CN111888485A - 一种类共晶体-碱性蛋白药物复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种类共晶体‑碱性蛋白药物复合物的制备与应用。所述类共晶体通过将变性的人血清白蛋白包裹化疗药物紫杉醇和双硫仑制得，该类共晶体生理条件下荷负电，能够与碱性蛋白通过静电作用形成复合物，提高碱性蛋白的稳定性和入胞效率，因此是一种可用于碱性蛋白递送的良好的载体系统。所制备的类共晶体‑碱性蛋白药物复合物能够同时将两种小分子药物和一种碱性蛋白药物递送到胞内，达到“一石三鸟”的效果，从而更好地杀死耐药肿瘤细胞。与现有的蛋白递送系统相比，本发明不含有毒性较大的聚合物和容易引起过敏反应的溶剂，并且生理条件下带负电荷，因此生物安全性较高。

Description

一种类共晶体-碱性蛋白药物复合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种类共晶体-碱性蛋白药物复合物的制备与应用。
背景技术
蛋白质类生物大分子药物在肿瘤治疗领域具有独特优势，但因其分子量大、不稳定等因素难以入胞发挥作用，可以通过开发纳米制剂实现对蛋白质类药物的体内递送。蛋白质类药物包括酸性蛋白和碱性蛋白，其中碱性蛋白为等电点（pI）高于7.5并且生理条件下表面携带净正电荷的蛋白质，酸性蛋白为等电点（pI）低于7.5并且生理条件下表面携带净负电荷的蛋白质；已报道的蛋白类递送载体多为阳离子聚合物和阳离子脂质体等，这些载体只适用于酸性蛋白的递送，而对于碱性蛋白药物的递送系统报道的很少，因此本发明通过制备带负电的类共晶体来实现对碱性蛋白的递送。
目前临床上肿瘤的治疗还是以化疗为主，然而化疗药物的多次使用会使肿瘤细胞产生多药耐药现象最终导致化疗失败。已上市化疗药物的纳米制剂（如紫杉醇白蛋白纳米粒，阿霉素脂质体等）多为单个化学药物的纳米制剂，无法有效地逆转肿瘤的多药耐药现象；类共晶体可以同时包裹两种及以上化疗药物，通过多种化疗药物的协同作用来提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而更好地杀死肿瘤细胞，在肿瘤治疗尤其是肿瘤的多药耐药治疗领域方面具有明显的优势。
发明内容
本发明的目的之一在于构建一种稳定并易于制备的碱性蛋白递送载体。本发明使用安全性高、生物相容性好的人血清白蛋白，将其加热变形暴露其疏水基团后将两种疏水性药物包裹形成带负电的类共晶体，该类共晶体可作为碱性蛋白递送载体。
本发明的目的之二在于构建类共晶体-大分子药物复合物，该复合物的制备通过静电吸附制得并且不涉及化学修饰，能够保持大分子药物的原有活性。
本发明的目的之三在于提供该纳米晶-大分子药物复合物在体外抗耐药肿瘤细胞中的应用。
一种用于递送碱性蛋白的类共晶体，其特征在于：所述用于碱性蛋白药物（生理条件下荷正电）递送的类共晶体包括：两种疏水性药物和包裹在疏水药物外部的变性白蛋白。
所述的类共晶体，其特征在于：所述疏水性药物选自紫杉醇、双硫仑、顺铂、喜树碱、黄芩素、姜黄素、二甲双胍、小檗碱中的两种，优选紫杉醇和双硫仑作为其内部的疏水药物；所述的变性蛋白为热变性的β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白等常见的蛋白质，优选变性的人血清白蛋白作为类共晶体制备的稳定剂。
所述的类共晶体的制备方法，其特征在于：
1）疏水性药物紫杉醇和双硫仑的质量比为1:1到10:1；优选质量比为5:1为最优比例；
2）变性的人血清白蛋白与紫杉醇的质量比为1:0.5到1:3，优选质量比为1:1为最优比例；
