CN111971561A - 同种异体移植受体分型的生物标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及将同种异体移植物受体分型或分类为术语抗体介导的排斥(ABMR)的移植排斥组的生物标志物。本发明还提供了通过施用合适的治疗剂，对患有抗体介导的排斥的分型的同种异体移植物受体进行治疗。

Description

同种异体移植受体分型的生物标记物
发明领域
本发明涉及分子整段领域，更具体涉及根据移植排斥状态对同种异体移植受体的生物标记物定型的领域，其能鉴定患有或有风险患有与抗体介导的排斥(ABMR)相关的移植排斥的同种异体移植受体。本发明还涉及治疗领域，更具体的涉及患有与ABMR有关的移植排斥的同种异体移植受体的治疗领域，其中根据本文所述的方法对所述受体定型或指定。
背景技术
从供体移植器官或组织到患者是一些程序或治疗方案的部分。尽管尝试通过宿主-供体组织类型匹配来避免同种异体移植排斥，在供体器官被植入宿主的移植过程中，通常需要免疫抑制治疗来维持供体器官在宿主中存活。这意味着同种异体抑制排斥，或抑制排斥是在同种异体抑制受体中几乎总会在某种程度上存在的现象。因此可以说同种异体移植受体原则上默认会有一定程度移植排斥的风险。甚至尽管广泛使用免疫抑制治疗，也会发生由于同种免疫反应的器官移植排斥。
同种免疫驱动的移植排斥可分成以下类：主要由T细胞介导的排斥(TCMR)或抗体介导的排斥(ABMR)驱动的移植排斥机制。
监测患者中的同种异体移植物，尤其是肾同种异体移植的实验是本领域已知的。监测肾脏同种异体移植物的一种目前临床非侵袭的方法基于测定血清肌酸酐水平(RabantM,et al.,J Am Soc Nephrol,26:2840-51(2015)),血管小球过滤速率(Wadei H.M.etal.,J Am Soc Hypertens.,5(1):39-47(2011))和蛋白尿(Naesens M.et al.J Am SocNephrol,27:281-92(2016))。这些标记物是非特异性的，且仅能检测在相对晚期的病理。而且它们也不能检测没有表现为或具有临床疾病的亚临床变化。因此其不可能鉴定潜在的移植排斥机制。
已提出了诊断肾同种异体移植排斥中的非侵袭实验。这些实验之一涉及鉴定许多尿蛋白，其指示急性移植排斥(Sigdel et al.,Proteomics Clin Appl.,4(1):32–47(2010))。然而这些标记物不能区分移植排斥表型，因此不能用于临床情况，其中患有或有风险患有移植排斥的同种异体移植物受体能够根据其排斥表型/机制来分类，因此也不能根据其移植排斥机制表型/机制来对其治疗进行定制。
因此，还没有开发出能够基于其移植排斥机制来对同种异体移植受体进行分类的生物标记物。将同种异体移植物受体根据其潜在的移植排斥机制分类是非常有利的，而且能够鉴定ABMR病例，因为这开辟了新的临床情形，其中可以根据同种异体移植物受体的需求来定制与ABMR有关的移植排斥治疗。在肾同种异体移植物的长期存活情形中这尤其关键，因为早期鉴定潜在的排斥机制-有时甚至在移植排斥症状出现之前-和随后定制治疗对于移植物的长期存活是重要的指标。
发明目的是提供能实现上述同种异体移植物受体分类的生物标记物，这些生物标记物可以非侵袭方式取样，且提供良好的诊断性能。在同一情形下，本发明的目的是能够早期鉴定同种异体移植物受体中的移植排斥，根据排斥机制分类，后者能够指定根据患者特异性的移植排斥机制定制的个性化治疗。区分ABMR和非ABMR表型还能减少移植损伤，并指导最佳免疫抑制给药。
发明
本发明解决这些问题的方案是提供一种对同种异体移植物受体中抗体介导排斥(ABMR)存在与否进行分型的方法，包括步骤：-提供包含来自同种异体移植物受体的蛋白质的样品；-在所述样品中测定至少两种选自以下基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1,优选如图1所示；-比较所述测定的蛋白质水平与所述至少两种基因的参比蛋白质水平；和-基于测定蛋白质水平和参比蛋白质水平，根据ABMR的存在与否对对同种异体移植物受体进行分型。以同样方式，本发明提供了根据抗体介导排斥(ABMR)存在与否对同种异体移植物受体进行分型的方法，包括步骤：
-在包含同种异体移植物受体的蛋白质的样品中测定至少两种选自以下基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1；-比较所述测定的蛋白质水平与所述至少两种基因的参比蛋白质水平；和-基于测定蛋白质水平和参比蛋白质水平的比较，根据ABMR的存在与否对同种异体移植物受体进行分型。
另外，本发明通过提供将同种异体移植物受体指定为ABMR组或非ABMR组的方法解决了这些问题，该方法包括步骤：-提供包含来自患有或有风险患有移植排斥的同种异体移植物受体的蛋白质样品；-测定所述样品中至少两种选自以下基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1，优选如图1所列；-比较所述测定的蛋白质水平与所述至少两种基因的参比蛋白质水平；和-基于测定蛋白质水平和参比蛋白质水平的比较，将所述同种异体移植物受体指定到所述ABMR组或所述非ABMR组。以相同方式，本发明提供了将同种异体移植物受体指定为ABMR组或非ABMR组的方法，包括步骤：-在包含来自患有或有风险患有移植排斥的同种异体移植物受体的蛋白质样品中测定至少两种选自以下基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1；-比较所述测定的蛋白质水平与所述至少两种基因的参比蛋白质水平；和-基于测定蛋白质水平和参比蛋白质水平的比较，将所述同种异体移植物受体指定到所述ABMR组或所述非ABMR组。
发明人发现一组21种基因(如图1所列)，其蛋白表达在显示抗体介导排斥(ABMR)表型的同种异体移植物受体的身体样品中上调–这样的表型可由组织学分析同种异体移植物活检样品确定－基于与不显示ABMR表型的同种异体移植物受体比较，其包括(i)同种异体移植物健康或正常的受体，可用同种异体移植物活检样品确定，和(ii)同种异体移植物显示排斥表型，但非ABMR表型的受体，例如T-细胞介导排斥(TCMR)，巨细胞相关肾病(PVAN)，肠纤维化和肾小球萎缩(IFTA)，肾小球肾炎(GNF)或其组合,全部都能用同种异体移植物活检样品的组织学分析确定。所发现的生物标志物可独立用于ABMR分型。此外，来自该组的生物标志物已显示能提供良好的诊断性能，且已在患有肾衰竭的先前接受肾同种异体移植的患者的独立组中成功验证(表2-3和4-7；以及图2和4-6)。
本文所用术语“分型”指根据移植物排斥(亚)类区分同种异体移植物受体，或对其分级。分型基于将(i)图1所列的至少一种或至少两种基因所测定的蛋白质水平与(ii)至少一种或至少两种基因的参比蛋白质水平比较。具体地，分型基于将(i)图1所列的至少两种基因所测定的蛋白质水平与(ii)至少两种基因的参比蛋白质水平比较。
本文所用的术语“同种异体移植物”指从一个个体或对象转移到属于同物种但不同基因型的另一个个体或对象的器官或组织移植物。术语“同种异体移植物”也可称作同种异体的移植物。除非上下文清楚另外明示，本文所用的术语“同种异体移植物”和“移植物”指移植的客体。同种异体移植物由供体提供，可以来自活的或尸体来源。优选同种异体移植物是选自心脏、肾脏、肝脏、肺、胰脏、肠或胸腺的器官。另外，同种异体移植物可以是组织，例如骨骼、韧带(两者也称作肌肉骨骼同种异体移植物)、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经或血管。术语“同种异体移植物”和“移植物”在本文中互换使用，除非上下文另有说明。
