CN111944892A

CN111944892A - 用于唇腭裂产前无创诊断的分子标志物及其应用

Info

Publication number: CN111944892A
Application number: CN202010855870.2A
Authority: CN
Inventors: 袁正伟; 贾杉杉; 顾卉; 魏晓伟; 马巍; 刘丹; 罗文婷
Original assignee: Shengjing Hospital of China Medical University
Current assignee: Shengjing Hospital of China Medical University
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2020-08-24
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-08-24
Also published as: CN111944892B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，用于唇腭裂产前无创诊断分子标志物及应用。用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物，是由4个基因EN2、LIN28A、HHIP和GLI2组成。所述的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物在制备用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验产品中的应用。本发明首次发现并证实EN2、LIN28A、HHIP和GLI2的基因或蛋白表达异常与唇腭裂胎儿的发生具有密切相关性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断提供了新的途径。本发明提供的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断相关的标志物，提供唇腭裂胎儿产前诊断或风险监控的服务，协作或独立地向医院和诊所销售诊断和预后的咨询服务。

Description

用于唇腭裂产前无创诊断的分子标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，用于唇腭裂产前无创诊断分子标志物及应用。

背景技术

唇腭裂是我国常见严重胎儿发育畸形之一，包括唇裂、腭裂和唇腭裂，根据是否合并其它畸形又可分为综合征型和非综合征型。唇腭裂平均发生率在1.7‰左右，亚洲属于高发地区。唇腭裂的发病机制目前尚不清楚，主要由遗传和环境因素共同作用所致。唇腭裂会导致患儿喂养困难和语言发育障碍等，治疗上主要是生后进行多次矫形手术，术后面部瘢痕会影响患儿心理发育和生活质量的提高。因此，研究唇腭裂的胚胎早期无创诊断的方法，使其能够在严重结构异常或不可逆损伤之前获得诊断，制定相应的胚胎早期治疗和预防新策略，是国内外研究的重点方向，对于减少畸形的致残率、提高人口素质具有极其重要意义。

建立无创的唇腭裂早期筛查方法，一直是人们不断追求的理想目标，也是国家中长期科学和技术发展规划纲要中的重点资助领域和优先研究主题。虽然目前影像学技术(超声和MRI)的发展非常迅速，使一些有明显结构异常畸形的诊断时间获得提前，但目前影像学方法只能在畸形结构形成后给予诊断，已失去了最佳预防和治疗的时机，不能达到早期诊断的要求。羊膜穿刺、绒毛膜和胎儿血取样可以对一些明显染色体异常(Down综合征等)或单基因疾病进行早期诊断，但对于唇腭裂这种复杂多基因疾病仍缺乏特异性检测指标。母体血清学检查是一种无创性产前诊断方法，孕妇易接受，适用于大范围产前筛查。但目前为止尚没有唇腭裂有效的产前诊断分子标志物。近年来，随着各种组学技术突飞猛进的发展，一系列新技术融入到高通量的组学研究中，使疾病诊断分子标志物筛查工作有了新的突破，也为目前大家非常重视的转化医学研究提供了极其重要的手段。利用高通量的组学技术可以充分考虑母体与胎儿两方面因素，从众多复杂的基因和蛋白质中筛选出一组(数十或数百个)改变明显的关键性分子，综合分析其变化规律，将有利于确定疾病早期诊断和预后判定的分子标志物，也是未来将复杂的分子标志物转化为临床应用的趋势所在。

目前产前治疗技术的研究进展明显滞后于产前诊断，许多唇腭裂胎儿虽然在产前获得诊断，但由于缺乏安全有效产前治疗方法，孕妇多选择终止妊娠或生后进行手术矫正。因此，寻找对胚胎和母亲均损害较轻的、能够在胚胎早期进行的分子靶向治疗是将来需要解决的重要问题。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于唇腭裂产前无创诊断分子标志物及应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物，是由4个基因EN2、LIN28A、HHIP和GLI2组成。

所述的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物在制备用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验产品中的应用。