3）最优条件下，所述类共晶体的粒径为148±2.45nm；
4）最优条件下，所述类共晶体的电位为-23±1.75mV。
所述的类共晶体的制备方法为：
1）将紫杉醇和双硫仑原料药加入到有机试剂（甲醇、乙醇、丙酮、DMSO）中，超声溶解，优选乙醇作为有机相；
2）将变性的人血清白蛋白溶液作为水相，提前置于冰上冰浴5-10分钟；
3）搅拌下将有机相逐滴加入到水相中，继续搅拌30秒后，冰浴条件下探头超声15分钟；
4）通过减压蒸发法除去残留的乙醇，得到紫杉醇-双硫仑类共晶体。
所述的类共晶体的制备方法，其特征在于：
1）步骤2）中变性的人血清白蛋白制备方法为：配置1mg/ml的人血清白蛋白溶液，调pH至7.0，室温搅拌溶解，水浴加热使蛋白变性，室温冷却后置于4℃存储备用；
2）步骤3）中所述的搅拌条件为转速1000-1500转/分钟，优选为1400-1500转/分钟；超声功率为150-250W，优选为230-250W。
所述变性的人血清白蛋白制备方法，其特征在于：水浴加热温度为70-95℃，优选为90℃；加热时间为0.5-2小时，优选为1小时。
所述的类共晶体，碱性蛋白以静电结合的方式与类共晶体形成类共晶体-碱性蛋白复合物。
所述的类共晶体-碱性蛋白复合物，其特征在于：所述的碱性蛋白为等电点大于的7.5且生理条件下带净正电荷的蛋白质，包括：细胞色素C（Cyt C）、阳离子化的牛血清白蛋白（cBSA）、胰蛋白酶（Trypsin）、抗菌肽（Cathelicidin）、细胞穿膜肽（CPPs）、组蛋白（Histone）、RNA酶A（RNase A）、半胱氨酸蛋白-9（Caspase-9）、皂草素（Saporin）、溶菌酶（Lysozyme）、糜蛋白酶（Chymotrypsin）等，优选细胞色素C和阳离子化的牛血清白蛋白作为所递送的碱性蛋白。
所述的类共晶体-碱性蛋白复合物，其特征在于：
1）变性的人血清白蛋白与碱性蛋白质量比为1:1到64:1，优选质量比为16:1为最优比例；
2）将共晶体与碱性蛋白按照最优质量比进行等体积混合，混合后室温孵育30分钟，得到碱性蛋白-类共晶体复合物；
3）最优比例条件下，所述碱性蛋白-类共晶体复合物粒径为185±3.24nm；
4）最优比例条件下，所述碱性蛋白-类共晶体复合物电位为-10±2.48mV。
所述的类共晶体-碱性蛋白复合物在体外抗耐药肿瘤中的应用。
具体而言：
本发明提供以下技术方案：
1）以人血清白蛋白为原料，制备1mg/ml的变性的人血清白蛋白溶液
准确称取100mg的人血清白蛋白并将其溶于100ml超纯水中，用1M的NaOH/HCL调节pH至7，室温搅拌2h，90℃水浴加热1h，室温冷却后置于冰箱四度保存待用。
2）阳离子化的牛血清白蛋白制备
将250 mL乙二胺溶液（0.9 M，pH 4.75）逐滴缓慢加入2 mL 牛血清白蛋白溶液（15 %，w/v）中，并持续搅拌；待混合均匀后，加入70 mg的 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温条件下，持续搅拌2h。随后加入200 μL醋酸盐缓冲液（4 M，pH 4.75）终止反应并继续搅拌，30min后将反应液转移至透析袋（截留分子量为3500Da）中，于聚乙二醇（分子量为 20000Da）溶液中浓缩至10mL，再转移至蒸馏水中继续透析3天；将透析后的溶液进行冻干，即得阳离子化的牛血清白蛋白。
3）采用反溶剂-超声共沉淀法制备类共晶体
