CN111920788A - 一种抑制脑肿瘤的药物及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种抑制脑肿瘤的药物及其应用。其中，所述抑制脑肿瘤的药物，其包括能够促进TRPV4信号通道的钙离子内流的至少一种TRPV4激动剂。本申请提供的药物，对脑肿瘤及其相关疾病具有良好的治疗效果，对于脑肿瘤及其相关疾病的治疗具有良好的应用前景。本申请提供的药物，应用于治疗脑肿瘤及其相关疾病的药物中，可以减少脑肿瘤及其相关疾病临床治疗过程中产生的毒副作用，提高脑肿瘤及其相关疾病的治疗效果。

Description

一种抑制脑肿瘤的药物及其应用

技术领域

本申请涉及医药技术领域，特别涉及一种抑制脑肿瘤的药物及其应用。

背景技术

脑部肿瘤是指生长在颅腔的新生物，又称颅内肿瘤、脑癌，可起源于脑、脑膜、神经、 血管及脑附件，或由身体的其他组织或脏器转移侵入颅内而形成，大都可产生头痛、颅内高 压及局灶性症状，其包括脑肿瘤和脑转移瘤，在此以胶质瘤为例。

胶质瘤为最常见的恶性脑肿瘤之一。胶质瘤偏良性者生长缓慢，病程较长，自出现症状 至就诊时间平均两年，恶性者瘤体生长快，病程短，自出现症状到就诊时多数在3个月之内， 70％～80％多在半年之内。

胶质瘤具有高侵袭、浸润能力强、微血管密集化等特点，极易引起胶质瘤的复发和浸润， 并且由于血脑屏障的存在，导致大多数的临床化疗药物不能用于胶质瘤的治疗，目前，仅有 一两个药物可以用于胶质瘤的治疗，但是随着耐药性的出现，这仅存的治疗药物也不宜再广 泛使用，此外，胶质瘤对脑组织的创伤较大，给患者的生命安全带来极大的危险。

替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)是治疗胶质瘤的一线临床化疗药物，但由于耐药性的 出现，导致其在临床的使用受限，而且在临床中，替莫唑胺具有突出的副作用，即服用者会 产生恶心、呕吐、精神萎靡不振的反应，这也为替莫唑胺的应用受到一定的限制。大麻二酚 (Cannabidiol，CBD)是从植物大麻中提取物其中一种具有生物活性的天然产物，对多种神 经系统疾病(癫痫、阿尔茨海默症、抑郁、自闭症等)具有潜在治疗作用。

目前，基于大麻二酚对于神经系统的作用以及其本身的无毒性或极小毒性，开始有人尝 试将大麻二酚应用于抗肿瘤中，以期对于癌症患者的精神状态进行改善并降低患者的疼痛感。 在研究中发现其与其他的药物一起使用时，具有一定的改善作用。但由于大麻二酚的作用机 理不清楚，尤其是抗肿瘤机制不明确，导致对其研究具有很大的盲目性，更无法针对某些肿 瘤类疾病进行准确研究和精准用药，这极大的增加了大麻二酚在体内治疗作用发挥的不稳定 性，易造成药效的损失，治疗效果不理想，更重要的是，无法预测或研究使用其作为抗肿瘤 药物组分时可能带来的毒副作用，这大大增加了其临床应用的阻力，故目前大麻二酚的抗肿 瘤效果仅限于研究，而鲜有临床应用，因此，以上所述均为目前亟待解决的问题。

而本发明人已经清晰的研究出了大麻二酚抗肿瘤的作用机制，从而有针对性的对其进行 应用或配合应用，得到了很惊喜的效果，不仅增加了抗肿瘤效果，更重要的是，将其与其它 组分联合应用时，降低了毒副作用和耐药性，该研究和创新对于大麻二酚的进一步应用和后 续研究具有里程碑式的意义。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的是提供一种抑制脑肿瘤的药物及其应用，其药物效果佳，毒副 作用小，作用机制清晰，解决了现有技术中存在的不足。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

本发明的一个发明点为提供一种抑制脑肿瘤的药物，其包括能够促进TRPV4离子通道的 钙离子内流的TRPV4，该TRPV4激动剂的浓度为0.01μM-30μM。该TRPV4激动剂优选大麻二酚。

同时，该TRPV4激动剂还可为其他的TRPV4激动剂类型或者大麻二酚与其他种类的TRPV4激动剂联用均可。

本发明的另一个发明点为：以上所述的药物还可包括具有抗肿瘤活性的肿瘤抑制剂，即 TRPV4激动剂(如大麻二酚)可以与肿瘤抑制剂(如替莫唑胺)联用，二者能够协同增加抗肿 瘤的效果，并可在很大程度上降低肿瘤抑制剂的毒副作用和/或耐药性等。所述肿瘤抑制剂、 TRPV4激动剂的浓度比为(10-500):(10-30)，替莫唑胺与大麻二酚的浓度比也为 (10-500):(10-30)，使用时，该肿瘤抑制剂的浓度可为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、40、50、60、80、100、200、300、400或500μM等。

进一步地，上述的肿瘤抑制剂包括干扰核酸生物合成的药物、直接影响DNA的药物、 干扰转录过程以及阻止RNA合成的药物中的至少一种。

优选地，该肿瘤抑制剂可为替莫唑胺。同时，该肿瘤抑制剂还可为替莫唑胺之外的其他 肿瘤抑制剂，当然也可以为包括或不包括替莫唑胺在内的两种或多种肿瘤抑制剂。即至少一 种TRPV4激动剂可与至少一种肿瘤抑制剂联用，如TRPV4激动剂大麻二酚与肿瘤抑制剂替 莫唑胺联用。需要说明的是，由于替莫唑胺可以通过影响DNA复制和修复来发挥细胞毒作 用，起到抗肿瘤的效果，所以替莫唑胺也可以作为直接影响DNA的抑制剂的一种。

所述肿瘤抑制剂还可为甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巯嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、烷化剂、多 柔比星、放线菌素D、柔红霉素、甲基苄肼、环己亚硝胺、长春新碱的至少一种。这些组分可以与替莫唑胺一起使用也可单独使用。

本发明还有一个发明点为：所述药物还包括协同增效物质，所述协同增效物质包括冰片 和/或薄荷脑。所述肿瘤抑制剂、TRPV4激动剂与所述协同增效物质的浓度比为(10-500):(10-30):(10-80)，该协同增效物质的浓度可为0.01-80μM，如0.01、0.05、0.1、0.5、 1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80μM等。该协同增效物质可与TRPV4激动剂 一起应用，也可以与至少一种TRPV4激动剂和至少一种肿瘤抑制剂联用，如协同增效物质与 大麻二酚和替莫唑胺一起作为药物应用。该协同增效物质能够提高药物的整体药效；并且其 还可增加药物的吸收率使得药物的利用率提高，有利于降低药物的使用量从而降低成本。

本发明的再一个发明点为：所述药物还包括赋形剂、佐剂、添加剂、表面活性剂、干燥 剂和稀释剂中的至少一种。

本发明最后一个发明点为：以上任意一段所述的药物在制备治疗脑肿瘤及其相关疾病的 药品中的应用。脑肿瘤及其相关疾病包括原发性脑肿瘤、复发性脑肿瘤、脑肿瘤形成过程中 产生的疾病以及脑肿瘤引起的并发症、后遗症等与脑肿瘤具有一定相关性的疾病。

所述治疗脑肿瘤及其相关疾病药物为通过促进诱导肿瘤细胞发生自噬、通过抑制肿瘤细 胞的增殖及通过抑制肿瘤干细胞的活性协同抗肿瘤的药物。如此通过多种途径的抗肿瘤机制 实现联合抑制肿瘤，疗效佳。

进一步地，上述的治疗脑肿瘤及其相关疾病的药品包括治疗胶质瘤相关疾病的药品和治 疗其他脑肿瘤及其相关疾病的药品。其他脑肿瘤包括但不限于脑膜瘤、垂体腺瘤、转移瘤、 听神经瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、第四脑室的室管膜瘤、蝶鞍部的颅咽管瘤，其他脑肿 瘤的相关疾病包括但不限于桥脑、偏瘫和癫痫等。

本申请的有益效果为：

本发明人首次清楚的研究了大麻二酚的作用机理，即清晰的了解了其通过激活TRPV4 发挥抗肿瘤作用机理，即大麻二酚可促进TRPV4离子通道导致钙离子内流，从而促进诱导肿 瘤细胞发生线粒体自噬，实现了更强的抗脑肿瘤的作用。因此，明确的获知，大麻二酚可通 过激活TRPV4具有抗肿瘤效果，并通过试验也证实了该效果。而且通过该机理并结合现有技 术中对于大麻二酚在其他领域的应用和研究，基本可预测大麻二酚没有毒副作用或毒副作用 极小。故其具有极佳的临床研究和应用的价值、意义。

通过对大麻二酚可作为激活TRPV4的药物的清晰研究和认知，本发明人将大麻二酚与肿 瘤抑制剂进行联用，效果大大提升。如将大麻二酚和替莫唑胺联用，二者作用相辅相成，不 仅效果大大增加，还显著降低替莫唑胺的恶心呕吐精神不振的毒副作用，且还消除了目前替 莫唑胺单独使用时的耐药性，效果非常惊喜。

在应用大麻二酚激活TRPV4的基础上与肿瘤抑制剂联用，增加协同增效物质，可进一步 提升药效，增加吸收率和利用率，协同改善替莫唑胺的毒副作用。

而且，本申请通过对各个组分机理的清楚了解，能够更好更合理的对各个组分的比例进 行调整，在本申请所给出的浓度比条件下，可实现最佳的治疗效果，高于该比例或低于该比 例都会大大降低药效。

以上所述的药物方案对于包括胶质瘤在内的脑肿瘤的相关疾病均具有极佳的治疗效果和 优良的应用前景。以胶质瘤为例，大麻二酚和替莫唑胺之间相互作用，可以诱导胶质瘤细胞 发生自噬，进而对胶质瘤起到显著的抑制作用，大麻二酚与替莫唑胺配伍使用还具有极高的 生物利用度和抗肿瘤活性，可以起到显著的抗肿瘤作用，其中，大麻二酚还可以进一步增强 替莫唑胺的活性，进一步增强替莫唑胺的抗肿瘤作用，二者联合使用可以显著抑制胶质瘤细 胞增殖及干性。