进一步地，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸，高通量测序平台，通过质谱技术、PCR、原位杂交、荧光原位杂交、免疫透射比浊法、放射免疫法等相关方法对唇腭裂胎儿产前无创诊断分子标志物进行定性地、定量地、或半定量地检测。

进一步地，所述唇腭裂胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验的标本包括孕妇血液(及其外泌体)、尿液(及其外泌体)、羊水(及其外泌体)和胎儿标本等。

改变上述用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物表达的试剂在制备用于唇腭裂干预治疗药物中的应用。

改变上述用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物表达的产物在制备唇腭裂干预治疗药物中的应用。

一种检测所述用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物的mRNA和/或蛋白质的试剂在制备唇腭裂胎儿产前无创诊断工具中的应用。

进一步地，所述检测唇腭裂胎儿产前无创诊断分子标志物的mRNA和/或蛋白质的试剂包括能够定量上述用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物的mRNA和/或蛋白质的试剂。

进一步地，所述能够定量上述用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物的试剂可以是基因或转录本的特异性引物，也可以是特异性识别探针，或同时包括引物和探针。

所述引物序列如SEQ ID NO.1-20所示。

一种用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断的工具，所述工具能够检测上述用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物的表达量。

进一步，所述工具包括能够定量EN2、LIN28A、HHIP和GLI2的mRNA和/或蛋白质的试剂。

进一步，所述用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

一种治疗唇腭裂的的药物，所述药物包含EN2、LIN28A和HHIP抑制剂，GLI2激活剂。

本发明的所述抑制剂或激活剂不受限制，只要所述抑制剂能够抑制EN2、LIN28A和HHIP上游或下游途径的分子的表达或活性，或激活GLI2上游或下游途径的分子的表达或活性，且对于治疗唇腭裂有效的药物即可。

进一步，所述抑制剂包括针对EN2、LIN28A和HHIP基因表达的干扰RNA，或者负调控miRNA、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向分子化合物，抑制型靶向分子化合物的实例如针对EN2、LIN28A和HHIP蛋白的抗体。

所述激活剂包括针对GLI2的正调控型的转录调控因子、靶向激活的分子化合物，或抑制GLI2降解的分子。

一种唇腭裂胎儿的产前治疗方法，所述方法包括抑制EN2和/或LIN28A和/或HHIP，和/或激活GLI2基因或蛋白。

进一步，所述方法包括抑制EN2和/或LIN28A和/或HHIP基因和蛋白质的表达，或激活GLI2基因或蛋白表达。

一种唇腭裂产前筛查、预警和诊断的方法，所述方法包括如下步骤。

(1)获取受试者的样品。

(2)检测受试者样品中上述分子表达水平。

(3)将测得的上述分子表达水平变化趋势与受试者的疾病相关性关联起来。

(4)与正常对照相比，上述分子表达异常，表明受试者怀有唇腭裂胎儿的风险高。

本发明的定量mRNA的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

本发明中PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification Refractory MutationSystem，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

本发明中的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

本发明中的探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增来制备。

本发明的定量蛋白质的试剂可基于非抗体的已知方法来发挥其功能：例如质谱技术，包括MRM和PRM等。

本发明的定量蛋白质的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括芯片(蛋白质芯片和微流控芯片等)、ELISA、放射免疫测定法、免疫透射比浊法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的定量蛋白的试剂包括特异性结合蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量蛋白的试剂可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

本发明的抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对本发明所述蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

本发明的标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

本发明的用于检测上述分子表达量的样品的获得是本领域的常规技术，优先选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。

所述的样品可以是但不限于：孕妇血液(及其外泌体)、尿液(及其外泌体)、羊水(及其外泌体)和畸形胎儿或患儿标本。在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。

本发明中的高通量测序平台是一种特殊工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知上述分子表达异常与唇腭裂相关也属于使用了本发明的新用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。

本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于上述分子检测来判断唇腭裂的试剂均包含在本发明范围内。