将不同质量比的紫杉醇：双硫仑原料药加入到有机溶剂中，超声溶解后作为有机相；取一定体积的变性的人血清白蛋白溶液作为水相，提前置于冰上冰浴5分钟；搅拌下将有机相逐滴加入到水相中，继续搅拌30秒后在冰浴条件下探头超声15分钟；通过减压蒸发法除去残留的乙醇，制得带负电的紫杉醇-双硫仑类共晶体。
4）类共晶体-碱性蛋白药物复合物的制备
制备不同浓度梯度的碱性蛋白（细胞色素C或阳离子化的牛血清白蛋白）溶液，将碱性蛋白溶液在低速涡旋下逐滴加入到等体积固定浓度的类共晶体溶液中，室温孵育30min，通过静电作用力结合，制得类共晶体-大分子药物复合物。
本发明中的关键步骤包括：类共晶体制备过程的处方筛选（有机试剂种类、两种疏水性化学药物的比例以及两种药物的载药量的确定），反溶剂-超声共沉淀法制备类共晶体方法的确定，类共晶体与碱性蛋白的结合比例的确定。
碱性蛋白是指等电点（pI）高于7.5并且生理条件下表面携带净正电荷的蛋白质，碱性蛋白在疾病治疗中具有很大的潜力，例如细胞色素C和皂草素（Saporin）能够促进肿瘤细胞的凋亡可用于癌症的治疗，抗菌肽和溶菌球菌素在抗感染治疗中发挥重要作用，碱性蛋白干扰素β可用于病毒性疾病的预防和治疗，其他一些小分子碱性蛋白还可以用于神经系统疾病如阿尔兹海默症、帕金森综合征和朊蛋白病的治疗（CN102665686B）。除疾病治疗外，碱性蛋白在生物体的结构和功能中发挥着重要作用，如髓鞘碱性蛋白（myelin basicprotein，MBP）在维持中枢神经系统髓鞘结构和功能的稳定和髓鞘形成和脑分化成熟过程中扮演重要角色，组蛋白作为生物体中染色质的重要组成部分，在基因调控中发挥重要作用等。
共晶体是指药物活性成分(Active pharmaceutical ingredient，API)和共晶形成物(Cocrystal former，CCF)在氢键或其他非共价键的作用下结合而成的晶体（CN108440456A）；本发明专利中，类共晶体被定义为两种及以上的疏水性小分子化学药物通过疏水相互作用与稳定剂相结合从而形成稳定的纳米级别的载体，被称为类共晶体。
有益效果：
1、本发明将生物相容性良好的人血清白蛋白作为类共晶体制备的稳定剂，通过反溶剂超声沉淀法同时把多药耐药调节剂药物（双硫仑）和传统抗肿瘤药物（紫杉醇）包裹制成带负电的类共晶体。该类共晶体载体通过静电作用与碱性蛋白（细胞色素C或阳离子化的牛血清白蛋白）结合形成类共晶体-碱性蛋白药物复合物，该复合物体系构成简单，易于构建，载药量高，毒性低，可同时实现将两种化学药物和一种大分子药物递送入胞，从而更好地解决肿瘤的多药耐药问题。
2、本发明的杂合纳米晶-碱性蛋白药物复合物具有制备工艺简单、安全性高、载药量高、碱性蛋白胞内递送效率高、体外抗耐药肿瘤细胞效果好等特点。
附图说明：
图1为本发明中类共晶体-碱性蛋白复合物制备流程示意图。
图2为本发明中有机试剂种类对类共晶体粒径电位影响图。
图3为本发明中PTX和DSF不同质量比对类共晶体粒径电位影响图。
图4为本发明中dHSA与紫杉醇的的质量比对类共晶体粒径影响图。
图5为本发明中类共晶体及类共晶体-碱性蛋白复合物粒径分布图。
图6为本发明中类共晶体及类共晶体-碱性蛋白复合物的TEM电镜结果图。
图7为本发明中类共晶体-碱性蛋白复合物结合的非变性凝胶电泳结果图。
图8为本发明中类共晶体-碱性蛋白复合物的荧光共振能量转移结果图。
图9为本发明中类共晶体-碱性蛋白复合物中碱性蛋白体外释放结果图。
图10为本发明中类共晶体-碱性蛋白复合物中紫杉醇的体外释放结果图。
图11为本发明中类共晶体-碱性蛋白复合物中双硫仑的体外释放结果图。
图12为本发明中类共晶体-碱性蛋白复合物细胞摄取结果图。
图13为本发明中类共晶体-碱性蛋白复合物MTT实验结果图。