优选地，在本发明的分型或指定方法中(本发明的方法)，同种异体移植物是肾脏同种异体移植物，在本文中也称作肾同种异体移植物。
优选本发明的分型或指定方法是体外方法。
本文所用的术语“同种异体移植物受体”指接受同种异体移植物的对象，优选是哺乳动物，更优选是灵长类，最优选是人类。除非上下文另有明示，本文所用的术语“同种异体移植物受体”指已经通过移植接受了同种异体移植物的对象或个体。优选地，同种异体移植物受体患有，或先前患有器官衰竭，需要移植器官或组织同种异体移植物。换言之，优选同种异体移植物受体是通过移植接受了器官或组织，以治疗器官或组织衰竭的对象或个体。
出于本公开的目的，认为器官衰竭是器官功能障碍达到了正常平衡在没有器官或组织移植形式的临床干预下无法维持的程度。
优选同种异体移植物受体患有或先前患有(在移植前)肾衰竭，其通过移植肾同种异体移植物来治疗。换言之，优选同种异体移植物受体是通过移植接受了肾脏，以治疗肾衰竭的对象或个体。本文所用的术语“肾衰竭”也可以指末期肾脏疾病。
本发明允许根据移植排斥(亚)类分辨同种异体移植物受体。迄今，不使用对移植的同种异体移植物的活检样品(侵入式)的组织分析还无法进行移植的同种异体移植物如此“深度”的表征。此外，实施例中断结果表明当使用本发明的方法时能够检出目前不能通过生物活检分析鉴定的患者群体，从而实现了目前治疗中的改进。
本文所用的术语“移植排斥”指受体或宿主的免疫系统响应移植的同种异体移植物，可造成同种异体移植物损伤或破坏的疾病状态。本领域技术人员了解移植排斥的情况是受到同种异体移植物受体控制的。该术语特别覆盖了移植排斥的所有阶段，包括亚临床移植排斥和临床移植排斥。本文所用的术语“亚临床排斥”或“亚临床移植排斥”指一种疾病状态，虽然未严重到存在绝对或可轻易观察的症状，但在同种异体移植物生物活检中优选(但不必然)发现排斥的组织学证据，可任选地不存在血清肌酸酐浓度的升高。亚临床移植排斥可能是导致长期移植物损失的因素之一。
本文所用的术语“移植排斥”包括急性和慢性(移植)排斥。
本文所用的术语“急性(移植)排斥”或“AR”指当移植的组织是免疫学上外来时，移植物受体的免疫系统对移植物的排斥。急性排斥的特征是受体免疫细胞或其效应物浸润移植物，可能损伤或破坏移植物。急性排斥的发生相当迅速，通常在移植手术后几周内发生在人体内。通常，可用免疫抑制药，例如雷帕霉素、依维莫司、环孢菌素、他克莫司、麦考酚酸和抗CD25单克隆抗体等抑制或阻抑急性排斥。术语“急性(移植)排斥”可互换地覆盖急性(或活跃)抗体介导排斥(ABMR)和急性T细胞介导排斥(TCMR)。
本文所用的术语“慢性(移植)排斥”指一般植入移植物后数月到数年间人发生的疾病状况，甚至可能存在成功免疫抑制了急性(移植)排斥。纤维化是所有类型的器官移植物慢性排斥中的常见因素。慢性排斥通常描述成一定范围的特定疾病，其是特定器官特征性的。例如，在肺移植中，此类疾病包括气道纤维增生性破坏(闭塞性细支气管炎)；在心脏移植或心脏组织移植(例如瓣膜置换)中，此类疾病包括纤维化动脉粥样硬化；在肾脏移植中，此类疾病包括阻塞性肾病，肾硬化，肾小管间质性肾病；在肝脏移植中，此类疾病包括胆管消失综合征。慢性排斥的特征还可能是缺血性损伤，移植器官的去神经化，高脂血症和免疫抑制药相关的高血压。术语“慢性移植排斥”特别覆盖慢性ABMR和慢性TCMR。
优选地，在本发明的分型、指定或测定方法中，同种异体移植物受体患有移植排斥－可能还特别包括亚临床排斥——或有患移植排斥的风险。原则上，同种异体移植物受体在定义上有患有移植排斥的风险，因为移植物是同种异体的。显然，在本发明上下文中术语“患有”不意味着移植排斥症状已经在同种异体移植物受体中明显。因此，术语还包括亚临床的移植排斥。术语“患有移植排斥”也可替换成“经历移植排斥反应”。
优选在本发明的方法中，移植排斥是急性(移植)排斥，与所述急性移植排斥相关的ABMR或TCMR因此优选是急性ABMR或急性TCMR。
本文所用的短语“ABMR相关移植排斥”包括指至少某种程度上，但优选主要由ABMR驱动的移植排斥，且所述短语还可简单用术语“ABMR”或短语“为ABMR的移植排斥”替代。当所述排斥表型非ABMR(如TCMR)时可用对应的短语。
ABMR是一种常见的同种异体移植物排斥的严重形式。ABMR的病理生理学提示抗体、B细胞和浆细胞的主要作用，但其它效应分子，尤其是补体系统也指示了可改变ABMR过程的可能目标。在30-40％肾移植病例中持续观察到ABMR，构成了早期移植物损失的主要原因。本领域技术人员熟知确定同种异体移植物生物活检样品是否有ABMR的方法和手段，例如进行组织学分析，使用Banff分类目录如下文报道的2015版更新的Banff分类目录。
在同种异体移植物中，TCMR的特征是T细胞和巨噬细胞渗入间质液，强IFNγ和TGFBβ效应以及表皮劣化。
通常根据已知的Banff分类目录(例如更新的2015版Banff分类目录)鉴定同种异体移植物的ABMR和TCMR，其中急性ABMR和急性TCMR复制于本文下文。本领域技术人员明白在这些指南中提供了慢性ABMR，慢性TCMR和间质纤维化和肾小管萎缩(IFTA)分类的类似指南。本领域技术人员还理解巨细胞病毒相关肾病(PVAN)和肾小球肾炎(GNF)分类于分开的排斥目录中，可以称作“不被认为是急性或慢性排斥导致的其它改变”，如Loupy等,2017(Loupy等，Am J Transplant.,17(1):28-41(2017))所述。
更新的2015Banff分类目录
目录2：抗体介导的改变
急性/活性ABMR：诊断必需存在全部三个特征。显示组织学特征的生物活检加上目前/近期与血管内皮或DSA(但不是两者)的抗体反应证据可被认为怀疑有急性/活性ABMR。病变可以是临床急性的或郁积型(smoldering)或可以是亚临床的；如果病变是C4d阳性或C4d阴性，需要注意，基于以下标准：
1.急性组织损伤的组织学证据，包括以下一种或多种：
-微血管炎症(不存在复发或新发肾小球肾炎中g>0，和/或ptc>0)
-内膜或透壁动脉炎(v>0)
-急性血栓性微血管病，不存在任何其它病因
-急性肾小管损伤，不存在任何其它明显病因
2.目前/近期与血管内皮作用的抗体，包括至少以下一种：
-肾小管周围毛细血管中线性C4d染色(冷冻切片上的C4d2或C4d3的IF染色，或石蜡切片上的IHC染色C4d>0)
-至少中度微血管炎症([g+ptc]≥2),虽然存在急性TCMR，边界渗透或感染；ptc≥2单独是不够的，g必须≥1
-如果彻底验证，生物活检组织中基因转录物表达提高，指示内皮损伤
3.DSA的血清学证据(HLA或其它抗原)
-符合标准1和2的怀疑有ABMR的生物活检样品应该加快进行DSA测试更新的2015Banff分类目录
目录4：急性TCMR(级别)
IA.显著肠炎症(>25％皮层实质非硬化,i2或i3)和中度肾小管炎病灶(t2)
IB.显著间质炎症(>25％非硬化皮层实质,i2或i3)和重度肾小管炎病灶(t3)
IIA.轻度至中度内膜动脉炎(v1)，具有或不具有间质炎症和肾小管炎
IIB.重症内膜动脉炎，包括>25％的管腔面积(v2)，具有或不具有间质炎症和肾小管炎
III.透壁性动脉炎和/或动脉纤维蛋白样变化，和内侧平滑肌细胞坏死，伴有淋巴细胞炎症(v3)
简而言之，可通过间质炎症(i)，肾小管炎(t)和血管炎(v)评分诊断T细胞介导的排斥(TCMR)，而抗体介导的排斥(ABMR)的标志是肾小管周围毛细血管的C4d沉积。
当本文使用术语“ABMR”时，指同种异体移植物受体的同种异体移植物的ABMR。当本文使用“非ABMR”或“TCMR”时，分别指同种异体移植物受体的同种异体移植物的非ABMR或TCMR。