一种唇腭裂治疗药物的筛选方法，可以通过在对细胞添加测试药物后或在对模型动物施用测试药物后的某个时期测量EN2和/或LIN28A和/或HHIP和/或GLI2基因或蛋白的表达水平来测定药物效果。更具体地说，当EN2和/或LIN28A和/或HHIP和/或GLI2基因或蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后改变时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为产前治疗唇腭裂的药物。

本发明的抑制剂或激活剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括但不限于乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的抑制剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂或激活剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抑制剂或激活剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，动脉内，口服，肌肉内，皮下的。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明的EN2、LIN28A、HHIP和GLI2基因序列可以在NCBI数据库中进行查询。

在本发明，“唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断”包括判断受试者胎儿是否已经发生唇腭裂，判断受试者胎儿是否存在患有唇腭裂的风险。

本发明中用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括。

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时。

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生。

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

本发明中“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

本发明首次发现并证实EN2、LIN28A、HHIP和GLI2的基因或蛋白表达异常与唇腭裂胎儿的发生具有密切相关性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断提供了新的途径。

本发明首次建立并证实EN2/LIN28A/hsa-let-7a-3p/HHIP/GLI2调控轴在唇腭裂发生过程中具有重要作用，并可作为唇腭裂的治疗靶点。

本发明提供的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断相关的标志物，提供唇腭裂胎儿产前诊断或风险监控的服务，协作或独立地向医院和诊所销售诊断和预后的咨询服务。

附图说明

图1是唇腭裂孕妇血浆、血浆外泌体和胎儿病变组织的转录组测序结果分析，以及共同差异表达hsa-let-7a-3p和hsa-let-7d-3p在病变组织定量PCR验证结果。

图2是唇腭裂胎儿病变组织的转录组测序差异表达mRNA分布的散点图。

图3是唇腭裂胎儿病变组织的转录组测序差异表达mRNA的生物信息学分析结果。

图4是唇腭裂胎儿病变组织差异表达hsa-let-7a-3p下游靶基因HHIP的mRNA和蛋白质表达情况及hsa-let-7a-3p与HHIP结合的双荧光素酶检测结果。

图5是HHIP的下游基因GLI2的mRNA和蛋白质在唇腭裂病变诊治表达情况。

图6是hsa-let-7a-3p过表达或低表达后其下游靶基因HHIP和GLI2mRNA和蛋白表达变化情况及其对细胞增殖功能影响的结果。

图7是HHIP低表达后对下游基因GLI2mRNA和蛋白表达变化情况及其对细胞增殖功能影响的结果。

图8是唇腭裂病变组织中hsa-let-7a-3p上游基因LIN28A mRNA和蛋白表达变化情况，干预LIN28A对下游分子表达及其对细胞增殖功能影响的结果。

图9是唇腭裂病变组织中LIN28A上游转录因子EN2 mRNA和蛋白表达变化情况，CHIP实验验证EN2与LIN28A结合调控的结果。

图10是双荧光素酶实验验证EN2与LIN28A结合调控，干预EN2表达对下游分子表达及其对细胞增殖功能影响的结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例中所用孕妇外周血和引产胎儿标本均来源于盛京出生队列样本库，并获得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准(批准号：2017PS264K)。

实施例1唇腭裂孕妇血浆、血浆外泌体和胎儿病变组织的转录组测序结果分析。

1、纳入研究对象。

收集5例孕周相匹配(24周左右)的唇腭裂胎儿唇部标本和5例难免流产的非唇腭裂胎儿唇部标本送转录组学分析。后续分析一共纳入25对唇腭裂胎儿和非唇腭裂胎儿的唇部标本。

2、提取组织的RNA，反转录和扩增实验。

取唇部组织后，用无RNA酶水多次清洗去除残留血液，置于1.5ml的EP管中冻存。抽提RNA时，每管中加入1mlTRIzol试剂，在组织研磨仪中充分碾磨，后按照实验步骤提取RNA。反转录和扩增过程同上。