具体实施方式
本发明所用的原料或者试剂，均市售可得。
采用动态光散射纳米粒径仪、透射电镜、荧光分光光度计等技术对杂合纳米晶及杂合纳米晶-大分子药物复合物进行表征。
采用非变性碱性蛋白凝胶电泳和荧光共振能量转移技术对杂合纳米晶-碱性蛋白药物复合物的形成进行验证。
以下结合具体实施实例对本发明做进一步的阐述。
dHSA：变性的人血清白蛋白
PTX：紫杉醇
DSF：双硫仑
Cyt C：细胞色素C
cBSA：阳离子化的牛血清白蛋白
实例1：紫杉醇-双硫仑类共晶体处方优化
制备流程如图1所示，处方优化工艺如下：
（1）有机试剂种类对紫杉醇-双硫仑类共晶体粒径和电位的影响
准确称取三组5mg的紫杉醇和1mg的双硫仑原料药置于EP管中，分别加入0.5ml乙醇/丙酮/DMSO超声溶解后作为有机相；取10ml的dHSA溶液作为水相置于西林瓶中，置于冰上冰浴5分钟；搅拌下（1500转/分钟）用将有机相逐滴加入到水相中，继续搅拌30秒，转移至探头超声，冰浴条件下230W功率超声15分钟，通过减压蒸发法将残留的有机溶剂除去，制得紫杉醇-双硫仑杂化纳米晶。
结果如图2所示，乙醇作为有机溶剂时，所制得的杂化纳米晶粒径最小，电位绝对值较大，因此选择乙醇作为有机溶剂。
（2）PTX和DSF不同质量比对紫杉醇-双硫仑杂化纳米晶粒径电位的影响
准确称取不同质量比为紫杉醇：双硫仑（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）原料药，称取过程中保持PTX的量为10mg，改变DSF的量从1mg-10mg，将其置于EP管中，分别加入0.5ml乙醇超声溶解后作为有机相；取10ml的dHSA溶液作为水相置于西林瓶中，置于冰上冰浴5分钟；搅拌下（1500转/分钟）用将有机相逐滴加入到水相中，继续搅拌30秒，转移至探头超声，冰浴条件下230W功率超声15分钟，通过减压蒸发法将残留的乙醇除去，制得紫杉醇-双硫仑杂化纳米晶。
结果如图3所示，由图可知当PTX和DSF质量比为5:1时，所制备的杂合纳米晶粒径最小，电位绝对值最大，因此选择质量比为5:1作为PTX和DSF的最佳质量比。
（3）dHSA与紫杉醇的的质量比对紫杉醇-双硫仑杂化纳米晶粒径的影响
在PTX和DSF的最佳质量比5:1的条件下，称取不同质量的紫杉醇（5mg、10mg 、15mg、20mg、30mg）原料药，使dHSA与紫杉醇的的质量比为1:0.5-1:3，分别加入0.5ml乙醇超声溶解后作为有机相；取10ml的dHSA溶液作为水相置于西林瓶中，置于冰上冰浴5分钟；搅拌下（1500转/分钟）用将有机相逐滴加入到水相中，继续搅拌30秒，转移至探头超声，冰浴条件下230W功率超声15分钟，通过减压蒸发法将残留的乙醇除去，制得紫杉醇-双硫仑杂化纳米晶。
结果如图4所示，由结果可知随着dHSA与PTX质量比的增加，类共晶体的粒径呈递增趋势，当dHSA与PTX质量比为1:1时，所制得的纳米晶粒径较小，因此最终选择PTX和DSF的质量比为1:1。
实例2：紫杉醇-双硫仑类共晶体制备
dHSA（1mg/ml） 10ml
紫杉醇 10mg
双硫仑 2mg
乙醇 0.5ml
制备工艺如下：
准确称取10mg紫杉醇和2mg双硫仑于离心管中，加入0.5ml乙醇超声溶解后作为有机相；取10ml的1mg/ml的dHSA溶液作为水相置于西林瓶中，置于冰上预冷5分钟；搅拌下（1500转/分钟）将有机相逐滴加入到水相中，继续搅拌30秒后转移至探头超声，冰浴条件下230W功率超声15分钟，通过减压蒸发法将残留的乙醇除去，制得紫杉醇-双硫仑类共晶体。