优选ABMR是根据Banff分类法分类的ABMR。优选TCMR或TFTA分别是根据Banff分类法分类的TCMR或IFTA。
由于术语“ABMR”,“非ABMR”和“TCMR”也与本领域术语“表型”联用，这些术语也可指“ABMR表型”，“非ABMR表型”和“TCMR表型”。
最优选的，在本发明的方法中，ABMR是抗体介导的肾排斥(ABMRR)和/或TCMR是T细胞介导的肾排斥(TCMRR)。
本文所用的术语“样品”指获自同种异体移植物受体的样品，所述样品包含蛋白质。样品优选体液样品。这些样品包括但不限于痰液、血液、血清、血浆、尿液、腹膜液和胸膜液。最优选的样品是尿样。获得样品在本领域技术人员的常识范畴内。该术语还包括指经处理样品，例如制备用于蛋白质水平测量步骤的样品。
优选本发明的方法是为了(i)对所述同种异体移植物受体的样品根据ABMR存在与否分型，或(ii)将所述同种异体移植物受体样品指定为ABMR组或非ABMR组。
在本发明方法的另一个步骤中，在所述样品中测定至少两种选自以下基因的蛋白质水平(也称作蛋白质表达水平)：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1。本领域技术人员明白当指为基因测定的蛋白质水平时，其意指测定通过转录基因和翻译基因转录产物最终产生的蛋白质表达产物。
本文所用的术语“蛋白质”和“肽”指氨基酸残基聚合物(氨基酸序列)，不意味着分子的特定长度。该术语也指或包括任何多肽的修饰(例如翻译后)，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。该定义中包括例如图1中各自的UniProtKB登录号所示蛋白质的天然存在的变体。对于蛋白水平，术语蛋白质和肽是可互换的。
优选在选自图1列出的基因的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或至少21种基因中测定蛋白质水平；或在选自TF,SERPINA1,AZGP1,ORM1,ORM2,SERPINC1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13或至少14种基因中测定蛋白质水平；或在选自TF,SERPINA1,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,APOA4,AFM,A1BG and APOA1的至少2,3,4,5,6,7,8,9或至少10种基因中测定蛋白质水平.优选在本发明的方法中，在至少基因TF和SERPINA1,更优选至少基因TF,SERPINA1和APOA4,甚至更优选至少基因TF,SERPINA1,APOA4和AZGP1中测定蛋白质水平，可任选地，在所述实施方式的每一种中还补充有ORM1,ORM2,C3,A1BG和/或SERPINC1。另外，在图1所列的基因至少从上(TF)到下(CYSTM1)的开头2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19，20或21种基因中测定蛋白质水平。
另外，在至少TF,SERPINA1,AFM,A1BG,SERPINC1和IGHA1中测定蛋白质水平。
优选在本文所述的方法中，在A1BG,AFM,APOA1,APOA4,IGHA1,IGHG4,LRG1,SERPINA1,SERPINC1和TF形成的组中选择至少两种基因来测定蛋白质水平。对此，优选内在本文所述的方法中，测定至少以下组合的基因的蛋白质水平：A1BG和AFM；A1BG和APOA1；A1BG和APOA4；A1BG和IGHA1；A1BG和IGHG4；A1BG和LRG1；A1BG和SERPINA1；A1BG和SERPINC1；A1BG和TF；AFM和APOA1；AFM和APOA4；AFM和IGHA1；AFM和IGHG4；AFM和LRG1；AFM和SERPINA1；AFM和SERPINC1；AFM和TF；APOA1和APOA4；APOA1和IGHA1；APOA1和IGHG4；APOA1和LRG1；APOA1和SERPINA1；APOA1和SERPINC1；APOA1和TF；APOA4和IGHA1；APOA4和IGHG4；APOA4和LRG1；APOA4和SERPINA1；APOA4和SERPINC1；APOA4和TF；IGHA1和IGHG4；IGHA1和LRG1；IGHA1和SERPINA1；IGHA1和SERPINC1；IGHA1和TF；IGHG4和LRG1；IGHG4和SERPINA1；IGHG4和SERPINC1；IGHG4和TF；LRG1和SERPINA1；LRG1和SERPINC1；LRG1和TF；SERPINA1和SERPINC1；SERPINA1和TF；或SERPINC1和TF。高度优选的是(i)至少A1BG和APOA4,(ii)A1BG和SERPINA1,(iii)A1BG和TF,(iv)APOA4和SERPINA1,(v)APOA4和TF或(vi)SERPINA1和TF。
另外，在至少以下基因中测定蛋白质水平：AZGP1和TF；AZGP1和SERPINA1；AZGP1和APOA4；AZGP1和AFM；AZGP1和ORM1；AZGP1和ORM2；AZGP1和C3；AZGP1和A1BG；AZGP1和SERPINC1；AZGP1和LRG1；AZGP1和IGHA1；AZGP1和IGHG4；AZGP1和TFAP2C；AZGP1和HPX；AZGP1和A2M；AZGP1和CARD6；AZGP1和SERPINA7；AZGP1和CCDC73；AZGP1和CYSTM1；AZGP1和APOA1；ORM1和TF；ORM1和SERPINA1；ORM1和APOA4；ORM1和AFM；ORM1和ORM2；ORM1和C3；ORM1和A1BG；ORM1和SERPINC1；ORM1和LRG1；ORM1和IGHA1；ORM1和IGHG4；ORM1和TFAP2C；ORM1和HPX；ORM1和A2M；ORM1和CARD6；ORM1和SERPINA7；ORM1和CCDC73；ORM1和CYSTM1；ORM1和APOA1；ORM2和TF；ORM2和SERPINA1；ORM2和APOA4；ORM2和AFM；ORM2和C3；ORM2和A1BG；ORM2和SERPINC1；ORM2和LRG1；ORM2和IGHA1；ORM2和IGHG4；ORM2和TFAP2C；ORM2和HPX；ORM2和A2M；ORM2和CARD6；ORM2和SERPINA7；ORM2和CCDC73；ORM2和CYSTM1；ORM2和APOA1；C3和TF；C3和SERPINA1；C3和APOA4；C3和AFM；C3和A1BG；C3和SERPINC1；C3和LRG1；C3和IGHA1；C3和IGHG4；C3和TFAP2C；C3和HPX；C3和A2M；C3和CARD6；C3和SERPINA7；C3和CCDC73；C3和CYSTM1；C3和APOA1；TFAP2C和TF；TFAP2C和SERPINA1；TFAP2C和APOA4；TFAP2C和AFM；TFAP2C和A1BG；TFAP2C和SERPINC1；TFAP2C和LRG1；TFAP2C和IGHA1；TFAP2C和IGHG4；TFAP2C和HPX；TFAP2C和A2M；TFAP2C和CARD6；TFAP2C和SERPINA7；TFAP2C和CCDC73；TFAP2C和CYSTM1；TFAP2C和APOA1；HPX和TF；HPX和SERPINA1；HPX和APOA4；HPX和AFM；HPX和A1BG；HPX和SERPINC1；HPX和LRG1；HPX和IGHA1；HPX和IGHG4；HPX和A2M；HPX和CARD6；HPX和SERPINA7；HPX和CCDC73；HPX和CYSTM