此外，本申请提供的药物，还可以包括协同增效物质，协同增效物质可以增强血脑屏障 通透性，提高药物在脑部病灶区的作用浓度，促进药物的吸收，提高药物的治疗效果。协同 增效物质可以为冰片和/或薄荷脑，冰片和/或薄荷脑与大麻二酚和替莫唑胺配伍使用，可以有 效增强血脑屏障的通透性，进而增强人体对药物中大麻二酚、替莫唑胺的吸收，使大麻二酚、 替莫唑胺大量进入大脑，提高药物在大脑中的治疗效果。

大麻二酚、替莫唑胺和协同增效物质之间相互作用，不仅能够从多个角度来增强抗肿瘤 效应，还能够显著降低毒副作用，尤其对传统替莫唑胺所产生的呕吐、眩晕、乏力等副作用 具有良好治疗效果。

本申请提供的药物，应用于制备治疗脑肿瘤及其相关疾病的药品中，可以显著减少脑肿 瘤及其相关疾病临床治疗过程中产生的毒副作用，提高脑肿瘤及其相关疾病的治疗效果。

本申请提供的TRPV4激动剂，可以促进钙离子通过TRPV4通道内流，激活内质网应激， 引起线粒体自噬，进而促使肿瘤细胞死亡，通过明确的作用机制来治疗脑肿瘤及其相关疾病， 抑制脑肿瘤及其相关疾病的发展与扩散。

附图说明

图1是本申请一试验例所述的各组细胞的相对活力柱状示意图；

图2是本申请一试验例 所述的各组细胞数量对比图；

图3是本申请一试验例所述的各组小鼠肿瘤生长状况示意图；

图4是本申请一试验例所述的各组小鼠生存率示意图；

图5是本申请一试验例所述的各组胶 质瘤细胞的相对活力柱状示意图；

图6是本申请一试验例所述的各组胶质瘤细胞的凋亡情况 柱状示意图；

图7是本申请一试验例所述的各组小鼠胶质瘤生长状况的示意图；

图8是本申 请一试验例所述的各组细胞的相对活力示意图；

图9是本申请一试验例所述的各组细胞的凋 亡情况柱状示意图；

图10是本申请一试验例所述的各组小鼠胶质瘤生长状况的示意图；

图 11是本申请一试验例所述的各组耐药胶质瘤细胞相对活力对比图；

图12是本申请一试验例 所述的各组胶质瘤细胞的细胞活力折线图；

图13是本申请一试验例所述的各组胶质瘤生长情 况对比图；

图14是本申请一试验例所述的各组胶质瘤体积的折线图；

图15是本申请一试验 例所述的各组胶质瘤细胞的生长情况对比图；

图16是本申请一试验例所述的各组胶质瘤细胞 中相关蛋白酶含量示意图；

图17是本申请一试验例所述的各组胶质瘤细胞线粒体示意图；

图 18是本申请一试验例所述的各组胶质瘤细胞的线粒体膜电位水平和氧化应激活性氧水平对比图；

图19是本申请一试验例所述的各组胶质瘤细胞共定位染色图；

图20是本申请一试验例 所述的各组胶质瘤细胞中相关线粒体自噬蛋白的含量水平对比图；

图21是本申请一试验例所 述的各组胶质瘤细胞的细胞活性对比图；

图22是本申请一试验例所述的各组胶质瘤细胞的染 色图；

图23是本申请一试验例所述的各组胶质瘤细胞的相关蛋白酶含量水平对比图；

图24 是本申请一试验例所述的各组胶质瘤细胞的细胞活性对比图；

图25是本申请一试验例所述的 各组胶质瘤细胞的细胞活性对比图；

图26是本申请一试验例所述的各组胶质瘤细胞的细胞活 性对比图；

图27是本申请一试验例所述的各组细胞荧光强度对比图；

图28是本申请一试验 例所述的各组胶质瘤细胞的相关蛋白酶含量水平对比图；

图29是本申请一实施例所述的 TRPV4基因在正常脑组织和胶质瘤组织中的生物信息学分析图；

图30是本申请一实施例所 述的胶质瘤细胞钙离子内流情况图；

图31a、图31b、图31c和图31d是本申请一实施例所述 的大麻二酚对线粒体自噬的机理试验图；

图32是本申请一实施例所述的大麻二酚与TRPV4 通道的作用过程示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请的具体实施方式进行描述。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所 通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试 剂、材料和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

MTT法：又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免 疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，灵敏度高。

MTT法的检测步骤如下：(1)收集待测细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至3000孔，边缘孔用无菌PBS填充；(2)5％CO₂，37℃孵育，至细胞 单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物；(3)5％CO₂，37℃孵育72小时；(4) 每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h；(5)终止培养，并吸去 孔内培养液；(6)每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶 解，在酶联免疫检测仪OD550nm处测量各孔的吸光值；(7)同时设置调零孔(培养基、MTT、 二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

活体成像(bioluminescence)：可见光活体成像技术主要采用生物发光(bioluminescence) 与荧光(fluorescence)两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或 DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP,Cyt及dyes等)进行标记，利用一套非 常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通 过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的 表达等生物学过程。另外,这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质 和方法,非常安全。因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点,在刚刚发展起来的 几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。

实施例1

一种抑制脑肿瘤的药物，其为TRPV4激动剂。该TRPV4激动剂能够促进TRPV4信号通道的钙离子内流，从而促进诱导脑肿瘤细胞发生自噬，实现了更强的抗脑肿瘤的作用。TRPV4激动剂的用量为：浓度0.01μM-30μM，如0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、 1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM等。

为证明TRPV4激动剂可以起到抑制脑肿瘤的作用，本发明人对TRPV4基因进行了正常 脑组织和胶质瘤组织中的生物信息学分析。从NCBI网站的基因表达数据库中下载GSE50161 数据集，从UCSC基因表达数据库下载TCGA中胶质瘤相关数据库，对各数据集中胶质瘤组 织芯片数据进行配对比较，数据已经通过质量控制和均一化处理，下载的数据通过应用 GraphpadPrism7软件分析胶质瘤组织中TRPV4mRNA表达差异情况。应用TCGA数据库对相关神经胶质瘤基因芯片数据进行生存分析，经Kaplan-Meier分析，绘制生存函数曲线，用Log-ranktest法进行差异显著性检验。

如图29所示，通过对CGGA以及TCGA中胶质瘤相关数据库TRPV4基因在神经胶质瘤及正常脑组织中的表达情况进行分析，结果显示，TRPV4基因在胶质母细胞瘤组织的表达显著低于正常脑组织(p<0.01)，同时，随神经胶质瘤恶性程度的增加，TRPV4基因表达水平降低更加明显，IV级胶质瘤组织中TRPV4的表达显著高于其他级胶质瘤(P<0.05)。为了探讨TRPV4的表达水平与临床预后的关系，通来源于TCGA数据库下载基因芯片数据中胶质瘤患者生存期数据，分析了TRPV4的表达与患者的生存时间，结果发现TRPV4的表达水平显著 影响患者的生存，与低表达组相比，TRPV4高表达的肿瘤患者存活时间具有较短的生存期。 另外通过WCGNA分析结果显示TRPV4与胶质瘤的关键标志物具有很强的相关性。以上结 果提示，TRPV4表达与脑肿瘤的病理等级及患者的预后密切相关，随脑肿瘤的发生而发展， 并且TRPV4的表达可以作为胶质瘤患者肿瘤进展和生存预后的预测指标之一及治疗靶点。

实施例2

在实施例1的基础上，所述的TRPV4激动剂为大麻二酚，该大麻二酚的浓度为0.01μM-30μM，如0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、15μM、20 μM、25μM、30μM等。

我们对大麻二酚在脑肿瘤的典型代表胶质瘤中的作用进行了机制研究，如图12-图15所 示，通过MTT法对大麻二酚之于胶质瘤细胞系U251、U87、LN18、U118MG、A172细胞的作用进行检测，结果表明大麻二酚对胶质瘤细胞系的抑制浓度为IC₅₀范围为20-30μM，且大麻二酚对原代胶质细胞的作用远低于其他肿瘤细胞系，表明对正常细胞的作用比较小。另外， 通过3D克隆形成实验评估大麻二酚对胶质瘤的克隆增殖能力作用的影响，结果表明大麻二 酚能显著的抑制肿瘤细胞的干性，最后进一步通过移植瘤实验体内评估大麻二酚的抑制作用， 结果显示大麻二酚能显著的抑制胶质瘤的形成能力。以上结果证实大麻二酚对胶质瘤具有显 著的抑制作用，即大麻二酚对脑肿瘤具有显著的抑制作用。

如图16所示，通过westernblot评估大麻二酚对自噬的诱导作用，结果显示大麻二酚处 理U251细胞、U87细胞后能显著上调ATG5，LC3-B的表达水平，并具有一定时间依赖性。该结果表明大麻二酚能诱导胶质瘤细胞发生自噬，但Cleaved-Caspase3未发生变化，这说明 大麻二酚引起细胞的死亡并不是通过细胞凋亡引起。

如图17-23所示，通过共聚焦评估大麻二酚对线粒体的影响，结果表明大麻二酚能显著 的诱导线粒体的形态变化，同时线粒体的数量随着浓度的提高的显著减少。这提示大麻二酚 对胶质瘤细胞等的脑肿瘤细胞中线粒体有显著的损伤作用且减少的线粒体的数量。随后我们 检测了线粒体膜电位，线粒体活性氧(ROS)的水平，结果显示大麻二酚能显著改变线粒体 功能，导致线粒体功能紊乱。线粒体紊乱往往引起线粒体自噬，对此我们进行了评估，结果 显示经大麻二酚处理后LC3-B与线粒体染料共定位，初步提示了大麻二酚诱导线粒体发生线 粒体自噬。我们进一步通过westernblot分析了线粒体裂解液中线粒体蛋白的表达情况，结果 显示大麻二酚能显著诱导PINK1.PAKIN在线粒体富集，表明大麻二酚能显著诱导胶质瘤细胞 等脑肿瘤细胞发生线粒体自噬。随后我们对这种诱导线粒体自噬的性质进行了研究。首先， 应用自噬抑制剂CQ、3MA进行预处理1h,随后采用大麻二酚作用48h，结果发现CQ、3MA 能显著协同的增强大麻二酚的抑制作用。但当应用早期自噬抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin)、 LY294002能显著减弱大麻二酚的对肿瘤细胞的作用。以上结果初步提示大麻二酚诱导的线粒 体自噬是一种致死性的自噬。进一步的我们应用干扰RNA技术对关键基因进行沉默，结果显 示siPINK,siATG5能显著的减弱大麻二酚诱导的线粒体标志蛋白的表达减少，同时也显著减 少凋亡蛋白的表达，再次证实了大麻二酚诱导的线粒体自噬是一种致死性的自噬。

