CN111961722A - miR-887在乳腺癌诊断和治疗中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测miR‑887表达的试剂在制备评估乳腺癌风险的产品中的应用，所述miR‑887的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步，本发明还公开了miR‑887在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。本发明首次发现了miR‑887在乳腺癌细胞中表达下调，同时还公开了miR‑887在乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭中起着重要的作用，提示miR‑887可应用于乳腺癌的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药研究领域，特别是涉及miR-887在乳腺癌诊断和治疗中的用途。
背景技术
乳腺癌(breast cancer)是女性最普遍的恶性肿瘤之一，通常发生在乳腺上皮组织。据资料统计，乳腺癌的发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％。全球每年有135万新增加的乳腺癌，其中有42万死亡，每年递增是2％。中国每年有4万多妇女死于本病，虽然不是乳腺癌高发国家，但是其增长速度远远高于其他国家。它的发病影响因素较多，遗传易感性和基因与环境相互作用均与其发生、进展和转移密切相关。虽然通过之前的研究已经发现了多种致癌基因和抑癌基因，使乳腺癌的诊断率有所提高，治疗效果有所改善，但并不能完全解决问题。因此需要对肿瘤发生的分子机制深入了解，为乳腺癌患者的治疗提供新的有效的治疗方法。在没有完全找到乳腺癌的发病原因之前，乳腺癌的早诊断、早治疗，是降低乳腺癌死亡率的关键。
microRNA是一种不编码蛋白质的，约21-25nt大小的单链小分子RNA。通过特异性的结合靶基因来调控其表达。在过去的几十年，大量的microRNA被发现并认为在细胞的发生、分化、增殖和凋亡起着重要的作用。据报道，miRNAs调控人类60％编码蛋白基因的表达，通过结合其目标基因mRNA的3’非翻译区而导致mRNA的降解或者翻译抑制。除了沉默作用外，某些miRNAs还被证实能激活基因的表达。在不同的肿瘤类型中，microRNA呈现两种不一样的角色：抑癌基因和癌基因。主要的作用机制包括：miRNA位点的缺失、扩增、突变，表观遗传水平改变，转录调控因子的异常表达等。
由于乳腺癌给人类健康带来的巨大危害，研究者们正通过各种途径寻找有效的治疗乳腺癌的方法。分子标志物正在被尝试应用到乳腺癌的诊断和治疗当中。最近的研究表明microRNA(miRNA)在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，寻找与乳腺癌发生发展相关的miRNA对乳腺癌的机制研究以及临床上的诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明提供了一种用于评估乳腺癌风险和/或治疗乳腺癌的标记物-miR-887及其应用，并为乳腺癌的治疗提供了新的方法和思路。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了检测miR-887表达的试剂在制备评估乳腺癌风险的产品中的应用，所述miR-887的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述产品用于诊断受试者是否患有乳腺癌风险，通过测量来自所述受试者的测试样品中的miR-887的水平来诊断受试者是否患有乳腺癌风险，其中与对照样品中miR-887的水平相比，测试样品中miR-887的水平下调，指示着受试者患有乳腺癌的风险。
在一些实施方式中，所述试剂包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miR-887或其同源物的水平的试剂。
在一优选实施方式中，所述试剂包括特异性针对miR-887的探针或引物。
本发明的第二方面，提供了miR-887在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用，所述miR-887的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些实施方式中，所述应用包括制备抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭和增殖的药物组合物。
在一些实施方式中，所述药物组合物包括促进miR-887表达或增强miR-887功能的试剂。
在一些实施方式中，所述试剂包括miR-887的模拟物、miR-887的激动剂或过表达miR-887的载体。
本发明的第三方面，提供了一种治疗乳腺癌癌/乳腺癌侵袭/乳腺癌转移的药物组合物，所述药物组合物以miR-887为活性成分，其中，所述miR-887的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
在一种实施方式中，所述药物组合物含有与载体结合的miR-887和/或药物可接受的辅料。
优选地，所述载体包括病毒载体、脂质体或壳聚糖。
本发明将miR-887作为作用对象，对药物进行筛选，以找到可以促进miR-887表达的激动剂作为乳腺癌治疗备选药物。如本发明所述的miR-887模拟物即是以人miR-887为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移作用的药物。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明通过过表达miR-887后可有效地抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭进程。本发明提供的miR-887核苷酸或模拟物能够特异性抑制乳腺癌细胞的增殖速率、迁移、侵袭，从而治疗乳腺癌，为乳腺癌治疗开辟新的方向。
附图说明
图1 miR-887在乳腺癌细胞中的表达；
图2 miR-887转染模拟物后，Q-PCR检测miR-887的表达量；
图3 miR-887转染模拟物后检测细胞增殖；
图4 miR-887抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
在本发明中，术语“miR-887”是指包含SEQ ID No.1所示序列或其同源序列的微小RNA。本领域中已知各种来源的miR-887，例如，人、鼠、兔等，这些同源序列均包含在本发明的术语miR-887中。本发明的术语中还包含上述天然存在的miR-887序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有miR-887生物活性的衍生RNA。
本发明中，人工合成的以及可以通过购买市售商品方式获得的具有miR-887生物学活性的miR-887模拟物也属于本发明的保护范围。
此外，本发明所述的miR-887也可以为前体形式，miR-887前体是指在被施用对象的细胞内或体内可以被加工成为miR-887的前体。获得天然存在的miR-887前体的方法为本领域技术人员所公知。
本领域技术人员公知，miR-887的初始转录产物经过一系列的加工后，形成成熟的miR-887。miR-887前体只有在加工成成熟的miR-887后才具有相应的生物学功能。
本发明的统计学分析：
所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用双侧Student's t检验。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图，以P<0.05为检验水准，当P<0.05为差异有统计学意义。
实施例1 QPCR检测miR-887在乳腺癌细胞中的表达
