CN113398116A - 鸢尾黄素在制备单增李斯特菌分选酶a抑制剂中的应用 - Google Patents

鸢尾黄素在制备单增李斯特菌分选酶a抑制剂中的应用 Download PDF

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张思琪
刘敏达
周永林
沈雪
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冯海华
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Abstract

本发明涉及鸢尾黄素在制备单增李斯特菌分选酶A抑制剂中的应用，通过SrtA酶活性实验、生物被膜实验和细胞侵袭实验验证鸢尾黄素能够有效抑制SrtA催化活性并对单增李斯特菌致病力有一定的抑制作用；小鼠单增李斯特菌全身感染模型治疗实验证明鸢尾黄素能够对单增李斯特菌造成的感染有良好的治疗效果。

Description

鸢尾黄素在制备单增李斯特菌分选酶A抑制剂中的应用
技术领域
本发明涉及鸢尾黄素在抑制单增李斯特菌分选酶A的催化活性及制备李斯特菌感染药物中的应用，属于医学制药技术领域。
背景技术
单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌)，是一种兽医临床上重要的革兰氏阳性机会致病菌，也是开展抗细菌感染药物研究及评价的重要模式病原菌。分选酶A(SrtA)在单增李斯特菌感染过程中对病原菌的致病力起着非常关键的作用，是单增李斯特菌抗感染药物研发的重要潜在靶标。抗生素作为治疗细菌感染的首选，随着其在医疗和畜牧养殖等领域的长期、大量和不合理使用导致细菌耐药性问题日趋严重，因此研发新型抗生素或替代药物迫在眉睫。
天然产物是抗毒力药物的重要资源，目前以SrtA为靶标的抗毒力药物的发现主要依赖于合成的小分子化合物和天然产物等。本研究旨以SrtA为靶标，针对天然化合物鸢尾黄素，研究其对单增李斯特菌致病力的抑制作用，为抗单增李斯特菌感染药物的研发提供有效的先导化合物。鸢尾黄素是一种天然存在的异黄酮类化合物，是中药材射干的有效成分之一。射干是一种常用的中药材，具有清热解毒、化痰散结的功效，具有抗炎、解热、抗过敏、抗微生物等作用。据报道，鸢尾黄素可抑制蛋白酪氨酸激酶活性，具有雌激素样作用，抗炎作用，抗氧化作用，预防糖尿病、抗过敏的作用和尿素酶抑制作用等。目前，国内外未见鸢尾黄素通过抑制单增李斯特菌分选酶A催化活性来抵抗李斯特菌感染的报道。
发明内容
本发明所述鸢尾黄素CAS登录号为548-77-6，分子式为C16H12O6，分子量为300.26。
鸢尾黄素的化学结构式如下：
Figure BDA0003178938690000021
本研究以SrtA为抗感染药物研究的靶标，研究鸢尾黄素对单增李斯特菌致病力的抑制作用。本研究通过SrtA酶活性实验、生物被膜实验、细胞侵袭实验和体内动物感染实验验证鸢尾黄素对单增李斯特菌致病力的抑制作用，结果表明鸢尾黄素可有效抑制SrtA催化活性从而抵抗单增李斯特菌感染。
附图说明
图1：鸢尾黄素对SrtA酶活性的抑制作用；
图2：鸢尾黄素对单增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用；
图3：鸢尾黄素对单增李斯特菌侵袭Caco-2细胞的抑制作用；
图4：鸢尾黄素对单增李斯特菌感染模型的生存率分析。
具体实施方式
通过以下实施进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
1.鸢尾黄素对SrtA酶活性的影响
本研究通过荧光共振能量转移实验(FRET)检测了鸢尾黄素对SrtA酶活性的抑制作用。单增李斯特菌SrtA识别和切割的多肽序列为LPETG，本实验所用的底物多肽为Dabcyl-QALPETGEE-Edans。SrtA蛋白与不同浓度(0～16μg/mL)鸢尾黄素在37℃下于96孔黑板中共孵育30min后，在相应孔加入荧光修饰底物肽或反应缓冲液，设置阳性对照组和阴性对照组，避光孵育1h时应用酶标仪测定荧光值，计算并分析各不同浓度鸢尾黄素对SrtA酶催化活性的影响，结果见附图1。
