CN111888369A - 聚糖组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了包括适合局部给予至含粘膜组织非肠部位(例如口腔、鼻腔和阴道)的聚糖制剂的组合物。进一步提供了使用所述聚糖制剂的方法。
Description
本申请是中国发明申请(发明名称:聚糖组合物及其用途,申请日:2016年8月25日;申请号:201680059550.8;国际申请号:PCT/US2016/048794)的分案申请。
优先权要求
本申请要求各自于2015年8月25日提交的美国申请号62/209,618;美国申请号62/209,626;以及美国申请号62/209,629的优先权。前述申请中的每一个的披露内容通过引用以其全文并入本文。
背景技术
维持或恢复人体健康面临大量挑战,其中许多是由于缺乏有效的治疗选择而导致。持续需要新型疗法和治疗方案。
发明内容
本发明的方面涉及聚糖制剂、药物组合物、剂型以及在含有粘膜组织的非肠身体部位局部使用聚糖制剂的方法。在一个方面,本发明的特征在于调节非肠身体部位中的细菌分类群的丰度的方法。在一些实施例中,该方法包括调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度,包括:向该非肠身体部位局部给予药物组合物,该药物组合物包括有效于调节该人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的量的聚糖制剂,其中该聚糖制剂具有至少一个以下特性:i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,ii)该聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,v)该聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,和/或任选地vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限。
在一些实施例中,人类受试者的非肠身体部位(例如,含粘膜组织)是鼻腔。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属、差异球菌属、或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属和葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少三个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的非肠身体部位(例如,含粘膜组织)是口腔。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属(Oribacterium)、双歧杆菌属、或莫氏菌属(Moryella)的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中双歧杆菌属、贫养菌属、梭菌目、卡氏菌属(Catonella)、莫氏菌属、纤毛菌属、艾肯菌属、凝聚杆菌属(Aggregatibacter)、普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少三个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌或口腔链球菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌和口腔链球菌的细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的非肠身体部位(例如,含粘膜组织)是阴道。在一些实施例中,调节了阴道中乳杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,调节包括增加该细菌分类群的丰度(例如增加至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、250%、500%、750%、或增加至少1000%)。在一些实施例中,调节包括降低该细菌分类群的丰度(例如降低至少5%、10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或降低至少99.9%)。在一些实施例中,调节包括将该细菌分类群的相对丰度增加或降低至少5%、10%、或增加或降低至少20%。在一些实施例中,调节包括相对于该非肠身体部位中的细菌群落,增加或降低该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,调节包括增加或降低该细菌分类群的丰度:i)相对于该非肠身体部位处第二细菌分类群的丰度,或者ii)相对于参考值(例如数值或非数值),任选地,i)其中该参考值是在将该聚糖制剂给予至该非肠身体部位之前(例如,在不存在聚糖制剂的情况下)该非肠身体部位处该细菌分类群的丰度的函数,ii)其中该参考值是具有生态失调的受试者的非肠身体部位处或该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度的函数,iii)其中该参考值是具有疾病、障碍、或病理状态的一个或多个个体(例如在非肠身体部位)的该细菌分类群的丰度的函数,iv)其中该参考值是不具有障碍或生态失调的受试者的非肠身体部位处或该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度的函数,v)其中该参考值是不具有障碍、生态失调的一个或多个个体的该细菌分类群的丰度值的函数,并且进一步任选地包括将作为该受试者的丰度的函数的值与该参考值进行比较。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度治疗了该非肠身体部位中的生态失调(例如,治疗了该非肠身体部位中的生态失调的至少一种症状)。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位的微生物多样性。在一些实施例中,微生物多样性降低(例如,因细菌分类群损失,或降低至少5%、6%、7%、8%、9%、或10%,或至少0.3对数倍、0.6对数倍或1对数倍,例如如通过Shannon多样性指数测量)。在一些实施例中,微生物多样性增加(例如,因细菌分类群增加,或增加至少55%、6%、7%、8%、9%、或10%,或至少0.3对数倍、0.6对数倍或1对数倍,例如如通过Shannon多样性指数测量)。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位的pH。在一些实施例中,pH变得更具碱性(例如,增加至少约0.25个pH单位或至少0.5个pH单位)。在一些实施例中,pH变得更具酸性(例如,降低至少约0.25个pH单位或至少0.5个pH单位)。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位中微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的图谱(profile)。在一些实施例中,调节包括增加该非肠身体部位中微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的水平。在一些实施例中,调节包括降低该非肠身体部位中微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的水平。
在一些实施例中,调节包括调节该非肠身体部位中挥发性脂肪酸的水平。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了、治疗了该非肠身体部位处的疾病、障碍或病理状态。在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,鼻腔处的疾病、障碍或病理状态是鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖或哮喘。在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,口腔处的疾病、障碍或病理状态是龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体炎、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)、或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是阴道。在一些实施例中,阴道处的疾病、障碍或病理状态是细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染以及早产或流产的风险。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群丰度的方法进一步包括局部或全身给予抗微生物剂(例如抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂)。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群丰度的方法进一步包括局部或全身给予抗炎剂或类固醇。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群丰度的方法进一步包括将有益细菌分类群(例如,驻留在本文所述的健康或非生态失调的非肠身体部位中的共生细菌分类群)局部给予至该非肠身体部位。在一些实施例中,该有益细菌分类群选自链球菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、埃希氏菌属、魏斯氏菌属、丙酸杆菌属、和芽孢杆菌属。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向口腔并选自口腔链球菌、乳房链球菌、大鼠链球菌(Streptococcus rattus)、齿双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、类干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、大肠杆菌Nisle、唾液链球菌、融合魏斯氏菌(Weissella confuse)和费氏丙酸杆菌。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向鼻腔并且选自清酒乳杆菌、罗伊乳杆菌、唾液链球菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌属物种B420和乳杆菌GG。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向阴道并且选自鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、詹氏乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、阴道乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌和凝结芽孢杆菌。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群丰度的方法进一步包括选择需要调节含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群丰度的受试者。在一些实施例中,该选择包括获得代表该非肠身体部位处的生态失调的值(例如,该部位的样品的微生物测序分析),并且如果存在生态失调,则选择该受试者。在一些实施例中,该选择包括获得代表该非肠身体部位处选定的细菌分类群的丰度的值(例如,该部位的样品的微生物测序分析),并且如果该非肠身体部位处该细菌分类群的丰度与该非肠身体部位的预定值(例如,在多名受试者中处于健康状态的分类群的丰度范围)不同,则选择该受试者。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群丰度的方法包括在第一或初始期过程中给予该聚糖制剂的第一单位剂型。在一些实施例中,该方法进一步包括在第二或后续期过程中给予该聚糖制剂的第二剂型。在一些实施例中,该第一或初始期包括调理或改变该分类群以代谢该聚糖制剂,并且该第二或后续期包括调节该受试者的非肠身体部位处该细菌分类群的丰度。在一些实施例中,该聚糖制剂作为适合局部给予至该受试者的非肠身体部位(例如粘膜组织)的单位剂型给予。
在一些实施例中,该聚糖制剂在通过胃肠道之前接触该非肠身体部位。在一些实施例中,局部给予的聚糖制剂的按重量计小于90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、或5%进入或通过胃肠道,例如通过胃。在一些实施例中,该聚糖制剂通过阴道口引入。在一些实施例中,该聚糖制剂通过鼻孔(鼻孔内壁)引入。在一些实施例中,该聚糖制剂通过口引入。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度减少了由该部位产生的气味(例如恶臭)。
在一些实施例中,在体外条件下对调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度进行确定。在一些实施例中,用于调节细菌分类群丰度的值是从人非肠身体部位收集的生物样品(例如唾液、粘液、排泄物、腔拭子等)繁殖的体外微生物培养物获得的。在一些实施例中,用于调节细菌分类群丰度的值是从已知在体内与非肠身体部位相关并在体外繁殖的单菌株细菌(例如,葡萄球菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属、棒状杆菌属、罗氏菌属、普氏菌属、链球菌属、纤毛菌属、金氏菌属、奈瑟氏菌属、嗜血杆菌属、奥里杆菌属等的菌株)获得的。
在一些实施例中,该聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1和约5:1之间。在一些实施例中,该聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.05和约0.6之间。在一些实施例中,该聚糖制剂的平均DP为以下之一:在约DP3和约DP15之间、在约DP3和约DP8之间、在约DP5和约DP10之间、或在约DP6和约DP18之间。
在一些实施例中,这些糖苷键中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个独立地包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键、或1->6糖苷键。
在另一方面,本发明的特征在于以下中任何一项的方法:a)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度,b)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的微生物多样性,c)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的pH,d)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的微生物代谢物的图谱,e)治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的生态失调,或f)治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位的疾病、障碍或病理状态,该方法包括:将聚糖制剂局部给予至该受试者的含粘膜组织非肠身体部位,其中该聚糖制剂具有一个、两个或更多个(例如3、4、5或6个)以下特性:i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,ii)该聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,v)该聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,从而a)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的细菌分类群的丰度,b)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的微生物多样性,c)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的pH,d)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的微生物代谢物的图谱,e)治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位的生态失调,或f)治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的障碍。
在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是口腔、鼻腔、或阴道。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是阴道。
在一些实施例中,该受试者的非肠身体部位中细菌分类群的丰度独立地增加至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、250%、500%、750%、或增加至少1000%。在一些实施例中,该受试者的非肠身体部位中细菌分类群的丰度独立地降低至少5%、10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或降低至少99.9%。在一些实施例中,该细菌分类群包括共生细菌分类群。在一些实施例中,该细菌分类群包括致病细菌分类群。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位的微生物多样性。在一些实施例中,微生物多样性降低(例如,因细菌分类群损失,或降低至少5%、6%、7%、8%、9%、或10%,或至少0.3对数倍、0.6对数倍或1对数倍,例如如通过Shannon多样性指数测量)。在一些实施例中,微生物多样性增加(例如,因细菌分类群增加,或增加至少55%、6%、7%、8%、9%、或10%,或至少0.3对数倍、0.6对数倍或1对数倍,例如如通过Shannon多样性指数测量)。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位的pH。在一些实施例中,pH变得更具碱性(例如,增加至少约0.25个pH单位或至少0.5个pH单位)。在一些实施例中,pH变得更具酸性(例如,降低至少约0.25个pH单位或至少0.5个pH单位)。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位中微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的图谱。在一些实施例中,调节包括增加该非肠身体部位中微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的水平。在一些实施例中,调节包括降低该非肠身体部位中微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的水平。在一些实施例中,该非肠身体部位的微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的浓度增加或降低至少约0.5%(例如,至少约1%、约5%、约10%)。在一些实施例中,该非肠身体部位的微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的浓度增加或降低至少约0.3对数倍(例如,至少0.6对数域、1对数倍)。在一些实施例中,该微生物代谢物选自下组,该组由以下各项组成:甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、抗坏血酸、色氨酸、血清素、吲哚、琥珀酸、三甲胺(TMA)、三甲胺N-氧化物(TMAO)、脱氧胆酸、硫酸乙苯酯、乙酰醛、乳酸、过氧化氢和丁二酮。
在一些实施例中,调节包括调节该非肠身体部位中挥发性脂肪酸的水平。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度治疗了该非肠身体部位中的生态失调(例如,治疗了该非肠身体部位中的生态失调的至少一种症状)。在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度治疗了该非肠身体部位的障碍(例如,治疗了该非肠身体部位中的障碍的至少一种症状)。在一些实施例中,该非肠身体部位选自口腔、鼻腔和阴道。
在一些实施例中,该方法包括在有需要的受试者中治疗口腔、鼻腔或阴道的障碍。在一些实施例中,该受试者在治疗后经历口腔、鼻腔或阴道的障碍的至少一种症状的减轻。在一些实施例中,治疗后症状严重程度相对于治疗前症状的严重程度的减轻为约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或约100%。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括口腔的粘膜组织。在一些实施例中,该方法包括治疗选自以下各项的口腔障碍:龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体炎、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)、或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括鼻腔的粘膜组织。在一些实施例中,该方法包括治疗选自以下各项的鼻腔障碍:鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖和哮喘。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括阴道的粘膜组织。在一些实施例中,该方法包括治疗选自以下各项的阴道障碍:细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染以及早产或流产的风险。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属、差异球菌属、或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属和葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少三个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、双歧杆菌属、或莫氏菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中双歧杆菌属、贫养菌属、梭菌目、卡氏菌属、莫氏菌属、纤毛菌属、艾肯菌属、凝聚杆菌属、普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少三个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌或口腔链球菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌和口腔链球菌的细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是阴道。在一些实施例中,调节了阴道中乳杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,该聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1和约5:1之间。在一些实施例中,该聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.05和约0.6之间。在一些实施例中,该聚糖制剂的平均DP为以下之一:在约DP3和约DP15之间、在约DP3和约DP8之间、在约DP5和约DP10之间、或在约DP6和约DP18之间。