如图31a、图31b、图31c、图31d所示，通过转录组学进行分析，GO富集分析及KEEG分析结果显示经大麻二酚处理胶质瘤细胞等脑肿瘤细胞后响应应激为肿瘤细胞的主要事件。 同时，显著差异基因表达分析结果显示ER应激蛋白ATF4、DDIT3、SESN2、CHAC1、TRIB3等基因显著上调，以上结果揭示大麻二酚诱导内质网应激是大麻二酚作用胶质瘤等脑肿瘤的 主要事件。应用内质网应激抑制剂4-PBA能显著逆转大麻二酚的作用，表明大麻二酚诱导的 内质网应激是诱导细胞死亡过程中重要事件。另外，应用siATF4、siDDIT3研究对大麻二酚 诱导内质网应激的影响，结果发现siATF4、siDDIT3能显著减弱大麻二酚的作用。说明大麻 二酚诱导的内质网应激是由ATF4-DDIT3介导的。最后对介导信号通路进行探究，结果发现 大麻二酚诱导的线粒体自噬是由AKT-mTOR调控的。

如图24-28、图32所示，实验过程中发现大麻二酚显著诱导胶质瘤细胞等脑肿瘤细胞空 泡化，研究结果表达这种空泡化现象与钙离子密切相关，于是我们对介导大麻二酚引起细胞 钙内流的靶点进行鉴定，通过研究发现TRPV4的拮抗剂及稳转TRPV4的细胞系能显著减弱 大麻二酚对肿瘤细胞的活性，同时显著减弱大麻二酚引起的钙内流。以上结果揭示了大麻二 酚可能通过TRPV4抑制胶质瘤的增殖。随后我们通过分子对接辅助性证实了大麻二酚可通过 与TRPV4的位于相邻聚体中的S5/S6疏水口袋的PHE703形成氢键达到很好的结合。

如图30所示，应用钙离子探针(Furo-4AM)与胶质瘤细胞系在生理缓冲液(140mmol/L NaCl，5mmol/LKCl，1mmol/LCaCl₂，1mmol/LMgCl₂，10mmol/L葡萄糖，5mmol/LHEPES，pH7.4)中进行孵育37℃处理20min后，加入药物观察前后钙离子的内流情况，检测488nm处 激发波长，结果表明大麻二酚能显著激活胶质瘤细胞TRPV4通道进而引发钙离子内流。而 TRPV4的拮抗剂GSK2193874能显著抑制大麻二酚诱导的钙离子内流，这表明TRPV4通道 可作为大麻二酚直接作用靶点发挥抗肿瘤作用。

所以，大麻二酚通过促进TRPV4离子通道的钙离子内流，从而促进诱导脑肿瘤细胞发生 线粒体自噬，最终实现较强的抗胶质瘤等脑肿瘤的作用。

TRPV4是一种瞬时性的钙离子通道，大麻二酚对TRPV4作用后会引起钙离子内流，而 钙离子内流是激活内质网应激的主要诱因，在使用TRPV4拮抗剂的情况下，可以逆转上述大 麻二酚的作用，所以，TRPV4可以作为大麻二酚在脑瘤中作用的潜在靶标。大麻二酚还可以 显著诱导线粒体的形态变化，并且线粒体的数量随着大麻二酚浓度的升高而显著减少，所以， 本实施例提供的TRPV4激动剂可以显著诱导肿瘤细胞发生线粒体自噬，进而导致肿瘤细胞的 死亡，抑制脑瘤的进一步发展和扩散。

综上所述可以得出，本实施例提供的TRPV4激动剂大麻二酚，对于脑肿瘤及其相关疾病 具有良好的治疗效果和应用前景，其中，TRPV4通道是大麻二酚进入人体后作用的潜在靶标， TRPV4激动剂进入人体后可以促进TRPV4通道的钙离子内流，激活内质网应激，进而诱导 线粒体损伤，导致线粒体发生自噬，进一步导致肿瘤细胞的死亡，对于脑肿瘤及其相关疾病 具有良好的治疗效果。

实施例3

一种抑制脑肿瘤的药物，该药物包括TRPV4激动剂和具有抗肿瘤活性的肿瘤抑制剂。 TRPV4激动剂和肿瘤抑制剂的浓度比为(即在同一溶液中二者浓度单位相同的情况)：(10-30):(10-500)。TRPV4激动剂的作用机理再配合肿瘤抑制剂的抑制机理，二者联用，实现 了增效、降低毒副作用的抗肿瘤效果。

在本实施例中，任意一种或多种TRPV4激动剂均可与任意一种或多种肿瘤抑制剂配合使 用。

较佳地，该肿瘤抑制剂包括替莫唑胺。该替莫唑胺可与至少一种TRPV4激动剂联用。

较佳地，所述TRPV4激动剂包括大麻二酚。TRPV4激动剂大麻二酚可与至少一种肿瘤 抑制剂联用。

最佳地，若肿瘤抑制剂为替莫唑胺，TRPV4激动剂为大麻二酚，大麻二酚和替莫唑胺的 用量比为：其浓度比优选为(10μM-20μM):(10μM-300μM)。

实施例4

本实施例提供一种抑制脑肿瘤的药物，包括：大麻二酚和替莫唑胺。

其中，大麻二酚的浓度为0.01μM-30μM，在实际应用中，大麻二酚的浓度可以为0.01 μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μ M等，优选为10μM或20μM，可视具体情况而定，本申请对此不做限制。

需要说明的是，在单独使用四氢大麻酚(THC)等其他大麻素类药物的情况下，通常会 影响人的记忆力、注意力和判断力，还会造成意识模糊、嗜睡、意识混乱、出现幻觉等，并具有成瘾性，但大麻二酚属于大麻素中的非成瘾性物质，不仅不会产生上述症状以及成瘾性， 而且在将大麻二酚与替莫唑胺联合使用的情况下，还可以显著改善患者精神状态。

本实施例所述的药物中加入大麻二酚，一方面，可以有助于药物透过血脑屏障，作用于 脑部病灶区域；另一方面，加入大麻二酚的药物将TRPV4作为靶标，通过作用TRPV4诱导 肿瘤细胞发生线粒体自噬，致使肿瘤细胞死亡，进而达到抑制肿瘤的增殖的效果，起到预防 或治疗脑肿瘤及其相关疾病的作用。

替莫唑胺是一种可以被人体迅速吸收转化的活性物质，本实施例所述的药物中加入替莫 唑胺，有助于提高药物的生物利用度和抗肿瘤活性。具体地，加入替莫唑胺的药物在进入体 内后，在体内可以快速自发降解，进而抑制肿瘤的增殖，产生抗肿瘤作用。

此外，患者在长时间服用替莫唑胺的情况下通常会产生耐药性，而大麻二酚与替莫唑胺 的联合使用，有助于提高细胞膜的通透性，促使药物更好的透过细胞膜进入肿瘤细胞发挥抑 制作用，如此可以有效避免耐药性的产生，提高治疗效果。

在本实施例所述的药物中，大麻二酚与替莫唑胺的配伍使用，大麻二酚有助于提高替莫 唑胺的肿瘤抑制作用，替莫唑胺有助于提高大麻二酚的生物利用度，二者的联合使用可以发 挥显著的协同作用，显著提高药物抑制肿瘤细胞的克隆增殖能力，显著提高药物抑制肿瘤细 胞的活性的能力，进而达到治疗脑肿瘤及其相关疾病的效果，提高患者的生存率，延长患者 的生存期，改善患者的生存质量，提高肿瘤相关疾病的治疗效果。

在实际应用中，替莫唑胺的浓度为0.01-500μM，如0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5 μM、1μM、5μM、10μM、15μM、30μM、50μM、80μM、90μM、100μM、150μ M、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM、500μM，优选为10-300μM， 更优选为10-200μM，大麻二酚的浓度优选为10μM或20μM，在上述的情况下，即在药物 只有这两种组分时，该比例下，二者协同效果最佳，因为，在该比例下，替莫唑胺的毒副作 用是最小的，其耐药性的改善或消除效果也是最好的，且药物整体的效果也是最好的，如果 改变该比例，要么效果会受到影响，要么替莫唑胺的毒副作用改善很小，要么其耐药性没有 改善，故综合平衡者两种组分的所有因素，该比例时，整体治疗效果最佳，且大麻二酚对于 提高替莫唑胺的肿瘤抑制作用和降低其毒副作用以及改善或消除其耐药性更为显著。此外， 在替莫唑胺的浓度为500μM的情况下，效果同样十分显著。

在本实施例中，所述的TRPV4激动剂大麻二酚搭配替莫唑胺使用，二者可以发挥显著的 协同作用，甚至可能会形成一个有机的整体，该组合物不仅可以增强对于TRPV4通道钙离子 内流的促进作用，还可以在促进TRPV4通道钙离子内流、激活内质网应激、诱导线粒体损伤 和自噬、诱导肿瘤细胞的基础上，提高药物整体在人体内的生物利用度和抗肿瘤活性，抑制 肿瘤细胞的活性，抑制肿瘤细胞的克隆增殖能力，提高脑肿瘤及其相关疾病的治疗效果，提 高患者生存率，延长患者生存期，改善患者生存质量。

实施例5

本实施例提供一种抑制脑肿瘤的药物，包括：TRPV4激动剂和协同增效物质。

优选地，TRPV4激动剂为大麻二酚，协同增效物质为冰片和/或薄荷脑。

在本实施例中，大麻二酚作为TRPV4激动剂能够促进TRPV4信号通道的钙离子内流， 从而促进诱导肿瘤细胞发生线粒体自噬，实现了更强的抗脑肿瘤的作用，协同增效物质可以 增强血脑屏障通透性，提高药物在脑部病灶区的作用浓度，促进药物的吸收，提高药物的治 疗效果，二者之间相互作用，不仅能够从多个角度来增强抗肿瘤效应，还能够显著降低毒副 作用，提供治疗效果。

实施例6

在实施例3或4的基础上，所述抑制脑肿瘤的药物还优选包括协同增效物质，该协同增 效物质包括冰片和/或薄荷脑，如可加入冰片、薄荷脑、冰片与薄荷脑的组合等。

其中，TRPV4激动剂大麻二酚、替莫唑胺与协同增效物质的浓度比为 (10-30):(10-500):(10-80)。优选浓度比为(10-20):(10-300):(20-50)或(10-20):500:(30-60)，即在药 物含有这三类组分时，该比例下，三者协同效果最佳，因为，在该比例下，替莫唑胺的毒副 作用是最小的，其耐药性的改善或消除效果也是最好的，且药物整体的效果也是最好的，如 果改变该比例，要么效果会受到影响，要么替莫唑胺的毒副作用改善很小，要么其耐药性没 有改善，要么协同增效物质对另外两种组分的辅助增效、降低毒副作用和耐药性的效果不显 著，故综合平衡三类物质的所有因素，该比例时，整体治疗效果最佳。

