方面，本发明提供了用于预测将包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH引入癌细胞内的效率的方法，该方法包括检查样品中的癌细胞中的CD44表达。
CD44是细胞膜蛋白，其涉及细胞粘附、细胞运动，以及癌细胞的增殖、浸润和转移等等。本发明人首次发现CD44是用于将包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、以及含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH引入细胞内的靶。即，已发现包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、以及含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，容易被引入具有CD44的高表达的癌细胞内。因此，在上述方法中，可以预测癌细胞中的CD44表达越高，将包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH引入癌细胞内的效率越高。
样品可以是任何样品，只要它含有癌细胞。例如，样品可以是病理样本或活组织检查样本。可替代地，样品可以是体液样品，例如血液。
癌症可以是任何类型的癌症。实例包括但不限于上皮癌，包括乳腺癌、胰腺癌和口腔癌，脑肿瘤，以及难治性癌症，例如骨和软组织肿瘤。
在这个方面的方法中，检查了癌细胞中的CD44表达量。如本文使用的，CD44意指CD44基因和CD44蛋白中的任一种或两者。CD44的表达可以通过已知方法进行检查。例如，可以通过经由用抗CD44抗体的免疫染色来检测癌细胞中的CD44蛋白，或者通过经由RNA印迹分析或实时PCR来检查癌细胞中的CD44基因表达，来检查CD44的表达。用于检查癌细胞中的CD44表达的手段和方法并不限于此。
用于检查CD44表达的优选方法的实例包括用抗CD44抗体的免疫染色。抗CD44抗体可以通过已知方法获得，并且也是商购可得的。抗CD44抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并且优选单克隆抗体。免疫染色是已知的方法。对于免疫染色，优选使用可检测标记例如荧光染料、荧光蛋白或放射性同位素与之附着的抗CD44抗体。第二抗体也可以用于检测抗CD44抗体。抗CD44抗体可以针对CD44蛋白或其一部分，或者可以针对编码CD44蛋白的基因或其一部分。
RNA印迹分析或实时PCR也优选用于检查CD44的表达。这些方法是本领域技术人员已知的。
CD44表达是否很高的确定也可以通过已知方法执行。例如，可以使用来自正常受试者的细胞、或来自患有良性疾病如良性肿瘤的患者的细胞中的CD44表达作为基础，来确定CD44的表达是否很高。还可以使用管家基因，如3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）或β-肌动蛋白或其产物的表达量作为基础，来确定CD44的表达是否很高。
通过将含有碱性氨基酸残基的肽与BSH在水溶液中混合且缀合，可以获得包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物。任选地，可以使用例如具有合适孔径的挤出机来调整复合物的大小。用于产生包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物的方法可以是与国际专利申请公开WO 2018/097335 A1中所述的那种相似的方法，所述国际专利申请公开引入本文作为参考。
可以通过已知方法获得含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH。例如，含有碱性氨基酸残基的肽可以经由BSH的SH基团与BSH共价连接。
含有碱性氨基酸残基的肽含有至少一个碱性氨基酸残基。构成包含碱性氨基酸残基的肽的氨基酸残基可以是天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基，并且可以是L型或D型。碱性氨基酸残基是已知的，并且其典型实例包括精氨酸残基、赖氨酸残基和组氨酸残基。碱性氨基酸残基的其它实例包括但不限于鸟氨酸残基和瓜氨酸残基。优选的碱性氨基酸残基是精氨酸残基和赖氨酸残基。因此，本发明中优选的含有碱性氨基酸残基的肽是含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基的肽。含有碱性氨基酸残基的肽的长度并未特别限制，但一般为2至20个氨基酸，优选3至16个氨基酸，更优选4至14个氨基酸，还更优选6至13个氨基酸。