结论：本研究通过荧光共振能量转移法表明鸢尾黄素对Srt A酶活性有抑制作用。鸢尾黄素可剂量依赖性地抑制Srt A的酶活性，16μg/mL鸢尾黄素的抑制率可达39％。
2.鸢尾黄素对单增李斯特菌生物被膜形成的影响
本研究通过生物被膜结晶紫染色法研究鸢尾黄素对单增李斯特菌生物被膜形成的影响。将单增李斯特菌野生型菌株BUG1600和单增李斯特菌Srt A敲除株BUG1777(作为对SrtA活性作用验证对照菌株)过夜培养后，取过夜菌BUG1600按照比例1:100加入到新鲜TSB培养基，加入不同浓度鸢尾黄素(0～32μg/mL)并转移到24孔板中，同时以上述比例设置BUG1777无药对照孔。在30℃、5％CO2条件下静置培养48h。用移液器轻轻吸走孔中的液体，并用PBS将生物被膜轻轻洗三次。将24孔板置于60℃干燥1h后，每孔加入400μL0.1％结晶紫染色液，静置1h。弃掉结晶紫染色液后，用去离子水将未结合的结晶紫洗去。每孔加入500μL33％冰醋酸，溶解结合的结晶紫，并用酶标仪检测溶解液在570nm波长的吸光度，结果见附图2。
结论：生物被膜结晶紫染色结果显示，随着鸢尾黄素浓度逐渐增加，单增李斯特菌生物被膜呈显著递减趋势。
3.鸢尾黄素对单增李斯特菌侵袭Caco-2细胞的影响-
取Caco-2细胞培养板(人克隆结肠腺癌细胞，2×105个/孔)，吸走上层培养液，加入不同浓度鸢尾黄素(0、4、16和64μg/mL)，并将过夜菌BUG1600以MOI＝50加至24孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2条件下共培养5h。吸走上层培养液，并用PBS清洗三次后，加入50μL/mL庆大霉素37℃孵育30min，每孔加入1mL的无菌水孵育5min后吹打混匀。每孔经10倍梯度稀释，取10μL涂于TSB琼脂平板上，37℃、5％CO2条件下培养18h，统计菌落个数。
结论：细胞侵袭实验结果显示，鸢尾黄素在16μg/mL以上随着其浓度逐渐增加，对单增李斯特菌侵袭Caco-2细胞的能力呈显著增强。
4.鸢尾黄素对单增李斯特菌小鼠感染模型的保护作用
取20只BALB/C小鼠(雌性，约20g)，经腹腔注射BUG1600悬液(7×107CFUs/只)；取10只BALB/C小鼠(雌性，约20g)，经腹腔注射BUG1777悬液(7×107CFUs/只)，建立小鼠单增李斯特菌全身感染模型。将感染BUG1600的小鼠随机平均分为2组，分为BUG1600对照组(100mg/kg体重)和鸢尾黄素组(100mg/kg体重)；感染BUG1777的小鼠为BUG1777对照组。所有组小鼠均通过灌胃给药，对照组均给0.5％羧甲基纤维素钠，每12h给药一次。观察96h内小鼠状态并记录死亡时间，结果见附图4。
结论：小鼠感染单增李斯特菌BUG1600后48h、72h、96h的存活率分别为40％、10％和0％，BUG1777对照组小鼠在对应时间的存活率分别为60％、20％和0％，而BUG1600鸢尾黄素治疗组小鼠在对应时间的存活率分别为80％、50％和30％。由此可见，鸢尾黄素可以提高感染小鼠的存活率。

Claims (2)

1.鸢尾黄素在抑制单增李斯特菌分选酶A催化活性及制备李斯特菌感染药物中的应用，其特征在于鸢尾黄素对分选酶A活性的抑制作用。
2.如权利要求1所述的鸢尾黄素在抑制单增李斯特菌分选酶A催化活性及制备李斯特菌感染药物中的应用，其特征在于所述的应用为鸢尾黄素在制备用于治疗由单增李斯特菌感染引起的疾病的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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SANIT THONGNEST，等: "Eriosema chinense: A rich source of antimicrobial and antioxidant flavonoids", 《PHYTOCHEMISTRY》 *

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