发明人检测MCF10A(对照细胞)、MCF-7、MDA-MB-231细胞中miR-887的表达水平。
1.miRNA提取
使用Tiangen的miRNA提取试剂盒，每200μl细胞中加入等体积裂解液，振荡器振荡混匀30秒。室温放置5min后，12,000rpm离心10min，取上清，加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5min后，12,000rpm离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min,12,000rpm离心30秒，保留流出液。缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min后12,000rpm离心30秒，离心后保留吸附柱。向吸附柱中加入500μl去蛋白液，室温12,000rpm离心30sec，弃废液。500μl漂洗液，室温12,000rpm离心30秒。将吸附柱放入2ml收集管中，室温12,000rpm离心1min，去除残余液体。再将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加15-30μl无RNA酶的水，室温12,000rpm离心2min。
2.逆转录
将10pg-1μg的RNA模板与2μl 10倍缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl引物、0.5μl核糖核酸酶抑制剂和无核糖核酸酶水混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl 0.5μg/μl特异性RT引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl 5倍缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。
3.Q-PCR检测
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/l)1μl，反向引物(5μM/l)1μl，模板cDNA2μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min,(95℃20s，60℃55s)40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2-ΔΔCT法进行相对定量。
4.结果
结果如图1所示，与对照细胞MCF10A相比，miR-887-5p在人乳腺癌细胞系中MCF-7、MDA-MB-231细胞中低表达，*P<0.05。
实施例2 miR-887基因对乳腺癌细胞增殖的影响
实验中所用的mimics NC(阴性对照)和miR-887mimics均由上海吉玛公司合成。
用转染试剂LipofectamineTM 3000将miR-887mimics(miR-887模拟物)转染乳腺癌MDA-MB-231细胞中，具体步骤如下：
1)转染前24h，在装有培养基的6孔板中接种3.0×105个细胞，转染时细胞融合度达到50％；
2)配制转染物:9μ1miR-887mimics及NC中加入125μl无血清无抗生素的RMPI 1640培养基，每孔加入5μl的LipofectamineTM 3000试剂，充分吹打混匀，后静置5min；
3)用吸管吸去6孔板中的培养液，然后在每孔中加入提前配好的800μl含10％胎牛血清的培养液和转染物；
4)轻轻晃动培养板，使试剂充分混合，置于培养箱中继续培养，6h后，更换新鲜的培养液。
用Q-PCR检测其表达量，具体步骤参照实施例1所述。结果如图2表明，miR-887mimics转染MDA-MB-231后细胞中miR-887表达量显著性上升(*P<0.05)，证明mimics能够模拟miR-887的表达。
进一步，miR-887mimics转染MDA-MB-231细胞24、36、48、72和96h后，体外用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，具体步骤如下：
转染后的MDA-MB-231细胞培养72h，用0.25％胰酶消化进行细胞计数，将细胞接种于96孔板中，浓度为1×104/ml，每孔加100μl；避光条件下，96孔板中每孔加入10μl的CCK8试剂，晃动培养板3min，然后将培养板放入培养箱中继续培养，2h后取出，在酶标仪450nm波长处测定OD值。
结果如图3，过表达miR-887后，相比对照，细胞增殖明显受到抑制(*P<0.05)。可见，miR-887能够显著性抑制乳腺癌细胞的增殖。
实施例3细胞迁移及侵袭实验
1、侵袭实验
Matrigel用PBS进行20倍稀释，以50μl/孔的体积铺在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃预置2h聚合成凝胶备用。每组设3个复孔，上室每孔加入200μl细胞悬液，约1×l05个；在下室加入500μl含FBS的RMPI 1640培养基，置于37℃、5％CO2条件下培养24h后用70％甲醇固定，0.4％结晶紫染色，封片后随机选取4个视野(x100)计穿膜细胞数，取平均值。
2、迁移实验
过程与Transwell侵袭实验基本一致，但不需要铺Matrigel胶及培养板置于37℃、5％CO2条件下培养8h。
3、结果
结果如图4所示，与对照组相比，实验组的迁移及侵袭能力均有明显下降(*P<0.05)，结果说明miR-887水平的升高能够抑制乳腺癌的迁移及侵袭，提示miR-887可作为靶标应用于乳腺癌转移的治疗。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京大学深圳医院
<120> miR-887在乳腺癌诊断和治疗中的用途
<130> P200232
<141> 2020-07-15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> miR-887
<400> 1
cttgggagcc ctgttagact c 21
Claims (10)
1.检测miR-887表达的试剂在制备评估乳腺癌风险的产品中的应用，所述miR-887的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miR-887或其同源物的水平的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性针对miR-887的探针或引物。
4.miR-887在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用，所述miR-887的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭和增殖的药物组合物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括促进miR-887表达或增强miR-887功能的试剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂包括miR-887的模拟物、miR-887的激动剂或过表达miR-887的载体。
8.一种治疗乳腺癌/乳腺癌侵袭/乳腺癌转移的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以miR-887为活性成分，其中，所述miR-887的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有与载体结合的miR-887和/或药物可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述载体包括病毒载体、脂质体或壳聚糖。
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