在一些实施例中,这些糖苷键中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个独立地包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键、或1->6糖苷键。
在另一方面,本发明的特征在于用于局部给予至受试者的含粘膜组织非肠身体部位的聚糖制剂的配制品,其中该聚糖制剂具有一个、两个或更多个(例如3、4、5或6个)以下特性:i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,ii)该聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,v)该聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,和/或vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限。
在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是口腔、鼻腔、或阴道。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是阴道。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括口腔的粘膜组织。在一些实施例中,给予该配制品以治疗选自以下各项的口腔障碍:龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体炎、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)、或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括鼻腔的粘膜组织。在一些实施例中,给予该配制品以治疗选自以下各项的鼻腔障碍:鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖和哮喘。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括阴道的粘膜组织。在一些实施例中,给予该配制品以治疗选自以下各项的阴道障碍:细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染以及早产或流产的风险。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,给予该配制品以调节鼻腔中棒状杆菌属、差异球菌属、或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属和葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少三个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,给予该配制品以调节口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、双歧杆菌属、或莫氏菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中双歧杆菌属、贫养菌属、梭菌目、卡氏菌属、莫氏菌属、纤毛菌属、艾肯菌属、凝聚杆菌属、普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少三个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌或口腔链球菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌和口腔链球菌的细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是阴道。在一些实施例中,给予该配制品以调节阴道中乳杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,该配制品作为单位剂型提供。
在一些实施例中,该配制品进一步包括糖、糖醇、氨基酸、肽、微量营养素、脂肪酸、或多酚。在一些实施例中,该配制品进一步包括糖或糖醇。在一些实施例中,该糖或糖醇包括葡萄糖、半乳糖、果糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、蔗糖、山梨糖、乳糖、山梨醇、麦芽糖、甘露醇、乳果糖、乳糖醇、赤藓糖醇、塔格糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖(gentiobiulose)、甘露二糖、蜜二酮糖(melibiulose)、芸香酮糖(rutinulose)、或木二糖。在一些实施例中,该配制品进一步包括微量营养素。在一些实施例中,该微量营养素包括维生素、元素、或矿物质。在一些实施例中,该配制品进一步包括脂肪酸。在一些实施例中,该脂肪酸包括短链脂肪酸(SCFA)、中链脂肪酸(MCFA)、长链脂肪酸(LCFA)、或极长链脂肪酸(VLCFA)。在一些实施例中,该配制品进一步包括多酚。在一些实施例中,该多酚包括儿茶素、鞣花丹宁、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮、花青素、或木质素。
在一些实施例中,该配制品进一步包括治疗剂(例如标准护理治疗剂)。在一些实施例中,该治疗剂包括抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、氟化物治疗剂、类固醇、硝酸银、糖或糖醇(例如,乳果糖、木糖醇)、油(例如,椰子油、MCT油、茶树油)、锌、碘、异黄酮(例如,大豆)、酸(例如,乙酸、硼酸)、天然提取物(例如,接骨木果、奶蓟、薰衣草)、抗氧化剂(例如,维生素C)、或大蒜。在一些实施例中,该配制品进一步包括抗微生物剂(例如,抗生素、抗真菌剂、或抗病毒剂)。在一些实施例中,该配制品进一步包括抗炎剂或类固醇。
在一些实施例中,该配制品进一步包括有益细菌分类群(例如,驻留在本文所述的健康或非生态失调的非肠身体部位中的共生细菌分类群)。在一些实施例中,该有益细菌分类群来自链球菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、埃希氏菌属、魏斯氏菌属、丙酸杆菌属、或芽孢杆菌属。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向口腔。在一些实施例中,靶向口腔的有益细菌分类群选自口腔链球菌、乳房链球菌、大鼠链球菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、类干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊乳杆菌、大肠杆菌Nisle、唾液链球菌、融合魏斯氏菌和费氏丙酸杆菌。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向鼻腔。在一些实施例中,靶向鼻腔的有益细菌分类群选自清酒乳杆菌、罗伊乳杆菌、唾液链球菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌属物种B420和乳杆菌GG。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向阴道。在一些实施例中,靶向阴道的有益细菌分类群选自鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、詹氏乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、阴道乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌和凝结芽孢杆菌。
在一些实施例中,该配制品被制备成单位剂型。在一些实施例中,该单位剂型被制备用于给予至口腔、鼻腔、或阴道。在一些实施例中,用于给予至口腔的单位剂型包括快速溶解于口中的固体(例如,溶解条、膜、快熔体)、液体(例如,漱口剂、喷雾剂、酊剂、滴剂)或凝胶(例如,牙膏、乳膏或软膏)。在一些实施例中,用于给予至阴道的单位剂型包括栓剂(例如,阴道栓)、乳膏、软膏、溶液、悬浮液、乳液、阴道环、卫生棉条、垫、冲洗剂、海绵、条、喷雾剂、泡沫、涂药器、或粘合剂。在一些实施例中,用于给予至口腔的单位剂型包括雾(例如,水雾)、干粉、喷雾剂、泡沫、涂药器、乳膏、软膏、溶液、悬浮液、乳液。
在一些实施例中,该聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1和约5:1之间。在一些实施例中,该聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.05和约0.6之间。在一些实施例中,该聚糖制剂的平均DP为以下之一:在约DP3和约DP15之间、在约DP3和约DP8之间、在约DP5和约DP10之间、或在约DP6和约DP18之间。
在一些实施例中,这些糖苷键中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个独立地包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键、或1->6糖苷键。
在另一方面,本发明的特征在于包括适合局部给予至非肠身体部位的多个单位剂型的聚糖制剂的容器。在一些实施例中,该容器包括包含第一单位剂型的第一隔室和包含第二剂型的第二隔室。在一些实施例中,该第一和第二剂型是相同的。在一些实施例中,该第一和第二剂型彼此不同,例如它们具有不同量的聚糖制剂,具有不同的释放特性,包括不同的赋形剂,或包括不同或不同量的药物。在一些实施例中,该容器包括在第一或初始期过程中给予该受试者的第一单位剂型和在第二或后续期给予该受试者的第二单位剂型。在一些实施例中,该第一期是适应期,并且该第二期是维持期。
在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是口腔、鼻腔、或阴道。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是阴道。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括口腔的粘膜组织。在一些实施例中,该容器包括用于治疗选自以下各项的口腔障碍的聚糖制剂:龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体炎、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)、或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括鼻腔的粘膜组织。在一些实施例中,该容器包括用于治疗选自以下各项的鼻腔障碍的聚糖制剂:鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖和哮喘。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括阴道的粘膜组织。在一些实施例中,该容器包括用于治疗选自以下各项的阴道障碍的聚糖制剂:细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染以及早产或流产的风险。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,该容器包括用于调节鼻腔中棒状杆菌属、差异球菌属、或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度的聚糖制剂。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属和葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少三个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,该容器包括用于调节口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、双歧杆菌属、或莫氏菌属的细菌分类群的丰度的聚糖制剂。在一些实施例中,调节了口腔中双歧杆菌属、贫养菌属、梭菌目、卡氏菌属、莫氏菌属、纤毛菌属、艾肯菌属、凝聚杆菌属、普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少三个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌或口腔链球菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌和口腔链球菌的细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是阴道。在一些实施例中,该容器包括用于调节阴道中乳杆菌属的细菌分类群的丰度的聚糖制剂。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,该容器包括作为单位剂型提供的聚糖制剂。在一些实施例中,该容器进一步包括糖、糖醇、氨基酸、肽、微量营养素、脂肪酸、或多酚。在一些实施例中,该容器进一步包括糖或糖醇。在一些实施例中,该糖或糖醇包括葡萄糖、半乳糖、果糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、蔗糖、山梨糖、乳糖、山梨醇、麦芽糖、甘露醇、乳果糖、乳糖醇、赤藓糖醇、塔格糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖、甘露二糖、蜜二酮糖、芸香酮糖、或木二糖。在一些实施例中,该容器进一步包括微量营养素。在一些实施例中,该微量营养素包括维生素、元素、或矿物质。在一些实施例中,该容器进一步包括脂肪酸。在一些实施例中,该脂肪酸包括短链脂肪酸(SCFA)、中链脂肪酸(MCFA)、长链脂肪酸(LCFA)、或极长链脂肪酸(VLCFA)。在一些实施例中,该容器进一步包括多酚。在一些实施例中,该多酚包括儿茶素、鞣花丹宁、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮、花青素、或木质素。
在一些实施例中,该容器进一步包括治疗剂(例如标准护理治疗剂)。在一些实施例中,该治疗剂包括抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、氟化物治疗剂、类固醇、硝酸银、糖或糖醇(例如,乳果糖、木糖醇)、油(例如,椰子油、MCT油、茶树油)、锌、碘、异黄酮(例如,大豆)、酸(例如,乙酸、硼酸)、天然提取物(例如,接骨木果、奶蓟、薰衣草)、抗氧化剂(例如,维生素C)、或大蒜。在一些实施例中,该容器进一步包括抗微生物剂(例如,抗生素、抗真菌剂、或抗病毒剂)。在一些实施例中,该容器进一步包括抗炎剂或类固醇。
在一些实施例中,该容器进一步包括有益细菌分类群(例如,驻留在本文所述的健康或非生态失调的非肠身体部位中的共生细菌分类群)。在一些实施例中,该有益细菌分类群来自链球菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、埃希氏菌属、魏斯氏菌属、丙酸杆菌属、或芽孢杆菌属。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向口腔。在一些实施例中,靶向口腔的有益细菌分类群选自口腔链球菌、乳房链球菌、大鼠链球菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、类干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊乳杆菌、大肠杆菌Nisle、唾液链球菌、融合魏斯氏菌和费氏丙酸杆菌。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向鼻腔。在一些实施例中,靶向鼻腔的有益细菌分类群选自清酒乳杆菌、罗伊乳杆菌、唾液链球菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌属物种B420和乳杆菌GG。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向阴道。在一些实施例中,靶向阴道的有益细菌分类群选自鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、詹氏乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、阴道乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌和凝结芽孢杆菌。
在一些实施例中,该容器包括配制为单位剂型的聚糖制剂。在一些实施例中,该单位剂型被制备用于给予至口腔、鼻腔、或阴道。在一些实施例中,用于给予至口腔的单位剂型包括快速溶解于口中的固体(例如,溶解条、膜、快熔体)、液体(例如,漱口剂、喷雾剂、酊剂、滴剂)或凝胶(例如,牙膏、乳膏或软膏)。在一些实施例中,用于给予至阴道的单位剂型包括栓剂(例如,阴道栓)、乳膏、软膏、溶液、悬浮液、乳液、阴道环、卫生棉条、垫、冲洗剂、海绵、条、喷雾剂、泡沫、涂药器、或粘合剂。在一些实施例中,用于给予至口腔的单位剂型包括雾(例如,水雾)、干粉、喷雾剂、泡沫、涂药器、乳膏、软膏、溶液、悬浮液、乳液。
在一些实施例中,该聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1和约5:1之间。在一些实施例中,该聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.05和约0.6之间。在一些实施例中,该聚糖制剂的平均DP为以下之一:在约DP3和约DP15之间、在约DP3和约DP8之间、在约DP5和约DP10之间、或在约DP6和约DP18之间。
在一些实施例中,这些糖苷键中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个独立地包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键、或1->6糖苷键。
在另一方面,本发明包括试剂盒,该试剂盒包括用于局部给予至含粘膜组织非肠身体部位的聚糖制剂。在一些实施例中,该聚糖制剂具有两个或更多个(例如3、4、5或6个)以下特性:i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,ii)该聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间或在0.05和约0.5之间,iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP2和约DP20之间、在约DP3和约DP15之间、在约DP3和约DP8之间、在约DP5和约DP10之间、或在约DP6和约DP18之间,v)该聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1和约5:1之间或在约0.8:1和约5:1之间,和/或vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限。
在一些实施例中,该聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1和约5:1之间。在一些实施例中,该聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.05和约0.6之间。在一些实施例中,该聚糖制剂的平均DP为以下之一:在约DP3和约DP15之间、在约DP3和约DP8之间、在约DP5和约DP10之间、或在约DP6和约DP18之间。
在一些实施例中,这些糖苷键中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个独立地包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键、或1->6糖苷键。
在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是口腔、鼻腔、或阴道。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,该含粘膜组织非肠身体部位是阴道。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括口腔的粘膜组织。在一些实施例中,该试剂盒包括用于治疗选自以下各项的口腔障碍的聚糖制剂:龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体炎、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)、或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括鼻腔的粘膜组织。在一些实施例中,该试剂盒包括用于治疗选自以下各项的鼻腔障碍的聚糖制剂:鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖和哮喘。