对制得的紫杉醇-双硫仑类共晶体进行粒径和电位测定，粒径结果见图5，紫杉醇-双硫仑类共晶体的粒径为148±2.45nm；电位为-23±1.75mV。
对制得的紫杉醇-双硫仑类共晶体进行TEM拍照，结果见图6，紫杉醇-双硫仑类共晶体的形状为长棒状，电镜下长度约为150nm。
实例3：紫杉醇-双硫仑类共晶体包封率和载药量的测定
为了考察类共晶体的载药量和包封率，采用超滤离心法分离制剂中游离的药物，高效液相色谱法测定纳米粒中的药物的含量。具体步骤为：精密量取1.5ml实例2中的类共晶体于超滤管中，加入1.5ml等体积的纯化水混匀后，3500转/分钟，离心30 min，取超滤液20μL进样，用高效液相色谱测定游离的PTX和DSF的含量，即Wfree；另取1ml同一批次的类共晶体，加入5ml甲醇破乳，超声20min，冷却至室温后，加入甲醇定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤后取滤液20μL进样，通过峰面积计算得纳米粒制剂总的药物含量，即Wtotal。按公式(1) 和(2) 分别计算纳米粒的包封率和载药量。
包封率( EE) % = ( Wtotal－Wfree) /Wtotal × 100% (1)
载药量( DL) % = ( Wtotal－Wfree) /Wprotein × 100% (2)
其中，Wtotal，Wfree和Wprotein分别为总药量、游离药量和制剂中变性蛋白的质量。
结果表明，紫杉醇-双硫仑类共晶体具有较高的包封率和载药量，其中紫杉醇的包封率为98.01%，载药量为88.92%；双硫仑的包封率为96.71%，载药量为20.6%。
实例4：类共晶体-碱性蛋白复合物的制备
类共晶体选择实例2中的紫杉醇-双硫仑类共晶体，碱性蛋白选择细胞色素Cyt C和cBSA。
准确称取一定量的Cyt C和cBSA，用纯化水将其溶解制成62.5μg/ml的溶液，涡旋下将实例2中的紫杉醇-双硫仑类共晶体分别与Cyt C和cBSA等体积混合，室温孵育30分钟后，碱性蛋白通过静电作用与类共晶体结合，制得类共晶体-碱性蛋白复合物。
对制得的类共晶体-碱性蛋白复合物进行粒径和电位测定，粒径结果见图5，类共晶体-碱性蛋白复合物的粒径为185±3.24nm；电位为-10±2.48mV。
对制得的类共晶体-碱性蛋白复合物进行TEM拍照，结果见图6，类共晶体-碱性蛋白复合物的形状为长棒状，电镜下长度约为170nm。
实例5：非变性碱性蛋白电泳验证类共晶体-碱性蛋白复合物的形成
电泳缓冲体系的配置如下：
1）分离胶的制备：0.06M 氢氧化钾，0.376M乙酸，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；
2）堆积胶的制备：0.06M 氢氧化钾，0.063M乙酸，pH6.8（3.125% T，25% C）；
3）电泳缓冲液的配置：0.14M的β-丙氨酸，0.35M 乙酸，pH4.5；
其中，T代表丙烯酰胺和二叉丙烯酰胺的总浓度,C代表二叉丙烯酰胺占总量的百分比。
电泳实验操作如下：
1）制样：制备15μg/ml的Cyt C和cBSA溶液，将实例2中的紫杉醇-双硫仑类共晶体用纯化水分别稀释至含变性的人血清白蛋白960μg/ml、、480μg/ml、240μg/ml、120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml；取稀释后的类共晶体6μl和6μl Cyt C/cBSA溶液等体积混合，室温孵育30分钟后，加入3μl的上样缓冲液混匀后上样；样品上样后，反转电极，80V 恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换120V 恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳。
