CN111956633B - 石斛酚或其联合妥布霉素抗铜绿假单胞菌感染的制药用途 - Google Patents

石斛酚或其联合妥布霉素抗铜绿假单胞菌感染的制药用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了石斛酚或其联合妥布霉素抗铜绿假单胞菌感染的制药用途。本发明首次发现石斛酚具有抑制铜绿假单胞菌感染的作用，并且在有效剂量下不抑制铜绿假单胞菌生长；本发明首次发现石斛酚与妥布霉素联合用药能有效抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成，预示着其具有较好的预防和治疗铜绿假单胞菌感染的临床应用前景。

Description

石斛酚或其联合妥布霉素抗铜绿假单胞菌感染的制药用途
技术领域
本发明属于医药技术，特别涉及石斛酚或其联合妥布霉素抗铜绿假单胞菌感染的制药用途。
背景技术
抗生素的滥用加剧了细菌耐药性的产生。细菌产生耐药的一个重要原因是形成生物被膜(Biofilm)。生物被膜形成了一道天然屏障，能够阻碍抗生素通过细胞膜进入细胞内部，从而使大多数抗生素失去药效。当前，解决细菌耐药的一个重要途径是研发新型抗感染药物，即在不杀菌，不抑制细菌生长的前提下，通过抑制细菌毒力因子的产生，而达到降低毒力，减少细菌对宿主侵染的目的。
群体感应(Quorum sensing，QS)是细菌之间的一种交流方式，研究表明，细菌毒力因子的产生、生物被膜的形成均受到QS系统的调控。因此，阻断细菌的QS，降低毒力因子产生和生物被膜形成，是解决细菌耐药的重要途径。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一种革兰氏阴性菌，是导致临床病人感染的常见病原菌。铜绿假单胞菌的QS系统由las、rhl和pas组成。铜绿假单胞菌所分泌的毒力因子例如蛋白酶(Protease)、弹性蛋白酶(Elastase)、绿脓菌素 (Pyocyanin)、鼠李糖脂(Rhamnolipid)、海藻酸盐(Alginate)均受QS系统的调控。此外，铜绿假单胞菌生物被膜的形成以及Swimming和Swarming也都受QS系统的调控。因此，抑制铜绿假单胞菌的QS系统，能够降低其选择性压力，降低其耐药性的产生。
抗生素的广泛使用使得细菌产生耐药性，临床上只能加大抗生素的使用量来治疗耐性菌感染。而抗生素的过度使用又进一步加剧了细菌多重耐药，甚至泛耐药。因此，寻求新的抗生素替代方案，或者开发新型药物，以抑制细菌毒力为目的，而不对细菌产生选择性压力，这样就避免了细菌耐药性的产生。再将这种药物与传统抗生素联合用药，以达到增强抗生素药敏性的效果。
石斛酚(CAS登记号：67884-30-4)是从药用植物石斛提取出来的一种酚类物质，其结构如下：
Figure BDA0002655037150000021
石斛酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉硬化、降血糖等多种功效。但至今尚未见有关石斛酚抗感染的研究报道。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了石斛酚或其联合妥布霉素抗铜绿假单胞菌感染的制药用途。
技术方案：石斛酚在制备改善或治疗铜绿假单胞菌感染药物中的应用。
进一步的，所述石斛酚通过抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成而达到抗感染目的。
更进一步的，所述石斛酚通过抑制铜绿假单胞菌群体感应从而抑制生物被膜。
更进一步的，所述石斛酚能够抑制铜绿假单胞菌群体感应调控的毒力因子的合成，能够抑制铜绿假单胞菌群体感应相关基因的表达。
石斛酚联合妥布霉素用于制备改善或者治疗铜绿假单胞菌感染药物中的应用也在本发明的保护范围内。
有益效果：(1)本发明首次发现石斛酚具有抑制铜绿假单胞菌感染的作用，并且在有效剂量下不抑制铜绿假单胞菌生长；(2)本发明首次发现石斛酚与妥布霉素联合用药能有效抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成，预示着其具有较好的预防和治疗铜绿假单胞菌感染的临床应用前景。
附图说明
图1是石斛酚对群体感应调控的毒力因子表达的抑制作用；
图2是石斛酚抑制群体感应相关基因的表达；
图3是石斛酚联合妥布霉素抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。
实施例1
对群体感应调控的毒力因子表达的抑制作用：
药物：石斛酚由药用植物石斛分离提取获得也可购置于上海源叶生物科技有限公司。
菌株：铜绿假单胞菌PAO1由中国海洋大学宫倩红副教授赠送。
挑取铜绿假单胞菌PAO1单菌落接种到NB培养基中，37℃、180rpm培养 17h。取培养好的菌液30uL接种到30mL新鲜的NB培养基中，同时加入终浓度为100和200μg/mL的石斛酚，以DMSO为阴性对照，以100μg/mL的白藜芦醇(Resveratrol,Res)为阳性对照。37℃、180rpm培养17h。培养液于4℃、 10000rpm离心10min。
蛋白酶活性测定：取100mg偶氮酪蛋白溶于5mL浓度为50mM的Tris/HCl，备用。取250μL该溶液加入到150μL菌液上清液中，混匀后4℃静置4h，然后加入1.2mL浓度为10％的三氯乙酸终止反应。混匀后4℃静置15min，10000 rpm离心10min。取上清加入1.4mL浓度为1M的NaOH，混匀后测定OD440。
试验结果：由图1A可知，与DMSO和白藜芦醇对照组比较，100和200μg/mL 的石斛酚能显著抑制蛋白酶活性，并且随着石斛酚浓度的增加，其抑制活性增加。