在一些实施例中,该非肠身体部位包括阴道的粘膜组织。在一些实施例中,该试剂盒包括用于治疗选自以下各项的阴道障碍的聚糖制剂:细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染以及早产或流产的风险。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,该试剂盒包括用于调节鼻腔中棒状杆菌属、差异球菌属、或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度的聚糖制剂。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属和葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少三个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,该试剂盒包括用于调节口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、双歧杆菌属、或莫氏菌属的细菌分类群的丰度的聚糖制剂。在一些实施例中,调节了口腔中双歧杆菌属、贫养菌属、梭菌目、卡氏菌属、莫氏菌属、纤毛菌属、艾肯菌属、凝聚杆菌属、普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少三个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌或口腔链球菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌和口腔链球菌的细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是阴道。在一些实施例中,该试剂盒包含包括调节阴道中乳杆菌属的细菌分类群的丰度的聚糖制剂。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,该试剂盒包括作为单位剂型提供的聚糖制剂。在一些实施例中,该试剂盒进一步包括糖、糖醇、氨基酸、肽、微量营养素、脂肪酸、或多酚。在一些实施例中,该试剂盒进一步包括糖或糖醇。在一些实施例中,该糖或糖醇包括葡萄糖、半乳糖、果糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、蔗糖、山梨糖、乳糖、山梨醇、麦芽糖、甘露醇、乳果糖、乳糖醇、赤藓糖醇、塔格糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖、甘露二糖、蜜二酮糖、芸香酮糖、或木二糖。在一些实施例中,该试剂盒进一步包括微量营养素。在一些实施例中,该微量营养素包括维生素、元素、或矿物质。在一些实施例中,该试剂盒进一步包括脂肪酸。在一些实施例中,该脂肪酸包括短链脂肪酸(SCFA)、中链脂肪酸(MCFA)、长链脂肪酸(LCFA)、或极长链脂肪酸(VLCFA)。在一些实施例中,该试剂盒进一步包括多酚。在一些实施例中,该多酚包括儿茶素、鞣花丹宁、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮、花青素、或木质素。
在一些实施例中,该试剂盒进一步包括治疗剂(例如标准护理治疗剂)。在一些实施例中,该治疗剂包括抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、氟化物治疗剂、类固醇、硝酸银、糖或糖醇(例如,乳果糖、木糖醇)、油(例如,椰子油、MCT油、茶树油)、锌、碘、异黄酮(例如,大豆)、酸(例如,乙酸、硼酸)、天然提取物(例如,接骨木果、奶蓟、薰衣草)、抗氧化剂(例如,维生素C)、或大蒜。在一些实施例中,该试剂盒进一步包括抗微生物剂(例如,抗生素、抗真菌剂、或抗病毒剂)。在一些实施例中,该试剂盒进一步包括抗炎剂或类固醇。
在一些实施例中,该试剂盒进一步包括有益细菌分类群(例如,驻留在本文所述的健康或非生态失调的非肠身体部位中的共生细菌分类群)。在一些实施例中,该有益细菌分类群来自链球菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、埃希氏菌属、魏斯氏菌属、丙酸杆菌属、或芽孢杆菌属。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向口腔。在一些实施例中,靶向口腔的有益细菌分类群选自口腔链球菌、乳房链球菌、大鼠链球菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、类干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊乳杆菌、大肠杆菌Nisle、唾液链球菌、融合魏斯氏菌和费氏丙酸杆菌。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向鼻腔。在一些实施例中,靶向鼻腔的有益细菌分类群选自清酒乳杆菌、罗伊乳杆菌、唾液链球菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌属物种B420和乳杆菌GG。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向阴道。在一些实施例中,靶向阴道的有益细菌分类群选自鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、詹氏乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、阴道乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌和凝结芽孢杆菌。
在一些实施例中,该试剂盒包括配制为单位剂型的聚糖制剂。在一些实施例中,该单位剂型被制备用于给予至口腔、鼻腔、或阴道。在一些实施例中,用于给予至口腔的单位剂型包括快速溶解于口中的固体(例如,溶解条、膜、快熔体)、液体(例如,漱口剂、喷雾剂、酊剂、滴剂)或凝胶(例如,牙膏、乳膏或软膏)。在一些实施例中,用于给予至阴道的单位剂型包括栓剂(例如,阴道栓)、乳膏、软膏、溶液、悬浮液、乳液、阴道环、卫生棉条、垫、冲洗剂、海绵、条、喷雾剂、泡沫、涂药器、或粘合剂。在一些实施例中,用于给予至口腔的单位剂型包括雾(例如,水雾)、干粉、喷雾剂、泡沫、涂药器、乳膏、软膏、溶液、悬浮液、乳液。
在另一方面,本发明的特征在于制备适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型的方法,该方法包括:提供第一量的该聚糖制剂;将该第一量的该聚糖制剂分成适合局部给予至受试者的非肠身体部位的多个单位剂型,从而制备适合给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型。
在另一方面,本发明的特征在于制备适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型的方法,该方法包括:(a)提供聚糖制剂;(b)获得该聚糖制剂的一个或多个以下特征的值:(i)聚合度(DP),(ii)平均支化度(DB),或(iii)α-糖苷键与β-糖苷键的比率,并且(c)如果满足一个或多个以下标准,则将该制剂配制成适合局部给予至受试者的非肠身体部位的单位剂型:(i)该制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的DP,(ii)该制剂中的聚糖的平均支化度(DB)为至少0.01,(iii)该制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1至约5:1之间,从而制备适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型。
在一些实施例中,制备聚糖制剂的方法进一步包括:获得该制剂的任何一个或两个附加特征的值:(iv)这些聚糖单元的身份,(v)聚糖单元的比率,并且将该制剂配制成药物组合物,如果:(vi)该制剂中的聚糖单元比率与该聚糖单元输入的比率大约相同。
在一些实施例中,该制备方法进一步包括:b)获得该制剂的任何一个或两个附加特征的值:(iv)已知与该非肠身体部位相关(或驻留于此)的至少一个共生细菌分类群(例如,细菌菌株)在补充有该聚糖制剂的培养基中的细菌生长水平,并且c)如果i)相对于预定水平(例如,对照碳源如例如糖单体或二聚体例如葡萄糖的预定水平)或ii)相对于另一个预定细菌分类群(例如,病原体或致病有机体),该聚糖制剂调节(例如增加)该细菌分类群的生长,则将该制剂配制成药物组合物。
在一些实施例中,该细菌分类群是乳杆菌属,例如卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、格氏乳杆菌、和詹氏乳杆菌,并且该非肠身体部位是阴道。在一些实施例中,该细菌分类群是奈瑟氏菌属(例如粘膜奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌和微黄奈瑟氏菌)、罗氏菌属(例如粘滑罗氏菌)、链球菌属(例如唾液链球菌)、或韦荣球菌属(例如小韦荣球菌),并且该非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,该细菌分类群是变异链球菌,并且相对于另一预定细菌分类群(例如奈瑟氏菌属(例如粘膜奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌和微黄奈瑟氏菌)、罗氏菌属(例如粘滑罗氏菌)、链球菌属(例如唾液链球菌)、或韦荣球菌属(例如小韦荣球菌))其生长减少,并且该非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,该细菌分类群是假白喉棒状杆菌或表皮葡萄球菌,并且该非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,该细菌分类群是金黄色葡萄球菌或拥挤棒状杆菌,并且相对于另一预定细菌分类群(例如假白喉棒状杆菌或表皮葡萄球菌)其生长减少,并且该非肠身体部位是鼻腔。
在一些实施例中,将该制剂配制成药物组合物的步骤包括以下中的一个或多个:i)从该制剂中除去不想要的成分,ii)减少该制剂的体积,iii)将该制剂灭菌,iv)将该制剂与药学上可接受的赋形剂或载体混合,v)将该制剂与第二药物或药剂混合,以及vi)将该制剂配制成适用于该非肠身体部位的剂型。
在一些实施例中,将该制剂配制成药物组合物的步骤包括以下中的一个或多个:(i)包装该制剂,(ii)标记经包装的制剂,以及(iii)出售或供应以销售经包装的和经标记的制剂。
在另一方面,本发明的特征在于制备药物组合物的方法,该方法包括:(i)提供包括选自下组的至少一种聚糖单元的聚糖制剂(例如,治疗性聚糖制剂),该组由以下各项组成:葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、和甘露糖,(ii)确定预选的NMR峰或NMR峰组是否与该聚糖制剂相关,并且(iii)如果存在该预选峰或峰组,则将该制剂配制成药物组合物。
在另一方面,本发明的特征在于药物组合物,该药物组合物包括适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型,其包括分支聚糖的混合物,其中该制剂中的聚糖的平均支化度(DB)为至少0.01,并且其中i)该制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),ii)该聚糖制剂包括α-糖苷键和β-糖苷键两者,iii)该制剂的聚糖中存在的糖苷键中的至少一个包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键或1->6糖苷键,和/或iv)该制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1至约5:1之间。
在一些实施例中,这些糖苷键中的至少两个独立地包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键或1->6糖苷键。在一些实施例中,这些糖苷键中的至少三个独立地包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键或1->6糖苷键。
在一些实施例中,该聚糖单元包括选自下组的至少一种单糖,该组由以下各项组成:葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、和鼠李糖。在一些实施例中,该制剂中至少20%(按重量或数目计)的聚糖不包括超过预选参考水平的2个聚糖单元的重复单元。在一些实施例中,该聚糖制剂是合成的并且不是从天然寡糖或多糖源分离。
在一些实施例中,该药物组合物组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中,该组合物被配制为单位剂型。在一些实施例中,该单位剂型被配制成延迟释放或时间控制系统。
在一些实施例中,该组合物被局部给予至含粘膜组织非肠身体部位,包括局部给予至该非肠身体部位的粘膜组织。
在一些实施例中,人类受试者的非肠身体部位(例如,含粘膜组织)是鼻腔。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属、差异球菌属、或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中棒状杆菌属和葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少三个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的非肠身体部位(例如,含粘膜组织)是口腔。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、双歧杆菌属、或莫氏菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中双歧杆菌属、贫养菌属、梭菌目、卡氏菌属、莫氏菌属、纤毛菌属、艾肯菌属、凝聚杆菌属、普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少两个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少三个细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌或口腔链球菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌和口腔链球菌的细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,人类受试者的非肠身体部位(例如,含粘膜组织)是阴道。在一些实施例中,调节了阴道中乳杆菌属的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌的细菌分类群的丰度。在一些实施例中,调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,调节包括增加该细菌分类群的丰度(例如增加至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、250%、500%、750%、或增加至少1000%)。在一些实施例中,调节包括降低该细菌分类群的丰度(例如降低至少5%、10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或降低至少99.9%)。在一些实施例中,调节包括将该细菌分类群的相对丰度增加或降低至少5%、10%、或增加或降低至少20%。在一些实施例中,调节包括相对于该非肠身体部位中的细菌群落,增加或降低该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度。
在一些实施例中,调节包括增加或降低该细菌分类群的丰度:i)相对于该非肠身体部位处第二细菌分类群的丰度,或者ii)相对于参考值(例如数值或非数值),任选地,i)其中该参考值是在将该聚糖制剂给予至该非肠身体部位之前(例如,在不存在聚糖制剂的情况下)该非肠身体部位处该细菌分类群的丰度的函数,ii)其中该参考值是具有生态失调的受试者的非肠身体部位处或该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度的函数,iii)其中该参考值是具有疾病、障碍、或病理状态的一个或多个个体(例如在非肠身体部位)的该细菌分类群的丰度的函数,iv)其中该参考值是不具有障碍或生态失调的受试者的非肠身体部位处或该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度的函数,v)其中该参考值是不具有障碍、生态失调的一个或多个个体的该细菌分类群的丰度值的函数,并且进一步任选地包括将作为该受试者的丰度的函数的值与该参考值进行比较。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度治疗了该非肠身体部位中的生态失调(例如,治疗了该非肠身体部位中的生态失调的至少一种症状)。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位的微生物多样性。在一些实施例中,微生物多样性降低(例如,因细菌分类群损失,或降低至少5%、6%、7%、8%、9%、或10%,或至少0.3对数倍、0.6对数倍或1对数倍,例如如通过Shannon多样性指数测量)。在一些实施例中,微生物多样性增加(例如,因细菌分类群增加,或增加至少55%、6%、7%、8%、9%、或10%,或至少0.3对数倍、0.6对数倍或1对数倍,例如如通过Shannon多样性指数测量)。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位的pH。在一些实施例中,pH变得更具碱性(例如,增加至少约0.25个pH单位或至少0.5个pH单位)。在一些实施例中,pH变得更具酸性(例如,降低至少约0.25个pH单位或至少0.5个pH单位)。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位中微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的图谱。在一些实施例中,调节包括增加该非肠身体部位中微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的水平。在一些实施例中,调节包括降低该非肠身体部位中微生物代谢物(例如,表8中所述的微生物代谢物)的水平。
在一些实施例中,调节包括调节该非肠身体部位中挥发性脂肪酸的水平。
在一些实施例中,调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了、治疗了该非肠身体部位处的疾病、障碍或病理状态。在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。在一些实施例中,鼻腔处的疾病、障碍或病理状态是鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖或哮喘。在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是口腔。在一些实施例中,口腔处的疾病、障碍或病理状态是龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体炎、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)、或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。在一些实施例中,人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位是阴道。在一些实施例中,阴道处的疾病、障碍或病理状态是细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染以及早产或流产的风险。
在一些实施例中,该药物组合物调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群丰度,进一步包括局部或全身给予抗微生物剂(例如抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂)。
在一些实施例中,该药物组合物调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群丰度,进一步包括局部或全身给予抗炎剂或类固醇。
在一些实施例中,该药物组合物调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群丰度,进一步包括将有益细菌分类群(例如,驻留在本文所述的健康或非生态失调的非肠身体部位中的共生细菌分类群)局部给予至该非肠身体部位。在一些实施例中,该有益细菌分类群选自链球菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、埃希氏菌属、魏斯氏菌属、丙酸杆菌属、和芽孢杆菌属。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向口腔并选自口腔链球菌、乳房链球菌、大鼠链球菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、类干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊乳杆菌、大肠杆菌Nisle、唾液链球菌、融合魏斯氏菌和费氏丙酸杆菌。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向鼻腔并且选自清酒乳杆菌、罗伊乳杆菌、唾液链球菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌属物种B420和乳杆菌GG。在一些实施例中,该有益细菌分类群靶向阴道并且选自鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、詹氏乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、阴道乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌和凝结芽孢杆菌。
在一些实施例中,该聚糖制剂在通过胃肠道之前接触该非肠身体部位。在一些实施例中,局部给予的聚糖制剂的按重量计小于90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、或5%进入或通过胃肠道,例如通过胃。在一些实施例中,该聚糖制剂通过阴道口引入。在一些实施例中,该聚糖制剂通过鼻孔(鼻孔内壁)引入。在一些实施例中,该聚糖制剂通过口引入。
附图说明
图1:图1A中示出了具有聚合物骨架和侧链的示例性催化剂的一部分。图1B中示出了示例性催化剂的一部分,其中具有酸性基团的侧链通过接头连接到该聚合物骨架上并且其中具有阳离子基团的侧链直接连接到该聚合物骨架上。
图2:中等分子量(MW)glu100样品在16和20.5分钟之间的示例性SEC曲线,其显示平均MW和该曲线的前缘和后缘上10%最大吸收时的MW。
图3:比较聚合度(DP)+产率(条)和平均DP(线)的图,证明两个特性一起变动并且可以控制。