2）染色和脱色：取出胶板于0.25％考马斯亮蓝染色液中染色60min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景，之后用高灵敏度化学发光成像仪扫描拍照。
结果见图7，紫杉醇-双硫仑类共晶体和碱性蛋白（Cyt C或cBSA）在质量比16-64时形成类共晶体-碱性蛋白复合物。
实例6：荧光共振能量转移对类共晶体-碱性蛋白复合物结构确证
将制备好的荧光标记的类共晶体、碱性蛋白、碱性蛋白类共晶体复合物分别置于比色皿中，将比色皿放入荧光分光光度计中，设置激发波长为495nm，扫描500-700nm范围内的发射光谱，其中激发光与发射光的狭缝宽分别设置为5nm和15nm，进行荧光扫描。
结果见图8，双荧光标记的的类共晶体-碱性蛋白复合物中供体生色团荧光强度降低，受体生色团荧光强度升高，表明碱性蛋白能与类共晶体通过静电作用结合在一起。
实例7：类共晶体-碱性蛋白复合物体外释放实验
为了测定紫杉醇和双硫仑的体外释放，取实例4制备的类共晶体-碱性蛋白复合物2ml，将其转移到3.5 kDa透析袋中，37±1℃、转速为100转/分钟的条件下，在30ml含0.5%吐温80的磷酸盐缓冲液，pH值分别为7.4、6.8和5.0的释放介质中孵育，并在预定的间隔时间内，从透析袋外取出样品，用等量的新鲜释放介质代替。经0.45μm膜过滤器过滤后，用高效液相色谱法测定样品中的PTX 和DSF的含量。用类似的方法测定类共晶体-碱性蛋白复合物中碱性蛋白的释放情况，将实例4制备的类共晶体-碱性蛋白复合物放入300 kDa透析袋中，用日本岛津RF-5301PC荧光光谱仪测定释放的碱性蛋白含量，计算累积释放百分率。
类共晶体-碱性蛋白复合物中碱性蛋白的释放结果见图9，24h内碱性蛋白的释放量约为70%，其中在pH为7.4的条件下复合物中碱性蛋白的释放量最高。
类共晶体-碱性蛋白复合物中紫杉醇的释放结果见图10，48h内紫杉醇的释放量约为60%，其中在pH为6.5的条件下复合物中紫杉醇的释放量最高。
类共晶体-碱性蛋白复合物中双硫仑的释放结果见图11，48h双硫仑的释放量约为55%，其中在pH为6.5的条件下复合物中双硫仑的释放量最高。
实例8：A549/Taxol细胞对类共晶体-碱性蛋白复合物的体外细胞摄取实验
将处于对数生长期的A549/Taxol细胞消化，用新鲜的培养基重悬，以每孔2×105个细胞的密度接种于12孔板中，培养箱过夜培养贴壁； 弃去培养基，每孔分别加入1.8ml无血清培养基和200ul的碱性蛋白/荧光标记的类共晶体-碱性蛋白复合物，培养箱分别孵育0.5h，1h，2h，4h，6h。孵育结束后，弃掉上清培养基，PBS洗三次；使用流式细胞仪测定各组的荧光强度。
结果见图12，类共晶体-碱性蛋白复合物的胞内荧光强度明显高于游离的碱性蛋白，说明类共晶体能够显著提高碱性蛋白的入胞效率。
实例9：类共晶体-碱性蛋白复合物细胞毒性实验