3、唇腭裂孕妇血浆、血浆外泌体和胎儿病变组织的转录组测序结果分析。

为了验证血浆中差异表达miRNA是否由于局部病变组织中表达异常所致，对唇腭裂胎儿病变组织进行了全转录组测序检测，结果发现551个差异表达miRNA，其中375个低表达，176个高表达。通过与全血浆和血浆来源外泌体的全转录组结果进行比对分析，发现36个miRNA在三种组织均出现差异表达，其中31个低表达，5个高表达。31个低表达miRNA中包括两个Let7家族成员(hsa-let-7a-3p和hsa-let-7d-3p)，对这两个miRNA进行了扩大样本量PCR检测，结果发现hsa-let-7a-3p在唇腭裂孕妇的血浆和血浆来源的外泌体，以及唇腭裂胎儿的病变部位均显著低表达，表明hsa-let-7a-3p表达异常与唇腭裂发生有关。

联合分析血浆、血浆来源的外泌体和病变组织的转录组学结果，验证共同差异表达的hsa-let-7a-3p和hsa-let-7d-3p在病变部位的表达量情况，如图1-3所示。

实施例2hsa-let-7a-3p下游靶基因筛选与分子调控机制验证。

1、预测hsa-let-7a-3p的靶基因。

结合组学报告，并利用相关预测网站(TargetScan 7.1,miRDB v6,DIANA-TarBasev8,和DIANA-microT)，预测hsa-let-7a-3p可能调控的靶基因。

2、扩大样本量，qRT-PCR和Western blot实验验证靶基因HHIP内源性表达情况。

(1)qRT-PCR：RNA提取和反转录步骤如上，qRT-PCR实验中，管家基因选择β-actin。HHIP基因的正向引物为5’-AGGAGGAGAAGGTGCCTGAATGG-3’(SEQ ID NO.1)；该基因的反向引物为5’-GAAGCCACCGCACAGCATCTC-3’(SEQ ID NO.2)。

(2)Western blot：称取50mg组织，使用研磨仪对其充分研磨，后加入300ul混合工作液(RIPA裂解液：PMSF＝100:1)充分震荡，超声波裂解后于冰上裂解30min。4℃低温高速离心机离心，14000rpm，30min,取上清于-80℃保存。BCA方法对蛋白定量后，采用SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、5％脱脂奶粉封闭、一抗孵育过夜、二抗孵育2h、显色。将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将HHIP蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS25.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3、荧光素酶报告基因实验分析验证hsa-let-7a-3p与靶基因HHIP mRNA 3’UTR区的结合作用和结合位点。

以下质粒均由上海吉玛制药技术有限公司合成。根据hsa-let-7a-3p基因序列，设计合成hsa-let-7a-3p mimic和hsa-let-7a-3p基因无序列同源性的阴性对照hsa-let-7a-3p mimic NC。其中，hsa-let-7a-3p mimic的序列为5’-CUAUACAAUCUACUGUCUUUC-3’(SEQID NO.3)。设计合成HHIP 3’UTR野生型和突变型序列片段，分别构建到目标载体(pmirGLO，promega)。HHIP 3’UTR野生型序列为：AAAATAAGTTTTTAGGAGAGTAATATATATTCATGGGATTGTGAGGGAGCATTGTAGAGCTGTTTTCTTCTCAGTCATAGTGGTGGTTTTCCTAGCTGCTATGGAAAGGTTTGTTCACTTATGAGATTAGGACTTTTCTTAAATTCCTCATTAAATATGAACCTAAGGCATACCCATCATTTACCTTGATTCCCATATAATTTGTATAAGTCATATATAAGTCCATTGACAAAATAAAAAAATAAATAATTGGATTCCTTGTATCAACAGAAAGCCTTGTGCTTAAAACCTGTTATTCTTCTTTGAGCCAGACTAAACAGTAACATTTACAAAATGGTATCAGCTCAACATTAAATCTAAGGTTACTTCTCACATACATCATAAAGTCAGCCATCATCTTTCATTTAG(SEQ ID NO.4)。HHIP 3’UTR突变型序列为：AAATAAGTTTTTAGGAGAGTAATATATATTCATGGGATTGTGAGGGAGCATTGTAGAGCTGTTTTCTTCTCAGTCATAGTGGTGGTTTTCCTAGCTGCTATGGAAAGGTTTGTTCACTTATGAGATTAGGACTTTTCTTAAATTCCTCATTAAATATGAACCTAAGGCATACCCATCATTTACCTTGATTCCCATATAAAAACATATAGTCATATATAAGTCCATTGACAAAATAAAAAAATAAATAATTGGATTCCTTGTATCAACAGAAAGCCTTGTGCTTAAAACCTGTTATTCTTCTTTGAGCCAGACTAAACAGTAACATTTACAAAATGGTATCAGCTCAACATTAAATCTAAGGTTACTTCTCACATACATCATAAAGTCAGCCATCATCTTTCATTTAG(SEQ ID NO.5)。使用Dual-Luciferase报告基因检测系统(Promega，E1910)检测吸光度。