图4:比较三种不同聚糖中每种的两种制剂的平均DP和α-/β-比率的图证明平均DP和α-/β-比率是无关的特性,但它们可以独立控制。
图5:比较三种不同聚糖中每种的两种制剂的支化度(DB)和平均DP的图证明这两个特性以串联方式变动并且可以控制。
图6:显示来自连同示例性聚糖制剂离体生长20小时的两个人类口腔微生物组的关键有益细菌属的相对丰度的图表。
图7:描绘来自两名用9种聚糖制剂处理的受试者的口腔离体微生物组细菌增加的图示。所有方框代表指定属相对于FOS或葡萄糖在标准化为生长时的显著倍数变化(调整P<0.05,t检验)。
具体实施方式
本文描述了已经发现有效例如调节含粘膜的各种非肠身体部位(例如像口腔、鼻腔和阴道)中的细菌分类群、调节其中的细菌丰度、调节其中的pH、调节其中的细菌代谢物、治疗其中的生态失调和/或其中的多种疾病、障碍或病理状态的聚糖制剂和药物组合物、适用于局部给予的剂型以及相关方法。
定义
如本文所用,术语“丰度”在涉及到微生物分类群时是指在身体部位(诸如口腔、鼻腔或阴道)处指定的微生物生态位中与另一个微生物分类群相比,一个微生物分类群的存在情况。
如本文使用的术语“获得”(“acquire”或“acquiring”)是指通过“直接获得”或“间接获得”值或物理实体来获得值(例如,数值)或图像或物理实体(例如,样品)。“直接获得”意指执行一个过程(例如,执行合成或分析方法或方案)来获得值或物理实体。“间接获得”是指从另一方或来源(例如,直接获得物理实体或值的第三方实验室)接收值或物理实体。直接获得值或物理实体包括执行包括实物的物理变化的过程或使用机器或装置。直接获得值的实例包括从人类受试者获得样品。直接获得值包括执行使用机器或装置(例如,NMR光谱仪)的方法以获得NMR光谱。
如本文所用,宿主有机体的“定殖”是指细菌或其他微生生物非暂态驻留在某一生态位。
如本文所用,“组合疗法”或“组合地给予”意指将两种(或更多种)不同药剂或治疗给予受试者作为特定疾病或病症的限定治疗方案的一部分。治疗方案限定给予每种药剂使得独立药剂对受试者的效果重合的剂量和周期。在一些实施例中,同时或并行递送两种或更多种药剂,且这些药剂可以共同配制。在其他实施例中,这两种或更多种药剂不是共同配制,而是按顺序给予作为规定方案的一部分。在一些实施例中,组合地给予两种或更多种药剂或治疗,使得症状或与障碍相关的其他参数的下降大于单独递送一种药剂或治疗或没有另一者将观察到的结果。两种治疗的效果可以部分累加、完全累加或大于累加(例如,协同)。按顺序或大体上同时给予每种药剂可以通过任何适当的给药途径实现,包括局部和全身途径。可以通过相同途径或通过不同途径给予这些药剂。例如,可以通过局部给予给予该组合的第一药剂,同时全身给予该组合的第二药剂。
如本文使用的“微生物群落的多样性”或“微生物多样性”是指给定生态位或宿主受试者内微生物群中发现的多样性。多样性可以涉及生态位或宿主内不同微生物分类群的数量和/或微生物分类群的丰富性,且可以例如用如本文所述的Shannon多样性指数(Shannon熵)、α-β多样性、总OTU观测数量或Chao1指数表示。在一些实施例中,本文所述的微生物组调节剂调节微生物群落内的多样性,这可以用Shannon熵作为量度来表示。例如,细菌分类群的丰度越不等,Shannon公式中pi值的加权几何平均数越大,且相应的Shannon熵越小。如果实际上所有丰度集中到一个分类群,另一分类群极为稀少(即使它们数量多),Shannon熵接近零。当只有一个分类群,Shannon熵正好等于零。
如本文所用,“剂量方案”、“给药方案”或“治疗方案”是达到治疗目标的给药形式。剂量方案包括明确以下一者、两者、三者或四者:给药途径、单位剂量、给药频率或治疗长度。
如本文所用,“生态失调”是指微生物群在宿主疾病、易感宿主疾病条件或宿主的其他非期望病症或症状下的状态,包括在不同微生物生态位或身体部位(例如像鼻腔、口腔和阴道)内的状态。在一个实施例中,生态失调是指微生物群在疾病条件下的状态。生态失调可与生态平衡对比,生态平衡是指微生物群在宿主健康条件下的状态。微生物群的状态可以包括与微生物群的结构或功能有关的特征。在一个实施例中,生态失调包括微生物群状态失衡,其中微生物分类群的正常多样性或相对丰度受到影响,例如,相对于第二细菌分类群或相对于所述分类群在健康条件下的丰度。在一个实施例中,生态失调包括微生物群的功能失衡,例如,基因表达水平、基因产物水平或代谢输出(例如,免疫功能,诸如免疫监控或炎症反应)改变。在一些实施例中,生态失调是与宿主内的非期望症状相关的非期望的(例如,不健康的)状态,包括不同微生物生态位或身体部位内,例如像鼻腔、口腔和阴道内,且不再促进健康,例如,在生态位或身体部位中。
如本文所用,“生态位”(“ecological niche”或简单地“niche”)是指有机体或有机体群占据的生态空间(诸如非肠身体部位,例如含粘膜组织非肠身体部位,诸如口腔、鼻腔和阴道)。在一些实施例中,生态位具体是指微生物在非肠身体部位中占据的空间。生态位可以描述有机体或有机体群体如何响应资源分布、物理参数(例如,宿主组织空间,诸如粘膜组织)和竞争者(例如,通过在资源丰富时和在缺少捕食者、寄生虫和病原体时生长),以及它进而如何改变那些相同的因素(例如,限制其他生物体接触资源,充当捕食者的食物来源以及被捕食者的消费者)。
如本文使用的“有效量”和“治疗有效量”是指药物组合物或药剂足以提供期望效果的量。在一些实施例中,医师或其他健康专家决定合适的量和剂量方案。有效量还是指药物组合物或药剂预防医学病症发展或复发的量。
如本文所用,“聚糖制剂”是包括聚糖且展示治疗效果的制剂。聚糖制剂包括多个单糖、二糖、寡聚糖和/或多聚糖种类(例如寡糖和/或多糖,称为“寡糖”)的合成混合物,其中寡聚糖和/或多聚糖种类包括由糖苷键连接的聚糖单元。在一些实施例中,可以将聚糖制剂配制成药物组合物供人类使用,例如用于局部施用至非肠身体部位。在一些实施例中,可以将聚糖制剂配制在任何合适的剂型(包括试剂盒)中。在一些实施例中,聚糖制剂不含一种或多种天然存在的或合成的寡糖或多糖,包括:葡萄糖寡糖、甘露糖寡糖、菊粉、剪秋罗糖、麦芽四糖、黑曲四糖、耐斯糖、赛斯糖(sesemose)、水苏糖、异麦芽三糖、黑曲三糖、麦芽三糖、松三糖、麦芽三酮糖(maltotriulose)、棉子糖、蔗果三糖、果寡糖、2'-岩藻糖基乳糖、低聚半乳糖、糖基、依达肝素、低聚异麦芽糖、麦芽糖糊精、木寡糖、琼脂、琼脂糖、海藻酸、多糖酸(alguronic acid)、α葡聚糖、支链淀粉、直链淀粉、阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、胼胝质、卡苏兰(capsulan)、卡拉胶、纤维糊精、动物纤维素、纤维素、几丁质、几丁质纳米纤维、几丁质-葡聚糖复合物、壳聚糖、金藻昆布多糖、凝胶多糖、环糊精、α-环糊精、葡聚糖、糊精、双醛淀粉、聚蔗糖、果聚糖、岩藻多糖、半乳葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳糖胺半乳糖(galactosamineogalactan)、结兰胶、葡聚糖、葡甘露聚糖、葡糖醛酸木聚糖(glucoronoxyland)、糖萼、糖原、半纤维素、羟丙甲纤维素、艾考糊精、开菲尔多糖、海带多糖、香菇多糖、果聚糖多聚、地衣淀粉、甘露聚糖、粘液、天然胶、裸藻淀粉、果胶酸、果胶、喷他淀粉(pentastarch)、植物糖原、皮鲁兰(pleuran)、卡拉胶、聚葡萄糖、紫菜聚糖、普鲁兰多糖、裂裥菌素、琼脂糖凝胶、海葱糖、西佐喃、舒更葡糖、韦兰胶、黄原胶、木聚糖、木葡聚糖、酵母聚糖等。在一些实施例中,聚糖作为盐(例如,药学上可接受的盐)存在。
如本文使用的“聚糖单元”是指本文披露的聚糖的单个单元,例如,制备聚糖的构建块。在一个实施例中,聚糖单元是单体。在一个实施例中,聚糖单元是二聚体。在一个实施例中,聚糖单元是单糖。在一个实施例中,聚糖单元是二糖。在一些实施例中,聚糖单元是碳水化合物,且可以选自糖醇、短链脂肪酸、糖酸、亚胺糖、脱氧糖和氨基糖。在一些实施例中,聚糖单元是赤藓糖、苏阿糖、赤藓酮糖(erythulose)、阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、岩藻糖、墨角藻糖、鼠李糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖等。在一些实施例中,聚糖单元是葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖或鼠李糖。在实施例中,聚糖包括不同聚糖单元,例如,第一和第二单糖、或第一和第二二糖、或单糖和二糖。在实施例中,聚糖包括不同聚糖单元,例如,第一、第二、第三、第四和/或第五不同聚糖单元。
如本文所用,“分离的”或“纯化的”聚糖制剂基本上是纯的且不含污染物,例如病原体或其他非期望的生物材料,或毒素或其他非期望的有机或无机化合物。在一些实施例中,纯的或分离的化合物、组合物或制剂可以包含微量溶剂和/或盐(诸如小于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、小于0.5%或0.1%,以w/w、w/v、v/v或摩尔%计)。纯化的化合物是或制剂包含至少约60%(以w/w、w/v、v/v或摩尔%计)、至少约75%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%或至少约99%(以w/w、w/v、v/v或摩尔%计)的感兴趣的一种或多种化合物。例如,纯化的(基本上纯的)或分离的聚糖制剂是至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、98%、99%、99.5%、99.8%、99.9%或100%的聚糖制剂,以w/w、w/v、v/v或摩尔%计(即,不包括聚糖制剂可以溶解于其中的任何溶剂,例如像水),并且在例如制造、提取/纯化和/或加工期间与伴随它的组分分离(例如使得聚糖制剂基本上不含非期望的化合物)。可以通过任何适当的标准方法测量纯度,例如,通过柱色谱法(例如,尺寸排阻色谱法(SEC))、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)或核磁共振(NMR)光谱法。纯化的或纯度也可以限定对给予人类受试者安全的无菌程度,例如缺少活的感染剂或毒性剂。
如本文所用,术语“局部地”或“局部给予”意指在特定身体部位给予,以在该部位获得基本上局部的效果。局部给予的实例包括表皮、吸入、关节内、鞘内、阴道内、玻璃体内、子宫内、病灶内、淋巴结给予、肿瘤内、局部给予,以及给予至受试者的粘膜,在每种情况下,其中给予意在具有基本上局部的效果。在一些实施例中,例如,通过喷雾或液滴、滴注液体、或直接接触聚糖制剂或者包括该聚糖制剂的组合物或剂型,将聚糖制剂施加至非肠身体部位(例如,组织或其粘膜)。“基本上”局部意指药剂的主要效果集中在局部部位(例如,含粘膜组织非肠身体部位)而不是全身(例如不具有基本上全身的效果)。在一个实施例中,该药剂(例如聚糖制剂)基本上不会吸收到血液中。在一个实施例中,该药剂(例如聚糖制剂)基本上不会吸收到淋巴系统中。在一个实施例中,该药剂(例如聚糖制剂)基本上不会吸收到肠道(例如包括胃、结肠和肠)中。在一个实施例中,小于50%、40%、30%、20%、10%或5%(按重量计)的局部给予至非肠身体部位的聚糖制剂进入或通过胃肠道,例如胃或胃下游。
如本文所用,“微生物组”是指持续和暂时居住在受试者(例如人类受试者)中或上的微生物群落的遗传内容物,包括真核生物、古生菌、细菌和病毒(包括细菌病毒(例如,噬菌体)),其中“遗传内容物”包括基因组DNA、RNA(诸如核糖体RNA和信使RNA)、表观基因组、质粒和所有其他类型的遗传信息。在一些实施例中,微生物组具体是指生态位中微生物群落的遗传内容物。
如本文使用的“微生物群”是指出现(持续或暂时)在受试者(例如,人类受试者)中和上的微生物群落,包括真核生物、古细菌、细菌和病毒(包括细菌病毒,例如噬菌体)。在一些实施例中,微生物群具体是指生态位上的微生物群落。
如本文使用的“调节微生物群”(“modulate the microbiota”或“modulating themicrobiota”)是指改变微生物群的状态。改变微生物群的状态可以包括改变微生物群的结构和/或功能。微生物群的结构变化是例如非肠身体部位(例如,口腔、鼻腔或阴道或其特定粘膜组织)中例如分类群的相对组成的变化。在一个实施例中,例如非肠身体部位处微生物群的结构变化包括一个分类群例如相对于另一个分类群或相对于在没有调节时将观察到的分类群的丰度变化。调节微生物群也可以或此外包括微生物群的功能变化,诸如微生物群基因表达、基因产物(例如,RNA或蛋白质)水平或微生物群的代谢输出的变化。微生物群的功能也可以包括宿主病原体保护和宿主免疫调节。微生物群的结构或功能的调节此外可以因微生物群或其功能的变化诱导宿主的一个或多个功能途径的改变(例如,基因表达、基因产物水平和/或宿主细胞的输出或宿主过程的变化)。
如本文使用的术语“鼻腔”是指鼻子和鼻腔通道的任何区域或分部,包括鼻孔内部/鼻孔、鼻咽、鼻甲(例如,下鼻甲)、前庭、上颌骨、腭骨、翼突内侧板、筛骨迷路、鼻窦(例如鼻旁窦、额窦、上颌窦、蝶窦、筛窦)、口、鼻壁(例如,外侧鼻壁)、漏斗部、上颚、鼻咽部、嗅觉上皮、呼吸道上皮和犁鼻器,包括其粘膜组织。
如本文使用的术语“非肠身体部位”是指不同于胃或胃后(例如下游)的胃肠道的任何部分的身体部位(例如微生物生长部位),例如,十二指肠、空肠、大肠、十二指肠、小肠、结肠、回肠、盲肠和直肠。在一些实施例中,非肠身体部位包括口腔、鼻腔和阴道。在一些实施例中,非肠粘膜组织是指不同于胃或其后(例如胃下游)的胃肠道的任何部分的粘膜组织的粘膜组织。在一些实施例中,非肠部位包括一种或多种粘膜组织。
如本文所用,术语“寡糖”是指由多个(即,两个或更多个)共价连接的单个聚糖单元组成的分子。每个聚糖单元可以通过以α或β构型存在的糖苷键(例如,1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键、1->5糖苷键或1->6糖苷键)连接。
如本文所用,术语“致病性的”(例如“致病菌”)是指能够引起疾病的物质、微生物或条件。在某些情境下,病原体还包括与疾病或病症相关,但尚未建立或尚待建立因果关系(例如,直接因果关系)的微生物(例如细菌)。在一些实施例中,并非病原体且可以是共生体的微生物可以引起疾病或生态失调或与之相关联,这取决于各种因素(例如部位的免疫状态、微生物分类群的丰度等)。此类微生物被称为“致病有机体”。
如本文使用的术语“口腔”是指口或喉的区域或分部,诸如唇、牙龈、舌、颊、上颚(例如,舌腭)、扁桃体、唾腺、颌、咽、口咽、咽喉、会厌、喉头、气管和食管,包括其粘膜组织。
如本文所用,“药物组合物”或“药物制剂”是对减轻、治疗或预防疾病具有药理学活性或其他直接效果的组合物或制剂,和/或其最终剂型或配制品,且是供人类使用。药物组合物或药物制剂通常在良好生产规范(GMP)条件下生产。药物组合物或制剂可以是无菌或非无菌的。如果是非无菌的,此类药物组合物满足如美国药典(USP)或欧洲药典(EP)中所述的非无菌药学产品的微生物指标和标准。药物组合物还可以包括其他活性剂(例如像其他治疗剂),或可以与之共同给予。药物组合物也可以包括药学上可接受的赋形剂、溶剂、载体、填充剂或其任何组合。
术语“表型”是指单个实体的一组可观测到的特征。例如,单个受试者可以具有“健康”或“病态”表型。表型可以描述实体的状态,其中一个表型内的所有实体共享一组相同的描述该表型的特征。个体的表型部分或完全是由实体基因组和/或微生物组与环境的相互作用导致。
如本文所用,术语“多糖”是指由多个共价连接的单个聚糖单元组成的聚合分子。在一些实施例中,多糖包括至少10个或更多个聚糖单元(例如,至少10、至少15、至少20、至少25、或至少50、至少100、至少250、至少500、或至少1000个聚糖单元)。每个聚糖单元可以通过以α或β构型存在的糖苷键(例如,1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键、1->5糖苷键和1->6糖苷键)连接。在一些实施例中,多糖是包括相同重复单元的均质聚合物。在其他实施例中,多糖是由不同重复单元组成的异质聚合物。多糖还可以通过支化度(DB,每个残基的分支点)或聚合度(DP)表征。
如本文所用,术语“受试者”或“患者”通常是指任何人类受试者。该术语不指示具体的年龄或性别。受试者可以包括怀孕妇女。受试者可以包括新生儿(早产新生儿、足月新生儿)、最多一岁的婴儿、幼儿(例如,1岁至12岁)、青少年(例如,13-19岁)、成人(例如,20-64岁)和老年人(65岁和以上)。受试者不包括农业动物,例如,农场动物或牲畜,例如,牛、马、绵羊、猪、鸡等。一般而言,受试者包括宿主及其相应的微生物群。
如本文使用的“大幅降低”是降低5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.9%或100%。
如本文使用的“大幅增加”是增加10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%、1000%、或大于1000%。
如本文使用的“合成的”是指并非天然存在的人造化合物或制剂,诸如聚糖制剂。在一个实施例中,在合适的反应条件下通过例如由加入反应中的单个聚糖单元产生寡聚物和聚合物的聚合(或缩合)反应,使用本文所述的聚合催化剂合成制剂的聚糖。在一些实施例中,聚合催化剂充当水解剂且可断裂糖苷键。在其他实施例中,聚合物催化剂可以形成糖苷键(水解)。合成聚糖制剂也可以包括不是从天然寡糖或多糖源(例如来自多肽的N-连接或O-连接聚糖)分离的聚糖制剂。应当理解,虽然聚糖制剂不是从天然寡糖或多糖源分离,但组成聚糖制剂的聚糖单元可以且通常是从天然寡糖或多糖源(包括本文列出的那些)分离,或者从头合成。
如本文使用的术语“治疗”(“treating”和“treatment”)是指将药剂或组合物给予受试者(例如,受不利病症、障碍或疾病困扰的有症状受试者),以减轻症状的严重程度和/或频率,消除症状和/或其根本病因,和/或促进损伤改善或修复,和/或预防无症状受试者中不利病症、障碍或疾病,该受试者易受特定不利病症、障碍或疾病的影响或者疑似发展或具有发展该病症、障碍或疾病的风险。
如本文使用的术语“阴道”是指阴道区域或分部或周围区域,包括阴唇、外阴、子宫颈、子宫、输卵管、卵巢、尿道和膀胱,包括其粘膜组织。
聚糖制剂的产生
包括多种聚糖(例如像,寡糖混合物)的制剂可以利用非酶催化剂(例如,美国专利号8,466,242,“POLYMERIC ACID CATALYSTS AND USES THEREOF[聚合酸催化剂及其用途]”中所述的聚合催化剂)或通过其他合适方法产生。制备本文所述的聚合和固体负载型催化剂的方法可以在WO2014/031956,“POLYMERIC AND SOLID-SUPPORTED CATALYSTS,ANDMETHODS OF DIGESTING CELLULOSIC MATERIALS USING SUCH CATALYSTS[聚合和固体负载型催化剂以及使用此类催化剂消化纤维素材料的方法]”中找到。例如,通过使用催化剂(例如如WO 2016/007778,“OLIGOSACCHARIDE COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCINGTHEREOF[寡糖组合物及其生产方法]”和WO/2016/122889“GLYCAN THERAPEUTICS ANDRELATED METHODS THEREOF[聚糖治疗剂及其相关方法]”中所述)产生的聚糖可以是结构比那些用酶反应生产的具有大得多的多样性的聚糖。通过引用将所有专利申请并入本文。
还提供了用于产生本文所述的聚糖(例如寡糖)制剂的方法,例如通过:a)提供一种或多种单糖或二糖聚糖单元或其组合,b)使该单糖或二糖与本文所述的任何聚合催化剂和合适的溶剂(例如像水或非水性溶剂)接触一段足以生产聚合种类群体(具有期望的平均聚合度)的时间;并且c)分离和/或回收至少一部分聚合的聚糖制剂。
在一些实施例中,聚糖(例如寡糖)的制剂是多分子的。在一些实施例中,聚糖(例如寡糖)的制剂是多分子的且具有多分散性。例如,聚糖制剂包括不同寡糖种类(例如具有不同聚合度和支化度以及不同的α-β糖苷键比率)的混合物。在一些实施例中,聚糖制剂包括多种不同种类(例如寡糖),且可以由1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014或更多种彼此比例不同的种类组成。本文描述了聚糖制剂的平均特性,诸如聚合度、支化度、α-糖苷键和β-糖苷键的比率等。
在某些实施例中,起始材料(包括聚糖单元)与聚合物催化剂在促进在聚糖单元之间形成一个或多个糖苷键的条件下接触,从而生产聚糖的制剂。在一个实施例中,聚糖单元是单糖。在一个实施例中,聚糖单元是二糖。合适的聚合物催化剂包括连接在一起形成聚合物骨架的酸性单体和离子单体,其中每个酸性单体具有至少一个Bronsted-Lowry酸,且每个离子单体独立地具有至少一个含氮阳离子基团或含磷阳离子基团。在一些实施例中,聚合物催化剂的每个酸性单体可以具有一个Bronsted-Lowry酸,且任选地,这些Bronsted-Lowry酸是不同的。在一些实施例中,聚合物催化剂的每个离子单体具有一个含氮阳离子基团或含磷阳离子基团。在一些实施例中,聚合物催化剂的至少一个离子单体具体两个含氮阳离子基团或含磷阳离子基团。描绘出一般官能团的示意图示出在图1a和1b中。
一般来说,将聚合催化剂和聚糖单元同时或按顺序引入反应器的内腔中。聚糖(例如寡糖)合成可以按分批工艺或连续工艺进行。例如,在一个实施例中,聚糖合成以分批工艺进行,其中反应器的内容物连续混合或共混,并移除(例如分离和/或回收)所有或大量反应产物。在一个变型中,聚糖合成以分批工艺进行,其中开始使反应器的内容物掺杂或混合,但不进一步进行物理混合。在另一个变型中,聚糖合成以分批工艺进行,其中进一步混合内容物后,或定期混合反应器内容物(例如,每小时一次或多次),在一定时间后移除(例如分离和/或回收)所有或大量反应产物。
在其他实施例中,聚糖(例如寡糖)合成以连续工艺进行,其中内容物以平均连续流速流过反应器,但未明确混合。在将聚合催化剂和聚糖单元引入反应器后,连续或定期混合或共混反应器的内容物,并在一定时间后,移除(例如分离和/或回收)不到所有的反应产物。在一个变型中,聚糖合成以连续工艺进行,其中不主动混合含催化剂和聚糖单元的混合物。此外,混合催化剂和聚糖单元可以通过重力沉降聚合催化剂重新分布实现,或在材料流过连续反应器时不主动混合实现。
在该方法的一些实施例中,聚合反应的起始材料是选自一种或多种单糖、一种或多种二糖或其组合的一种或多种聚糖单元。在该方法的一些实施例中,聚合反应的起始材料是选自呋喃糖和吡喃糖的一种或多种聚糖单元。在该方法的一些实施例中,聚合反应的起始材料是选自四糖、戊糖、己糖或庚糖的一种或多种聚糖单元。在该方法的一些实施例中,聚合反应的起始材料是选自葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖和鼠李糖的一种或多种聚糖单元,它们全部任选地是L-形式或D-形式,α或β构型(对于二聚体)和/或脱氧形式(适用时),及其任何组合。在一些实施例中,聚糖单元经乙酸酯、硫酸半酯、磷酸酯或丙酮酸环缩醛基团中的一个或多个取代或衍生化,或已经以其他方式在例如一个或多个羟基基团处衍生化。