弹性蛋白酶活性的测定：取100μL菌液与900μL弹性蛋白酶缓冲液混合(含刚果红20mg，100mM Tris/HCl，1M CaCl2，pH 7.5)，37℃、180rpm培养3 h，10000rpm离心10min。吸取上清，酶标仪测定OD495。
试验结果：由图1B可知，与DMSO和白藜芦醇对照组比较，100和200μg/mL 的石斛酚能显著抑制弹性蛋白酶活性，并且随着石斛酚浓度的增加，其抑制活性增加。
绿脓菌素含量的测定：取3mL氯仿加入到5mL菌液中，混匀，静置分层后取下层有机相加入1mL 0.2M的HCl，混匀后10000rpm离心10min，酶标仪测定OD520。
试验结果：由图1C可知，与DMSO和白藜芦醇对照组比较，100和200μg/mL 的石斛酚能显著抑制绿脓菌素的产生，并且随着石斛酚浓度的增加，其抑制活性增加。
鼠李糖脂含量的测定：取300μL菌液加入600μL乙醚震荡萃取，静置分层后，取有机相氮吹仪吹干，加入100μL蒸馏水溶解，加入800μL 60％的浓硫酸和100μL1.6％的地衣酚，80℃反应30min，冷却后，吸取反应液测定OD421。
试验结果：由图1D可知，与DMSO和白藜芦醇对照组比较，100和200μg/mL 的石斛酚能显著抑制鼠李糖脂的产生，并且随着石斛酚浓度的增加，其抑制活性增加。
海藻酸盐含量的测定：取70μL菌液与600μL硼酸/盐酸(4:1)混匀，混合液置于55℃水浴30min，测定OD530。
试验结果：由图1E可知，与DMSO和白藜芦醇对照组比较，100和200μg/mL 的石斛酚能显著抑制海藻酸盐的产生，并且随着石斛酚浓度的增加，其抑制活性增加。
铁载体活性的测定：取菌液用Tris/HCl(pH 7.4)10倍稀释，酶标仪测定 OD405。
试验结果：由图1F可知，与DMSO和白藜芦醇对照组比较，100和200μg/mL 的石斛酚能显著抑制铁载体活性，并且随着石斛酚浓度的增加，其抑制活性增加。
运动能力测定：取过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液2μL点到swimming 培养基(蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂0.3g，水100mL，pH 7.2)和swarming 培养基(NB培养基0.8g，葡萄糖0.5g，琼脂0.5g，水100mL，pH 7.2)中央，以DMSO为阴性对照，白藜芦醇为阳性对照，37℃培养过夜。
试验结果：由图1G和图1H可知，与DMSO和白藜芦醇对照组比较，石斛酚能显著抑制swimming和swarming。图1 G和图1 H中，a为DMSO处理组，b 为100μg/mL白藜芦醇处理组，c和d分别表示100和200μg/mL石斛酚处理组。
实施例2
对群体感应相关基因的表达的影响：接种铜绿假单胞菌PAO1单菌落至NB 培养基中，37℃、180rpm培养17h。取菌液30μL加入到30mL NB培养基中，加入终浓度为100μg/mL的石斛酚，以DMSO为对照，37℃、180rpm培养17h。按照RNeasy Mini Kit试剂盒(天根生物，北京)的提取方法提取总RNA，并按照RNeasy Mini Kit试剂盒所述方法进行RNA逆转录试验，设定lasI、lasR、rhlI、 rhlR以及内参基因rpsL的引物(如表1所示)。
表1试验用引物序列
Table 1Primers used in this study
Figure BDA0002655037150000051
(1)根据
Figure BDA0002655037150000052
Premix Ex TaqTM(Tli RnaseH Plus)kit建立qRT-PCR反应体系，如表2所示
表2qRT-PCR反应体系
Table 2qRT-PCR Reaction
Figure BDA0002655037150000053
(2)用Applied Biosystems 7300Real-time PCR System进行qRT-PCR试验，反应循环参数如下：95℃，30s；95℃，5s；58℃，30s；72℃，30s；95℃， 15s；60℃，30s。试验重复3次，每个试验设置4个重复。
试验结果：由图2可知，石斛酚处理后，群体感应相关基因lasI、lasR、rhlI、 rhlR均显著下降。
实施例3
生物被膜抑制试验：接种铜绿假单胞菌PAO1单菌落至NB培养基中，37℃、 180rpm培养17h。取菌液30μL加入到30mL TSB培养基中，混匀。分别加入 0.4μg/mL妥布霉素、100μg/mL石斛酚、200μg/mL石斛酚、0.4μg/mL妥布霉素+100μg/mL石斛酚、0.4μg/mL妥布霉素+200μg/mL石斛酚。以DMSO为阴性对照。取上述各组混合液200μL，加入到96孔板中，37℃静置培养24h。培养后，洗去浮游的细菌，60℃烘干。加入200μL甲醇固定15min，60℃烘干。加入200μL浓度为0.05％的结晶紫染色，15min，吸去多余的结晶紫，水洗 3遍，60℃烘干。加入200μL无水乙醇脱色30min。吸取120μL测定OD570。此外，对于生物被膜的抑制作用，采用扫描电子显微镜进行观察。
试验结果：由图3A可知100和200μg/mL的石斛酚能显著抑制生物被膜的形成。而且妥布霉素与石斛酚联合用药后，能显著增强对生物被膜的抑制作用。扫描电子显微镜(图3B)进一步证实了上述结论。

Claims (1)

1.石斛酚联合妥布霉素在制备改善或者治疗铜绿假单胞菌感染药物中的应用。
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