与BSH形成复合物的含有碱性氨基酸残基的肽优选为含有碱性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基的肽。碱性氨基酸残基如上所述。疏水性氨基酸残基也是已知的，并且其实例包括但不限于甘氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、脯氨酸残基、苯丙氨酸残基、色氨酸残基、酪氨酸残基和半胱氨酸残基。
与BSH形成复合物的更优选的含有碱性氨基酸残基的肽是含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基的肽。与BSH形成复合物的含有碱性氨基酸残基的肽的实例包括但不限于以单字母氨基酸符号表示的AAAAAK、AAAAAAK、AAAAAAAK、AAAAAKK、AAAAAAKK、AAAAAAAKK、AAAAAR、AAAAAAR、AAAAAAAR、AAAAARR、AAAAAARR、AAAAAAARR。与BSH形成复合物的含有碱性氨基酸残基的肽的更优选实例包括但不限于AAAAAAK和AAAAAAR。
与BSH共价连接的优选的含有碱性氨基酸残基的肽是含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基的肽。优选与BSH共价连接的含有碱性氨基酸残基的肽的等电点高于7。可替代地，构成与BSH共价连接的含有碱性氨基酸残基的肽的50%或更多、更优选60%或更多、还优选70%或更多，并且还更优选80%或更多的氨基酸残基是碱性氨基酸残基。含有此类碱性氨基酸残基的肽的优选实例包括但不限于精氨酸的3至16聚体和赖氨酸的3至16聚体。与BSH共价连接的含有碱性氨基酸残基的肽的更优选实例包括但不限于精氨酸的4至14聚体或赖氨酸的4至14聚体，还优选精氨酸的6至13聚体或赖氨酸的6至13聚体。
在第二个方面，本发明提供了试剂盒，其用于预测将包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH引入癌细胞内的效率，该试剂盒包括用于检查CD44表达的手段。试剂盒可以用于执行第一个方面的方法。用于检查CD44表达的手段是本领域技术人员已知的，并且并无特别限制，但手段的优选实例包括用抗CD44抗体的免疫染色，以及使用RNA印迹分析或实时PCR的CD44基因的表达分析。试剂盒因此可以包括用于用抗CD44抗体执行免疫染色的试剂或仪器。可替代地，试剂盒可以包括关于用于检查CD44表达的RNA印迹分析或实时PCR的试剂或仪器。试剂盒通常包括说明书。
在第三个方面，本发明提供了用于预测癌细胞对硼中子俘获疗法（BNCT）的敏感性的方法，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，该方法包括检查样品中的癌细胞中的CD44表达。
由于包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、以及含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，容易被引入具有CD44的高表达的癌细胞内，因此具有CD44的高表达的癌细胞对BNCT是高度敏感的，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物和/或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH。因此，在上述方法中，可以预测癌细胞中的CD44表达越高，癌细胞对BNCT的敏感性越高，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH。
在第四个方面，本发明提供了用于测定癌细胞对BNCT的敏感性的试剂盒，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，该试剂盒包括用于检查抗CD44抗体表达的手段。试剂盒可以用于执行第三个方面的方法。试剂盒通常包括说明书。
根据本发明的第三个方面的方法和第四个方面的试剂盒，不仅能够了解患者的癌症是否是适合于BNCT的病例，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物和/或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，还能够优化BNCT中的适当硼制剂的类型（例如，包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物和/或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH是否是有效的，BPA是否是有效的，或其组合是否是有效的），并且优化硼制剂的剂量或配混量。