用于本文所述方法中的聚糖单元可以包括一种或多种糖。在一些实施例中,这一种或多种糖选自单糖、二糖和三糖、或其任何混合物。在一些实施例中,这一种或多种糖是单糖,诸如一种或多种C5或C6单糖。在一些实施例中,这一种或多种糖是C5单糖。在其他实施例中,这一种或多种糖是C6单糖。
在一些实施例中,聚合反应的起始材料是选自单糖和其他碳水化合物的一种或多种聚糖单元,包括乙醇醛、甘油醛、二羟丙酮、赤藓糖、苏阿糖、赤藓酮糖、阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、岩藻糖、墨角藻糖、鼠李糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖、神经氨酸、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、果糖胺、半乳糖胺、葡萄糖胺、山梨醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨醇、半乳糖醇、岩藻糖醇和乳酸。
在一些实施例中,聚合反应的起始材料是选自单糖的一种或多种聚糖单元。在一些实施例中,该单糖是葡萄糖、半乳糖、果糖、岩藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖和木糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是葡萄糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是半乳糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是果糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是岩藻糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是甘露糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是阿拉伯糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是鼠李糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是木糖。
在一些实施例中,聚合反应的起始材料是选自二糖和其他碳水化合物的一种或多种聚糖单元,包括acarviosin、N-乙酰氨基乳糖、异乳糖、纤维二糖、壳二糖、半乳糖-α-1,3-半乳糖、龙胆二糖、异麦芽、异麦芽糖、异麦芽酮糖、曲二糖、乳糖醇、乳糖酸、乳糖、乳果糖、昆布二糖、麦芽糖醇、麦芽糖、甘露二糖、蜜二糖、蜜二酮糖、新橙皮糖、黑曲霉糖、刺槐糖、芸香糖、山布双糖(sambubiose)、槐糖、三氯蔗糖、蔗糖、乙酸异丁酸蔗糖酯、蔗糖八乙酸酯、海藻糖、松二糖、荚豆二糖和木二糖。
在一些实施例中,聚合反应的起始材料是选自氨基糖、脱氧糖、亚胺糖、糖酸、短链脂肪酸和糖醇的一种或多种聚糖单元。
合适的聚糖单元包括氨基糖,例如像阿卡波糖、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰塔罗糖胺糖醛酸(N-acetyletalosaminuronic acid)、阿拉伯吡喃糖基-N-甲基-N-亚硝基脲、D-果糖-L-组氨酸、N-羟乙酰神经氨酸、酮胺、贵田霉素、甘露糖胺、1B-甲基硒基-N-乙酰-D-半乳糖胺、胞壁酸、胞壁酰二肽、磷酸核糖胺、PUGNAc、唾液酰-路易斯A、唾液酰-路易斯X、有效霉素、伏格列波糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、天门冬氨酰葡萄糖胺、巴利硫醇(bacillithiol)、六碳氨糖、红霉脱氧糖胺、果糖胺、半乳糖胺、葡萄糖胺、葡甲胺和过骨胺(perosamine)。
合适的聚糖单元包括脱氧糖,例如像1-5-脱水葡萄糖醇、克拉定糖、可立糖、2-脱氧-D-葡萄糖、3-脱氧葡糖醛酮、脱氧核糖、双脱氧核苷酸、毛地黄糖、氟脱氧葡萄糖、箭毒羊角拗糖(sarmentose)和磺基鸡纳糖。
合适的聚糖单元包括亚胺糖,例如像粟树精胺、1-脱氧野尻霉素、亚胺糖、米格列醇、美格鲁特和苦马豆素。
合适的聚糖单元包括糖酸,例如像N-乙酰神经氨酸、N-乙酰塔罗糖胺糖醛酸(N-acetyltalosamnuronic acid)、醛糖二酸、醛糖酸、3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸、葡糖醛酸、葡糖胺糖醛酸、甘油酸、N-羟乙酰神经氨酸、艾杜糖醛酸、异糖精酸、潘氨酸、唾液酸、苏糖酸、酮糖酸、糖醛酸、木糖酸、葡糖酸、抗坏血酸、酮脱氧辛酮糖酸、半乳糖醛酸、半乳糖胺糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖胺糖醛酸、酒石酸、粘酸、葡糖二酸、乳酸、草酸、琥珀酸、己酸、富马酸、马来酸、丁酸、柠檬酸、氨基葡萄糖酸、苹果酸、琥珀酰胺酸、癸二酸和癸酸。
合适的聚糖单元包括短链脂肪酸,例如像甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸。
合适的聚糖单元包括糖醇,例如像甲醇、乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿糖醇、核糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨醇、半乳糖醇、艾杜醇、庚七醇、岩藻糖醇、肌醇、麦芽三糖醇、麦芽四糖醇和聚葡糖醇。
在一些实施例中,聚糖单元可以作为盐(例如,药学上可接受的盐)存在,例如像盐酸盐、氢碘酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、甲烷磺酸盐、乙酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐、丙酮酸盐、富马酸盐、丙酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐。
用于本文所述方法中的聚糖单元可以从任何商业上已知的来源获得,或者根据本领域已知的任何方法生产。
在一些实施例中,聚糖制剂是合成的,而非从天然产物(例如,天然寡糖或天然多糖)分离。在一些实施例中,聚糖制剂不是从N-连接聚糖或O-连接聚糖衍生或制备。在一些实施例中,聚糖制剂不是从粘蛋白衍生或制备。
反应条件
在一些实施例中,允许聚糖单元和催化剂(例如,聚合催化剂或固体负载型催化剂)反应至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少6小时、至少8小时、至少16小时、至少24小时、至少36小时或至少48小时;或1-24小时之间、2-12小时之间、3-6小时之间、1-96小时之间、12-72小时之间、或12-48小时之间。
在一些实施例中,根据本文所述的方法生产的聚糖制剂的聚合度(DP)可以通过反应时间来调节。例如,在一些实施例中,聚糖制剂的聚合度通过增加反应时间而增加,而在其他实施例中,聚糖制剂的聚合度通过减少反应时间而减小。
反应温度
在一些实施例中,将反应温度维持在约25℃至约150℃的范围内。在某些实施例中,该温度是从约30℃至约125℃、约60℃至约120℃、约80℃至约115℃、约90℃至约110℃、约95℃至约105℃或约100℃至110℃。
聚糖单元的量
用于本文所述方法中的聚糖单元相对于使用的溶剂量的量可以影响反应速率和产率。使用的聚糖单元的量可以通过干固体含量来表征。在某些实施例中,干固体含量是指在干重基础上作为百分比的浆液的总固体。在一些实施例中,聚糖单元的干固体含量在约5wt%至约95wt%之间、在约10wt%至约80wt%之间、在约15wt%至约75wt%之间、或在约15wt%至约50wt%之间。
催化剂的量
用于本文所述方法中的催化剂的量可取决于几种因素,包括例如,选择聚糖单元的一种或多种类型、聚糖单元的浓度和反应条件(例如,温度、时间和pH)。在一些实施例中,催化剂与一种或多种聚糖单元的重量比是约0.01g/g至约50g/g、约0.01g/g至约5g/g、约0.05g/g至约1.0g/g、约0.05g/g至约0.5g/g、约0.05g/g至约0.2g/g或约0.1g/g至约0.2g/g。
溶剂
在某些实施例中,利用聚合催化剂在水性环境中合成聚糖(例如寡糖)。一种合适的水性溶剂是水。一般而言,具有较低浓度的离子种类的水是优选的,因为这些离子种类可能降低聚合催化剂的效果。在水性溶剂是水的一些实施例中,水有少于10%的离子种类(例如,钠盐、磷盐、铵盐、镁盐)。在水性溶剂是水的一些实施例中,水有至少0.1兆欧-厘米、至少1兆欧-厘米、至少2兆欧-厘米、至少5兆欧-厘米或至少10兆欧-厘米的电阻率。
水含量
在一些实施例中,在一个或多个聚糖单元之间形成每个糖苷键时产生水(脱水反应)。在某些实施例中,本文所述的方法可以进一步包括监测一段时间内反应混合物中存在的水量和/或水与聚糖单元或催化剂的比率。在一些实施例中,该方法进一步包括去除反应混合物中产生的至少一部分水(例如,如通过真空过滤去除至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%、或100%中的任一者)。然而,应理解,可以基于反应条件和使用的特定催化剂调整水相对于聚糖单元的量。
可以使用本领域已知的任何方法去除反应混合物中的水,包括例如通过真空过滤、真空蒸馏、加热和/或蒸发。在一些实施例中,该方法包括在反应混合物中包括水。
在一些方面,本文提供了生产聚糖制剂的方法,通过:组合聚糖单元与具有酸性部分和离子部分的催化剂以形成反应混合物,其中在反应混合物中产生水;并且去除反应混合物中产生的至少一部分水。在某些变型中,去除至少一部分水,以将反应混合物中的水含量维持在少于99%、少于90%、少于80%、少于70%、少于60%、少于50%、少于40%、少于30%、少于20%、少于10%、少于5%、或少于1%,以重量计。
在一些实施例中,生产的聚糖制剂的聚合度可以通过调节或控制反应混合物中存在的水浓度来调整。例如,在一些实施例中,聚糖制剂的聚合度通过降低水浓度而增加,而在其他实施例中,聚糖制剂的聚合度通过增加水浓度而减小。在一些实施例中,在反应期间调节反应的水含量来调整生产的聚糖制剂的聚合度。
例如,大多数(例如约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或约97%)的聚糖制剂具有2与25之间、3与25之间、4与25之间、5与25之间、6与25之间、7与25之间、8与25之间、9与25之间、10与25之间、2与30之间、3与30之间、4与30之间、5与30之间、6与30之间、7与30之间、8与30之间、9与30之间、或10与30之间的DP。
在一个实例中,向配备有顶置式搅拌器和夹套式短路冷凝器的圆底烧瓶中加入一种或多种聚糖单元以及1%-50%(1%-10%、1%-20%、1%-30%、1%-40%、1%-60%、1%-70%)以干重计的一种或多种本文所述的催化剂。可以将水或另一种相容性溶剂(0.1-5当量、1-5当量、1-4当量、0.1-4当量)加入干混合物中,且浆液可以缓慢速度(例如10-100rpm、50-200rpm、100-200rpm),使用大小匹配尽可能接近所选圆底烧瓶的轮廓的桨合并。在10-1000毫巴真空压力下将混合物加热至70℃-180℃(70℃-160℃、75℃-165℃、80℃-160℃)。搅拌该反应30分钟至6小时,持续从反应中去除水。可以通过HPLC监测反应进程。
本文所述方法中的一种或多种聚糖单元的转化产率可以通过本领域已知的任何合适方法测定,包括例如,高效液相色谱法(HPLC)。在一些实施例中,组合一种或多种聚糖单元与催化剂后(例如,在组合一种或多种聚糖单元与催化剂2、3、4、8、12、24或48小时后)转化为DP>1的聚糖制剂的产率大于约50%(例如,大于约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%)。在一些实施例中,组合一种或多种聚糖单元与催化剂后(例如,在组合一种或多种聚糖单元与催化剂2、3、4、8、12、24或48小时后)转化为>DP2的聚糖制剂的产率大于30%(例如,大于35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%)。在一些实施例中,组合一种或多种聚糖单元与催化剂后(例如,在组合一种或多种聚糖单元与催化剂2、3、4、8、12、24或48小时后)转化为>DP3的聚糖制剂的产率大于30%(例如,大于35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%)。
在一些实施例中,聚糖制剂在组合一种或多种聚糖单元与聚合催化剂后(例如,在组合一种或多种聚糖单元与催化剂2、3、4、8、12、24或48小时后)的聚合度(DP)分布是:DP2=0%-40%,诸如小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于5%、或小于2%;或10%-30%或15%-25%;DP3=0%-20%,诸如小于15%、小于10%、小于5%;或5%-15%;和DP4+=大于15%、大于20%、大于30%、大于40%、大于50%;或15%-75%、20%-40%或25%-35%。
可以将通过该工艺获得的固体物质溶解在体积足以产生约50Brix(克糖/100g溶液)的溶液的水中。溶解完成后,可以通过过滤去除固体催化剂。可以例如通过旋转蒸发将包括治疗性聚糖的溶液浓缩至约50-75Brix。在一些实施例中,可以将包括治疗性聚糖的溶液浓缩至约50-60Brix、60-70Brix、70-80Brix、55-65Brix、65-75Brix或75-85Brix。在一些实施例中,可以将包括治疗性聚糖的溶液浓缩至约50、55、60、65、70、75、80或约85Brix。任选地,可以使用有机溶剂,且可以通过双相萃取去除与水不混溶的溶剂,且可以在浓缩步骤的同时例如通过旋转蒸发去除水混溶性溶剂。
另外的加工步骤
任选地,生产的聚糖制剂可以经历另外的加工步骤。另外的加工步骤可以包括例如纯化步骤。纯化步骤可以包括例如分离、稀释、浓缩、过滤、脱盐或离子交换、色谱分离或脱色或其任何组合。
脱色
在一些实施例中,本文所述的方法还包括脱色步骤。生产的聚糖制剂可以利用本领域已知的任何方法经历脱色步骤,包括例如,用吸收剂、活性碳处理、色谱法(例如,利用离子交换树脂)、氢化和/或过滤(例如,微滤)。
在某些实施例中,使生产的聚糖制剂与颜色吸收材料在特定温度下、在特定浓度下接触和/或持续特定持续时间。在一些实施例中,与聚糖制剂接触的颜色吸收种类的质量小于聚糖制剂质量的50%、小于聚糖制剂质量的35%、小于聚糖制剂质量的20%、小于聚糖制剂质量的10%、小于聚糖制剂质量的5%、小于聚糖制剂质量的2%、或小于聚糖制剂质量的1%。
在一些实施例中,使聚糖制剂与颜色吸收材料接触。在某些实施例中,使聚糖制剂与颜色吸收材料接触少于10小时、少于5小时、少于1小时或少于30分钟。在一个特定实施例中,使聚糖制剂与颜色吸收材料接触1小时。
在某些实施例中,使聚糖制剂与颜色吸收材料在从约20℃至100℃、约30℃至80℃、约40℃至80℃或约40℃至65℃的温度下接触。在一个特定实施例中,使聚糖制剂与颜色吸收材料在约50℃的温度下接触。
在某些实施例中,该颜色吸收材料是活性碳。在一个实施例中,该颜色吸收材料是粉末状活性碳。在其他实施例中,该颜色吸收材料是离子交换树脂。在一个实施例中,该颜色吸收材料是氯化物形式的强碱性阳离子交换树脂。在另一个实施例中,该颜色吸收材料是交联聚苯乙烯。在又另一个实施例中,该颜色吸收材料是交联聚丙烯酸酯。在某些实施例中,该颜色吸收材料是Amberlite FPA91、Amberlite FPA98、Dowex 22、Dowex MarathonMSA或Dowex Optipore SD-2。
离子交换/脱盐(脱矿质)
在一些实施例中,使聚糖制剂与材料接触以去除盐、矿物质和/或其他离子种类。在某些实施例中,聚糖制剂流过阴离子/阳离子交换柱对。在一个实施例中,阴离子交换柱含有氢氧化物形式的弱碱性交换树脂,且阳离子交换柱含有质子化形式的强酸性交换树脂。
分离和浓缩
在一些实施例中,本文所述的方法还包括分离生产的聚糖制剂。在某些变型中,分离聚糖制剂包括使用本领域已知的任何方法使至少一部分聚糖制剂与至少一部分催化剂分离,包括例如,离心、过滤(例如,真空过滤、膜过滤)和重力沉降。在一些实施例中,分离聚糖制剂包括使用本领域已知的任何方法使至少一部分聚糖制剂与至少一部分任何未反应的聚糖单元分离,包括例如,过滤(例如,膜过滤)、色谱法(例如,色谱分级)、差示溶解度法和离心(例如,差速离心)。
在一些实施例中,该方法还包括浓缩步骤。例如,分离的聚糖制剂经历蒸发(例如,真空蒸发),以产生浓缩聚糖制剂。在其他实施例中,分离的聚糖制剂经历喷雾干燥步骤,以产生粉末状聚糖制剂。在某些实施例中,分离的聚糖制剂经历蒸发步骤和喷雾干燥步骤两者。
分馏
在一些实施例中,产生具有多分散性(即呈现一系列聚合度)的聚糖制剂(例如寡糖)。在一些实施例中,本文所述的方法还包括分馏步骤。聚糖种类(例如,寡糖)可以按分子量,使用本领域已知的任何方法分离,包括例如,高效液相色谱法、吸附/解吸(例如低压活性碳色谱法)或过滤(例如,超滤或渗滤)。在某些实施例中,将聚糖种类分离成代表60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或大于98%的短(约DP1-2)、中(约DP3-10)、长(约DP11-18)或极长(约DP>18)种类的池。
在某些实施例中,通过吸附到碳质材料上,随后通过用有机溶剂在水中的混合物以1%、5%、10%、20%、50%或100%的浓度清洗材料使馏分解吸而将聚糖种类分级。在一个实施例中,该吸附材料是活性炭。在另一个实施例中,该吸附材料是活性炭与增量剂(诸如硅藻土或Celite 545,5%、10%、20%、30%、40%、或50%体积或重量份)的混合物。
在另外的实施例中,通过高效液相色谱系统分离聚糖种类。在某些变型中,通过离子亲和色谱法、亲水作用色谱法、或尺寸排阻色谱法(包括凝胶渗透和凝胶过滤)分离聚糖种类。
在其他实施例中,通过过滤方法去除低分子量材料。在某些变型中,通过透析、超滤、渗滤或切向流过滤去除低分子量材料。在某些实施例中,在静态透析管装置中进行过滤。在其他实施例中,在动态流过滤系统中进行过滤。在其他实施例中,在离心力驱动滤筒中进行过滤。
聚糖制剂的特征
本文所述的聚糖制剂可以包括寡糖和/或多糖(本文称为“寡糖”)。在一些实施例中,聚糖制剂包括均寡聚物或聚合物(例如,均聚糖),其中寡聚物或聚合物中的所有聚糖单元的类型相同。包括均聚物的聚糖制剂可以包括通过单种或多种糖苷键类型键合在一起的单糖。
在一些实施例中,聚糖制剂包括杂寡聚物或聚合物(例如,杂聚糖),其中存在超过一种类型的聚糖单元。包括杂聚物的聚糖制剂可以包括通过单种或多种糖苷键类型键合在一起的不同类型的单糖。
在一些实施例中,可以利用水解产生适合生产本文所述的聚糖的组成聚糖单元。在一个实施例中,聚糖单元是单糖。单糖可以许多不同形式存在,例如,构象异构体、环形式、无环形式、立体异构体、互变异构体、端基差向异构体和异构体。
聚合度
在一些实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有至少5个且少于30个聚糖单元的DP。在一些实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有至少3个且少于30个聚糖单元的DP。在一些实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有至少3个且少于25个聚糖单元的DP。在一些实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有至少8个且少于30个聚糖单元的DP。在一些实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有至少10个且少于30个聚糖单元的DP。在一些实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有3、4、5、6、7、8与10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个聚糖单元之间的DP。在一些实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19与20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个聚糖单元之间的DP。在一些实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有3、4、5、6、7、8、9、10与20、21、22、23、24、25、26、27、28个聚糖单元之间的DP。
在一个实施例中,聚糖制剂具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP)。在一个实施例中,聚糖制剂具有至少5个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP)。在一个实施例中,聚糖制剂具有至少3个且少于25个聚糖单元的聚合度(DP)。
在一个实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有至少2的DP。在一个实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有至少3的DP。
在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.8%、或至少99.9%或甚至100%的聚糖制剂具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或至少12个聚糖单元且少于75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16或少于15个聚糖单元的聚合度(DP)。
在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.8%、或至少99.9%或甚至100%的聚糖制剂具有至少3个且少于30个聚糖单元、至少5个且少于30个聚糖单元、或至少8个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP)。
在一些实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有约DP5、DP6、DP7、DP8、DP9、DP10、DP11、DP12、DP13、DP14或DP15的平均聚合度(DP)。
在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中至少50%、60%、70%、或80%的聚糖制剂具有至少3个且少于30个聚糖单元或至少5个且少于25个聚糖单元的聚合度。在一些实施例中,聚糖制剂的平均DP在约DP7与DP9之间或在约DP6与DP10之间。在一些实施例中,这些聚糖制剂包括从0.8:1至5:1或从1:1至4:1的α-糖苷键与β-糖苷键比。在一些实施例中,分级的制剂具有约0.01与约0.2之间或约0.05与0.1之间的平均支化度。