在实际应用中，大麻二酚的浓度可以为10μM、20μM等，替莫唑胺的浓度可以为10 μM、50μM、100μM、150μM、200μM等，协同增效物质的浓度可以为0.01μM、0.05 μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、 60μM、70μM、80μM等，可视具体情况而定，本申请对此不做限制。

冰片，由菊科艾纳香茎叶或樟科植物龙脑樟枝叶经水蒸汽蒸馏并重结晶而得。薄荷脑是 一种由薄荷的叶和茎中所提取得到的化学药剂，呈白色晶体。

本实施例所述的抑制脑肿瘤的药物加入冰片、薄荷脑等协同增效物质，冰片、薄荷脑在 药物中可以产生芳香开窍的作用，可以提高5-羟色胺在下丘脑的含量，促使生理及病理情况 下脑微血管内皮细胞生成一氧化氮，进而增强血脑屏障的通透性，有助于药物中大麻二酚、 替莫唑胺快速高效的通过血脑屏障到达脑部病灶区发挥肿瘤抑制作用，冰片、薄荷脑还可以 抑制细胞膜上P-糖蛋白的活性，进而使进入血脑屏障的大麻二酚、替莫唑胺被排除的几率大 大减小，促进脑部病灶区对药物中大麻二酚、替莫唑胺有效成分的吸收，促进药物药效的发 挥，提高药物对脑肿瘤及其相关疾病的治疗效果。

需要说明的是，冰片、薄荷脑促进血脑屏障的开放是生理性开放，其在促进血脑屏障开 放的同时还对血脑屏障具有一定的保护作用，不会引起脑部的病理性损害。

此外，在单独使用替莫唑胺的情况下，会存在明显的呕吐、眩晕、乏力等毒副作用，在 本实施例所述的药物中，将大麻二酚和协同增效物质等与替莫唑胺配伍使用，可以显著减少 由替莫唑胺引起的呕吐、眩晕、乏力，血小板异常等症状，副作用减缓明显。

在本实施例中，大麻二酚、替莫唑胺和协同增效物质之间可能会形成络合物，使其相互 作用，不仅能够从多个角度来增强抗肿瘤效应，还能够显著降低毒副作用，尤其对传统替莫 唑胺所产生的呕吐、眩晕、乏力等副作用具有良好治疗效果。

实施例7

在实施例1-6任意一项的基础上，所述抑制脑肿瘤的药物还可以包括：赋形剂、佐剂、 添加剂、表面活性剂、干燥剂、稀释剂中的至少一种。

赋形剂，是药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。在本实施例中，在药物制 成片剂的情况下，赋形剂可以为黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂等；在药物制成液体制剂 的情况下，赋形剂可以为防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等，可视具体情况而定，本申请对此不做限制。本实施例所述的药物中加入赋形剂，可以提高药物的制剂灵活性，根据不同的实际需求将药物制成不同的剂型，扩大药物的适用人群，提高药物对不同类型患者的治疗效果。

佐剂，是一种非特异性免疫增强剂。在本实施例中，药物中加入的佐剂可以为氢氧化铝 佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、明矾等均可，本申请对此不做限制，本实施例所 述的药物根据实际需求加入不同的佐剂，可以提高患者身体的免疫应答能力，并相应提高药 物的治疗效果。

添加剂是一种为提高药物质量和治疗效果的物质。在本实施例中，药物中加入的添加剂 可以为大环内酯类添加剂，多肽类添加剂，四环素类添加剂和化学合成类添加剂等，可视具 体情况而定，本申请对此不做限制。本实施例所述的药物中根据实际需求添加不同的添加剂， 可以提高药物的质量和安全性，从而进一步提升药物的治疗效果。

表面活性剂，是一种少量加入即可以使其溶液体系的界面状态发生明显变化的物质。在 本实施例中，表面活性剂可以为阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子型表面活性 剂、两性表面活性剂、复配表面活性剂、其他表面活性剂等，可视具体情况而定，本申请对 此不做限制。本实施例所述的药物中根据实际需求加入不同种类的表面活性剂，可以在药物 制成溶液剂的情况下，增加药物在溶液中的溶解性，并且可以有效杀菌消毒，提高药物的安 全性。

干燥剂，是一种能够除去潮湿物质中水分的物质。在本实施例中，干燥剂既可以为碳酸 钙、氯化钙等化学干燥剂，也可以为硅胶、活性氧化铝等物理干燥剂，或是其他类型的干燥 剂均可，本申请对此不做限制。本实施例所述的药物中根据实际需求加入不同种类的干燥剂， 可以提高药物的干燥性，延长药物的保存时间。

稀释剂，又称填充剂，是一种能够增加片重或体积的物质。在本实施例中，在药物制成 片剂的情况下，稀释剂可以为淀粉、糊精等淀粉类稀释剂，也可以为糖粉、乳糖、甘露醇等 糖类稀释剂，还可以为微晶纤维素等其他类型的稀释剂，本申请对此不做限制。在本实施例 所述的药物制成片剂的情况下，根据实际需求加入不同种类的稀释剂，可以有效提高药物的 压片质量，有助于药物的保存。

此外，本申请所述的药物还可以包括其他成分，比如粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂 等，可以视药物的具体剂型而定，本申请对此不做限制。

进一步地，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂中的任意一种。

片剂是药物与辅料均匀混合后压制而成的片状或异形片状的固体制剂，包括普通口服片 剂、含片、舌下片、口腔贴片、咀嚼片、分散片、泡腾片、阴道片、速释或缓释或控释片、 肠溶片等。在本实施例中，将药物制作为片剂，可以保证剂量准确，理化性质稳定，贮存期 长，使用、运输、携带方便，价格实惠，产量高。

胶囊剂是药物或与适宜辅料充填于空心硬胶囊或密封于软质囊材中制成的固体制剂，主 要包括硬胶囊、软胶囊、缓释胶囊、控释胶囊和肠溶胶囊等。在本实施例中，将药物制作为 胶囊剂，可以有效提高药物稳定性，有助于药物的迅速起效，还可以根据实际需求延缓或定 位释放药物，灵活性高。

粉剂，又称为散剂，是将原药、大量的填料及适当的稳定剂一起混合粉碎所得到的一种 干剂。在本实施例中，将药物制作为粉剂，稳定性好，服用方便，起效快。

颗粒剂是原料药和适宜的辅料混合制成具有一定粒度的干燥颗粒状制剂，其既可以直接 吞服，也可以冲入水中饮服。在本实施例中，将药物制作为颗粒剂，吸收快，显效迅速，服 用方便。

丸剂是药材细粉或药材提取物加适宜的粘合辅料制成的球形或类球片形制剂，包括水丸、 蜜丸、糊丸、蜡丸、浓缩丸、微丸等。在本实施例中，将药物制作为丸剂，便于储存，药效 持久，并且服用方便。

栓剂是药物与适宜基质制成的具有一定形状的供人体腔道内给药的固体制剂。栓剂在常 温下为固体，塞入腔道后，在体温下能迅速软化熔融或溶解于分泌液，逐渐释放药物而产生 局部或全身作用。在本实施例中，将药物制作为栓剂，可以使得药物不受或少受胃肠道pH 值或酶的破坏，避免药物对胃黏膜的刺激，适于不能或不愿口服给药的患者。

软膏剂是药物与适宜基质均匀混合制成的具有一定稠度的半固体外用制剂。在本实施例 中，将药物制作为软膏剂，给药方便，透过皮肤直接到达病灶，参与血液循环，疗效快而直 接。

溶液剂一般为非挥发性药物或少数挥发性药物的澄明溶液，大多以水为溶剂，也有以乙 醇、植物油或其他液体为溶剂者，可供内服和外用。在本实施例中，将药物制作为溶液剂， 有助于加速人体对药物的吸收，起效快。

此外，本实施例提供的药物，还可以制作为混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等剂型，可以 视具体情况而定，本申请对此不做限制。

本实施例提供的药物，包括大麻二酚、替莫唑胺和协同增效物质，其中，大麻二酚可以 诱导胶质瘤细胞等肿瘤细胞发生自噬，进而对胶质瘤等脑肿瘤及其相关疾病起到显著的抑制 作用，替莫唑胺具有极高的生物利用度和广谱的抗肿瘤活性，可以起到显著的抗肿瘤作用， 大麻二酚还可以进一步增强替莫唑胺的活性，进一步增强替莫唑胺的抗肿瘤作用，二者联合 使用可以显著抑制胶质瘤细胞增殖及干性。此外，协同增效物质可以增强血脑屏障通透性， 提高药物在脑部病灶区的作用浓度，促进药物的吸收，提高药物的治疗效果。

所以，本申请提供的抑制脑肿瘤的药物，对包括胶质瘤在内的原发性脑瘤及其相关疾病 具有良好的治疗效果，对于包括胶质瘤在内的原发性脑瘤及其相关疾病的治疗具有良好的应 用前景。

实施例8

本实施例提供一种实施例1-7任意一项所述的药物在制备治疗脑肿瘤及其相关疾病的药 品中的应用。

其中，脑肿瘤包括胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、转移瘤、听神经瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、第四脑室的室管膜瘤、蝶鞍部的颅咽管瘤等。本申请优选所述脑肿瘤为胶质瘤。

脑肿瘤的相关疾病可以是脑肿瘤形成过程中产生的疾病或脑肿瘤引起的并发症、后遗症 等与脑肿瘤具有一定相关性的疾病，比如桥脑、偏瘫、癫痫等，本申请对此不做限制。

可选地，所述药物能够与预防或治疗脑肿瘤及其相关疾病的药物在制备治疗所述治疗脑 肿瘤及其相关疾病的药品中联合使用，换而言之，所述药物为能够与预防或治疗脑肿瘤及其 相关疾病的药物在制备治疗所述治疗脑肿瘤及其相关疾病的药品中联合使用的药物。

在本实施例中，预防或治疗脑肿瘤及其相关疾病的药物可以为干扰核酸生物合成的药物， 比如甲氨蝶呤(MTX)、氟尿嘧啶(5-FU)、巯嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷等，或是直接影响DNA 的药物，比如烷化剂等，或是干扰转录过程以及阻止RNA合成的药物，比如多柔比星、放线 菌素D、柔红霉素等，或是其他具有相关预防或治疗作用的药物，比如甲基苄肼，环己亚硝 胺，长春新碱等均可，本申请对此不做限制。