关于本发明的第三个方面的方法和第四个方面的试剂盒的其它细节，应用关于本发明的第一个方面的方法和第二个方面的试剂盒的描述。
在第五个方面，本发明提供了用于预测BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物在癌细胞中的停留时间的方法，该方法包括检查样品中的癌细胞中的翻译相关因子表达。
包含BSH的复合物是其中BSH和另一种物质以不同于共价键的方式形成复合物的复合物，所述方式例如离子键、范德华力或疏水键。包含BSH的复合物的实例包括但不限于如上所述的包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物。BSH衍生物是其中另一种分子经由BSH的任何原子与BSH共价连接的衍生物。BSH衍生物的实例包括但不限于其中如上所述的含有碱性氨基酸残基的肽与BSH共价连接的衍生物。包含BSH的复合物的实例包括但不限于包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物。包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物的实例包括但不限于BSH/A6K。BSH衍生物的实例包括但不限于含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH。含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH的实例包括但不限于BSH-3R和BSH-11R。含有碱性氨基酸残基的肽的细节如上所述（关于BSH/A6K、BSH-3R、BSH-11R，参见实施例1）。
本发明人已首次发现，含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH靶向细胞中的翻译相关因子。作为细胞内靶的翻译相关因子的高表达意味着细胞中的翻译相关因子是丰富的。因此，在具有翻译相关因子的高表达的癌细胞中，含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH的停留时间很长。因此可以预测癌细胞中的翻译相关因子表达越高，BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物在癌细胞中的停留时间越长。
在这个方面的方法中，检查了癌细胞中的翻译相关因子的表达量。翻译相关因子是涉及细胞中的遗传信息翻译的因子，并且它们是已知的。如本文使用的，翻译相关因子指编码翻译相关因子的基因及其产物中的任一种或两者。可以检查一种或者两种或更多种翻译相关因子的表达。翻译相关因子的实例包括但不限于翻译起始因子例如eIF4A（包括eIF4A1）、eIF4E和eIF4G，翻译延伸因子例如eEF2，翻译终止因子例如eRF3，核糖体蛋白例如pS6，以及mRNA结合因子例如PABPc1。在这个方面的方法中，可以检查一种翻译相关因子的表达，但优选可以检查两种或更多种翻译相关因子的表达。
在翻译相关因子中，eIF4A（包括eIF4A1）、eIF4E、eIF4G、eEF2、eRF3、pS6等等通过与BSH共价连接的含有碱性氨基酸残基的肽靶向。PABPc1通过任何类型的BSH制剂（包括简单的BSH）靶向。
翻译相关因子的表达可以通过已知方法进行检查。例如，可以通过经由用针对翻译相关因子的抗体的免疫染色来检测癌细胞中的翻译相关因子，或者通过经由RNA印迹分析或实时PCR来检查癌细胞中的翻译相关因子基因的表达，来检查翻译相关因子的表达。用于检查癌细胞中的翻译相关因子表达的手段和方法并不限于此。
优选地，通过用针对翻译相关因子的抗体的免疫染色来检查翻译相关因子的表达。针对翻译相关因子的抗体可以通过已知方法获得，并且也是商购可得的。针对翻译相关因子的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并且优选单克隆抗体。免疫染色是已知的方法。对于免疫染色，优选使用可检测标记例如荧光染料、荧光蛋白或放射性同位素与之附着的针对翻译相关因子的抗体。第二抗体也可以用于检测针对翻译相关因子的抗体。针对翻译相关因子的抗体可以是针对作为蛋白质的翻译相关因子或其一部分的抗体，或者可以是针对编码作为蛋白质的翻译相关因子的基因或其一部分的抗体。
还优选通过RNA印迹分析或实时PCR来检查翻译相关因子的表达。这些方法是本领域技术人员已知的。
翻译相关因子的表达是否很高的确定也可以通过已知方法执行。例如，可以使用来自正常受试者的细胞、或来自患有良性疾病如良性肿瘤的患者的细胞中的翻译相关因子表达作为基础，来确定翻译相关因子的表达是否很高。可替代地，还可以使用管家基因，如3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）或β-肌动蛋白或其产物的表达量作为基础，来确定翻译相关因子的表达是否很高。