1；HPX和APOA1；A2M和TF；A2M和SERPINA1；A2M和APOA4；A2M和AFM；A2M和A1BG；A2M和SERPINC1；A2M和LRG1；A2M和IGHA1；A2M和IGHG4；A2M和CARD6；A2M和SERPINA7；A2M和CCDC73；A2M和CYSTM1；A2M和APOA1；CARD6和TF；CARD6和SERPINA1；CARD6和APOA4；CARD6和AFM；CARD6和A1BG；CARD6和SERPINC1；CARD6和LRG1；CARD6和IGHA1；CARD6和IGHG4；CARD6和SERPINA7；CARD6和CCDC73；CARD6和CYSTM1；CARD6和APOA1；SERPINA7和TF；SERPINA7和SERPINA1；SERPINA7和APOA4；SERPINA7和AFM；SERPINA7和A1BG；SERPINA7和SERPINC1；SERPINA7和LRG1；SERPINA7和IGHA1；SERPINA7和IGHG4；SERPINA7和CCDC73；SERPINA7和CYSTM1；SERPINA7和APOA1；CCDC73和TF；CCDC73和SERPINA1；CCDC73和APOA4；CCDC73和AFM；CCDC73和A1BG；CCDC73和SERPINC1；CCDC73和LRG1；CCDC73和IGHA1；CCDC73和IGHG4；CCDC73和CYSTM1；CCDC73和APOA1；CYSTM1和TF；CYSTM1和SERPINA1；CYSTM1和APOA4；CYSTM1和AFM；CYSTM1和A1BG；CYSTM1和SERPINC1；CYSTM1和LRG1；CYSTM1和IGHA1；CYSTM1和IGHG4；CYSTM1和APOA1。
显示了图1列出的基因中至少两种基因的蛋白质水平已经能够进行ABMR分型(图6)。
更优选地，在A1BG,APOA4,SERPINA1和TF的组中选出至少两种基因测定蛋白质水平。甚至更优选地，测定选自以下组的至少6种基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1；甚至更优选地，所述至少6种基因选自下组：A1BG,AFM,APOA1,APOA4,IGHA1,IGHG4,LRG1,SERPINA1,SERPINC1和TF,例如(i)至少A1BG,APOA1,APOA4,IGHA1,SERPINA1和TF,(ii)至少A1BG,APOA4,IGHA1,LRG1,SERPINA1和TF或(iii)至少A1BG,APOA1,APOA4,LRG1,SERPINA1和TF。
优选在本发明的方法中，在至少基因TF和SERPINA1,更优选至少基因TF,SERPINA1,APOA4，甚至更优选至少基因TF,SERPINA1,APOA4和A1BG中测定蛋白质水平，可任选地，在所述实施方式的每一种中还补充有AFM,APOA1,IGHA1,IGHG4,LRG1和/或SERPINC1。
本发明还提供一种对同种异体移植物受体中抗体介导排斥(ABMR)存在与否进行分型的方法，包括步骤：-测定包含来自同种异体移植物受体的蛋白质的样品中的至少选自下组的一种基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1；-比较所述测定的蛋白质水平与所述至少一种基因的参比蛋白质水平；和-基于测定蛋白质水平和参比蛋白质水平，根据ABMR的存在与否对对同种异体移植物受体进行分型。图1显示了所有独立基因的蛋白质水平与AMBR相关。本发明还提供了将同种异体移植物受体指定为ABMR组或非ABMR组的方法，包括步骤：-在包含来自患有或有风险患有移植排斥的同种异体移植物受体的蛋白质样品中测定至少一种选自以下基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1；-比较所述测定的蛋白质水平与所述至少一种基因的参比蛋白质水平；和-基于测定蛋白质水平和参比蛋白质水平的比较，将所述同种异体移植物受体指定到所述ABMR组或所述非ABMR组。本文所述的实施方式涉及基于至少两种基因分型或指定的方法，当合适时，这些方法也可使用至少一种基因。
本发明还提供了至少两种(不同)蛋白质的用途，优选在尿液样品作为肾同种异体移植物受体ABMR存在与否的(生物)标志物，这些蛋白质由基因TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1或APOA1编码。优选使用至少两种蛋白质，优选至少两种蛋白质的蛋白质水平，其由以下基因编码A1BG,AFM,APOA1,APOA4,IGHA1,IGHG4,LRG1,SERPINA1,SERPINC1和TF；更优选地涉及使用至少六种蛋白质，优选至少六种蛋白质的蛋白质水平，其由以下基因编码：A1BG,AFM,APOA1,APOA4,IGHA1,IGHG4,LRG1,SERPINA1,SERPINC1和TF。涉及本文所述方法的实施方式如合适还能用于本文所述的用途，例如蛋白质和/或基因的组合。
本领域技术人员本身熟知大量测定样品中蛋白质或基因水平的方法和手段，包括测定相对或绝对蛋白或肽浓度，和/或纵向(同一患者随时间多次采样)或横截面(每个病人一个时间点的测量值)测量。.
示范性蛋白质或肽分析方法包括但并不限于高通量液相层析(HPLC)；质谱(MS)，优选设置成MS/MS模式；基于LC-MS的肽概述，优选HPLC-MS,后者优选设置成MS/MS模式(鸟枪模式/数据依赖式采集(DDA)，数据独立采集(DIA)，靶向模式(选择反应监测(SRM)，平行反应监测(PRM)，多重反应监测(MRM))；酶联免疫吸附实验(ELISA)；蛋白质微阵列，蛋白QPCR等。广义上，蛋白表达评估可以是定性或定量的。在本发明中，方法对测定样品中是否存在蛋白质或肽提供了定量检测，即对实验样品中蛋白质或肽的实际量或相对丰度进行评估或测评。在这样的实施方式中，定量检测可以是绝对的，或如果方法是检测样品中的两种或多种不同蛋白质或肽时，是相对的。如此，当在定量，或测定样品中蛋白质或肽的蛋白质水平的背景下使用术语“水平”或“定量的”时可指绝对或相对定量。绝对定量可通过加入一种或多种已知浓度的对照分析物，并将检测到的靶蛋白或肽的水平比照已知对照分析物(例如通过产生标准曲线)实现。另外，相对定量可通过在两种或多种不同靶蛋白或肽之间比较检测到的量或水平，以提供两种或多种不同蛋白质或肽例如相对于彼此的相对定量实现。另外，可用对照或参照物，来自一种或多种对照样品的值(或概貌)确保相对定量。术语“蛋白质水平”也包括肽水平，尤其是当所述肽水平实际上用作蛋白质水平量度时。同样术语“蛋白质”也包括蛋白质部分。
在本发明的方法红，可使用任何方便的蛋白质或肽定量方案，其中在所提供的样品中测定列于图1的至少两种基因的蛋白质表达水平，以产生样品的蛋白质或肽特征或概貌。这些方法包括标准免疫实验，包括基于抗体或适体的蛋白质定量分析(例如ELISA实验，例如多重ELISA实验，Western印迹，基于FACS的蛋白质分析等)，蛋白质活性实验，包括多重蛋白质活性实验，蛋白QPCR，蛋白质表达实验等。
本发明的方法还可包括步骤：-在样品中用胰蛋白酶(或任何替代蛋白质或其组合)消化蛋白质，从而提供肽混合物；-对所述肽混合物进行液相层析步骤(或类似分离技术，例如毛细电泳)，以提供含有肽的洗脱液；和-对所述洗脱液进行质谱步骤，以测定至少两种肽的肽水平，所述至少两种肽代表所述至少两种基因的蛋白质水平。