此外，所述治疗脑肿瘤及其相关疾病的药物还可以附以其他治疗手段对患者进行治疗， 比如化疗、放疗、手术治疗等均可，以提高治疗效果。

可选地，所述药物通过抑制肿瘤细胞的增殖及干性来预防或治疗脑肿瘤及其相关疾病。

进一步地，所述药物通过以TRPV4为靶标，诱导肿瘤细胞发生线粒体自噬致使肿瘤细胞 死亡，进而预防或治疗脑肿瘤及其相关疾病。

具体地，本实施例提供的药物可以通过作用潜在靶标TRPV4诱导肿瘤细胞发生线粒体自 噬，致使肿瘤细胞死亡，进而起到预防或治疗脑肿瘤及其相关疾病的作用。

其中，TRPV4(瞬时感受器电位通道4)是一种瞬时性的钙离子通道，药物作用后会引 起钙离子内流，而钙离子内流是激活内质网应激的主要诱因，在使用拮抗剂的情况下，TRPV4 可以逆转药物的作用，所以，TRPV4可以作为药物在脑瘤中作用的潜在靶标。

本实施例提供的药物还可以显著诱导线粒体的形态变化，并且线粒体的数量随着药物浓 度的升高而显著减少，所以，本实施例提供的药物可以显著诱导肿瘤细胞发生线粒体自噬， 进而导致肿瘤细胞的死亡，抑制脑瘤的进一步发展和扩散，同时，药物中的协同增效物质还 可以降低替莫唑胺的毒副作用，提高脑肿瘤及其相关疾病的治疗效果。

所以，本实施例提供的药物，应用于制备预防或治疗原发性脑瘤等脑肿瘤及其相关疾病 的药品中，可以减少原发性脑瘤等脑肿瘤及其相关疾病临床治疗过程中产生的毒副作用，提 高原发性脑瘤等脑肿瘤及其相关疾病的治疗效果。

试验例1

本试验例设置对照组1和试验组1-5。对照组1和试验组1-5每组均选择相同数量的体外 胶质瘤细胞系，上述体外胶质瘤细胞系包括U251细胞、U87细胞和LN18细胞，其中，对照 组1不对体外胶质瘤细胞系做任何处理，试验组1采用10μM大麻二酚对体外胶质瘤细胞系 处理48小时，试验组2采用20μM大麻二酚对体外胶质瘤细胞系处理48小时，试验组3采用500μM替莫唑胺对体外胶质瘤细胞系处理48小时，试验组4采用10μM大麻二酚和500 μM替莫唑胺对体外胶质瘤细胞系处理48小时，试验组5采用20μM大麻二酚和500μM 替莫唑胺对体外胶质瘤细胞系处理48小时，48小时后通过MTT法对各组体外胶质瘤细胞系 的相对活力进行检测。

如图1所示，图1a是各组U251细胞的相对活力示意图，其中，横轴表示组别，纵轴表示以对照组1为基准的U251细胞的相对活力，可以看出，试验组1在加入10μM大麻二酚 的情况下，U251细胞活力与对照组1基本持平；试验组2加入20μM大麻二酚的情况下， U251细胞的活力得以降低；试验组3在加入500μM替莫唑胺的情况下，U251细胞的活力 与对照组1相差无几；试验组4在加入10μM大麻二酚和500μM替莫唑胺的情况下，U251 细胞的活力在试验组2的基础上进一步降低；试验组5在加入20μM大麻二酚和500μM替 莫唑胺的情况下，U251细胞的活力在试验组2、4的基础上显著降低。

图1b是各组U87细胞的相对活力示意图，其中，横轴表示组别，纵轴表示以对照组1为基准的U87细胞的相对活力，可以看出，试验组1在加入10μM大麻二酚的情况下，U87 细胞的活力略高于对照组1；试验组2加入20μM大麻二酚的情况下，U87细胞的活力略低 于对照组1；试验组3在加入500μM替莫唑胺的情况下，U87细胞的活力略低于对照组1； 试验组4在加入10μM大麻二酚和500μM替莫唑胺的情况下，U87细胞的活力在对照组1 和试验组1-3的基础上得以降低；试验组5在加入20μM大麻二酚和500μM替莫唑胺的情 况下，U87细胞的活力在对照组1和试验组1-3的基础上显著降低。

图1c是各组LN18细胞的相对活力示意图，其中，横轴表示组别，纵轴表示以对照组1 为基准的LN18细胞的相对活力，可以看出，试验组1在加入10μM大麻二酚的情况下，LN18细胞的活力略高于对照组1；试验组2加入20μM大麻二酚的情况下，LN18细胞的活力略 低于对照组1；试验组3在加入500μM替莫唑胺的情况下，LN18细胞的活力略低于对照组 1；试验组4在加入10μM大麻二酚和500μM替莫唑胺的情况下，LN18细胞的活力在对照 组1和试验组1-3的基础上得以降低；试验组5在加入20μM大麻二酚和500μM替莫唑胺 的情况下，LN18细胞的活力在对照组1和试验组1-3的基础上显著降低。

如图2所示，图2是U251细胞和U87细胞的数量对比图，自左边起依次为对照组1、试验组2、试验组3、试验组5的细胞数量图，可以看出，在大麻二酚与替莫唑胺联合使用的情况下，U251细胞和U87细胞的数量显著减少，即可以显著抑制肿瘤细胞的增殖。

所以，大麻二酚与替莫唑胺具有极好的协同作用，二者的联合使用可能会形成一个络合 的整体，显著抑制肿瘤细胞的克隆增殖，对于治疗脑肿瘤及其相关疾病均具有良好的应用前 景，并且在大麻二酚浓度为20μM，替莫唑胺浓度为500μM的情况下其对肿瘤细胞的抑制 作用最为显著。

试验例2

本试验例设置对照组1和试验组1-3。对照组1和试验组1-3每组均选择BALB/c-nude7-8 周龄雄性裸鼠40只。

取U87-MG-Luc细胞经过胰酶消化处理制备成1*10⁶浓度的单细胞悬液，将U87-MG-Luc 细胞重悬于4μlPBS中，利用立体定位仪取4μl细胞悬液缓慢注射至裸鼠的右脑半球，深度 为3mm，注射完毕后缓慢取出注射器，并用碘酒消毒，将小鼠送至SPF级动物房饲养。

各组小鼠以同样的饲养环境和饲养条件饲养四周，其中，对照组1的小鼠不使用任何药 物，试验组1-3小鼠的给药情况如表1所示：

表1各组小鼠给药情况示意表

需要说明的是，大麻二酚的溶剂为5％DMSO+95％生理盐水，替莫唑胺的溶剂为生理盐 水。

分别在饲养的第7天、第14天、第21天和第28天观察小鼠的胶质瘤情况，结果如图3所示。

图3是小鼠胶质瘤发展情况示意图，其中检测显示荧光部分表示胶质瘤。从图3中可以 看出，在单独使用大麻二酚或替莫唑胺的情况下，小鼠的胶质瘤依旧随着时间的推移持续增 长，而在将大麻二酚与替莫唑胺联合使用的情况下，小鼠的胶质瘤体积显著减小，胶质瘤得 以抑制。

分别统计及分析各组小鼠的生存期及荧光信号，结果如图4所示。图4a是各组小鼠生存 情况折线示意图，横轴表示天数，纵轴表示生存率，可以看出，在单独使用大麻二酚或替莫 唑胺的情况下，患有胶质瘤小鼠的生存状况与对照组1无明显差异，而在将大麻二酚与替莫 唑胺联合使用的情况下，患有胶质瘤小鼠的生存时间得以延长一倍左右。图4b是各组活体成 像bioluminescence(Bli)信号强度情况折线示意图，横轴表示天数，纵轴表示活体成像 bioluminescence信号强度，图4c是图4b的局部放大图，可以看出，随着时间的推移，患有 胶质瘤的bioluminescence信号会显著升高，患有胶质瘤的小鼠在使用大麻二酚后，其 bioluminescence信号较弱，患有胶质瘤的小鼠在在使用大麻二酚的基础上应用替莫唑胺后， 其bioluminescence信号进一步减弱，患有胶质瘤的小鼠在联合使用大麻二酚和替莫唑胺后， 其bioluminescence信号十分稳定，并未出现升高迹象。

所以，本申请提供的药物，将大麻二酚与替莫唑胺联合使用，相对于二者的单独使用， 抗肿瘤能力有了显著提高，还可以显著延长患者生存期。

试验例3

本试验例设置对照组1和试验组1-7。对照组1和试验组1-7每组均选择相同数量的体外 胶质瘤细胞系，上述体外胶质瘤细胞系包括U373细胞和U87细胞，其中，对照组1不对体 外胶质瘤细胞系做任何处理，试验组1采用15μM薄荷脑对体外胶质瘤细胞系处理48小时， 试验组2采用15μM冰片对体外胶质瘤细胞系处理48小时，试验组3采用15μM替莫唑胺对体外胶质瘤细胞系处理48小时，试验组4采用15μM大麻二酚对体外胶质瘤细胞系处理 48小时，试验组5采用10μM替莫唑胺和15μM大麻二酚对体外胶质瘤细胞系处理48小时， 试验组6采用10μM替莫唑胺、15μM大麻二酚和15μM薄荷脑对体外胶质瘤细胞系处理 48小时，试验组7采用10μM替莫唑胺、15μM大麻二酚和15μM冰片对体外胶质瘤细胞 系处理48小时，48小时后通过MTT法对各组体外胶质瘤细胞系的相对活力进行检测。如图 5所示，图5是U373胶质瘤细胞和U87胶质瘤细胞的相对活力柱状示意图，其中横轴表示 组别，纵轴表示小鼠的胶质瘤细胞的相对活力。

从图5中可以看出，在仅使用薄荷脑、冰片、大麻二酚或替莫唑胺对小鼠进行治疗的情 况下，胶质瘤细胞的相对活力与不使用任何药物治疗无甚差异，在使用大麻二酚和替莫唑胺 对对细胞进行处理情况下，对胶质瘤细胞的相对活力具有明显的抑制作用，在使用大麻二酚、 替莫唑胺、薄荷脑或大麻二酚、替莫唑胺、冰片对胶质瘤细胞进行处理情况下，胶质瘤细胞 的相对活力显著降低，说明本申请提供的药物可以对胶质瘤细胞产生良好的抑制作用和治疗 效果。