在第六个方面，本发明提供了用于预测BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物在癌细胞中的停留时间的试剂盒，该试剂盒包括用于检查翻译相关因子表达的手段。试剂盒可以用于执行第五个方面的方法。用于检查翻译相关因子表达的手段是本领域技术人员已知的，并且并无特别限制，但手段的优选实例包括用针对翻译相关因子的抗体的免疫染色，以及使用RNA印迹分析或实时PCR的翻译相关因子基因的表达分析。试剂盒因此可以包括针对翻译相关因子的抗体。试剂盒可以包括用于用针对翻译相关因子的抗体执行免疫染色的试剂或仪器。试剂盒可以包括关于用于检查翻译相关因子表达的RNA印迹分析或实时PCR的试剂或仪器。试剂盒通常包括说明书。
关于第五个方面的方法和第六个方面的试剂盒的其它细节，应用根据本发明的第一个方面至第四个方面的关于本发明的描述。
在第七个方面，本发明提供了用于预测癌细胞对BNCT的敏感性的方法，所述BNCT使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物，该方法包括检查样品中的癌细胞中的翻译相关因子表达。
当含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH在癌细胞中的停留时间很长时，其细胞内浓度维持很高，因此增加了癌细胞对BNCT的敏感性。因此，可以预测癌细胞中的翻译相关因子表达越高，癌细胞对在癌细胞中使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物的BNCT的敏感性越高。
在第八个方面，本发明提供了用于确定癌症对BNCT的敏感性的试剂盒，所述BNCT使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物，该试剂盒包括用于检查翻译相关因子表达的手段。试剂盒可以用于执行第七个方面的方法。试剂盒通常包括说明书。
根据本发明的第七个方面的方法和第八个方面的试剂盒，不仅能够了解患者的癌症是否是适合于BNCT的病例，所述BNCT使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物，还能够优化BNCT中的适当硼制剂的类型（例如，BSH、包含BSH的复合物和/或BSH衍生物是否是有效的，BPA是否是有效的，或其组合是否是有效的），并且优化硼制剂的剂量或混合量。
关于本发明的第七个方面的方法和第八个方面的试剂盒的其它细节，应用关于本发明的第五个方面的方法和第六个方面的试剂盒的描述。
如上文提到的，CD44的表达越高，包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH的引入效率越高。然后，CD44的表达越高，对使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH的BNCT的敏感性越高。因此，通过检查癌细胞中的CD44表达，可以预测CD44的表达越高，使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH的BNCT有效的可能性越高。因此，在第九个方面，本发明提供了用于预测BNCT有效的可能性的方法，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，该方法包括：检查样品中的癌细胞中的CD44表达；并且预测CD44的表达越高，使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH的BNCT有效的可能性越高。
此外，在第十个方面，本发明提供了用于预测BNCT有效的可能性的试剂盒，所述BNCT使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，该试剂盒包括用于检查CD44表达的手段。试剂盒可以用于执行第九个方面的方法。试剂盒通常包括说明书。
如上文提到的，癌细胞中的翻译相关因子表达越高，BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物的停留时间越长。然后，癌细胞中的翻译相关因子表达越高，对使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物的BNCT的敏感性越高。因此，通过检查癌细胞中的翻译相关因子表达，可以预测翻译相关因子的表达越高，使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物的BNCT的成功可能性越高。因此，在第十一个方面，本发明提供了用于预测BNCT有效的可能性的方法，所述BNCT使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物，该方法包括：检查样品中的癌细胞中的翻译相关因子表达；并且预测翻译相关因子的表达越高，使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物的BNCT有效的可能性越高。