在一个实施例中,提供了具有多分散性的分级聚糖制剂,其包括至少85%、90%、或至少95%的DP为约3-10的中等长度种类。在一个实施例中,提供了具有多分散性的分级聚糖制剂,其包括至少85%、90%、或至少95%的DP为约11-18的长长度种类。在一个实施例中,提供了具有多分散性的分级聚糖制剂,其包括至少85%、90%、或至少95%的DP为约18-30的极长长度种类。在一些实施例中,这些中、长和极长分级制剂包括从0.8:1至5:1或从1:1至4:1的α-糖苷键与β-糖苷键比。在一些实施例中,分级的制剂具有约0.01与约0.2之间或约0.05与0.1之间的平均支化度。
在一些实施例中,约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约97%的聚糖制剂具有约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800g/mol且小于1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900和5000g/mol的平均分子量。
支化度
在一些实施例中,聚糖制剂(例如寡糖)的结构从线性跨度到高度支化。非分支聚糖可以只含有α键或只含有β键。非分支聚糖可以含有至少一个α键和至少一个β键。分支聚糖可以含有至少一个通过α或β糖苷键连接以形成分支的聚糖单元。支化率或支化度(DB)可以不同,使得约每第2个、第3个、第4个、第5个、第6个、第7个、第8个、第9个、第10个、第15个、第20个、第25个、第30个、第35个、第40个、第45个、第50个、第60个、或第70个单元包括至少一个分支点。例如,动物糖原约每10个单元含有一个分支点。
在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中该制剂包括分支聚糖的混合物,其中平均支化度(DB,每个残基的分支点)是0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.99、1或2。在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中平均支化度是至少0.01、0.05、0.1、0.2、0.3或至少0.4。在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中平均支化度在约0.01与0.1之间、0.01与0.2之间、0.01与0.3之间、0.01与0.4之间或0.01与0.5之间。在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中平均支化度在约0.05与0.1之间、0.05与0.2之间、0.05与0.3之间、0.05与0.4之间或0.05与0.5之间。在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中平均支化度在约0.1与0.2之间、0.1与0.3之间、0.1与0.4之间或0.1与0.5之间。在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中平均支化度不是0。在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中平均支化度不在至少0.1与小于0.4之间或至少0.2与小于0.4之间。在一些实施例中,聚糖制剂包括线性聚糖。在一些实施例中,聚糖制剂包括具有分支或枝上枝结构的聚糖,例如,分支聚糖(例如像,分支寡糖和/或分支多糖)。
在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中平均支化度(DB)不是0,而是至少0.01、0.05、0.1或至少0.2、或范围在约0.01与约0.2之间或在约0.05与0.1之间。
糖苷键
对于包括一种或多种糖(例如,单糖、二糖等)的化合物而言,两个聚糖单元之间的键(linkage或bond)可以表示为例如1,4、1->4或(1-4),可互换使用,且在本文中称为糖苷键。单糖可以是环状形式(例如吡喃糖或呋喃糖形式)。例如,乳糖是由环状形式的通过β(1-4)键连接的半乳糖和葡萄糖组成的二糖,其中缩醛氧桥呈β取向。
见于聚糖制剂的单个聚糖单元之间的键(linkage或bond)可以包括α1->2、α1->3、α1->4、α1->6、α2->1、α2->3、α2->4、α2->6、β1->2、β1->3、β1->4、β1->6、β2->1、β2->3、β2->4和β2->6中的一个或多个(例如,两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个等)。
在一些实施例中,聚糖制剂包括选自下组的α-糖苷键和β-糖苷键,该组由以下各项组成:1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键、1->5糖苷键和1->6糖苷键。在一些实施例中,聚糖制剂包括至少两个或至少三个α和β1->2糖苷键、α和β1->3糖苷键、α和β1->4糖苷键、α和β1->5糖苷键和/或α和β1->6糖苷键。
在一些实施例中,聚糖制剂只包含α键。在一些实施例中,聚糖只包含β键。在一些实施例中,聚糖制剂包括α键和β键的混合物。
在一些实施例中,制剂中的α:β糖苷键比是约0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.2:1、1.5:1、1.7:1、2:1、2.2:1、2.5:1、2.7:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或约10:1。
在一些实施例中,聚糖制剂在制剂中包括约0.8:1、1:1、2:1、3:1、4:1或5:1的α:β糖苷键比,或范围是从约0.8:1至约5:1或从约1:1至约4:1。
在一些实施例中,聚糖制剂(例如寡糖)的制剂包括基本上所有α构型的或β构型的聚糖单元,任选地包括约1%、2%、3%、4%5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、或20%的对应的另一构型。
在一些实施例中,聚糖制剂的制剂包括至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、至少99.9%或甚至100%的具有α糖苷键的聚糖。在一些实施例中,聚糖制剂包括至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、至少99.9%或甚至100%的具有β糖苷键的聚糖。在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、或至少85%的聚糖具有为α糖苷键的糖苷键,至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、或至少85%的聚糖具有为β糖苷键的糖苷键,且其中α和β糖苷键的百分比不超过100%。
在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、至少99.9%或甚至100%的聚糖糖苷键是以下中的一个或多个:1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键和1->6糖苷键。在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、至少20%、或25%的聚糖糖苷键各自是1->2、1->3、1->4和1->6糖苷键。任选地,聚糖制剂还包括至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、或至少85%的选自下组的聚糖糖苷键,该组由以下各项组成:α2->1、α2->3、α2->4、α2->6、β2->1、β2->3、β2->4和β2->6糖苷键。
在一些实施例中,聚糖制剂包括具有至少两个选自下组的糖苷键的聚糖:α1->2和α1->3、α1->2和α1->4、α1->2和α1->6、α1->2和β1->2、α1->2和β1->3、α1->2和β1->4、α1->2和β1->6、α1->3和α1->4、α1->3和α1->6、α1->3和β1->2、α1->3和β1->3、α1->3和β1->4、α1->3和β1->6、α1->4和α1->6、α1->4和β1->2、α1->4和β1->3、α1->4和β1->4、α1->4和β1->6、α1->6和β1->2、α1->6和β1->3、α1->6和β1->4、α1->6和β1->6、β1->2和β1->3、β1->2和β1->4、β1->2和β1->6、β1->3和β1->4、β1->3和β1->6以及β1->4和β1->6。
对于包括含侧链的分支聚糖制剂(例如DB为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.99、1或2的那些)的制剂,它们可以是相同或不同的侧链,该侧链可以通过一个或多个β和α键,诸如(1-2)、(1-3)、(1-4)、(1-6)、(2-3)、(2-6)或其他合适的键附接至主链。
聚糖单元
在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中至少一个聚糖单元是L型糖。在一些实施例中,提供了聚糖的制剂,其中至少一个聚糖单元是D型糖。在一些实施例中,提供了聚糖的制剂,其中聚糖单元是L型或D型糖,因为它们是天然存在的或更常见(例如D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖)。
在一些实施例中,聚糖制剂(例如寡糖)包括例如期望比率的L型和D型聚糖单元的期望混合物,诸如:1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:100、1:150的L型比D型或D型比L型。
在一些实施例中,聚糖制剂包括具有基本上所有L型或D型聚糖单元的聚糖,任选地包括约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的对应的另一形式。
在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中至少一个聚糖单元是二糖、三糖、四糖、戊糖、己糖或庚糖。任选地,参与形成聚糖的聚糖单元不同。单糖聚糖单元的实例包括己糖,诸如葡萄糖、半乳糖、和果糖,以及戊糖,诸如木糖。单糖聚糖单元可以无环(开链)形式存在。具有相同分子图的开链单糖可以作为两种或更多种立体异构体存在。单糖也可以通过羰基基团与同一分子中的一个羟基之间的亲核加成反应以环状形式存在。该反应产生由一个桥联氧原子封闭的碳原子的环。在这些环状形式中,该环通常具有5(呋喃糖)或6个原子(吡喃糖)。
在一些实施例中,聚糖制剂(例如寡糖)包括任何期望比率的不同单糖聚糖单元的期望混合物,诸如二糖、三糖、四糖、戊糖、己糖或庚糖的混合物,包括两种或更多种戊糖(例如,阿拉伯糖和木糖)的任何混合物以及两种或更多种己糖(例如,葡萄糖和半乳糖)的混合物,例如对于任何两种聚糖单元:1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:100、1:150等,对于任何三种聚糖单元:1:1:1、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:6:1、1:7:1、1:8:1、1:9:1、1:10:1、1:12:1、1:14:1、1:16:1、1:18:1、1:20:1、1:1:2、1:2:2、1:3:2、1:4:2、1:5:2、1:6:2、1:7:2、1:8:2、1:9:2、1:10:2、1:1:3、1:2:3、1:3:3、1:4:3、1:5:3、1:6:3、1:7:3、1:8:3、1:9:3、1:10:3、1:1:4、1:2:4、1:3:4、1:4:4、1:5:4、1:6:4、1:7:4、1:8:4、1:9:4、1:10:4、1:1:5、1:2:5、1:3:5、1:4:5、1:5:5、1:6:5、1:7:5、1:8:5、1:9:5、1:10:5等,对于任何四种聚糖单元:1:1:1:1、1:2:2:1、1:3:2:1、1:4:2:1、1:5:2:1、1:6:2:1、1:7:2:1、1:8:2:1、1:9:2:1、1:10:2:1、1:1:1:2、1:2:2:2、1:3:2:2、1:4:2:2、1:5:2:2、1:6:2:2、1:7:2:2、1:8:2:2、1:9:2:2、1:10:2:2等,对于任何五种聚糖单元:1:1:1:1:1、1:2:2:1:1等,对于任何六种聚糖单元:1:1:1:1:1:1、1:1:1:1:1:2等,对于任何七种聚糖单元:1:1:1:1:1:1:1、1:1:1:1:1:1:2等,以此类推。
在一些实施例中,聚糖制剂包括两种、三种、四种或五种不同聚糖单元的期望混合物,诸如以下项的混合物,例如,i)一种或多种选自单糖的聚糖单元,这些单糖选自葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖和鼠李糖;ii)一种或多种选自二糖的聚糖单元,这些二糖选自acarviosin、n-乙酰氨基乳糖、异乳糖、纤维二糖、壳二糖、半乳糖-α-1,3-半乳糖、龙胆二糖、异麦芽、异麦芽糖、异麦芽酮糖、曲二糖、乳糖醇、乳糖酸、乳糖、乳果糖、昆布二糖、麦芽糖醇、麦芽糖、甘露二糖、蜜二糖、蜜二酮糖、新橙皮糖、黑曲霉糖、刺槐糖、芸香糖、山布双糖、槐糖、三氯蔗糖、蔗糖、乙酸异丁酸蔗糖酯、蔗糖八乙酸酯、海藻糖、松二糖、荚豆二糖和木二糖;iii)一种或多种选自氨基糖的聚糖单元,这些氨基糖选自阿卡波糖、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰塔罗糖胺糖醛酸、阿拉伯吡喃糖基-N-甲基-N-亚硝基脲、D-果糖-L-组氨酸、N-羟乙酰神经氨酸、酮胺、贵田霉素、甘露糖胺、1B-甲基硒基-N-乙酰-D-半乳糖胺、胞壁酸、胞壁酰二肽、磷酸核糖胺、PUGNAc、唾液酰-路易斯A、唾液酰-路易斯X、有效霉素、伏格列波糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、天门冬氨酰葡萄糖胺、巴利硫醇、六碳氨糖、红霉脱氧糖胺、果糖胺、半乳糖胺、葡萄糖胺、葡甲胺和过骨胺;iv)一种或多种选自脱氧糖的聚糖单元,这些脱氧糖选自1-5-脱水葡萄糖醇、克拉定糖、可立糖、2-脱氧-D-葡萄糖、3-脱氧葡糖醛酮、脱氧核糖、双脱氧核苷酸、毛地黄糖、氟脱氧葡萄糖、箭毒羊角拗糖和磺基鸡纳糖;v)一种或多种选自亚胺糖的聚糖单元,这些亚胺糖选自粟树精胺、1-脱氧野尻霉素、亚胺糖、米格列醇、美格鲁特和苦马豆素;一种或多种选自糖酸的聚糖单元,这些糖酸选自N-乙酰神经氨酸、N-乙酰塔罗糖胺糖醛酸、醛糖二酸、醛糖酸、3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸、葡糖醛酸、葡糖胺糖醛酸、甘油酸、N-羟乙酰神经氨酸、艾杜糖醛酸、异糖精酸、潘氨酸、唾液酸、苏糖酸、酮糖酸、糖醛酸、木糖酸、葡糖酸、抗坏血酸、酮脱氧辛酮糖酸、半乳糖醛酸、半乳糖胺糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖胺糖醛酸、酒石酸、粘酸、葡糖二酸、乳酸、草酸、琥珀酸、己酸、富马酸、马来酸、丁酸、柠檬酸、氨基葡萄糖酸、苹果酸、琥珀酰胺酸、癸二酸和癸酸;vi)一种或多种选自短链脂肪酸的聚糖单元,这些短链脂肪酸选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸;以及vii)一种或多种选自糖醇的聚糖单元,这些糖醇选自甲醇、乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿糖醇、核糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨醇、半乳糖醇、艾杜醇、庚七醇、岩藻糖醇、肌醇、麦芽三糖醇、麦芽四糖醇和聚葡糖醇。
在一些实施例中,聚糖制剂不包括聚葡萄糖。
在一些实施例中,聚糖制剂包括呈盐形式(例如,药学上可接受的盐形式)的一种聚糖单元或多种聚糖单元,例如像,盐酸盐、氢碘酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、甲烷磺酸盐、乙酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐、丙酮酸盐、富马酸盐、丙酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐。
示例性聚糖通过代表单体糖组分的三字母代码随后是反映单体构成的材料的百分比的百分数来描述。因此,‘glu100’归于由100%D-葡萄糖(聚糖单元)输入产生的聚糖,并且‘glu50gal50’归于由50%D-葡萄糖和50%D-半乳糖(聚糖单元)输入或可替代地乳糖二聚体(聚糖单元)输入产生的聚糖。如本文所用,xyl=D-木糖;ara=L-阿拉伯糖;gal=D-半乳糖;glu=D-葡萄糖;rha=L-鼠李糖;fuc=L-岩藻糖;man=D-甘露糖;sor=D-山梨醇;gly=D-甘油;neu=NAc-神经氨酸。
在一些实施例中,聚糖制剂包括一种选自以上i)至vii)的聚糖单元A,其中聚糖单元A包括100%的聚糖单元输入。例如,在一些实施例中,聚糖制剂选自均聚糖xyl100、rha100、ara100、gal100、glu100和man100。在一些实施例中,聚糖制剂选自均聚糖fuc100和fru100。在一些实施例中,聚糖制剂包括man100。
在一些实施例中,聚糖制剂包括两种独立地选自以上i)至vii)的聚糖单元A和B的混合物,其中A和B可以选自相同或不同的组i)至vii),且其中可以选择任何期望比率的A和B(例如1%-99%A和99%-1%B,不超过100%)。
例如,在一些实施例中,聚糖治疗性制剂选自杂聚糖ara50gal50、xyl75gal25、ara80xyl20、ara60xyl40、ara50xyl50、glu80man20、glu60man40、man60glu40、man80glu20、gal75xyl25、glu50gal50、man62glu38,以及混合聚糖glu90sor10和glu90gly10。
在一些实施例中,聚糖制剂包括三种独立地选自以上i)至vii)的聚糖单元A、B和C的混合物,其中A、B和C可以选自相同或不同的组i)至vii),且其中可以选择任何期望比率的A、B和C(例如1%-99%A、1%-99%B、1%-99%C,不超过100%)。
例如,在一些实施例中,聚糖治疗性制剂选自杂聚糖xyl75glu12gal12、xyl33glu33gal33、glu33gal33fuc33、man52glu29gal19,以及混合聚糖glu33gal33neu33。
在一些实施例中,聚糖制剂包括四种独立地选自以上i)至vii)的聚糖单元A、B、C和D的混合物,其中A、B、C和D可以选自相同或不同的组i)至vii),且其中可以选择任何期望比率的A、B、C和D(例如1%-99%A、1%-99%B、1%-99%C、1%-99%D,不超过100%)。
在一些实施例中,聚糖制剂包括五种独立地选自以上i)至vii)的聚糖单元A、B、C、D和E的混合物,其中A、B、C、D和E可以选自相同或不同的组i)至vii),且其中可以选择任何期望比率的A、B、C、D和E(例如1%-99%A、1%-99%B、1%-99%C、1%-99%D、1%-99%E,不超过100%)。
在一些实施例中,提供了聚糖制剂,其中至少一种聚糖单元选自下组,该组由以下各项组成:葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、和鼠李糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是葡萄糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是半乳糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是果糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是岩藻糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是甘露糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是阿拉伯糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是鼠李糖。在一个实施例中,该聚糖单元不是木糖。
在一些实施例中,聚糖制剂包括两种不同单糖聚糖单元的期望混合物,诸如以下项的混合物,例如,葡萄糖和半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖、葡萄糖和甘露糖、葡萄糖和果糖、葡萄糖和木糖、葡萄糖和岩藻糖、葡萄糖和鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖、半乳糖和果糖、半乳糖和木糖、半乳糖和岩藻糖、以及半乳糖和鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖、阿拉伯糖和果糖、阿拉伯糖和木糖、阿拉伯糖和岩藻糖、以及阿拉伯糖和鼠李糖、甘露糖和果糖、甘露糖和木糖、甘露糖和岩藻糖、以及甘露糖和鼠李糖、果糖和木糖、果糖和岩藻糖、以及果糖和鼠李糖、木糖和岩藻糖、木糖和鼠李糖、以及岩藻糖和鼠李糖等,例如比率为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90或1:100或其反比。
在一些实施例中,聚糖制剂(例如寡糖)包括三种不同单糖聚糖单元的期望混合物,诸如以下项的混合物,例如对于含葡萄糖的聚糖治疗性制剂,葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖;葡萄糖、半乳糖和甘露糖;葡萄糖、半乳糖和果糖;葡萄糖、半乳糖和木糖;葡萄糖、半乳糖和岩藻糖;葡萄糖、半乳糖和鼠李糖;葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖;葡萄糖、阿拉伯糖和果糖;葡萄糖、阿拉伯糖和木糖;葡萄糖、阿拉伯糖和岩藻糖;葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖;葡萄糖、甘露糖和果糖;葡萄糖、甘露糖和木糖;葡萄糖、甘露糖和岩藻糖;葡萄糖、甘露糖、鼠李糖;葡萄糖、果糖和木糖;葡萄糖、果糖和岩藻糖;葡萄糖、果糖和鼠李糖;葡萄糖、岩藻糖和鼠李糖等,例如比率为1:1:1、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:6:1、1:7:1、1:8:1、1:9:1、1:10:1、1:12:1、1:14:1、1:16:1、1:18:1、1:20:1、1:1:2、1:2:2、1:3:2、1:4:2、1:5:2、1:6:2、1:7:2、1:8:2、1:9:2、1:10:2、1:1:3、1:2:3、1:3:3、1:4:3、1:5:3、1:6:3、1:7:3、1:8:3、1:9:3、1:10:3、1:1:4、1:2:4、1:3:4、1:4:4、1:5:4、1:6:4、1:7:4、1:8:4、1:9:4、1:10:4、1:1:5、1:2:5、1:3:5、1:4:5、1:5:5、1:6:5、1:7:5、1:8:5、1:9:5、1:10:5等。