技术人员理解所述至少两种基因的肽水平是在本发明的方法中所述至少两种基因的蛋白质水平的量度。另外，进行上述质谱步骤还可特别包括测定或提供肽概貌/特征，和测量或确定至少两种肽的肽水平，所述至少两种肽的肽水平代表所述至少两种基因的蛋白质水平或是其量度。本领域技术人员清楚这个短语指所述至少两种肽的每一种原来形成所述至少两种基因中不同基因编码的蛋白质部分。本领域技术人员理解可测量或测定另一种肽的肽水平，这样的肽可代表与在先的两种肽之一相同的肽，或相反可以是图1中列出的另一种蛋白质的标识物。
同样的，本发明人鉴定了一组十二种独特肽(表1，SEQ ID No:1-12)，它们是图1中列出的六种蛋白质的特异性标志物(绿色和灰色标记的蛋白质)。同样，鉴定了另10种肽(SEQ ID No:13-22，表4)。当用MS作为蛋白质或肽的测量工具时，这些肽序列提供了益处，使得在产生的对应于这些蛋白质的MS概貌中可以轻易鉴定峰并指定为本文所述的蛋白质生物标志物。这样的肽的MS峰值是其肽水平的量度，提供了这些肽对于图1所列蛋白质是独特的事实，它们也能够提供蛋白质水平的量度。然而应当理解，可用许多其它方法测量蛋白质表达水平。
因此，本文方法中优选至少两种肽选自具有SEQ ID NO:1-12和/或13-22的序列的肽。更优选地，在本发明的方法中，测量或测定表1中所列的至少3,4,5,6,7,8,9,10,11或12种肽的肽水平，或测量或测定表4中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20种肽的肽水平。甚至更优选地，测定选自(i)SEQ ID NO:3或4；(ii)SEQ ID NO:7或8；和(iii)SEQ ID NO:11或12的至少两种肽的肽水平。
另外，在本发明的方法中，用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行蛋白质水平测量。
本发明分型或指定的方法还包括将经测量或测定的蛋白质水平与参比蛋白质水平比较的步骤。
测量和测定靶蛋白的蛋白质水平后，例如提供了概貌或特征形式的蛋白质水平后，分析或评估蛋白质水平以确定是否同种异体移植物受体患有或正在经历ABMR或非ABMR反应。这样的分析涉及将一组基因经测量或测定的蛋白质水平与同组基因的参比蛋白质水平比较。
术语“参比蛋白质水平”指标准化蛋白质水平(或标准化蛋白质水平概貌或蛋特征，或总的标准化蛋白质水平)，其可用于诠释同种异体移植物受体样品中测量或测定的蛋白质水平。
适合本发明的分型或指定目的的参比蛋白质水平可以由本领域技术人员以多种不同方式设置，这样的参比蛋白质水平设置属于本领域技术人员的一般知识范畴。
例如在本发明的方法中，参比蛋白质水平可以是参比样品中所述至少两种基因的参比蛋白质水平，优选基于参比样品获得。参比样品可以是来自任何个体，例如健康或疾病个体的样品，但优选是来自同种异体移植物受体的样品。同种异体移植物受体的参比样品可以是来自不显示任何移植排斥症状的健康同种异体移植物受体的样品，但也可以是来自患有或经历移植排斥(反应)例如ABMR或TCMR的参比样品。参比样品也可以来自患有或经历非ABMR而是非ABMR例如TCMR的移植排斥(反应)的同种异体移植物受体。在本发明的方法中，当与来自未患有ABMR的同种异体移植物受体的参比样品中所述至少两种基因的参比蛋白质水平比较时，如果蛋白质水平与参比蛋白质水平相比提高，要分型或指定分组的同种异体移植物受体被分作ABMR或经历ABMR反应，或指定到ABMR组。已确定当与不存在时相比，存在ABMR时图1中所发现的生物标志物在蛋白质水平上调。.由于已知蛋白质表达方向，本领域技术人员能够常规使用与AMBR表型有相似性或无相似性的合适的参比蛋白水平进行本文所述的分型或指定方法。优选在本文所述的任一种方法中，当受体分型为患有ABMR时，与没有ABMR的同种异体移植物受体中的蛋白质表达水平相比，所述至少两种基因的蛋白质表达水平提高或上调。
本领域技术人员应理解可用多个参照样品设定合适的参照值，例如来自具有ABMR的一个或多个同种异体移植物受体的样品和来自不具有ABMR但具有相同或不同的非ABMR的一种或多种同种异体移植物受体的样品。
参照样品还可以是来自多个个体，优选本文所述的同种异体移植物受体(例如未具有或未经历ABMR(反应)的同种异体移植物受体)的合并蛋白质样品。可以从多于10个个体，多于20个个体，多于30个个体，多于40个个体，或多于50个个体合并所述样品。
高度有益的参比蛋白质水平是将ABMR与非ABMR区分开的绝对蛋白质水平。设置这样的绝对蛋白质水平阈值在本领域技术人员公知常识范围内。
可用多种方式进行同种异体移植物受体的分型或指定排斥表型组。在一种方法中，确定一个系数，其是目标样品中的蛋白质水平与先前建立的参比蛋白质水平(图1中所示基因)的相似性或不相似性的量度，可以对于某些细胞类型、组织、疾病状态或任何其它感兴趣的生物或临床感兴趣的样品组是特异性的。这样多参比蛋白质表达水平可作为概貌模板。样品的分型或指定可基于其与单个概貌模板或优选基于多个概貌模板的(不)相似性。通过测定与概貌模板的关联性，可设置对一组基因的总体相似性评分。相似性评分是来自同种异体移植物受体的样品中一组基因的蛋白质水平与概貌模板的平均关联性量度。所述相似性评分可以是，但不需要是+1(表示所述同种异体移植物受体样品中的该组基因的蛋白质水平与概貌模板之间成高度正比)和-1(表示反比)之间的数值。然后可设置阈值基于移植排斥分辨样品。所述阈值是能够分辨具有ABMR的同种异体移植物受体样品和没有ABMR的同种异体移植物受体样品的任意值。如果使用相似性阈值，优选设置成可接受数量的具有ABMR的同种异体移植物受体将评为假阴性且可接受数量的没有ABMR的患者将评为假阳性的值。相似性评分优选显示于或输出到用户界面设备，计算机可读存储介质，或当地或远程计算机系统。
当具有不同预测因子时，计算相似性评分的经典方法是线性对数回归，但还有其它本领域技术人员已知的能用于计算相似性评分的统计学和数据挖掘分类方法。例如，非限制性例子是支持向量机(support vector machine)，其是一种建立分类模型的统计学习方法(Cristianini等,支持向量机和其它基于核的学习方法的介绍(An Introduction toSupport Vector Machines and Other Kernel-based Learning Methods).,2000,Cambridge University Press；Vapnik,The Nature of Statistical Learning Theory.,1995 New York Springer；Zhang等,BMC Bioinformatics,7:197(2006))。
更优选的，在本发明的方法中，参比蛋白质水平是标准化的绝对蛋白质水平值，对于基于抗体或适体的蛋白质定量实验，例如酶联免疫吸附实验(ELISA)蛋白测量而设定。这样的蛋白质水平值作为阈值，能够分辨患有或经历ABMR的同种异体移植物受体样品中的蛋白质水平和未具有、未患有、或未经历ABMR(非ABMR)而患有例如TCMR的同种异体移植物受体样品中的蛋白质水平。
在本发明分型的方法中，当同种异体移植物受体分型成不具有或不经历ABMR时，受体优选分型成具有健康或正常的同种异体移植物，或与TCMR表型的移植排斥表型相关的同种异体移植物。
本文所用的术语“非ABMR”包括指(i)健康或正常同种异体移植物，因此不显示排斥迹象，和(ii)与表型不是ABMR而是TCMR，巨细胞病毒相关肾病(PVAN)，肠纤维化和肾小球萎缩(IFTA)，肾小球肾炎(GNF)或其组合的移植排斥相关的同种异体移植物。
另外，本发明的方法还可包括步骤：-对所述同种异体移植物指定疗法；其中如果所述受体分型为患有或经历ABMR，指定针对ABMR的标准治疗剂用于治疗。结合本发明的指定方法可进行相应步骤。另外，如果所述受体分型成未具有、未患有或未经历ABMR，可进行进一步分型或分类步骤来鉴定潜在的非ABMR表型。结合本发明的指定方法可进行相应步骤。