此外，在第十二个方面，本发明提供了用于预测BNCT有效的可能性的试剂盒，所述BNCT使用BSH、包含BSH的复合物或BSH衍生物，该试剂盒包括用于检查翻译相关因子表达的手段。试剂盒可以用于执行第十一个方面的方法。试剂盒通常包括说明书。
对于根据本发明的第九个方面至第十二个方面的方法和试剂盒，应用关于根据第一个方面至第八个方面的方法和试剂盒的描述。
由于BPA通过氨基酸转运蛋白（如LAT1、LAT2、ATB0,+）吸收到细胞内，随着癌细胞中这些氨基酸转运蛋白的表达越高，BPA的摄取越高。因此，对于癌细胞中的BPA，通过检查氨基酸转运蛋白（如LAT1、LAT2或ATB0,+）的表达，可以预测氨基酸转运蛋白的表达越高，使用BPA的BNCT有效的可能性越高。
综上所述，可以如下表述：癌细胞中的CD44表达越高，选择含有以下的硼制剂越合适：包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH。还可以如下表述：癌细胞中的氨基酸转运蛋白如LAT1、LAT2、ATB0,+（优选LAT1）的表达越高，选择含有BPA的硼制剂越合适。因此，在第十三个方面，本发明提供了用于选择用于硼中子俘获疗法（BNCT）的硼制剂的方法，其包括以下步骤：
（a）检查样品中的癌细胞中的CD44表达和LAT1表达；然后
（b）当CD44的表达高于LAT1的表达时，选择含有以下的硼制剂：包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH，并且当LAT1的表达高于CD44的表达时，选择含有BPA的硼制剂。
此外，在第十四个方面，本发明提供了用于选择用于BNCT的硼制剂的试剂盒，该试剂盒包括用于检查CD44表达的手段和用于检查LAT1表达的手段。试剂盒可以用于执行第十三个方面的方法。试剂盒通常包括说明书。
还可以如下表述：癌细胞中的翻译相关因子表达越高，选择含有BSH、包含BSH的复合物和/或BSH衍生物的硼制剂越合适。此外，癌细胞中的氨基酸转运蛋白如LAT1、LAT2、ATB0,+（优选LAT1）表达越高，选择含有BPA的硼制剂越合适。因此，在第十五个方面，本发明提供了用于选择用于硼中子俘获疗法（BNCT）的硼制剂的方法，其包括以下步骤：
（a）检查样品中的癌细胞中的翻译相关因子表达和LAT1表达；然后
（b）当翻译相关因子的表达高于LAT1的表达时，选择含有BSH、包含BSH的复合物和/或BSH衍生物的硼制剂，并且当LAT1的表达高于翻译相关因子的表达时，选择含有BPA的硼制剂。
此外，在第十六个方面，本发明提供了用于选择用于BNCT的硼制剂的试剂盒，该试剂盒包括用于检查翻译相关因子表达的手段和用于检查LAT1表达的手段。试剂盒可以用于执行第十五个方面的方法。试剂盒通常包括说明书。
在根据第十三个方面至第十六个方面的本发明的方法和试剂盒中，检查了癌细胞中的CD44、翻译相关因子和LAT的表达量。如上所述检查CD44和翻译相关因子的表达量。如本文使用的，LAT1意指LAT1基因和LAT1蛋白中的任一种或两者。LAT1的表达可以通过已知方法进行检查。例如，可以通过经由用抗LAT1抗体的免疫染色来检测癌细胞中的LAT1蛋白，或者通过经由RNA印迹分析或实时PCR来检查癌细胞中的LAT1基因表达，来检查LAT1的表达。用于检查癌细胞中的LAT1表达的手段和方法并不限于此。
用于检查LAT1表达的优选方法的实例包括用抗LAT1抗体的免疫染色。抗LAT1抗体可以通过已知方法获得，并且也是商购可得的。抗LAT1抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并且优选单克隆抗体。免疫染色是已知的方法。对于免疫染色，优选使用可检测标记例如荧光染料、荧光蛋白或放射性同位素与之附着的抗LAT1抗体。第二抗体也可以用于检测抗LAT1抗体。抗LAT1抗体可以是针对LAT1蛋白或其一部分的抗体，或者可以是针对编码LAT1蛋白的基因或其一部分的抗体。
LAT1表达是否很高的确定也可以通过已知方法执行。例如，可以使用来自正常受试者的细胞、或来自患有良性疾病如良性肿瘤的患者的细胞中的LAT1表达作为基础，来确定LAT1的表达是否很高。可替代地，可以使用管家基因，如3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）或β-肌动蛋白或其产物的表达量作为基础，来确定LAT1的表达是否很高。