4、细胞培养和转染。

将人肾胚细胞HEK-293细胞置于含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，在37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。使用LipoFiterTM3.0脂质体转染试剂进行载体的转染，具体转染方法按照说明书进行。

5、qRT-PCR和Western blot实验验证GLI2内源性表达情况。

采用以上方法，验证得到GLI2在唇腭裂胎儿的病变部位低表达。GLI2基因的正向引物为5’-TCAGCCACTGCCTCCGAGAAG-3’(SEQ ID NO.6)；该基因的反向引物为5’-TTCCTGGTGTCGCATGTCAATCG-3’(SEQ ID NO.7)。

6、hsa-let-7a-3p下游靶基因HHIP和GLI2表达与分子调控机制的研究结果。

利用TargetScan 7.1和miRDB v6软件预测hsa-let-7a-3p下游靶基因，GO分析结果提示靶基因聚类在“细胞增殖”，这些靶基因中HHIP被DIANA-TarBase和DIANA-microT两个软件同时预测到，而且评分最高。我们利用qRT-PCR和Western blot方法对HHIP在唇腭裂病变组织中表达情况进行了检测，结果均显示在病变组织高表达。双荧光素酶报告基因实验也证实hsa-let-7a-3p和HHIP存在结合调控。这些结果证明HHIP是hsa-let-7a-3p下游靶基因。HHIP是SHH信号通路的负调控因子，而GLI2是SHH信号通路的关键分子。因此，我们利用qRT-PCR和Western blot方法对GLI2在唇腭裂病变组织中表达情况进行了检测，结果均显示在病变组织低表达。上述结果证明HHIP和GLI2是hsa-let-7a-3p的下游靶基因。

根据全转录组测序结果筛选hsa-let-7a-3p下游靶基因，并在唇腭裂胎儿病变组织进行差异表达验证，同时进行分子间相互调控机制研究，结果证明hsa-let-7a-3p通过下游靶基因HHIP和GLI2相互作用导致唇腭裂发生，如图4-5所示。

实施例3干预hsa-let-7a-3p表达研究下游靶基因和细胞增殖的影响。

1、干扰RNA设计合成。

根据hsa-let-7a-3p基因序列，由上海吉玛制药技术有限公司设计合成hsa-let-7a-3p agomir和hsa-let-7a-3p antagomir载体。同时合成阴性对照hsa-let-7a-3pagomir NC和hsa-let-7a-3p antagomir NC。hsa-let-7a-3p agomir的序列为5’-CUAUACAAUCUACUGUCUUUCAAGACAGUAGAUUGUAUAGUU-3’(SEQ ID NO.8)；hsa-let-7a-3p agomir NC的正向序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO.9)；hsa-let-7a-3p agomir NC的反向序列为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.10)；hsa-let-7a-3p antagomir序列为5’-GAAAGACAGUAGAUUGUAUAG-3’(SEQ ID NO.11)；

hsa-let-7a-3p antagomir NC序列为5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ IDNO.12)。