在一些实施例中,提供了聚糖治疗剂的制剂,其中至少一种聚糖单元是呋喃糖。在一些实施例中,提供了聚糖的制剂,其中至少一种聚糖单元是吡喃糖。在一些实施例中,聚糖治疗剂包括呋喃糖和吡喃糖的混合物。在一些实施例中,制剂中呋喃糖:吡喃糖比率是约0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.2:1、1.5:1、1.7:1、2:1、2.2:1、2.5:1、2.7:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、或约10:1。
在一些实施例中,聚糖制剂(例如寡糖)包括例如期望比率的呋喃糖和吡喃糖的期望混合物,诸如:1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:100、1:150的呋喃糖比吡喃糖或吡喃糖比呋喃糖。
在一些实施例中,聚糖制剂基本上全部包括呋喃糖或吡喃糖,任选地包括1%、2%、3%、4%5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、或20%的对应的另一种糖。
在一些实施例中,聚糖制剂在制剂中包括基本上全部吡喃糖以及不超过约0.1%、02%、0.5%、1%、2%、3%、4%、或不超过5%呋喃糖形式的单体聚糖单元。在一些实施例中,制剂中不超过3%、2%或不超过1%的单体聚糖单元处于呋喃糖形式。
在一些实施例中,聚糖制剂不包括N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰葡萄糖胺。在一些实施例中,聚糖制剂不包括神经氨酸。在一些实施例中,聚糖的制剂不包括唾液酸。在一些实施例中,聚糖制剂不包括脂质和脂肪酸。在一些实施例中,聚糖制剂不包括氨基酸。在一些实施例中,聚糖制剂不包括山梨醇。在一些实施例中,聚糖制剂不包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖。在一些实施例中,聚糖制剂不包括可检测的重复单元。在一些实施例中,聚糖制剂不包括统计上显著量的重复单元。在一些实施例中,重复单元具有至少2、3、4、5或至少6个聚糖单元的DP。例如,透明质酸是糖胺聚糖,重复二糖单元由两种葡萄糖衍生物(葡糖醛酸盐(葡糖醛酸)和N-乙酰葡萄糖胺)组成。糖苷键是β(1->3)和β(1->4)。纤维素是用通过β-键连接在一起的重复葡萄糖单元制成的聚合物。可以例如通过使用完全水解(例如测定聚糖单元比例)、甲基化分析(例如测定键类型分布)和HSQC(例如测定α-糖苷和β-糖苷的分布)测定重复单元的存在和量。本领域的技术人员已知测定显著性的统计方法。
如果需要,聚糖的单糖或寡糖聚糖单元被进一步取代或衍生化,例如,羟基基团可以被醚化或酯化。例如,聚糖(例如寡糖)可以含有修饰的糖单元,诸如其中的羟基基团被去除的2'-脱氧核糖、其中的羟基基团被氟替换的2'-氟核糖、或N-乙酰葡萄糖胺(一种葡萄糖的含氮形式)(例如,2'-氟核糖、脱氧核糖和己糖)。取代度(DS,每个糖基单元的平均羟基基团数目)可以是1、2或3或另一个合适的DS。在一些实施例中,1%、2%、3%、4%5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的聚糖单元被取代或衍生化。在一些实施例中,亚单元间的取代度有所差异,例如,某一比例未衍生化,展示1的DS,展示2的DS,或展示3的DS。可以产生任何期望的混合物,例如0-99%的亚单元未衍生化,0-99%的亚单元展现1的DS,0-99%的亚单元展现2的DS,0-99%的亚单元展现3的DS,总体构成100%。可以通过调整加入糖基部分中的取代基的平均摩尔数控制取代度(摩尔取代度(MS))。可以通过调整反应条件、试剂类型和取代程度控制取代基沿着聚糖寡糖和多糖链长度的分布。在一些实施例中,单体亚单元被乙酸酯、硫酸半酯、磷酸酯或丙酮酸环缩醛基团中的一个或多个取代。
溶解度
在一些实施例中,聚糖治疗性制剂高度支化,例如具有至少0.01、0.05或0.1的平均DB。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂具有约0.01至约0.05、0.01至0.1、0.05至0.1、或约0.1至约0.2的平均DB。在一些实施例中,包括分支寡糖的聚糖治疗性制剂高度可溶。在一些实施例中,可以在23℃下将聚糖治疗性制剂浓缩到至少55Brix、65Brix、60Brix、65Brix、70Brix、75Brix、80Brix、或至少85Brix,而不会观察到明显固化或结晶(最终溶解度极限)。在一些实施例中,可以将聚糖治疗性制剂浓缩至约50-60Brix、60-70Brix、70-80Brix、55-65Brix、65-75Brix或至约75-85Brix。在一些实施例中,可以在23℃下将聚糖治疗性制剂浓缩至约50、55、60、65、70、75、80或约85Brix,而不会观察到明显固化或结晶(最终溶解度极限)。
在一些实施例中,可以在23℃下将聚糖治疗性制剂浓缩到至少约0.5g/ml、1g/ml、1.5g/ml、2g/ml、2.5g/ml、3g/ml、3.5g/ml或至少4g/ml,而不会观察到明显固化或结晶(最终溶解度极限)。
在一些实施例中,聚糖治疗性制剂(例如寡糖)具有分支,例如具有至少0.01、0.05或0.1的平均DB,且在23℃下在水中具有至少约70Brix、75Brix、80Brix或至少约85Brix的最终溶解度极限,或者最终溶解度极限是至少约1g/ml、2g/ml或至少约3g/ml。
在一些实施例中,在去离子水中,或在合适的缓冲液(例如像,磷酸盐缓冲盐水,pH7.4或类似生理pH)中并且在20℃下,聚糖制剂具有至少0.001g/L、0.005g/L、0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、100g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L、600g/L、700g/L、800g/L、900g/L、1000g/L的最终溶解度极限。在一些实施例中,在去离子水中,或在合适的缓冲液(例如像,磷酸盐缓冲盐水,pH 7.4或类似生理pH)中并且在20℃下,聚糖制剂的溶解度大于50%、大于60%、大于70%、大于80%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%、或大于99.5%,并且在大于0.001g/L、0.005g/L、0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、100g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L、600g/L、700g/L、800g/L、900g/L、1000g/L的浓度下未观察到沉淀。
甜度
在一些实施例中,聚糖制剂具有期望的甜度。例如,蔗糖(调味糖)是甜味物质的标准。蔗糖在溶液中具有1的甜味感知评级,且其他物质相对于这个进行评级(例如,果糖被评定为蔗糖甜度的1.7倍)。在一些实施例中,聚糖制剂的甜度相对于蔗糖在从0.1至500,000的范围内。在一些实施例中,相对于蔗糖(蔗糖评分为一),相对甜度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、25000、50000、75000、100000、150000、200000、250000、300000、350000、40000、450000、500000或大于500,000。在一些实施例中,聚糖制剂具有中等甜度,或同时具有甜味和苦味。
在一些实施例中,聚糖制剂,例如基本上为DP2+或DP3+的制剂(例如至少80%、90%、或至少95%,或DP2+或DP3+的分级制剂)基本上无法感知到甜味,且相对于蔗糖(蔗糖评分为一),相对甜度是约0、0.0001、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或约0.9。
在一些实施例中,聚糖制剂具有一个或多个(例如,2、3、4、5或6个)以下(整体)特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,和/或
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限。
在一些实施例中,聚糖制剂中的分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.05与约0.6之间。
在一些实施例中,聚糖制剂的平均DP为以下之一:在约DP3和约DP15之间、在约DP3和约DP8之间、在约DP5和约DP10之间、或在约DP6和约DP18之间。
在一些实施例中,聚糖制剂的聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1和约5:1之间。
聚糖治疗性制剂的鉴定和表征
如果需要,聚糖治疗性制剂可以通过本领域已知的任何方法和本文所述的方法表征。
群体内聚合度(DP)为n(这里表示为DP(n))的种类的摩尔百分比是通过高效液相色谱法(HPLC),例如在Agilent 1260BioInert系列仪器上测定,该仪器配备有折射率(RI)检测器和各种本领域技术人员熟悉的柱,使用水作为流动相。从最佳地分离感兴趣的种类的化学方法中选择柱,包括HILIC、金属配位和水性尺寸排阻色谱法。摩尔%DP(n)是通过以下公式测算:
%DP(n)=100*AUC[DP(n)]/AUC[DP(总)],
其中将AUC定义为感兴趣种类的曲线下面积,如通过针对已知标准进行校准来测定。糖苷键异构体的摩尔百分比(%α和%β)是通过核磁共振(NMR)光谱法,使用本领域技术人员熟悉的各种2D技术测定。α-异构体和β-异构体可以例如通过NMR光谱上的不同位移加以区分,且摩尔百分比是通过以下公式测算:
%(糖苷异构体n)的糖苷键=
100*AUC[位移(异构体n)]/AUC[位移(异构体α+异构体β)],
其中将AUC定义为已知代表期望异构体n的特定位移值下的曲线下面积。区域化学异构体的摩尔百分比是以类似方式,用以下公式测算:
%(区域异构体n)的区域异构体=100*AUC[位移(区域异构体n)]/
AUC[位移(所有区域异构体)]。
构成寡聚群体的单体糖的相对百分比是通过例如寡聚样品的总酸消化,随后转化为多羟糖醇乙酸酯,随后以气相色谱(GC)分析所得单体溶液,与已知标准的GC相比来测定。单体(n)(其中n可以是任何糖)的摩尔百分比通过以下公式测算:
%(糖n)=100*AUC[糖n]/AUC[所有单体糖全部]。
在一些实施例中,聚糖制剂的溶解度可以通过例如选择聚糖单元的电荷、结构(例如DP、支化度)和/或衍生化来控制。
对于聚糖治疗性制剂,单体构建块(例如单糖或聚糖单元组成)、侧链的异头构型、取代基基团的存在和位置、聚合度/分子量和连接模式可以通过本领域已知的标准方法鉴定,例如像甲基化分析、还原裂解、水解、GC-MS(气相色谱-质谱法)、MALDI-MS(基质辅助激光解吸/电离-质谱法)、ESI-MS(电喷雾电离-质谱法)、HPLC(高效液相色谱法-紫外或折射率检测)、HPAEC-PAD(高效阴离子交换色谱法-脉冲安培检测)、CE(毛细管电泳)、IR(红外)/拉曼光谱法和NMR(核磁共振)光谱技术。对于晶体一致的聚合物,晶体结构可以利用例如固态NMR、FT-IR(傅里叶变换红外光谱法)和WAXS(广角X射线散射)解决。DP、DP分布和多分散性可以通过例如粘度测量法和SEC(SEC-HPLC、高效尺寸排阻色谱法)测定。外来基团、末端基团和取代基可以例如利用SEC-标记、水相分析法、MALDI-MS、FT-IR和NMR鉴定。为鉴定聚糖的单体组分,可以使用例如像酸催化水解、HPLC(高效液相色谱法)或GLC(气液色谱法)(转化为多羟糖醇乙酸酯之后)等方法。为测定聚糖中存在的键,在一个实例中,用碘甲烷和强碱在DMSO中使多糖甲基化,进行水解,还原为部分甲基化的糖醇,使甲基化多羟糖醇乙酸酯乙酰化,并通过GLC/MS(气液色谱法外加质谱法)进行分析。在一些实施例中,为测定多糖序列,用酸或酶进行部分解聚,以测定结构。将多糖的可能结构与水解寡聚物的那些进行比较,并测定可能的结构中哪一种可以产生这些寡聚物。为鉴定异头构型,在一个实例中,使完整的多糖或寡糖的制剂经历酶促分析,例如使它们与对特定类型键具有特异性的酶(例如,β-半乳糖苷酶或α-葡糖苷酶等)接触,并且可以使用NMR来分析产物。
例如,聚糖治疗性制剂的(或平均)聚合度(DP)的分布可以通过将浓度为例如10-100mg/mL的样品注射到配备有7.8x300 mm BioRad Aminex HPX-42A柱(或类似柱)和RI检测器的Agilent 1260BioPure HPLC(或类似仪器)上来测定,如例如Gómez等人(Purification,Characterization,andPrebiotic Properties of PecticOligosaccharides from Orange Peel Wastes[来自橙皮废料的果胶聚糖的纯化、表征和益生特性],J Agric Food Chem[农业与食品化学杂志],2014,62:9769)中所述。可替代地,可以将一定浓度的样品注射到配备有4x250 mm Dionex CarboPac PA1柱(或类似柱)和PAD检测器的Dionex ICS5000 HPLC(或类似仪器)中,如例如Holck等人(Feruloylated andnonferuloylated arabino-oligosaccharides from sugar beet pectin selectivelystimulate the growth of bifidobacterium spp.in human fecal in vitrofermentations[来自甜菜果胶的阿魏酰基化和非阿魏酰基化阿拉伯糖寡糖选择性刺激人体粪便体外发酵中的双歧杆菌属的生长],Journal of Agricultural and FoodChemistry[农业与食品化学杂志],2011,59(12),6511–6519)中所述。相比于寡聚物的标准溶液,所得光谱的整合允许测定平均DP。
可以例如通过MALDI质谱法测定分子量的分布。可以用Mettler-Toledo糖折射计(或类似仪器)测定寡糖浓度,最终值针对标准曲线进行调整,以解释单体与寡聚物之间的折射差异。
糖苷区域化学的分布可以通过例如各种2D-NMR技术(包括COSY、HMBC、HSQC、DEPT和TOCSY分析),使用标准脉冲序列和Bruker 500MHz光谱仪表征。可以使天然存在的多糖的光谱与已知区域化学相关联来分配峰。
在一些实施例中,样品的相对峰分配取决于多种因素,包括样品的浓度和纯度、溶剂的身份和品质(例如,同位素标记的溶剂)和采用的脉冲序列。因此,在实施例中,例如,当因为所述因素在相似条件下获得NMR光谱时,包括葡萄糖的聚糖的相对峰分配可能变化(例如,变化约0.01ppm、约0.02ppm或约0.05ppm)。在如本文所用的这些实例中,术语“对应峰”(“corresponding peak”或“corresponding peaks”)是指与相同样品相关联但因为以下原因而变化的NMR峰(例如,变化约0.01ppm、约0.02ppm或约0.05ppm),包括例如样品的浓度和纯度、同位素标记的溶剂的身份和品质和采用的脉冲序列。
寡聚物的单体组成可以例如通过竞争性水解方法测量,其中在升高的温度下将已知量的寡聚物溶解在强酸中,并允许有足够时间发生完全水解。然后可以通过本文所述的和本领域已知的HPLC或GC方法测量个别单体的浓度,以实现相对丰度测量,如在Holck等人中。可以通过给HPLC样品添加已知量的检测器活性标准测量绝对量,该检测器活性标准经选择以防止与任何关键信号重合。
任何给定群体的支化度可以通过例如Hakomori(J.Biochem.[生物化学杂志](东京),1964,55,205)建立的甲基化分析方法来测量。利用这些数据,可以通过组合来自完全水解、平均DP和甲基化分析的数据,并且将其与DEPT NMR光谱比较来鉴定潜在重复单元。异头碳信号的数量与这些数据的相关性指示是否需要常规重复单元来满足收集的数据,如例如Harding等人(Carbohydr.Res.[碳水化合物研究]2005,340,1107)所展示的。
可以利用一个、两个、三个或四个以下参数鉴定聚糖制剂(例如包括单糖或二糖聚糖单元的那些,诸如葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、和甘露糖):a)存在2、3、4、5、6、7个或更多个(例如至少4个或5个)诊断异头NMR峰,每个峰表示不同的糖苷键类型,b)α-键与β-键比率在约0.8:1和约5:1之间(例如在约1:1与4:1之间,通常有利于α键类型),c)至少2种或至少3种不同糖苷区域化学来自以下清单:1,2-;1,3-;1,4-;和1,6-取代,和至少2种或至少3种不同糖苷区域化学来自以下清单:1,2,3-;1,2,4-;1,2,6-;1,3,4-;1,3,6-;和1,4,6-取代,和d)DP分布,其中至少50%、60%、70%或至少80%的单个种类具有至少2、至少3、3与30之间或5与25之间的DP。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂具有不同于天然存在的寡糖制剂的平均特性(例如,DP、DB、α:β糖苷键比)。这些结构特征可以通过本领域已知的任何合适方法和本文所述的那些来分析且任选地量化。本文所述的聚糖治疗性制剂具有至少一个、两个、三个、四个或至少五个以下特征:
(i)分子量的分布在例如从约DP3至约DP30、约DP2至约DP30、约DP2至约20、约DP2至约DP10、约DP3至约DP20、约DP3至约DP10或从约DP5至约DP25的范围内,它们可以通过定量质谱法测量、SEC-HPLC、IAC-HPLC或IEC-HPLC鉴定;
(ii)大比例的α和β键两者,键比率例如在从0.8:1、1:1、2:1、3:1、4:1至5:1的范围内(通常有利于α立体化学),它们可以通过各种NMR技术鉴定,包括允许明确区分和量化来自α和β糖苷的信号的HSQC脉冲序列。一些实施例的聚糖治疗性制剂中以观察到的比率存在α-糖苷键和β-糖苷键不同于天然存在的寡糖或多糖的制剂,它们通常有利于一种主要糖苷立体化学,且任选地只包括相对少量的相反立体化学;
(iii)存在至少一种、两种、三种或四种糖苷区域化学,它们可以通过Hakomori等人开发的指纹NMR方法或完全甲基化分支鉴定来鉴定。在一些实施例中,聚糖治疗行制剂具有至少0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、或至少10%的以下项中的一个、两个、三个或四个:1,2-;1,3-;1,4-和1,6-糖苷键类型。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂具有至少0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、或至少10%的以下项中的两个:1,2-;1,3-;1,4-和1,6-糖苷键类型。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂具有至少0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、或至少10%的以下项中的三个:1,2-;1,3-;1,4-和1,6-糖苷键类型。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂具有至少0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、或至少10%的以下项中的所有四个:1,2-;1,3-;1,4-和1,6-糖苷键类型。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂此外包括至少0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%或至少5%的分支键类型。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂包括至少0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%或至少5%的至少一种、两种或至少三种分支键类型,包括1,3,6-;1,4,6-;或1,2,4-糖苷。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂包括以下项中的至少两种分支键类型:1,3,6-;1,4,6-;或1,2,4-糖苷。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂包括至少0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%或至少5%的以下项中的三种分支键类型:1,3,6-;1,4,6-;或1,2,4-糖苷。在给定位置X没有羟基基团的糖将没有1,X-键类型,例如岩藻糖(6-脱羟基-半乳糖)将没有1,6-糖苷键,但将有1,2-;1,3-;和1,4-糖苷键。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂包括至少0.1%、02%、0.5%、1%、2%、或至少3%的呋喃糖形式的单体聚糖单元。一些实施例的聚糖治疗性制剂中存在大量糖苷区域化学和分支不同于通常有利于特定键构造的天然存在的寡糖或多糖的制剂。虽然已知所有这些区域化学出现在天然来源的寡糖中,但天然来源的寡糖的制剂不包括一些实施例的聚糖治疗性制剂展现的区域化学的数量和复杂性,
(iv)代表至少50%、60%、70%、80%或至少90%的所有可能的区域化学和立体化学的糖苷键的分布。个别地,区域化学分布可以通过分支分析测定,且立体化学分布可以通过NMR测定。HSQC-NMR。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂在异头区域中展现出多种多样的峰,这些峰与区域化学和立体化学两者的乘法组合相关联。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂包括以下项中的至少两个或至少三个:α-1,2-;α-1,3-;α-1,4-;和α-1,6-糖苷以及以下项中的至少两个或至少三个:β-1,2-;β-1,3-;β-1,4-;和β-1,6-糖苷。在一些实施例中,聚糖治疗性制剂包括以下项中的所有四个:α-1,2-;α-1,3-;α-1,4-;和α-1,6-糖苷以及以下项中的所有四个:β-1,2-;β-1,3-;β-1,4-;和β-1,6-糖苷。例如,glu100制剂的HSQC示出该制剂含有所有α-1,2-;α-1,3-;α-1,4-;和α-1,6-糖苷以及所有β-1,2-;β-1,3-;β-1,4-;和β-1,6-糖苷。在给定位置X没有羟基基团的糖将没有1,X-键类型,例如岩藻糖(6-脱羟基-半乳糖)将没有1,6-糖苷键,但将有1,2-;1,3-;和
1,4-糖苷键。