除了LAT1的表达之外或代替LAT1的表达，可以检查对于酪氨酸或苯丙氨酸特异性的氨基酸转运蛋白，例如LAT2和/或ATB0,+的表达。
用于比较CD44表达与LAT1表达的手段和方法是本领域技术人员已知的。其一个实例是使用针对这些蛋白质的抗体，其中彼此可鉴定的标记附着至所述抗体。例如，针对CD44的抗体可以用绿色荧光蛋白进行标记，而针对LAT1的抗体可以用红色荧光蛋白进行标记，并且两者的表达可以在视觉上进行比较。其另一个实例是例如使用统计方法，比较癌细胞和正常细胞中的CD44表达之间的差异与癌细胞和正常细胞中的LAT1表达之间的差异。可以以相同的方式执行翻译相关因子表达与LAT1表达的比较。
在根据第十三个方面至第十六个方面的方法和试剂盒中，当CD44的表达高于LAT1的表达时，选择含有以下的硼制剂：包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH。当翻译相关因子的表达高于LAT1的表达时，选择包括BSH、包含BSH的复合物和/或BSH衍生物的硼制剂。当LAT1的表达高于CD44的表达时，或当LAT1的表达高于翻译相关因子的表达时，选择含有BPA的硼制剂。当使用通过这些方面的方法和试剂盒选择的硼制剂执行BNCT时，所选择的制剂可以单独使用，或者可以组合使用或与另一种硼制剂一起配制。例如，当选择BPA时，可以单独使用BPA，或者可以使用BPA与包含BSH和BPA的复合物的组合。硼制剂的剂量、其与另一种硼制剂的比率等等可以由医生容易地确定。
关于根据本发明的第十三个方面至第十六个方面的方法和试剂盒的其它细节，适用关于根据第一个方面至第十二个方面的方法和试剂盒的描述。
除非另有说明，否则本文使用的术语的含义与例如医学、药学、生物学领域中通常理解的相同。
在下文中，通过实施例更详细地且具体地描述本发明，但实施例不应解释为本发明范围的任何限制。
实施例
实施例1
实施例1. 含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH、以及包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物摄取到表达CD44的癌细胞和CD44敲减的癌细胞内
为了检查由三精氨酸组成的肽与之共价连接的BSH（称为BSH-3R）、由十一精氨酸组成的肽与之共价连接的BSH（称为BSH-11R）、以及包含Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Lys和BSH的复合物（称为BSH/A6K）的细胞内摄取与CD44表达之间的关系，首先将CD44-shRNA慢病毒引入高度表达CD44的恶性脑肿瘤细胞系U87MG内，以产生CD44敲减的细胞亚系。通过用抗CD44抗体（由Cell Signaling Technology，Inc.制造）的蛋白质印迹法确认了敲减效率。然后，为了验证BSH-11R和BSH/A6K的引入效率与CD44的表达水平的相关性，通过用针对BSH的抗体执行荧光免疫染色，来检查BSH-11R和BSH/A6K进入通过上述方法产生的CD44敲减的细胞亚系内的细胞内摄取。所使用的抗体是小鼠单克隆抗BSH抗体（由Dr. Kirihata，OsakaPrefecture University提供）。BSH-3R和BSH-11R通过化学合成获得。BSH/A6K通过国际专利申请公开WO 2018/097335 A1中所述的方法获得，所述国际专利申请公开引入本文作为参考。
结果显示于图1中。如根据图1的上部分中所示的蛋白质印迹可见的，CD44在产生的两个细胞亚系中明确地被敲减。如图1的中部分中所示，确认了CD44的表达越低，BSH-3R、BSH-11R和BSH/A6K的细胞内摄取的降低越大（图1的下部分是当使用BSH-11R时的结果的条形图）。换言之，确认了CD44的表达越高，BSH-3R、BSH-11R和BSH/A6K的细胞内摄取的增加越大。
实施例2
实施例2. 通过含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH靶向翻译相关因子
向恶性脑肿瘤细胞系U251的细胞破碎溶液中，加入简单的BSH（称为BSH）（50 μM）或BSH-11R（50 μM），并且通过用抗BSH抗体（10 μg）的免疫沉淀，探究与BSH和BSH-11R结合的蛋白质。
结果显示于图2中。由于与BSH相比，更多的翻译相关因子与BSH-11R共沉淀，因此发现BSH-11R的肽部分（11R）对于与翻译相关因子的结合是必需的。还发现根据翻译相关因子，存在mRNA不依赖性结合模式和mRNA依赖性结合模式。