根据HHIP基因序列，由北京合生基因科技有限公司构建HHIP的沉默质粒及其NC载体。将sh-HHIP进行引物合成，并插入慢病毒表达骨架质粒中，完成慢病毒基因沉默质粒构建。

sh-HHIP引物序列为5’-GCAACGTGCCTTATTCCATACCGAAGTATGGAATAAGGCACGTTGC-3’(SEQ ID NO.13)，阴性对照载体引物序列为5’-AAACGTGACACGTTCGGAGAACGAATTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’(SEQ ID NO.14)。

2、人口腔角质上皮细胞(HOK)培养。

将细胞置于含10％胎牛血清的MEM培养液，在37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。分组转染载体，qRT-PCR和Western blot检测hsa-let-7a-3p下游靶基因的表达情况。

3、CCK-8实验检测HOK细胞增殖能力的变化。

使用日本同仁CCK-8细胞检测试剂盒对不同质粒转染组进行检测，操作按照说明进行。用Infinite M200 PRO多功能酶标仪(Tecan)在450nm处测定吸光度。

4、干预hsa-let-7a-3p表达对下游靶基因和细胞增殖影响的结果。

HOK细胞转染hsa-let-7a-3p agomir和hsa-let-7a-3p antagomir进行高表达和低表达干预后，下游靶基因HHIP和GLI2均出现相应的表达改变，HOK细胞的增殖能力也出现相应的改变。干预HHIP表达也出现其下游基因GLI2的相应表达改变。上述结果证明hsa-let-7a-3p通过下游靶基因HHIP和GLI2影响细胞增殖，进而导致唇腭裂的发生。

构建hsa-let-7a-3p和HHIP过表达/沉默载体，研究其对下游靶基因的表达调控作用及对细胞增殖的影响，如图6-7所示。

实施例4hsa-let-7a-3p上游分子LIN28A在病变部位的表达研究。

1、检测病变部位的LIN28A表达水平。

qRT-PCR和Western blot方法检测LIN28A的表达情况。LIN28A基因的正向引物为5’-CAGGTGCTACAACTGTGGAGGTC-3’(SEQ ID NO.15)；LIN28A基因的反向引物为5’-GGCTGATGCTCTGGCAGAAGTG-3’(SEQ ID NO.16)。

2、构建LIN28A的沉默质粒。

构建LIN28A的沉默质粒，转染后，分别检测HOK细胞中hsa-let-7a-3p及HHIP和GLI2的mRNA和蛋白表达水平的变化。sh-LIN28A的序列为5-GCCACTACATTCTGTGGAAGGCGAACCTTCCACAGAATGTAGTGGC-3’(SEQ ID NO.17)。CCK-8实验检测HOK细胞增殖能力的变化。

3、LIN28A在病变部位的表达及干预后下游靶基因变化情况。

LIN28A是RNA结合蛋白，可与Let7家族结合，而且在唇腭裂病变组织全转录组测序结果中是高表达。因此，我们利用qRT-PCR和Western blot方法对LIN28A在唇腭裂病变组织中表达情况进行了检测，结果均显示在病变组织高表达。HOK细胞稳转sh-LIN28A降低其表达后，hsa-let-7a-3p和GLI2出现高表达，而HHIP出现低表达，细胞增殖能力明显增加。这些结果证明LIN28A是hsa-let-7a-3p、HHIP和GLI2的上游调控分子。

检测hsa-let-7a-3p上游分子LIN28A在病变部位的表达情况，及沉默LIN28A后对下游指标和细胞增殖能力的影响，如图8所示。

实施例5EN2通过促进LIN28A转录调控下游靶基因参与唇腭裂发生。

1、检测病变部位的EN2表达水平。

qRT-PCR和Western blot方法检测EN2的表达情况。EN2基因的正向引物为5’-AGGAGCTGAGCCTCAACGAGTC-3’(SEQ ID NO.18)；EN2基因的反向引物为5’-CTTGGCTGTGGTGGAGTGGTTG-3’(SEQ ID NO.19)。