如图6所示，图6是U373胶质瘤细胞的凋亡情况柱状示意图，其中，横轴表示组别，纵轴表示胶质瘤细胞的相对活力。

从图6可以看出，在仅使用薄荷脑、冰片、大麻二酚或替莫唑胺对进行治疗的情况下， 仅有极少胶质瘤细胞出现凋亡的情况，在使用大麻二酚和替莫唑胺对胶质瘤细胞进行处理， 凋亡细胞相应增多，在使用大麻二酚、替莫唑胺、薄荷脑或大麻二酚、替莫唑胺、冰片对胶 质瘤细胞进行处理显著诱导胶质瘤细胞凋亡，说明本申请提供的药物，大麻二酚与替莫唑胺 可以诱导胶质瘤细胞的凋亡，薄荷脑与冰片可以显著增强大麻二酚与替莫唑胺对胶质瘤的抑 制作用。

试验例4

本试验例设置对照组1和试验组1-7。对照组1和试验组1-7每组均选择BALB/c-nu/nu7-8 周龄雄性裸鼠40只。

取U87-MG-Luc细胞经过胰酶消化处理制备成1*10⁶浓度的单细胞悬液，将U87-MG-Luc 细胞重悬于4μlPBS中，利用立体定位仪取4μl细胞悬液缓慢注射至裸鼠的右脑半球，深度 为3mm，缓慢注射5min,注射完毕后缓慢取出注射器，并用碘酒消毒，将小鼠送至SPF级动物房饲养。

各组小鼠以同样的饲养环境和饲养条件饲养三周，其中，对照组1的小鼠不使用任何药 物，试验组1-7小鼠的给药情况如表1所示：

表2各组小鼠给药情况示意表

如图7所示，图7是饲养14天和28天情况下，各组小鼠胶质瘤生长状况的示意图，其中，荧光信号部分表示胶质瘤。从图7中可以看出，在仅使用薄荷脑、冰片、大麻二酚或替 莫唑胺对小鼠进行治疗的情况下，小鼠胶质瘤的状况并没有得到改善，反而随着时间的推移不断生长扩散，在使用大麻二酚和替莫唑胺对小鼠进行治疗的情况下，小鼠胶质瘤得到明显 改善，在使用大麻二酚、替莫唑胺、薄荷脑或大麻二酚、替莫唑胺、冰片对小鼠进行治疗的 情况下，小鼠胶质瘤面积显著缩小，说明胶质瘤得以抑制。

所以，本申请提供的药物，大麻二酚可以显著增强替莫唑胺对胶质瘤的抑制作用，薄荷 脑及冰片可以促进脑部对大麻二酚和替莫唑胺的吸收作用，提高到达脑瘤病灶的药物浓度， 进而进一步提高对胶质瘤的抑制作用，提高药物对胶质瘤等脑瘤疾病的治疗效果。

试验例5

本试验例设置对照组1和试验组1-6。对照组1和试验组1-6每组均选择相同数量的体外 胶质瘤细胞系，上述体外胶质瘤细胞系包括U251细胞和U87细胞，其中，对照组1不对体 外胶质瘤细胞系做任何处理，试验组1采用15μM大麻二酚和5μM四氢大麻酚对体外胶质瘤细胞系处理48小时，试验组2采用10μM替莫唑胺和15μM薄荷脑对体外胶质瘤细胞系 处理48小时，试验组3采用10μM替莫唑胺和15μM冰片对体外胶质瘤细胞系处理48小 时，试验组4采用10μM替莫唑胺、15μM大麻二酚和15μM薄荷脑对体外胶质瘤细胞系 处理48小时，试验组5采用10μM替莫唑胺、15μM大麻二酚和15μM冰片对体外胶质瘤 细胞系处理48小时，试验组6采用10μM替莫唑胺、15μM大麻二酚、15μM薄荷脑和15 μM冰片对体外胶质瘤细胞系处理48小时，48小时后通过MTT法对各组小鼠的胶质瘤细胞 的相对活力进行检测。

结果如图8所示，图8是试验组1-6各组U251细胞和U87细胞的相对活力示意图，其中，横轴表示组别，纵轴表示以对照组1为基准的U251细胞和U87细胞的相对活力，可以 看出，试验组1-3中在大麻二酚与四氢大麻酚、或替莫唑胺与冰片/薄荷脑配合使用的情况下，U251细胞和U87细胞的细胞相对活力基本持平，试验组4和5中在替莫唑胺与大麻二酚、 薄荷脑配合使用或替莫唑胺与大麻二酚、冰片配合使用的情况下，U251细胞和U87细胞的 相对活力显著降低，试验组6中在替莫唑胺与大麻二酚、薄荷脑和冰片的配合使用的情况下，U251细胞和U87细胞的相对活力进一步降低。

由此可见，替莫唑胺与大麻二酚、薄荷脑配合使用以及替莫唑胺与大麻二酚、冰片配合 使用可以良好的抑制胶质瘤细胞的活力，良好的抑制胶质瘤的生长与发展，并且在此基础上， 将替莫唑胺、大麻二酚、薄荷脑与冰片配合使用，可以进一步提高对胶质瘤细胞的抑制能力， 进而极好的抑制胶质瘤的生长与发展。

对体外胶质瘤细胞系中的U251细胞的凋亡情况进行检测，结果如图9所示，图9是U251 细胞的凋亡情况柱状示意图，其中，横轴表示组别，纵轴表示胶质瘤细胞中活细胞、早期凋 亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞的比例。从图9中可以看出，如试验组1和2的将四氢大 麻酚与大麻二酚配合使用、或替莫唑胺与薄荷脑配合使用对体外胶质瘤细胞系进行处理的情 况下，U251细胞的活细胞数量最多，如试验组3的将替莫唑胺与冰片配合使用对体外胶质瘤 细胞系进行处理的情况下，U251细胞的活细胞数量得以降低，如试验组4的将替莫唑胺与大 麻二酚、冰片配合使用对体外胶质瘤细胞系进行处理的情况下，U251细胞的活细胞数量在试 验组3的基础上得以进一步降低，如试验组5和6的将替莫唑胺与大麻二酚、薄荷脑配合使 用，或将替莫唑胺与大麻二酚、冰片、薄荷脑配合使用对体外胶质瘤细胞系进行处理的情况 下，U251细胞的活细胞数量显著降低，坏死细胞数量显著升高。

由此可见，替莫唑胺与大麻二酚、冰片配合使用，或替莫唑胺与大麻二酚、薄荷脑配合 使用可以抑制胶质瘤细胞的生长与增殖，抑制胶质瘤的生长与发展，替莫唑胺与大麻二酚、 冰片以及薄荷脑配合使用可以显著转移至胶质瘤细胞的生长与增殖，显著抑制胶质瘤的生长 与发展。

试验例6

本试验例设置试验组1-4。上述试验组1-4每组均选择BALB/c-nu/nu7-8周龄雄性裸鼠40 只。

取U87MG-Luc细胞经过胰酶消化处理制备成1*10⁶浓度的单细胞悬液，将U87MG-Luc 细胞重悬于4μlPBS中，利用立体定位仪取4μl细胞悬液缓慢注射至裸鼠的右脑半球，深度 为3mm，注射完毕后缓慢取出注射器，并用碘酒消毒，将小鼠送至SPF级动物房饲养。

各组小鼠以同样的饲养环境和饲养条件饲养28天，其中，试验组1-4小鼠的给药情况如 表3所示：

表3各组小鼠给药情况示意表

对各组小鼠的胶质瘤生长情况进行检测，结果如图10所示，图10是饲养14天和28天 的情况下，各组小鼠胶质瘤生长状况的示意图，其中，荧光信号部分表示形成的肿瘤组织。 可以看出，在试验组1使用替莫唑胺和冰片对小鼠进行治疗的情况下，小鼠胶质瘤随着时间 的推移不断生长扩散，在试验组2使用替莫唑胺和薄荷脑对小鼠进行治疗的情况下，小鼠胶 质瘤随着时间的得以抑制，在试验组3使用替莫唑胺、大麻二酚和冰片对小鼠进行治疗的情 况下，随着时间的推移小鼠胶质瘤未发生明显变化，在试验组4使用替莫唑胺、大麻二酚和 冰片对小鼠进行治疗的情况下，小鼠胶质瘤被显著抑制，胶质瘤几乎不复存在。

所以，替莫唑胺与大麻二酚、冰片的配合使用，以及替莫唑胺与大麻二酚、薄荷脑的配 合使用，可以有效抑制小鼠胶质瘤的生长与发展。

试验例7

本试验例设置对照组1和试验组1-5。对照组1和试验组1-5每组均选择BALB/c-nu/nu7-8 周龄雄性裸鼠60只。

取U87-MG-Luc细胞经过胰酶消化处理制备成1*10⁶浓度的单细胞悬液，将U87-MG-Luc 细胞重悬于4μlPBS中，利用立体定位仪取4μl细胞悬液缓慢注射至裸鼠的右脑半球，深度 为3mm，注射完毕后缓慢取出，并用碘酒消毒，将小鼠送至SPF级动物房饲养。

各组小鼠以同样的饲养环境和饲养条件饲养三周，其中，对照组1和试验组1-5小鼠的 给药情况如表4所示：

表4各组小鼠给药情况示意表

在饲养期间观察并统计各组小鼠出现的不良反应情况，结果如表5所示。

表5各组小鼠不良反应情况对比表

由此可见，如对照组1的结果所示，对患有脑细胞瘤等脑肿瘤及其相关疾病的小鼠单独 使用替莫唑胺治疗的情况下，多数会引起胃肠道反应、血小板减少等严重的不良反应；如试 验组1-2的结果所示，对患有胶质瘤的小鼠同时使用替莫唑胺和冰片、或替莫唑胺和薄荷脑 的情况下，小鼠的不良反应得到轻微改善；如试验组3的结果所示，在将替莫唑胺与大麻二 酚联合使用对小鼠进行治疗的情况下，小鼠的不良反应得到显著改善；如试验组4-5的结果 所示，在将替莫唑胺与大麻二酚、协同增效物质联合使用对小鼠进行治疗的情况下，小鼠的 不良反应得到进一步地抑制。