为了检查BSH-11R与翻译相关因子的结合是直接结合还是间接结合，制备了恶性脑肿瘤细胞系U251的亚系，其经历了用shRNA慢病毒的翻译相关因子敲减。向细胞破碎溶液中，加入BSH-11R（50 μM），并且用抗BSH抗体（10 μg）分析与BSH-11R结合的翻译相关因子。
结果显示于图3中。发现BSH-11R与eIF4A和eRF3直接结合（无需RNA），而eIF4E和eIF4G经由eIF4A与BSH-11R间接结合。如与图2中的结果组合的，还得出结论：PABPc1以RNA依赖性方式与BSH结合。
实施例3
实施例3. 使用含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH的BNCT
根据BSH-11R与翻译相关因子的结合，认为翻译机制可以被选择性地靶向。因此，决定执行使用BSH-11R的BNCT。用100 μM BSH-11R预处理恶性脑肿瘤细胞系U87ΔEGFR（在照射前24小时）。细胞在照射当天用胰蛋白酶进行剥离，以1 x 106个细胞/mL的量分配到管内，并且使用加速器（在National Institute of Radiological Sciences处），用中子射线进行照射。照射时间为0、15、45和60分钟，并且每一个基本Gy（戈瑞）估计和计算为小于或等于1 Gy。
回收照射后的细胞，执行RNA提取，然后使用等量的RNA（1000 ng）作为模板产生cDNA，并且执行定量PCR。结果，发现如图4中所示，取决于用中子射线的照射时间，18S核糖体RNA和mRNA的比例显著减少。在作为对照实验执行的用X射线的高剂量照射（10 Gy）中，并未观察到此类变化。由此可以确定使用BSH-11R的BNCT能够极其有效地破坏翻译机制。
实施例4
实施例4. 各种癌中的LAT1和CD44表达水平的比较
图5显示了通过免疫染色法，检查关于黑色素瘤、头颈癌、胰腺癌、恶性脑肿瘤和乳腺癌样本（在TCGA数据库中登记的临床样本）的CD44和LAT1表达强度的结果。
在黑色素瘤和头颈癌中，存在其中CD44和LAT1两者均高度表达的许多病例。根据这些结果，认为当选择包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH或BPA中的任何一种时，用于黑色素瘤和头颈癌的BNCT在许多病例中响应。还认为当选择包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH与BPA的组合时，用于黑色素瘤和头颈癌的BNCT在许多病例中是有效的。
在胰腺癌中，存在其中CD44高度或中等表达的许多病例。对于LAT1，中等表达的病例多于高度表达的病例。根据这些结果，认为当选择包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH时，用于胰腺癌的BNCT在许多病例中响应，并且当选择BPA时，它在许多病例中响应至一定程度。还认为在包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物或含有碱性氨基酸残基的肽与BPA的组合使用中，当包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物或含有碱性氨基酸残基的肽的比率很高时，用于胰腺癌的BNCT在许多病例中是有效的。
在乳腺癌中，存在CD44和LAT1两者均中等表达的许多病例。根据这些结果，认为当选择包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH或BPA中的任何一种时，用于乳腺癌的BNCT预计在许多病例中响应至一定程度。还认为当使用包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH与BPA的组合时，用于乳腺癌的BNCT预计在许多病例中响应至一定程度。
在恶性脑肿瘤中，对于CD44，存在许多具有中等表达的病例，以及相当多的具有低表达的病例（存在很少具有高表达的病例）。对于LAT1，存在许多具有中等表达的病例。根据这些结果，认为当选择BPA时，用于恶性脑肿瘤的BNCT预计在许多病例中在一定程度上是有效的。还认为与当选择BPA时相比，当选择包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH时，用于恶性脑肿瘤的BNCT预计在更少的病例中响应。此外，认为在包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物或含有碱性氨基酸残基的肽与BPA的组合使用中，当所含的BPA比率很高时，用于恶性脑肿瘤的BNCT在许多病例中是有效的。