2、验证转录因子EN2与靶基因LIN28A的结合作用和结合位点。

(1)荧光素酶报告基因实验：为了明确LIN28A被转录因子EN2调控，构建含有荧光素报告基因的LIN28A质粒，转染细胞，双荧光素酶报告系统检测荧光强度。

(2)ChIP实验：按照说明书操作步骤，利用ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit进行ChIP实验。简述如下：利用甲醛溶液将293T细胞固定，然后裂解，微球菌核酸酶消化DNA为150-900bp长度，然后电泳，利用EN2抗体进行免疫沉淀，纯化结合的DNA，进行PCR扩增检测。

3、构建EN2的沉默质粒，检测对其下游指标的调控作用。

构建EN2的沉默质粒，sh-EN2的序列为：5’-GAAGAAGAACCCGAACAAAGACGAATCTTTGTTCGGGTTCTTCTTC-3’(SEQ ID NO.20)。将EN2沉默质粒转染细胞后，利用qRT-PCR和Westernblot方法检测其下游靶基因LIN28A、hsa-let-7a-3p、HHIP和GLI2的表达变化情况，利用CCK-8实验检测细胞增殖能力的变化情况。

4、参与唇腭裂发生的分子调控通路(EN2/LIN28A/hsa-let-7a-3p/HHIP/GLI2)建立。

通过对病变组织全转录组结果分析和生物信息学分析(JASPAR bioinformaticssoftware)，对可能调控LIN28A的上游调控转录因子进行分析，其中EN2的预测评分最高。因此，进一步利用qRT-PCR和Western blot方法检测唇腭裂胎儿病变组织中EN2的表达情况，结果EN2的mRNA和蛋白质表达水平在唇腭裂组织均明显升高。利用荧光素酶报告基因实验和ChIP实验也证明EN2与LIN28A存在结合和调控作用。进一步利用RNA干扰技术将EN2低表达，利用qRT-PCR和Western blot方法检测其下游靶基因变化情况，结果发现其下游靶基因均出现规律性表达改变，细胞增殖能力也明显提高。这些研究结果可以明确一个新的参与唇腭裂发生的分子调控通路(EN2/LIN28A/hsa-let-7a-3p/HHIP/GLI2)，也为唇腭裂产前治疗确定了新的治疗靶点。

通过对病变组织全转录组结果分析和生物信息学分析，推测EN2可能是LIN28A上游调控转录因子，进一步利用qRT-PCR和Western blot方法明确EN2在病变组织的表达情况，利用荧光素酶报告基因实验和ChIP实验证明EN2与LIN28A存在结合和调控作用，如图9-10所示。上述研究结果建立了一个新的参与唇腭裂发生的分子调控通路(EN2/LIN28A/hsa-let-7a-3p/HHIP/GLI2)，也为唇腭裂产前治疗确定了新的治疗靶点。

序列表

<110> 中国医科大学附属盛京医院

<120>用于唇腭裂产前无创诊断的分子标志物及应用

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

AGGAGGAGAA GGTGCCTGAA TGG 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GAAGCCACCG CACAGCATCT C 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CUAUACAAUC UACUGUCUUU C 21