另外，本发明的方法还可包括一个步骤：-测定所述同种异体移植物受体血清样品中血清肌酸酐水平；－测定肾小球滤过速率，优选通过在同种异体移植物受体的血流中静脉注射(i)菊糖，(ii)菊糖类似物，例如海蔥糖或(iii)用于测定肾小球滤过速率的放射性物质，例如51Cr-EDTA或99mTc-DTPA,并测定其清除；和/或通过进行蘸棒测试或使用液体结晶进行人血清白蛋白(HSA)水平检测，并将HAS水平与参比值比较，测定同种异体移植物尿液样品中蛋白尿。
另外，本发明还提供了测定人对象样品中蛋白质水平的方法，包括步骤：
-提供包含来自人对象蛋白质的样品，优选来自人类同种异体移植物受体的样品；
-在所述样品中测定选自下组的至少一种或至少两种基因，特别是两种基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1,优选如图1所示。
对此，与提供样品并测定蛋白质水平相关的实施方式也是本文所述的测定样品中蛋白质水平的方法中的实施方式。
另外，本发明的测定蛋白质水平的方法还可包括一个步骤：-测定所述同种异体移植物受体血清样品中血清肌酸酐水平；－测定肾小球滤过速率，优选通过在同种异体移植物受体的血流中静脉注射(i)菊糖，(ii)菊糖类似物，例如海蔥糖或(iii)用于测定肾小球滤过速率的放射性物质，例如51Cr-EDTA或99mTc-DTPA,并测定其清除；和/或通过进行蘸棒测试和/或使用液体结晶进行人血清白蛋白(HSA)水平检测，并将HAS水平与参比值比较，测定同种异体移植物尿液样品中蛋白尿。
本发明还提供了对本发明的方法分型或指定的同种异体移植物受体的药物治疗。由于现在能够根据移植排斥表型对同种异体移植物受体进行分组，能够根据患者的需求定制治疗。另外，实施例说明了一组先前用经典组织学分析同种异体移植物活体样品没有鉴定出的新患者现在被鉴定出来，并进行个体化治疗。
对此，本发明提供了标准疗法的治疗药，用于治疗患有或经历ABMR相关移植排斥的同种异体移植物受体，其中(i)所述受体或其样品根据本发明分型法分型成具有或经历ABMR，或(ii)所述受体或其样品根据本发明的指定方法指定到ABMR组。
本文所用的术语“标准疗法的治疗剂”指一种治疗化合物或所述化合物的组合，其由医师认为对于一类患者、疾病或临床情况例如移植排斥是合适的、被接受的和/或广泛使用的。用于抵消移植排斥的标准疗法本领域可得。用于治疗患有、或经历ABMR相关的移植排斥的具体标准疗法治疗剂包括皮质类固醇、利妥昔单抗、静脉免疫球蛋白(IVIG)产品，硼替佐米,依库珠单抗或其组合。更广泛的，用于治疗移植排斥的标准疗法治疗药包括环孢霉素，他克莫司，麦考酚酸，西罗莫司，依维莫司，贝拉西普，巴利昔单抗和抗胸腺细胞球蛋白。
以相同方式，本发明还提供了一种治疗患有ABMR相关移植排斥的同种异体移植物受体的方法，包括步骤：-治疗有效量的标准疗法的治疗药，用于治疗患有或经历ABMR相关移植排斥的同种异体移植物受体，其中(i)所述受体或其样品根据本发明分型法分型成具有或经历ABMR，或(ii)所述受体或其样品根据本发明的指定方法指定到ABMR组。
术语“治疗有效量”指特定药物在用药物治疗的对象中足以达到所需效果的量。理想地，药物的治疗有效量是足够抑制或治疗疾病或病况，而不阻抑导致对象中显著细胞毒性效应的量。药物的治疗有效量由要治疗的对象，痛苦严重度，和治疗剂的给药方式决定。确定有效给药方案在本领域技术人员的知识和能力范畴内。
本文所用的术语“给予”指用本领域技术人员已知的任何方法和传递系统将药剂或治疗化合物物理引入同种异体移植物受体患者。本领域技术人员知道给药和剂型适合的方法。一般可通过进行非胃肠道外给药，例如口腔和经肠给药来施用小分子。基于蛋白质的药剂，例如抗体的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮下，腹膜内，脊椎或其它胃肠道外给药途径，因此由溶液形式的注射或输注执行。可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行给药。
以相同方式，本发明提供了标准疗法的治疗药的用途，其用于制备治疗患有ABMR相关移植排斥的同种异体移植物受体的药物，其中(i)所述受体或其样品根据本发明分型法分型成具有或经历ABMR，或(ii)所述受体或其样品根据本发明的指定方法指定到ABMR组。
优选地，在治疗ABMR相关移植排斥的医学方法中，标准疗法的治疗剂选自下组：皮质类固醇、利妥昔单抗、静脉免疫球蛋白(IVIG)产品，硼替佐米,依库珠单抗及其组合；其中所述药剂根据治疗有效给药方案施用。更优选的，标准疗法的治疗剂是硼替佐米,依库珠单抗或利妥昔单抗。
出于清楚和简明的目的，各特征在此作为同一或不同方面内容的组成元素加以描述，然而，应理解本发明范围内的实施方式可包括所有或部分在此所述特征的组合。
本文引述的文献内容在此引入以供参考。
以下将通过附图说明和实施例来说明本发明，这些实施例仅用于说明目的而非限制，并应理解，可以对所述方法和所示的量进行许多改变，这些皆属于本发明的构思和所附权利要求的范围。
附图说明
图1.在肾同种异体移植受体中将ABMR与非ABMR分组的生物标志物列表
最上部是21种选择上调的蛋白质，其将病例-对照设定的步骤1和步骤2(训练组)中的ABMR与非ABMR表型隔离开来。六种标为绿色(灰色)的蛋白质是用两种独特肽(见表1)训练并验证了统计学SVM模型(实施例1)的蛋白质。全部21种蛋白质在AMBR病例中上调(在步骤1或步骤2中log2的最小倍数改变为0,8)。
图2.验证数据组的ROC曲线
使用六种蛋白质(实施例1)获得的接受者操作特征(ROC)曲线–以表1中所列的12种肽的形式检测而得–作为包含已接受肾脏同种异体移植物的患者的验证组(N＝240)中的生物标志物。
图3.研究概述
研究概述，显示训练(步骤1和2)和验证组(步骤3)。
图4和5。训练数据组(图4)和验证数据组(图5)的ROC曲线。
训练和验证组(实施例2)中蛋白质生物标志物的诊断准确性。接收者操作特征(ROC)曲线显示了训练组(N＝249，图4)和验证组(N＝391；图5)的10种蛋白质(表4)的完整模型。在训练数据组中，具有10种蛋白质的完整模型具有98％AUC。在验证数据组中，该模型具有88％AUC。
图6.用表5的两种随机蛋白质分类
表5随机蛋白质的数量需要实现ABMR分类。
实施例
实施例1.生物标志物的训练和验证，将抗体介导的肾脏同种异体移植物排斥与其它肾同种异体移植物排斥表型分开。
材料和方法
研究群体
我们进行了多中心回顾性研究。在4个欧洲临床中心(University HospitalLeuven,Paris Necker,CHU Limoges and Hannover Medical School)接受肾同种异体移植的患者在提供书面告知同意书后被纳入研究中。进行生物活检方案或指征，收集尿样。在该蛋白质组学研究中，仅用尿样进行分析。由当地或中心病理学家分析生物活检样品，将所有样品分成四种不同表型：正常(NL),抗体介导排斥(ABMR),T-细胞介导的排斥(TCMR)和肠纤维化及肾小球萎缩(IFTA)。还可以组合表型。
一般研究设计
本研究可一般分为三步。步骤1中，分析肾同种异体移植物受体的130个尿样，在步骤2中分析133个肾同种异体移植受体的尿样。步骤1和2涉及鉴定和训练差异表达的蛋白质，以用作诊断性ABMR生物标志物。步骤3涉及生物标志物的独立验证，在该步骤中对240个肾同种异体移植受体的样本测试生物标志物的诊断表现。
尿收集