恶性脑肿瘤按类型进行研究。结果显示于图5的下部栏中。在间充质脑肿瘤和经典脑肿瘤中，存在其中CD44比LAT1更高度表达的许多病例（由该图中的箭头指示）。因此，认为当选择包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物、或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH时，用于它们的BNCT在许多病例中是有效的。还认为在包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物或含有碱性氨基酸残基的肽与BPA的组合使用中，当包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物或含有碱性氨基酸残基的肽的比率很高时，用于它们的BNCT在许多病例中是有效的。在神经脑肿瘤中，存在其中CD44和LAT1两者均中等表达的许多病例。在前神经脑肿瘤中，存在其中LAT1比CD44更高度表达的许多病例（由该图中的箭头指示），因此，认为当选择BPA时，用于它们的BNCT在许多病例中是有效的。还认为在包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH与BPA的组合使用中，当所含的BPA比率很高时，用于它们的BNCT在许多病例中是有效的。
乳腺癌也按类型进行研究。结果显示于图6中。在其中HER2、雌激素和孕激素受体全部为阴性的最恶性的病例中，存在其中LAT1比CD44更高度表达的许多病例。因此，认为当选择BPA时，用于它们的BNCT在许多病例中是有效的。还认为在包含含有碱性氨基酸残基的肽和BSH的复合物或含有碱性氨基酸残基的肽与之共价连接的BSH与BPA的组合使用中，当配混的BPA的比率很高时，用于它们的BNCT在许多病例中是有效的。
一般CD44和LAT1表达可以对于每种癌进行检查，并且CD44和LAT1表达可以对于每个病例进行分析。BNCT的个性化医学可以通过个案分析来实现。
根据上述结果，可以如下表述：用本发明的方法和试剂盒，可以对于每种癌/病例执行硼制剂的组合或比率的最佳选择和确定，并且BNCT的潜力可以对于先前未被视为关于使用PBA的BNCT的良好适应症的癌症/病例进行扩展。
本申请要求于2018年2月15日提交的日本专利申请号2018-025216的优先权利益。该日本申请的全部内容引入本文作为参考。此外，本文引用的文献的全部内容也引入本文作为参考。
工业适用性
本发明可以用于癌症的测试和研究，抗癌剂的研究、开发和制造等等。

Claims (7)

1.一种用于预测将包含肽和巯基十一氢十硼酸酯BSH的复合物、或所述肽与之共价连接的BSH引入癌细胞内的效率的方法，所述肽长度为2至20个氨基酸并且含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基，所述方法包括检查样品中的癌细胞中的CD44表达，并且所述方法用于非诊断和治疗目的。
2.根据权利要求1的方法，其中通过免疫染色检查CD44的表达。
3.一种用于预测癌细胞对硼中子俘获疗法BNCT的敏感性的方法，所述BNCT使用包含肽和BSH的复合物、或所述肽与之共价连接的BSH，所述肽长度为2至20个氨基酸并且含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基，所述方法包括检查样品中的癌细胞中的CD44表达，并且所述方法用于非诊断和治疗目的。
4.根据权利要求3的方法，其中通过免疫染色检查CD44的表达。
5.一种用于预测BNCT有效的可能性的方法，所述BNCT使用包含肽和BSH的复合物、或所述肽与之共价连接的BSH，所述肽长度为2至20个氨基酸并且含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基，所述方法包括：检查体外癌细胞系中的CD44表达；并且预测CD44的表达越高，使用包含所述肽和BSH的复合物、或所述肽与之共价连接的BSH的BNCT有效的可能性越高。
6.一种用于选择用于硼中子俘获疗法BNCT的硼制剂的方法，其包括以下步骤：
（a）检查样品中的癌细胞中的CD44表达和LAT1表达；然后
（b）当CD44的表达高于LAT1的表达时，选择含有以下的硼制剂：包含肽和BSH的复合物、或所述肽与之共价连接的BSH，所述肽长度为2至20个氨基酸并且含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基，并且当LAT1的表达高于CD44的表达时，选择含有BPA的硼制剂。
7.包含肽和BSH的复合物、或所述肽与之共价连接的BSH在制备用于高度表达CD44的癌症的BNCT的药物中的用途，所述肽长度为2至20个氨基酸并且含有精氨酸残基和/或赖氨酸残基。
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