所以，本申请提供的药物将替莫唑胺与大麻二酚和协同增效物质联合使用可以显著减少 由替莫唑胺引起的呕吐、恶心以及血小板减少等不良反应，改善患者使用感。

试验例8

本试验例设置对照组1和试验组1-7，其中，对照组1和试验组1-7均选择相同数量的体 外胶质瘤细胞系，上述体外胶质瘤细胞系包括耐药细胞株U251细胞和U87细胞。其中，对 照组1不对体外胶质瘤做任何处理，试验组1采用10μM替莫唑胺对体外胶质瘤处理48小时，试验组2采用10μM替莫唑胺与15μM大麻二酚对体外胶质瘤处理48小时，试验组3 采用10μM替莫唑胺和15μM薄荷脑对体外胶质瘤处理48小时，试验组4采用10μM替 莫唑胺和15μM冰片对体外胶质瘤处理48小时，试验组5采用10μM替莫唑胺、15μM大 麻二酚和15μM冰片对体外胶质瘤处理48小时，试验组6采用10μM替莫唑胺、15μM大 麻二酚和15μM薄荷脑对体外胶质瘤处理48小时，试验组7采用10μM替莫唑胺、15μM 大麻二酚、15μM薄荷脑和15μM冰片对体外胶质瘤处理48小时，48小时后采用MTT法 对各组体外胶质瘤细胞系进行处理。

结果如图11所示，图11是耐药菌株U251细胞和U87细胞的细胞相对活力对比图，其中横轴表示组别，纵轴表示以对照组1为参照的细胞相对活力，可见在单独使用替莫唑胺对细胞进行处理的情况下，其对耐药菌株U251细胞和U87细胞的抑制能力较弱，在将替莫唑胺与大麻二酚、薄荷脑、冰片中的任意一种或几种联合使用对细胞进行处理的情况下，其对耐药菌株U251细胞和U87细胞的抑制作用得到极大的提高，尤其是在替莫唑胺与大麻二酚、薄荷脑、冰片联合使用对细胞进行处理的情况下，对耐药菌株U251细胞和U87细胞的抑制能力极为显著。所以，本申请提供的药物，可以有效改善替莫唑胺的耐药性，提高胶质瘤的治疗效果。

所以，本申请提供的药物，应可以减少原发性脑瘤等脑肿瘤及其相关疾病临床治疗过程 中产生的毒副作用，提高原发性脑瘤等脑肿瘤及其相关疾病的治疗效果。

试验例9

本试验例提供了大麻二酚体外抑制胶质瘤细胞的相关试验，设置对照组1和试验组1-3， 其中对照组1不采用任何药物对胶质瘤进行处理，试验组1-3分别采用10μM、20μM和30 μM的大麻二酚对胶质瘤进行处理，采用MTT法对对照组1和试验组1-3的胶质瘤中的多种细胞进行检测，获得图12-15。

如图12所示，图12是各组胶质瘤细胞的细胞活力折线图，其中，横轴表示大麻二酚的 浓度，纵轴表示细胞活力，大正方形表示A172人胶质母细胞瘤细胞，正三角形表示U87人神经胶质瘤细胞，倒三角形表示LN18人胶质母细胞瘤细胞，菱形表示U251人神经胶质瘤细胞，圆形表示U118MG胶质瘤细胞，小正方形表示原代胶质瘤细胞(Primaryglia)。

从图12中可以看出，在大麻二酚的浓度低于10μM的情况下，对不同胶质瘤细胞的抑 制作用较弱，但当处理浓度为10-30μM的情况下，各种胶质瘤细胞的活力显著抑制，而对原代胶质细胞无没明显抑制作用，该结果提示CBD对胶质瘤具有很好应用前景。

如图13所示，图13是对照组1和试验组1，CBD对小鼠模型胶质瘤生长情况作用对比图，可以看出，采用大麻二酚对胶质瘤进行处理，可以有效抑制胶质瘤的生长。

如图14所示，图14是对照组1和试验组1为CBD对小鼠模型作用后肿瘤体积变化情况， 其中，横轴表示时间(天)，纵轴表示胶质瘤体积(mm³)，圆形表示对照组1，正方形表示试验组1。

从图14可以看出，对照组1和试验组1的胶质瘤随时间肿瘤体积均有一定增长，但试验 组1胶质瘤的体积增长幅度远小于对照组1，说明10μM的大麻二酚可以显著抑制胶质瘤的 增长。

如图15所示，图15是CBD对U251人神经胶质瘤细胞、U87人神经胶质瘤细胞、LN18人胶质母细胞瘤细胞的克隆形成情况对比图，结果在大麻二酚的浓度显示随着大麻二酚浓度 的升高，对上述肿瘤细胞的克隆形成有显著抑制作用。

所以，大麻二酚可以对多种肿瘤细胞具有显著抑制作用，提示对原发性脑肿瘤及其相关 疾病具有良好的治疗效果与应用前景。

试验例10

本试验例设置试验组1-2，其中试验组1采用实施例1所述TRPV4激动剂对U251人神经胶质细胞瘤细胞进行处理，试验组2采用实施例5所述TRPV4激动剂对U87人神经胶质 细胞瘤细胞进行处理，采用蛋白质印记法(westernblot)检测TRPV4激动剂对两种人神经胶质细胞瘤进行检测，获得图16。

如图16a所示，图16a是试验组1的U251人神经胶质瘤细胞和U87人神经胶质瘤细胞中Caspase3蛋白酶、Cl-Caspase3蛋白酶的含量对比图，其中，黑色部分的面积表示含量，GAPDH表示标准参照。需要说明的是，Caspase3蛋白酶对细胞凋亡起着不可替代的作用，Cl-Caspase3同样是凋亡蛋白的一种，随着U251人神经胶质瘤细胞和U87人神经胶质瘤细胞中大麻二酚浓度的升高，Caspase3蛋白酶、Cl-Caspase3蛋白酶的含量也逐渐升高。

如图16b所示，图16b是试验组1的U251人神经胶质瘤细胞和U87人神经胶质瘤细胞中自噬相关蛋白ATG5、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的含量对比图，其中，黑色部分的面积表示含量，GAPDH表示标准参照。需要说明的是，自噬相关蛋白的含量越多，则人胶质瘤细胞的凋亡 越多。从图16b中可以看出，随着大麻二酚浓度的逐渐升高，三种自噬相关蛋白的含量也随 之逐渐升高。

由此可见，大麻二酚可以诱导人神经胶质瘤细胞中线粒体的自噬，进而导致越来越多的 人神经胶质瘤细胞逐渐凋亡，起到抑制脑肿瘤的生长和发展。

试验例11

本试验例设置对照组1和试验组1-3，其中对照组1不采用任何药物对胶质瘤进行处理， 试验组1-3分别采用10μM、20μM和30μM的大麻二酚对胶质瘤进行处理，观察对照组1、试验组1-3的U251人神经胶质瘤细胞、U87人神经胶质瘤细胞中的线粒体，结果如图17所示。

图17是上述各组人神经胶质瘤细胞线粒体示意图，可以看出对照组和试验组人神经胶质 瘤细胞中的线粒体均呈现不同的形态，所以，大麻二酚可以显著诱导线粒体的形态变化。

分别检测对照组1和试验组1的U251人神经胶质瘤细胞、U87人神经胶质瘤细胞、LN18 人胶质母细胞瘤细胞的活性氧的水平，结果如图18所示。

图18a是上述各组人神经胶质瘤细胞的线粒体膜电位改变水平对比图，其中，横轴表示 细胞内线粒体膜电位水平，纵轴表示count函数计算的结果；图18b是上述各组人神经胶质 瘤细胞的氧化应激活性氧水平对比图，其中，横轴表示细胞内氧化应激活性氧，纵轴表示count 函数计算的结果。从图18a和图18b中可以看出，大麻二酚可以显著改变人神经胶质瘤细胞 中的线粒体功能，导致线粒体功能紊乱。

试验例12

本试验例提供对照组和试验组，其中对照组不采用任何药物对胶质瘤进行处理，试验组 采用20μM大麻二酚对胶质瘤进行处理。采用共定位染色法分别对对照组和试验组进行染色 并观察，结果如图19所示。

图19是对照组和试验组的线粒体、荧光燃料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、自噬相 关蛋白LC3-Ⅱ的共定位染色对比图，Merge表示Mitotracker共定位染色图、DAPI共定位染 色图和LC3-Ⅱ共定位染色图的叠加图，其中，线粒体采用线粒体染料Mitotracker染色。可以 看出，在人神经胶质瘤细胞中，线粒体与自噬相关蛋白LC3-Ⅱ共定位，所以，大麻二酚可以 显著诱导人神经胶质瘤细胞中的线粒体自噬。

试验例13

本试验例设置对照组1和试验组1-4，其中，对照组1不采用任何药物对胶质瘤进行处理， 试验组1-4分别采用10、20、30、40μM大麻二酚对胶质瘤进行处理，采用westernblot技术 对每组胶质瘤中U251人神经胶质瘤细胞和U87人神经胶质瘤细胞的线粒体裂解液中的LC- Ⅰ、LC-Ⅱ、PINK线粒体自噬蛋白的表达情况进行检测，结果如图20所示。

图20是不同人神经胶质瘤细胞中相关线粒体自噬蛋白的含量水平对比图，其中β-actin 为内部参照。从图20中可以看出，随着大麻二酚浓度的不断升高，U251人神经胶质瘤细胞 和U87人神经胶质瘤细胞的线粒体裂解液中的LC-Ⅱ、PINK线粒体自噬蛋白的含量也随之 升高，所以，大麻二酚可以显著诱导人神经胶质瘤细胞发生线粒体自噬。

试验例14

本试验例设置对照组1-4和试验组1-4，其中，对照组1不采用任何药物对胶质瘤进行处 理，对照组2采用线粒体自噬抑制剂氯喹(chloroquine，CQ)对胶质瘤进行处理，对照组3 采用线粒体自噬抑制剂Baf-A1对胶质瘤进行处理，对照组4采用线粒体自噬抑制剂渥曼青霉 素(Wortmannin)对胶质瘤进行处理，试验组1采用大麻二酚对胶质瘤细胞进行处理，试验 组2先采用线粒体自噬抑制剂CQ对胶质瘤细胞预处理1小时，再采用大麻二酚其作用48小 时，试验组3先采用线粒体自噬抑制剂Baf-A1对胶质瘤预处理1小时，再采用大麻二酚其作 用48小时，试验组4先采用线粒体自噬抑制剂渥曼青霉素对胶质瘤预处理1小时，再采用大 麻二酚其作用48小时，以对照组1胶质瘤中U251人神经胶质瘤细胞、U87人神经胶质瘤细 胞的细胞活性为标准，分别统计其他各组胶质瘤中U251人神经胶质瘤细胞和/或U87人神经 胶质瘤细胞的相对活性，得到图21。