在4个不同的临床中心收集尿样。在采集生物活检样品前晨间收集新鲜尿样(优选中尿)。用蘸棒测试本地测定鸟肌酸酐，血红蛋白，淋巴细胞，葡萄糖和蛋白质含量。2,000g4℃离心尿样20分钟，除去细胞碎片并在收集后2小时内丢弃(casts)。-20℃储藏上清，直到运输到分析中心。抵达后，将样品储藏在-80℃。
每一步中，将每24个样品随机分批，使得所有批次包含来自每个临床中心和所有不同表型的样品。
样品制备
首次用PierceTM BCA蛋白质测试试剂盒(Thermo Scientific)测定浓度后，用Amicon Ultra-0.5离心滤膜单元(具有10kDa分子量截留值滤膜)(Merck Millipore)处理2mg蛋白质。再次用相同的BCA蛋白质实验测定浓缩样品的蛋白质浓度。随后，将100μg蛋白质加到PierceTM白蛋白耗竭试剂盒(Thermo Scientific)自旋柱上，从样品中耗竭人白蛋白。白蛋白耗竭后，最后一次测定蛋白质浓度。在0.1％Rapigest(RapiGestTM SF,Waters)对20μg蛋白变性。变性后，加入2μl的200mM TCEP(三(2-羧乙基)膦；Thermo Scientific)还原蛋白质，样品在55℃孵育1小时。然后，加入2μl的375mM IAA(碘化乙酰胺；ThermoScientific)室温避光烷基化样品30分钟。为了沉淀蛋白质，加入1ml预先冷冻的丙酮，-20℃孵育过夜。离心步骤(10,000g,15分钟,4℃)后，将蛋白质沉淀重悬浮于20μl 200mM TEAB(三乙基碳酸氢铵；Sigma-Aldrich)中。加入1μg胰蛋白酶(Trypsin Gold,质谱级；Promega)以消化蛋白质，同时37℃孵育过夜。停止消化，加入最终浓度为200mM的HCl水解Rapigest(30分钟，室温)。离心步骤(10,000g,15分钟,4℃)后，取出沉淀，样品稀释于2％乙腈和0.1％甲酸中,最终浓度为0.2μg/μl。在所有样品中加入4fmol/μl GFP([Glu1]-人纤维蛋白肽B；Sigma-Aldrich)。
纳米级反相液相层析和质谱
总共将补充有20fmol GFP的1μg肽混合物加到LC柱上。在Nano Acquity UltraPerformance LC系统(Waters)上使用nanoACQUITY UPLC Symmetry C18捕获柱(180μm x20mm；Waters)偶联ACQUITY UPLC肽BEH C18 nanoACQUITY柱(100μm X 100mm；Waters)分析胰蛋白酶肽混合物。线性梯度的流动相B(98％乙腈,0.1％甲酸,pH＝2)，68分钟内5到45％，然后是一个3分钟内增加到90％流动相B的步骤。流速设为400nl/分钟。纳米LC与LTQ VelosOrbitrap质谱仪(Thermo Scientific)通过纳米喷雾离子源(Thermo Scientific)在线连接。
LTQ Velos轨道阱设为MS/MS鸟枪模式，其中完整MS1前体扫描(300–2000m/z,分辨率60,000)后是10个最强前体峰的最多10个碰撞诱导解离(CID)MS2谱。在质谱仪的线性离子阱中获得CID谱。CID中所用的标准碰撞能力设为35％。我们使用了30秒动态排除以进行数据依赖采集。
质量控制分析
在质量控制(QC)分析中调查MS/MS结果(原始数据)和Proteome Discoverer结果。系统性进行QC分析，因为其保证每个样品每个时刻的样品质量和MS仪器。如果出于一些原因样品未达到所需的QC参数，这些样品将被排除在进一步数据分析步骤以外。
数据富集过程
为了对每个样品的所有肽获得定量数据，我们自主开发了软件在原始MS1数据中查找峰强度。简单说，该软件工具寻找原始MS1数据中保留时间窗为10分钟的###ppm为5的m/z值。以此，获得数据矩阵，其包括来自几乎所有鉴定的肽的定量信息。算法同时用诱饵检索净化了得到的数据，还检查了峰形。
模型建立
步骤1和步骤2的数据用作训练数据。用步骤1的数据选择显著差异表达的蛋白质。用步骤2的数据作为第一验证数据组。我们测试的假设是ABMR对非ABMR。用ANOVA选择在ABMR病例中显著上调或下调的蛋白质。对步骤1和步骤2样品中的每种蛋白独立产生的数据应用ANOVA。在最终列表中，选择顶部的21种蛋白质，其在ABMR1中相对于ABMR0(即ABMR对非ABMR)上调，在两个步骤之一(蛋白质水平上)具有至少0.8的倍数改变(log2倍数改变)(图1)。
一旦选择了蛋白质，每种蛋白质选择2种独特肽(无错切)(表1)。选择基于峰评分及其用于目标分析的适用性。如果最终列表中的蛋白质没有两条肽满足这些条件，则将该蛋白质排除出模型。如此，可在该研究后的额外验证步骤中，使用靶向蛋白质组学验证模型。在该ANOVA分析中仅使用独特肽。步骤1和步骤2分析的结果在下表1中列为log2倍数改变和p值。
模型验证
最终，模型化的支持向量机(SVM)应用于获自步骤3样品的标准化富集数据，其作为独立验证数据组。产生一条ROC曲线，观察结果，并对每个病人作图。
结果
肽鉴定
用Proteome Discoverer软件(2.1版；Thermo Scientific)对人Uniprot数据库检索所有数据。使用两种检索引擎Mascot和Sequest。采用如下检索参数：前体质量公差10ppm，片段质量公差0.5Da。选择酪蛋白酶作为切割酶，允许2次漏切。氨甲基甲基化被定位半胱氨酸上的固定修饰，甲硫氨酸氧化，丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸磷酸化被定位可变修饰。用以下设定过滤得到的肽鉴定结果：仅包括基于目标-伪装法假发现率(FDR)<5％的高度置信和评级为一级的肽，以获得图1中所指的蛋白质。
在另一种实验设置中，确定图1所列基因的表达产物在表达产物为mRNA时，不能区分ABMR和非ABMR表型(数据未显示)。
统计分析-模型建立
ANOVA应用于步骤1和步骤2中获得的数据，以p值列出结果。图1显示了最高的21种所选蛋白。我们选择了两种各自具有高置信鉴定的独特肽，其也可用于靶向分析。如果这些独特的肽不在列出的蛋白质的范围内，在该模型中不使用蛋白质。如此，我们最终的模型包括来自6种蛋白的12种肽。所选的肽如下文的表1所示。在我们的分析中生物活检结果被认为“结果可变”。我们对于步骤1和步骤2，用12种所选肽作为参数训练了支持向量机。固定截留点后，我们获得84.7％的灵敏度和78.3％的特异性(见表2)。
Figure BDA0002651234290000221
Figure BDA0002651234290000231
表1：用于训练SVM模型的独特肽选择列表
Figure BDA0002651234290000232
灵敏度＝84.7％
特异性＝78.3％
表2：训练数据组的列联表。
表2显示了用模型对样品分类的概貌，与生物活检结果比较。我们看到，对于诊断ABMR，该模型比起病理学家的决定更保守，因为在几乎30％生物活检结果诊断为ABMR的例子中，模型是反对的，而对于ABMR0(即非ABMR)，模型仅在15％案例中有反对。然而，这15％是非常重要的病例，因为在此模型能够在组织学揭示任何排斥迹象之前掌握ABMR的迹象。在ABMR诊断的病例中，模型能够帮助病理学家作出更准确的诊断。
统计分析-模型建立
用来自步骤1和2的数据作为训练数据组对SVM模型拟合。因此，用步骤3的样品作为完全独立的验证数据组。在大组(240个先前接受肾同种异体移植物的独立病人)中进行验证。
77％样品正确分类。固定截留点后，获得79.1％的灵敏度和70.3％的特异性(见表3)。
验证数据
Figure BDA0002651234290000241
灵敏度＝79.1％
特异性＝70.3％
表3：验证数据组的列联表。
实施例2.