采用MTT法测定不同制剂的细胞毒性，将处于对数生长期的A549/Taxol细胞用胰酶消化离心后计数，以3000个细胞每孔的密度接种于96孔培养板中，将培养板置于培养箱中培养24h使细胞贴壁。24h后弃去培养板中的培养基，每孔加入180μl的新鲜培养基和20μl的不同浓度的各类制剂，其中PTX的终浓度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、30μg/ml，Cyt C的终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、6μg/ml，每个样品设置5个复孔，并同时设置调零孔和对照孔。放置培养箱中继续培养48h，之后每孔加入20μl 5mg/ml的MTT溶液，在培养箱中继续培养4h，之后弃去孔内的培养基，每孔加入200μl DMSO溶液，放置在摇床上低速震荡10mim，之后用酶标仪测定570nm处的吸光度，计算每孔的细胞存活率。
结果见图13，在不同的药物浓度梯度下，类共晶体-碱性蛋白复合物对于耐药细胞的杀伤作用最高，说明该类共晶体-碱性蛋白复合物能够有效杀死耐药肿瘤细胞。

Claims (10)

1.一种用于递送碱性蛋白的类共晶体，其特征在于：包括两种疏水性药物和包裹在疏水药物外部的变性白蛋白。
2.根据权利要求1所述的类共晶体，其特征在于：所述疏水性药物为紫杉醇、双硫仑、顺铂、喜树碱、黄芩素、姜黄素、二甲双胍和小檗碱中的任意两种；所述的变性蛋白为热变性的β-乳球蛋白、牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
3.根据权利要求2所述的类共晶体，其特征在于所述疏水性药物为紫杉醇和双硫仑，所述的变性蛋白为人血清白蛋白。
4.根据权利要求3所述的类共晶体的制备方法，其特征在于：
1）疏水性药物紫杉醇和双硫仑的质量比为1:1到10:1；
2）变性的人血清白蛋白与紫杉醇的质量比为1:0.5到1:3。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
1）将紫杉醇和双硫仑原料药加入到有机试剂中，超声溶解，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或DMSO；
2）将变性的人血清白蛋白溶液作为水相，提前置于冰上冰浴5-10分钟；
3）搅拌下将有机相逐滴加入到水相中，继续搅拌30秒后，冰浴条件下探头超声15分钟；
4）通过减压蒸发法除去残留的有机溶剂，得到紫杉醇-双硫仑类共晶体。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤2）中变性的人血清白蛋白制备方法为：配置1mg/ml的人血清白蛋白溶液，调pH至7.0，室温搅拌溶解，水浴加热使蛋白变性，室温冷却后置于4℃存储备用；
步骤3）中所述的搅拌条件为转速1000-1500转/分钟；超声功率为150-250W；
步骤4）水浴加热温度为70-95℃；加热时间为0.5-2小时。
7.根据权利要求1-3任意一项所述的类共晶体，碱性蛋白以静电结合的方式与类共晶体形成类共晶体-碱性蛋白复合物。
8.根据权利要求7所述的类共晶体-碱性蛋白复合物，其特征在于：所述的碱性蛋白为等电点大于的7.5且生理条件下带净正电荷的蛋白质，包括：细胞色素C、阳离子化的牛血清白蛋白、胰蛋白酶、抗菌肽、细胞穿膜肽、组蛋白、RNA酶A、半胱氨酸蛋白-9、皂草素、溶菌酶或糜蛋白酶。
9.根据权利要求8所述的类共晶体-碱性蛋白复合物的制备方法，其特征在于：
1）变性的人血清白蛋白与碱性蛋白质量比为1:1到64:1
2）将变性的共晶体与碱性蛋白按照比例进行等体积混合，混合后室温孵育30分钟，得到碱性蛋白-类共晶体复合物。
10.根据权利要求9所述的类共晶体-碱性蛋白复合物在制备治疗耐药肿瘤药物中的应用。
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