<210> 4

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

AAAATAAGTT TTTAGGAGAG TAATATATAT TCATGGGATT GTGAGGGAGC ATTGTAGAGC 60

TGTTTTCTTC TCAGTCATAG TGGTGGTTTT CCTAGCTGCT ATGGAAAGGT TTGTTCACTT 120

ATGAGATTAG GACTTTTCTT AAATTCCTCA TTAAATATGA ACCTAAGGCA TACCCATCAT 180

TTACCTTGAT TCCCATATAA TTTGTATAAG TCATATATAA GTCCATTGAC AAAATAAAAA 240

AATAAATAAT TGGATTCCTT GTATCAACAG AAAGCCTTGT GCTTAAAACC TGTTATTCTT 300

CTTTGAGCCA GACTAAACAG TAACATTTAC AAAATGGTAT CAGCTCAACA TTAAATCTAA 360

GGTTACTTCT CACATACATC ATAAAGTCAG CCATCATCTT TCATTTAG 408

<210> 5

<211> 407

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

AAATAAGTTT TTAGGAGAGT AATATATATT CATGGGATTG TGAGGGAGCA TTGTAGAGCT 60

GTTTTCTTCT CAGTCATAGT GGTGGTTTTC CTAGCTGCTA TGGAAAGGTT TGTTCACTTA 120

TGAGATTAGG ACTTTTCTTA AATTCCTCAT TAAATATGAA CCTAAGGCAT ACCCATCATT 180

TACCTTGATT CCCATATAAA AACATATAGT CATATATAAG TCCATTGACA AAATAAAAAA 240

ATAAATAATT GGATTCCTTG TATCAACAGA AAGCCTTGTG CTTAAAACCT GTTATTCTTC 300

TTTGAGCCAG ACTAAACAGT AACATTTACA AAATGGTATC AGCTCAACAT TAAATCTAAG 360

GTTACTTCTC ACATACATCA TAAAGTCAGC CATCATCTTT CATTTAG 407

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

TCAGCCACTG CCTCCGAGAA G 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

TTCCTGGTGT CGCATGTCAA TCG 23

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

CUAUACAAUC UACUGUCUUU CAAGACAGUA GAUUGUAUAG UU 42

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

UUCUCCGAAC GUGUCACGUT T 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ACGUGACACG UUCGGAGAAT T 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

GAAAGACAGU AGAUUGUAUA G 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

CAGUACUUUU GUGUAGUACA A 21

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

GCAACGTGCC TTATTCCATA CCGAAGTATG GAATAAGGCA CGTTGC 46

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

AAACGTGACA CGTTCGGAGA ACGAATTCTC CGAACGTGTC ACGTTT 46

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

CAGGTGCTAC AACTGTGGAG GTC 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

GGCTGATGCT CTGGCAGAAG TG 22

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

GCCACTACAT TCTGTGGAAG GCGAACCTTC CACAGAATGT AGTGGC 46

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

AGGAGCTGAG CCTCAACGAG TC 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

CTTGGCTGTG GTGGAGTGGT TG 22

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

GAAGAAGAAC CCGAACAAAG ACGAATCTTT GTTCGGGTTC TTCTTC 46

Claims

1.用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物，其特征在于，是由4个基因EN2、LIN28A、HHIP和GLI2组成。

2.如权利要求1所述的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物在制备用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验产品中的应用。

3.改变权利要求1所述的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物表达的试剂在制备用于唇腭裂干预治疗药物中的应用。

4.改变权利要求1所述的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物表达的产物在制备用于唇腭裂干预治疗药物中的应用。

5.一种检测权利要求1所述的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物的mRNA和/或蛋白质的试剂在制备唇腭裂胎儿产前无创诊断工具中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测用于唇腭裂胎儿产前无创诊断分子标志物的mRNA和/或蛋白质的试剂包括能够定量权利要求1所述的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物的mRNA和/或蛋白质的的试剂；所述能够定量权利要求1所述的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物的试剂是基因或转录本的特异性引物，或是特异性识别探针，或同时包括引物和探针。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1-20所示。

8.一种用于用于唇腭裂胎儿产前筛查、预警和诊断的工具，其特征在于，所述工具能够检测权利要求1所述的用于唇腭裂胎儿产前无创诊断的分子标志物的表达量。

9.一种用于治疗唇腭裂的的药物，其特征在于，所述药物包含EN2抑制剂、LIN28A抑制剂、HHIP抑制剂和/或GLI2激活剂。

10.一种唇腭裂治疗药物的筛选方法，其特征在于，通过在对细胞添加测试药物后或在对模型动物施用测试药物后的某个时期测量EN2和/或LIN28A和/或HHIP和/或GLI2基因或蛋白的表达水平来测定药物效果。