该实施例基于实施例1。
研究中包括了额外的肾同种异体移植物受体。样品制备和蛋白质表达水平测定如实施例1所示。
训练数据组再次代表249名肾同种异体移植物受体，验证数据组现在代表391名肾同种异体移植物受体。复查该研究中包括的所有生物活检样品，将其以混合方式由与原来中心不同的中心病理学家分级。图3提供了研究概貌。
结果
在选链组中，60/249例显示ABMR(24.1％)，验证组中为43/391(11.0％)。
当扩大患者群体时，也达到实施例1的结果。
随后用实施例1相同方式，通过每种蛋白质选择2条独特肽，基于10种蛋白质(A1BG,AFM,APOA1,APOA4,IGHA1,IGHG4,LRG1,SERPINA1,SERPINC1和TF)建立诊断模型。下表4提供了这组20种肽。
GeneID 肽 SEQ ID
A1BG ATWSGAVLAGR 9
A1BG cEGPIPDVTFELLR 10
AFM AESPEVcFNEESPK 11
AFM FTDSENVcQER 12
APOA1 DLATVYVDVLK 13
APOA1 DYVSQFEGSALGK 14
APOA4 ISASAEELR 15
APOA4 SLAELGGHLDQQVEEFR 16
IGHA1 DASGVTFTWTPSSGK 5
IGHA1 TFTcTAAYPESK 6
IGHG4 TTPPVLDSDGSFFLYSR 17
IGHG4 YGPPcPScPAPEFLGGPSVFLFPPKPK 18
LRG1 ALGHLDLSGNR 19
LRG1 DLLLPQPDLR 20
SERPINA1 LSITGTYDLK 3
SERPINA1 SVLGQLGITK 4
SERPINC1 ADGEScSASMMYQEGK 21
SERPINC1 IEDGFSLK 22
TF cSTSSLLEAcTFR 7
TF DSGFQMNQLR 8
表4：用于训练训练组中SVM模型的所选肽列表
表5显示了所述10种基因每一种的诊断表现。
Figure BDA0002651234290000261
表5.将ABMR与非ABMR表型在训练数据组中分开的10种蛋白列表
该组10种蛋白质每一种蛋白质由两种肽代表，被认为是图1选出的10种随机蛋白质的良好代表。图4(训练组)和图5(验证数据组)显示了10蛋白模型的ROC曲线。将截留点固定为0.30后，该模型达到95％的灵敏度和96％的特异性。此外，还显示该10蛋白模型的诊断表现还能用所述10蛋白组的六种随机蛋白质实现(表6和7)。
Figure BDA0002651234290000262
Figure BDA0002651234290000271
表6：模型中包括的不同蛋白质组。
模型名称 TP TN FP FN 灵敏度 特异性 PPV NPV
训练组
模型10 57 182 7 3 0.95 0.96 0.89 0.98
模型6A 57 179 10 3 0.95 0.95 0.85 0.98
模型6B 57 178 11 3 0.95 0.94 0.84 0.98
模型6C 57 178 11 3 0.95 0.94 0.84 0.98
验证组
模型10 41 263 85 2 0.95 0.76 0.33 0.99
模型6A 36 243 105 7 0.84 0.70 0.26 0.97
模型6B 36 241 107 7 0.84 0.69 0.25 0.97
模型6C 40 243 105 3 0.93 0.70 0.28 0.99
表7：来自全部4个模型，对于训练数据组和验证数据组拟合的结果TP:真阳性；TN:真阴性；FP：假阳性；FN：假阴性；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值。
最后，图6显示了所述10种蛋白质组的至少两种随机蛋白质的诊断表现。出乎意料的是，显示了所述10种蛋白质组的至少两种随机蛋白质已提供了与ABMR大于87％的关联。显示了用6种蛋白质在诊断表现中已到达平台。

Claims (16)

1.一种根据抗体介导排斥(ABMR)存在与否对同种异体移植物受体进行分型的方法，包括步骤：
--在包含同种异体移植物受体的蛋白质的样品中测定至少两种选自以下基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1；
-比较所述测定的蛋白质水平与所述至少两种基因的参比蛋白质水平；
-基于测定蛋白质水平和参比蛋白质水平的比较，根据ABMR的存在与否对同种异体移植物受体进行分型。
2.如权利要求1所述的方法，其中方法用于对所述同种异体移植物受体的样品根据ABMR存在与否分型。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中同种异体移植物受体是肾同种异体移植物受体。
4.如先前权利要求任一所述的方法，其中样品是体液样品，优选尿样。
5.如先前权利要求任一所述的方法，其中测定至少六种选自以下基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1。
6.如前任一权利要求1-4所述的方法，其中在A1BG,AFM,APOA1,APOA4,IGHA1,IGHG4,LRG1,SERPINA1,SERPINC1和TF形成的组中选择至少两种基因来测定蛋白质水平。
7.如权利要求6所述的方法，其中在A1BG,AFM,APOA1,APOA4,IGHA1,IGHG4,LRG1,SERPINA1,SERPINC1和TF形成的组中选择至少六种基因来测定蛋白质水平。
8.如先前权利要求任一所述的方法，其中当与未患有ABMR的同种异体移植物受体的参比样品中所述至少两种基因的参比蛋白质水平比较有增加时，所述同种异体移植物受体或其样品分型为具有ABMR。
9.根据先前权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
-在样品中用胰蛋白酶消化蛋白质，从而提供肽混合物；
-对所述肽混合物进行液相层析步骤，以提供含有肽的洗脱液；和
-对所述洗脱液进行质谱步骤，以测定至少两种肽的肽水平，所述至少两种肽代表所述至少两种基因的蛋白质水平。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述至少两种肽选自SEQ ID NO:1-22。
11.如权利要求1-8任一所述的方法，其中用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行所述蛋白质水平测量。
12.一种将同种异体移植物受体指定为ABMR组或非ABMR组的方法，包括步骤：
--在包含患有或有风险患有移植排斥的同种异体移植物受体的蛋白质的样品中测定至少两种选自以下基因的蛋白质水平：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1和APOA1；
-比较所述测定的蛋白质水平与所述至少两种基因的参比蛋白质水平；
-根据将所测定的蛋白质水平与参比蛋白质水平比较，将所述同种异体移植物受体指定到所述ABMR组或所述非ABMR组。
13.至少两种蛋白质的用途，优选所述至少两种蛋白质的蛋白质水平，其由选自以下的基因编码：TF,SERPINA1,APOA4,AFM,AZGP1,ORM1,ORM2,C3,A1BG,SERPINC1,LRG1,IGHA1,IGHG4,TFAP2C,HPX,A2M,CARD6,SERPINA7,CCDC73,CYSTM1或APOA1，该用途是在尿样中作为肾同种异体移植物受体是否存在ABMR的标志物。
14.一种标准疗法的治疗药，用于治疗患有ABMR相关移植排斥的同种异体移植物受体，其中(i)所述受体或其样品根据权利要求1-11任一所述的方法分型成具有ABMR，或(ii)所述受体或其样品根据权利要求12所述的方法指定到ABMR组。
15.如权利要求14所述的用途的标准疗法治疗剂，其中所述药剂选自：皮质类固醇、利妥昔单抗、静脉免疫球蛋白(IVIG)产品，硼替佐米,依库珠单抗及其组合，其中所述药剂用于根据治疗有效的给药方案施用。
16.一种治疗患有ABMR相关移植排斥的同种异体移植物受体的方法，包括步骤：
-对患有ABMR相关移植排斥的同种异体移植物受体施用治疗有效量的标准疗法的治疗药，其中(i)所述受体或其样品根据权利要求1-11任一所述的方法分型成具有ABMR，或(ii)所述受体或其样品根据权利要求12所述的方法指定到ABMR组。
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