如图21所示，图21a是对照组1-3和试验组1-3的胶质瘤中U251人神经胶质瘤细胞的 细胞活性对比图，其中横轴表示组别，纵轴表示细胞相对活性，可以看出，大麻二酚可以显 著抑制人神经胶质瘤细胞的活性，抑制胶质瘤的生长，自噬抑制剂CQ和Baf-A1可以协同增 强大麻二酚的胶质瘤抑制作用。图21b是对照组1、对照组4和试验组1、试验组4的胶质瘤中U251人神经胶质瘤细胞和U87人神经胶质瘤细胞的细胞活性对比图，其中横轴表示组别，纵轴表示细胞相对活性，可以看出，大麻二酚可以显著抑制人神经胶质瘤细胞的活性，而自噬抑制剂渥曼青霉素会显著减弱大麻二酚对胶质瘤的抑制作用。

需要说明的是，自噬抑制剂CQ和Baf-A1属于晚期自噬抑制剂，而渥曼青霉素属于早期 自噬抑制剂，由此可见，只有早期自噬抑制剂可以减弱大麻二酚引起的线粒体自噬，那么可 以推断大麻二酚引起的线粒体自噬是一种致死性的自噬。

试验例15

本试验例设置对照组1-3和试验组1-3，其中对照组1-3分别采用siATG5和siPINK1对 胶质瘤中的ATG5和PINK1进行沉默，试验组1-3首先分别采用siATG5和siPINK1对胶质瘤中的ATG5和PINK1进行沉默，再采用相同剂量的大麻二酚对各组胶质瘤进行处理，结果如图22和图23所示。

图22是对照组1-2和试验组1-2胶质瘤中LN18人胶质母细胞瘤细胞的染色图，可以看 出，相对于对照组1和试验组1，siATG5可以显著减弱大麻二酚诱导的线粒体标志蛋白的减 少。

图23是对照组1、对照组3、试验组1、试验组3胶质瘤中U251人神经胶质瘤细胞的westernblot含量水平对比图，其中，COXIV为线粒体标志分子，parp(polyADP-ribosepolymerase)是DNA修复酶，Tomm20是重组人线粒体外膜转位酶20，caspase3是半胱氨酸蛋白酶3，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ是线粒体自噬蛋白，HSP90是热休克蛋白，可以看出，相对于对照 组1和试验组1，siPINK可以显著减弱大麻二酚诱导的线粒体标志蛋白的减少。

所以，大麻二酚可以显著诱导线粒体自噬，并且大麻二酚诱导的线粒体自噬是一种致死 性的自噬。

试验例16

本试验例设置对照组1-10和试验组1-10，每组均选择相同数量的体外胶质瘤细胞系，上 述体外胶质瘤细胞系包括U251细胞和LN18细胞,各组分别采用不同的方式对胶质瘤细胞系 进行处理，各组采用的处理方式如表6所示。

表6对照组1-10和试验组1-10处理方式对照表

分别统计各组胶质瘤细胞系中U251、LN18细胞的相对活性，结果如图24和图25所示。

图24是各组U251细胞相对活性对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示U251细胞的细胞相对活性，图25是各组LN18细胞相对活性对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示 LN18细胞的细胞相对活性，可以看出，在采用CB1拮抗剂、CB2拮抗剂、TRPV1拮抗剂、 TRPC拮抗剂、RUR拮抗剂、VGCC拮抗剂、Na/H拮抗剂、GPR55拮抗剂和TRPV4拮抗剂 对U251细胞、LN18细胞进行处理的情况下，U251细胞、LN18细胞的活性并未受到较大影 响，在采用大麻二酚作为TRPV4激动剂对U251细胞、LN18细胞进行处理的情况下，U251 细胞、LN18人神经胶质瘤细胞的活性显著下降，将大麻二酚与CB1拮抗剂、CB2拮抗剂、 TRPV1拮抗剂、TRPC拮抗剂、RUR拮抗剂、VGCC拮抗剂、Na/H拮抗剂或GPR55拮抗剂 联合使用对U251细胞、LN18细胞进行处理的情况下，U251细胞、LN18细胞的活性在使用 大麻二酚进行处理的基础上显现出进一步下降趋势，但是在将大麻二酚与TRPV4拮抗剂联合 使用的情况下，大麻二酚对U251细胞、LN18细胞的作用得到抑制，即TRPV4拮抗剂能够 显著减弱大麻二酚对U251细胞、LN18细胞的抑制作用，显著减弱大麻二酚引起的钙离子内 流，所以，大麻二酚是通过促进TRPV4的钙离子内流来发挥对肿瘤细胞的抑制作用的。

试验例17

本试验例设置对照组1-2和试验组1-2，对照组1不采用任何药物对胶质瘤进行处理，对 照组2采用GSK对胶质瘤进行处理，试验组1采用大麻二酚对胶质瘤细胞进行处理，试验组 2采用GSK和大麻二酚对胶质瘤进行处理，各组其他处理条件完全相同。

分别检测各组U251人神经胶质瘤细胞、LN18人胶质母细胞瘤细胞和U87人神经胶质瘤 细胞的活性情况，结果如图26所示。

如图26所示，其中横轴表示组别，纵轴表示细胞相对活性，可以看出，大麻二酚可以显 著抑制U251人神经胶质瘤细胞、LN18人胶质母细胞瘤细胞和U87人神经胶质瘤细胞的活性， 而GSK可以显著减弱大麻二酚对U251人神经胶质瘤细胞、LN18人胶质母细胞瘤细胞和U87 人神经胶质瘤细胞的抑制作用。

如图27所示，图27a是U251人神经胶质瘤细胞钙内流强度对比图，其中横轴表示CBD 作用时间，纵轴表示U251人神经胶质瘤细胞的荧光强度，图27b是LN18人胶质母细胞瘤细 胞荧光强度对比图，其中横轴表示大麻二酚或大麻二酚+GSK的CBD作用时间，纵轴表示LN18诱导胶质母细胞瘤细胞的钙流荧光强度。可见试验组1的CB诱导U251人神经胶质瘤 细胞和LN18人胶质母细胞瘤细胞的钙流荧光强度远大于试验组2，所以，GSK的加入会显 著减弱大麻二酚对U251人神经胶质瘤细胞和LN18人胶质母细胞瘤细胞引起钙流，提示 TRPV4为CBD潜在靶标。

如图28所示，图28是对照组1-2和试验组1-2的U251人神经胶质瘤细胞和LN18人胶质母细胞瘤细胞的westernblot检测图，其中，黑色表示含量水平，cleavedPARP表示降解产物，CleavedCaspase3是半胱氨酸蛋白酶3，Caspase-7是半胱氨酸蛋白酶7，Caspase-8是半胱氨酸蛋白酶8，LC3-I和LC3-Ⅱ是线粒体自噬蛋白，GADPH是内部参照，可以看出大麻二 酚可以对U251人神经胶质瘤细胞和LN18人胶质母细胞瘤细胞产生抑制作用，而GSK的加 入则会减弱大麻二酚对U251人神经胶质瘤细胞和LN18人胶质母细胞瘤细胞的抑制作用。

此外，我们通过大量的小鼠试验观察到，在使用如四氢大麻酚等的大麻素类药物对患有 胶质瘤的小鼠进行治疗时，大部分小鼠精神状态不佳，常常精神不振，并且在停药一段时间 后，其病情产生反复，精神状态愈发低迷，这说明如四氢大麻酚等的大麻素类药物会对小鼠 的精神状态产生不良影响，并且极易产生依赖性和成瘾性；在使用大麻二酚对患有胶质瘤的 小鼠进行治疗时，大部分小鼠的精神状态良好，肿瘤情况得以显著抑制，在停药一段时间后 也并未出现病情反复、精神状态改变的迹象，由此可见，采用大麻二酚治疗脑肿瘤及其相关 疾病，不会对患者的精神状态产生不良影响，并且不会产生依赖性和成瘾性，治疗效果好。

综上所述，本申请提供的药物，应用于制备治疗脑肿瘤及其相关疾病的药品中，可以显 著减少脑肿瘤及其相关疾病临床治疗过程中产生的毒副作用，提高脑肿瘤及其相关疾病的治 疗效果。

在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本 领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。

除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中 的若干子范围。还需要说明的是，给药剂量的浓度可调，若浓度调小，可适当增加给药量， 若浓度调大，可适当减少给药量。不过根据试验，大麻二酚的浓度优选为10-30μM，因此， 其他组分的浓度也对应的与该浓度相匹配。

上面结合附图对本申请优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本申请并不限 于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请 构思的前提下做出各种变化。

Claims (14)

1.一种抑制脑肿瘤的药物，其特征在于，其包括能够促进TRPV4信号通道的钙离子内流的至少一种TRPV4激动剂。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，TRPV4激动剂的浓度为0.01μM-30μM。

3.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述TRPV4激动剂包括大麻二酚。

4.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物还包括至少一种具有抗肿瘤活性的肿瘤抑制剂。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述肿瘤抑制剂与TRPV4激动剂的浓度比为(10-500):(10-30)。

6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述肿瘤抑制剂包括干扰核酸生物合成的抑制剂、直接影响DNA的抑制剂和干扰转录过程以及阻止RNA合成的抑制剂中的至少一种。

7.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述肿瘤抑制剂包括替莫唑胺。

8.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述肿瘤抑制剂包括甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巯嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、烷化剂、多柔比星、放线菌素D、柔红霉素、甲基苄肼、环己亚硝胺、长春新碱中的至少一种。

9.根据权利要求1或4所述的药物，其特征在于，所述药物还包括协同增效物质，所述协同增效物质包括冰片和/或薄荷脑。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述肿瘤抑制剂、TRPV4激动剂与所述协同增效物质的浓度比为(10-500):(10-30):(10-80)。

11.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物还包括赋形剂、佐剂、添加剂、表面活性剂、干燥剂和稀释剂中的至少一种。

12.一种药物在制备治疗脑肿瘤及其相关疾病的药品中的应用，其特征在于，所述药物为权利要求1-11任意一项所述的药物，所述脑肿瘤及其相关疾病包括原发性脑肿瘤、复发性脑肿瘤、脑肿瘤形成过程中产生的疾病以及脑肿瘤引起的并发症、后遗症、与脑肿瘤具有一定相关性的疾病。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述药物为通过促进诱导肿瘤细胞发生自噬、通过抑制肿瘤细胞的增殖及通过抑制肿瘤干细胞的活性协同抗肿瘤的药物。

14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述脑肿瘤包括但不限于胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、转移瘤、听神经瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、第四脑室的室管膜瘤、蝶鞍部的颅咽管瘤，所述脑肿瘤的相关疾病包括但不限于桥脑、偏瘫和癫痫；

优选地，所述脑肿瘤为胶质瘤。

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