调节细菌分类群和微生物多样性的方法
本文提供了调节人类受试者的含粘膜组织非肠部位中的细菌分类群丰度的方法。本文还提供了调节含粘膜组织非肠部位中的微生物多样性的方法。这些方法包括将本文所述的聚糖制剂以有效调节该部位中的细菌分类群和/或微生物多样性的量和时间局部(例如直接)给予至该非肠部位(例如粘膜组织)。在一些实施例中,非肠部位是口腔、鼻腔或阴道。
阴道
在一些实施例中,提供了调节人类受试者的阴道中的细菌分类群丰度的方法。这些方法包括将本文所述的聚糖制剂以有效调节该细菌分类群的量和时间局部(例如直接)给予至阴道。
在一些实施例中,聚糖制剂调节(例如增加或降低)一种或多种(例如两种、三种、四种、五种或更多种)细菌分类群(例如像,最丰富的细菌分类群)的生长或相对丰度。在一些实施例中,阴道中的通过给予本文所述的聚糖制剂调节的细菌分类群是以下细菌属中的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种或更多种):放线菌属、棒状杆菌属、拟杆菌属、普氏菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、链球菌属、厌氧球菌属(Anaerococcus)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)和小杆菌属,它们是常见的阴道细菌分类群。
在一些实施例中,提供了调节阴道中一种或多种乳杆菌的方法,这些方法包括将本文所述的聚糖制剂例如局部给予至阴道。在一些实施例中,这一种或多种乳杆菌被认为与阴道健康有关,且包括以下项中的一种或多种(例如,两种、三种、四种或更多种):Lactobacillus coleohominis、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、惰性乳杆菌、詹氏乳杆菌和阴道乳杆菌。
在一些实施例中,聚糖治疗剂驱动阴道微生物群的组成和活性的选择性变化,从而赋予人类宿主健康益处。
在一些实施例中,健康益处包括减少疾病、障碍或病理状态的症状,例如像细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染、早产或流产的风险。在一些实施例中,该疾病、障碍或病理状态是细菌性阴道病(BV)。在一些实施例中,该疾病、障碍或病理状态是耐万古霉素肠球菌(VRE)感染或B组链球菌感染。
在某些条件下,能够引起疾病(例如,通过诱导感染和/或炎症和/或与疾病状态相关的细菌)但不一定是致病物的致病性物种和致病有机体存在于生态位中。在一些实施例中,提供了用于通过将本文所述的聚糖制剂给予至阴道来调节(例如降低)阴道疾病相关细菌、致病有机体或病原体丰度的方法。
在一些实施例中,疾病相关细菌、致病有机体或病原体包括以下项中的一种或多种:阴道加德纳菌、普氏菌属物种、卟啉单胞菌属物种、消化链球菌属物种、人支原体、和动弯杆菌属物种、梭杆菌属物种、阴道阿托波菌和屎肠球菌。
在一些实施例中,疾病相关细菌、致病有机体或病原体包括以下属中的一种或多种:放线菌属、气球菌属、阿托波菌属、拟杆菌属、棒状杆菌属、小杆菌属、伊格尔兹氏菌属(Eggerthella)、埃希氏菌属、加德纳菌属、嗜血杆菌属、纤毛菌属、利斯特菌属、巨型球菌属、支原体属、动弯杆菌属、奈瑟氏菌、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、纤毛菌属、葡萄球菌属、链球菌属、和脲原体属、和梭菌目(例如细菌性阴道病相关细菌-1(BVAB-1)、BVAB-2、和BVAB-3)。
在一些实施例中,疾病相关细菌、致病有机体或病原体包括以下物种中的一种或多种:克里斯腾森气球菌(Aerococcus christensenii)、阴道阿托波菌、解脲拟杆菌、阴道棒状杆菌、Dialister micraerophilus、大肠杆菌、阴道加德纳菌、流感嗜血杆菌、绵羊纤毛菌(Leptotrichia amnionii)、单核细胞增生利斯特菌、人支原体、淋病奈瑟氏菌、Peptoniphilus lacrimalis、不解糖卟啉单胞菌、Prevotella timonensis、Sneathiasanguinegens、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和尿素分解脲原体。
在一些实施例中,用于通过将本文所述的聚糖制剂给予至阴道来调节(例如降低)阴道疾病相关细菌、致病有机体或病原体丰度的方法包括调节(例如增加)一种或多种与阴道健康相关的细菌分类群(例如一种或多种乳杆菌)的丰度。
在一些实施例中,提供了用于通过将本文所述的聚糖制剂局部给予至阴道并调节(例如增加)一种或多种与阴道健康相关的细菌分类群(例如一种或多种乳杆菌)的丰度,并降低该部位中的细菌多样性来调节(例如降低)阴道中的细菌多样性的方法。
鼻腔
在一些实施例中,提供了调节人类受试者的鼻腔中的细菌分类群丰度的方法。这些方法包括将本文所述的聚糖制剂以有效调节细菌分类群的量和时间局部(例如直接)给予至鼻腔。
在一些实施例中,聚糖制剂调节(例如增加或降低)一种或多种(例如两种、三种、四种、五种或更多种)细菌分类群(例如像,最丰富的细菌分类群)的生长或相对丰度。在一些实施例中,鼻腔中的通过给予本文所述的聚糖制剂调节的细菌分类群是以下细菌物种中的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种或更多种):痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、拥挤棒状杆菌、结核硬脂酸棒状杆菌(Corynebacteriumtuberculostearicum)、假白喉棒状杆菌、诡诈分支杆菌(Mycobacterium fallax)、产黏棒状杆菌(Corynebacterium mucifaciens)、懒惰狡诈球菌(Dolosigranulum pigrum)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)和卡他莫拉氏菌,它们是常见的鼻分类群。在一些实施例中,鼻腔中的通过给予本文所述的聚糖制剂调节的细菌分类群是以下细菌属中的一种或多种:托米泰拉属(Tomitella)、嗜胨菌属、厌氧球菌属,它们是常见的鼻分类群。
在一些实施例中,提供了调节鼻腔中乳杆菌属(例如清酒乳杆菌)和葡萄球菌属(例如表皮葡萄球菌)细菌分类群中的一种或两种的方法,这些方法包括将本文所述的聚糖制剂例如局部给予至鼻腔。这些细菌分类群被认为与健康鼻腔相关。
在一些实施例中,聚糖制剂驱动鼻腔微生物群的组成和活性的选择性变化,从而赋予人类宿主健康益处。
在一些实施例中,健康益处包括减少疾病、障碍或病理状态的症状,例如像,鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖和哮喘。
在某些条件下,能够引起疾病(例如,通过诱导感染和/或炎症和/或与疾病状态相关的细菌)但不一定是致病物的致病性物种和致病有机体存在于生态位中。在一些实施例中,提供了用于通过将本文所述的聚糖制剂给予至鼻腔来调节(例如降低)鼻疾病相关细菌、致病有机体或病原体丰度的方法。
在一些实施例中,疾病相关细菌、致病有机体或病原体包括以下属中的一种或多种:棒状杆菌属、狡诈菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、嗜胨菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属和链球菌属。
在一些实施例中,疾病相关细菌、致病有机体或病原体包括以下物种中的一种或多种:拥挤棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、结核硬脂酸棒状杆菌、懒惰狡诈球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉氏菌、Peptoniphilus rhinitidis、痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌。
在一些实施例中,用于通过将本文所述的聚糖制剂给予至鼻腔来调节(例如降低)鼻疾病相关细菌、致病有机体或病原体丰度的方法包括调节(例如增加)一种或多种与鼻健康相关的细菌分类群(例如乳杆菌属(例如清酒乳杆菌)和葡萄球菌属(例如表皮葡萄球菌))的丰度。
在一些实施例中,提供了用于通过将本文所述的聚糖制剂局部给予至鼻腔并调节(例如增加)一种或多种与鼻健康相关的细菌分类群(例如清酒乳杆菌和/或葡萄球菌属)的丰度,并降低该部位中的细菌多样性来调节(例如降低)鼻腔中的细菌多样性的方法。
口腔
在一些实施例中,提供了调节人类受试者的口腔中的细菌分类群丰度的方法。这些方法包括将本文所述的聚糖制剂以有效调节细菌分类群的量和时间局部(例如直接)给予至口腔。
在一些实施例中,聚糖制剂调节(例如增加或降低)一种或多种(例如两种、三种、四种、五种或更多种)细菌分类群(例如像,最丰富的细菌分类群)的生长或相对丰度。在一些实施例中,口腔中的通过给予本文所述的聚糖制剂调节的细菌分类群是以下细菌属中的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种或更多种):放线菌属、棒状杆菌属、罗氏菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、孪生球菌属、颗粒链菌属、链球菌属、新月形单胞菌属、韦荣球菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、金氏菌属、奈瑟氏菌、嗜血杆菌属和奥里杆菌属(Oribacterium),它们在口腔中是常见的。
口腔(具体地说牙齿)中常见的口细菌分类群包括以下属:放线菌属、棒状杆菌属、罗氏菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、孪生球菌属、颗粒链菌属、链球菌属、新月形单胞菌属、韦荣球菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、金氏菌属、奈瑟氏菌和嗜血杆菌属。
口腔(具体地说嘴)中常见的口细菌分类群包括以下属:放线菌属、普氏菌属、卟啉单胞菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、链球菌属、韦荣球菌属、孪生球菌属、奥里杆菌属、新月形单胞菌属、颗粒链菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、嗜血杆菌属和奈瑟氏菌属。
在一些实施例中,提供了调节口腔中奈瑟氏菌属(包括例如,粘膜奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌和微黄奈瑟氏菌)、罗氏菌属(例如粘滑罗氏菌)、链球菌属(例如唾液链球菌)和韦荣球菌属(例如小韦荣球菌)细菌分类群中一个或多个的方法,这些方法包括将本文所述的聚糖制剂例如局部给予至口腔。这些细菌分类群被认为与健康口腔相关。
在一些实施例中,聚糖制剂驱动口腔微生物群的组成和活性的选择性变化,从而赋予人类宿主健康益处。
在一些实施例中,健康益处包括减少疾病、障碍或病理状态的症状,例如像龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体结石(tonsiloliths)、扁桃体炎、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。
在某些条件下,能够引起疾病(例如,通过诱导感染和/或炎症和/或与疾病状态相关的细菌)但不一定是致病物的致病性物种和致病有机体存在于生态位中。在一些实施例中,提供了用于通过将本文所述的聚糖制剂给予至口腔来调节(例如降低)口疾病相关细菌、致病有机体或病原体丰度的方法。
在一些实施例中,疾病相关细菌、致病有机体或病原体包括以下物种中的一种或多种:变异链球菌;远缘链球菌。
在一些实施例中,疾病相关细菌、致病有机体或病原体包括以下物种中的一种或多种:伴放线凝聚杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、牙龈卟啉单胞菌、直肠弯曲菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌、福赛斯坦纳菌和中间普氏菌(Prevotellaintermedia)。
在一些实施例中,疾病相关细菌、致病有机体或病原体包括以下物种中的一种或多种:戈氏放线菌、伴放线凝聚杆菌、微小阿托波菌(Atopobiumminitum)、极小阿托波菌(Atopobium parvulum)、龈裂阿托波菌(Atopobium rimae)、福氏拟杆菌、直肠弯曲菌、动物梭杆菌(Fusobacterium animalis)、具核梭杆菌、麻疹孪生球菌、口金氏菌(Kingellaoralis)、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、微小消化链球菌、普氏消化链球菌、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、生痰新月形单胞菌、有害新月形单胞菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、唾液链球菌、血链球菌、远缘链球菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体。
在一些实施例中,疾病相关细菌、致病有机体或病原体包括以下属中的一种或多种:韦荣球菌属、放线菌属、颗粒链菌属、纤毛菌属、硫单胞菌属、双歧杆菌属、普氏菌属、阿托波菌属、欧氏菌属(Olsenella)、Pseudoramibacter、丙酸杆菌属、和Selenemonas。
在一些实施例中,疾病相关细菌、致病有机体或病原体包括以下属中的一种或多种:放线菌属、凝聚杆菌属(Aggregatibacter)、阿托波菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、棒状杆菌属、小杆菌属、真细菌属、梭杆菌属、孪生球菌属、颗粒链菌属、金氏菌属、乳杆菌属、纤毛菌属、欧氏菌属、类斯氏菌属(Parascardovia)、消化链球菌属、普氏菌属、卟啉单胞菌属、丙酸杆菌属、Pseudoramibacter、Selenemonas、鞘氨醇单胞菌属、链球菌属、坦纳菌属、硫单胞菌属、密螺旋体属和韦荣球菌属。
在一些实施例中,用于通过将本文所述的聚糖制剂给予至口腔来调节(例如降低)口疾病相关细菌、致病有机体或病原体丰度的方法包括调节(例如增加)一种或多种与口健康相关的细菌分类群,例如奈瑟氏菌属(包括例如,粘膜奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌和微黄奈瑟氏菌)、罗氏菌属(例如粘滑罗氏菌)、链球菌属(例如唾液链球菌)和韦荣球菌属(例如小韦荣球菌)中一种或多种的丰度。
在一些实施例中,提供了用于通过将本文所述的聚糖制剂局部给予至口腔并调节(例如增加)一种或多种与鼻健康相关的细菌分类群(例如奈瑟氏菌属(包括例如,粘膜奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌和微黄奈瑟氏菌)、罗氏菌属(例如粘滑罗氏菌)、链球菌属(例如唾液链球菌)和韦荣球菌属(例如小韦荣球菌))的丰度,并降低该部位中的细菌多样性来调节(例如降低)口腔中的细菌多样性的方法。
粘膜组织的厚度可以根据解剖部位而变化。在一些实施例中,粘膜组织的厚度在0.5μm至约1cm之间(例如,在约1μm与约5mm、约10μm至约1mm、约50μm至约500μm或约100μm至约500μm之间)。
在一些实施例中,本文提供了作为基本上仅针对能够利用聚糖制剂作为食物来源的选定细菌群的底物的聚糖制剂。然后聚糖制剂的分解可以对宿主的健康发挥有益效果。在一些实施例中,有益的健康效果是因为选择性刺激非肠部位(例如,鼻腔、口腔和阴道)处的微生物群驻留地的选定数量的微生物分类群(例如,属、物种或菌株)的生长和/或生物活性,这些分类群能够利用聚糖制剂作为食物来源,并赋予宿主健康益处。在某些实施例中,聚糖制剂的效果是因为选择性刺激非肠部位中有益细菌的生长。在一些实施例中,有益细菌调节该部位的代谢物、信号传导因子、刺激物等,和/或超过生态位中的病原体或非期望细菌。某些分类群的丰度的这种增加和降低足以使驻留微生物群“标准化”,例如,以恢复健康状态或平衡。在某些实施例中,某些细菌或它们的相对丰度的比率可以变化。此类变化可以相对于例如局部给予聚糖制剂之前在受试者非肠部位中存在的比例,或相对于未将聚糖制剂给予至该部位的对照组来测量。可以在门、纲、科、属和/或种水平上,通过本领域已知的方法(包括16S rDNA基因测序、FISH、实时PCR和微阵列),利用本领域已知的特异性探针和/或引物测定非肠部位处的微生物群的组成。
在一些实施例中,聚糖制剂是一种或有限数量的驻留在非肠部位的潜在有益细菌的选择性底物,刺激其生长和/或代谢活性。在一些实施例中,聚糖制剂将非肠部位的微生物组成变成更富含或更缺少特定细菌的组成。在一些实施例中,聚糖治疗剂选择性刺激一种或多种与(例如该部位的)健康和(例如受试者的)安康相关的细菌的生长和/或选择性活性。
在一些实施例中,本文所述的聚糖制剂调节(例如刺激/增加或抑制/减少)一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、150、200种或超过200种)针对该部位的合适属或种的内生共生微生物、驻留病原体或致病有机体或外源给予的有益细菌的生长。外源给予的有益细菌可以包括那些被认为与如本文别处描述的健康(例如非生态失调)非肠部位相关的细菌。
在一些实施例中,本文所述的聚糖制剂调节(例如大幅增加或大幅减少)表4-7中针对各个非肠部位列出的分类群(例如,属、种或系统发育进化枝)中一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50种或超过50种)的生长(和总数量)(或大幅增加或大幅减少总细菌群落中的相对表示)(或大幅增加或大幅减少细菌群落中分类群的相对丰度)。
在一些实施例中,本文所述的聚糖制剂增加表4-7中针对各个非肠部位列出的分类群(例如,属、种或系统发育进化枝)中一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50种或超过50种)的生长(和总数量)(或大幅增加或大幅减少总细菌群落中的相对表示)(或大幅增加或大幅减少细菌群落中分类群的相对丰度)。
在一些实施例中,本文所述的聚糖制剂减少表4-7中针对各个非肠部位列出的分类群(例如,属、种或系统发育进化枝)中一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50种或超过50种)的生长(和总数量)(或大幅增加或大幅减少总细菌群落中的相对表示)(或大幅增加或大幅减少细菌群落中分类群的相对丰度)。
在一些实施例中,本文所述的聚糖制剂增加和减少表4-7中针对各个非肠部位列出的分类群(例如,属、种或系统发育进化枝)中一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50种或超过50种)的生长(和总数量)(或大幅增加或大幅减少总细菌群落中的相对表示)(或大幅增加或大幅减少细菌群落中分类群的相对丰度)。
表4列出了鼻腔的细菌分类群。表5-6分别列出了口腔(例如,牙齿和嘴)的细菌分类群。表7列出了阴道的细菌分类群。调节非肠细菌群落(例如鼻腔、口腔或阴道的细菌群落)的组成和代谢活性可以通过例如给予(例如,局部给予)以下项实现:i)只有聚糖制剂(诸如不存在外源给予的细菌),ii)聚糖制剂和一种或多种有益微生物,或iii)聚糖制剂、有益微生物与另一药剂(例如像治疗剂,例如像抗菌剂(例如抗生素)、抗炎剂等)的组合。在一些实施例中,为使内生共生微生物或外源给予的微生物的有益效果最大化,给予本文所述的聚糖制剂以刺激非肠部位中有利细菌的生长和/或活性。本发明的方面涉及选择性提高外源给予的有益微生物和/或驻留、共生或有益细菌的存活、生长和/或有效性(例如提供支持非肠部位中健康细菌群落的微生物代谢物或其他药剂(例如像,细菌素))的聚糖治疗剂。
健康微生物群落被认为通过提供增加的障碍来保护宿主,例如,通过竞争性排除潜在病原体或疾病相关细菌和通过抑制细菌病原体和疾病相关细菌生长。健康细菌群落可以通过生产抗菌物质(包括细菌素和酸(例如,在非肠部位充当抗菌剂的较低pH))对病原体和疾病相关细菌发挥直接抗菌效果(Cotter P D等人2005Nat Rev[自然综述]3:777-788;Servin A L,2004FEMS Microbiol Rev[FEMS微生物综述],28:405-440)。抗菌物质单独地或协同地发挥其作用以抑制病原体或疾病相关细菌生长。健康细菌群落可以减少病原体和其毒素粘附至非肠部位表面,例如像,粘膜表面。本文所述的一些方法包括给予聚糖治疗剂和外源有益细菌两者至受试者的非肠部位。
本文提供了调节(例如增加或减少)非肠部位(例如,鼻腔、口腔和阴道)的细菌成分的生长和/或抑制或转移驻留在非肠部位的病原体的包括聚糖制剂的组合物以及包括聚糖制剂和有益细菌或有益细菌的组合的组合物。
在一些实施例中,给予与共生体相比被目标病原体细菌更不有效地代谢的聚糖制剂。在此类实施例中,聚糖制剂经过选择以通常更有效地被非肠部位的常见共生体代谢。在此类实施例中,给予刺激/增加超过2、超过3、超过4、超过5、超过6、超过8、超过12、超过20、超过30个或更多个期望有益细菌分类群的生长的聚糖制剂。在一些此类实施例中,给予抑制/减少超过2、超过3、超过4、超过8、超过12、超过20、超过30个或更多个非期望疾病相关或有害细菌分类群的生长的聚糖制剂。
在一些实施例中,给予聚糖制剂减少炎症。在一些实施例中,给予聚糖制剂减少感染。本文所述的一些方法包括给予聚糖制剂和外源有益细菌两者至受试者的非肠部位。在一些实施例中,将聚糖制剂和有益外源细菌给予至口腔、鼻腔或阴道之一。可替代地或另外地,有益外源细菌任选地与聚糖治疗剂可以例如口服给予至受试者的肠道,例如,以调节免疫功能(例如上调/增加其活性或下调/降低其活性)。免疫功能的上调提高例如对抗感染的能力,而免疫功能的下调预防炎症。任选地,将聚糖制剂给予至肠道,以刺激肠上皮细胞反应,包括恢复受损上皮屏障、生产抗菌物质和细胞保护蛋白、和阻断细胞因子诱导的肠上皮细胞凋亡。这些反应中有许多是由刺激肠上皮细胞中特定细胞内信号传导途径引起的。可替代地或另外地,将聚糖制剂口服给予至非肠部位以调节局部炎症。
细菌可以引发来自宿主(哺乳动物)细胞的促炎和抗炎反应,并且不同的细菌物种可以引发不同的宿主反应。在一个实施例中,使用聚糖制剂来改变细菌群体以引发希望的宿主反应。宿主反应可以通过与细菌群体直接相互作用或通过分泌或流出的细菌产物(例如,短链脂肪酸)的间接相互作用来调节。聚糖制剂可以改变细菌群体,使得细菌群体在与宿主细胞直接或间接相互作用时刺激抗菌肽(AMP)生产,或调节炎性和免疫调节细胞因子(即,增加或减少其群体),包括白介素-1α(Il-1α)、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5,也称为RANTES)、转化生长因子β(TGF-β)、干扰素γ(IFN-γ),或者调节其他先天性或适应性免疫反应。
在一些实施例中,通过局部给予聚糖制剂至非肠部位腔调节非肠部位微生物群减少非肠部位(例如鼻腔、口腔或阴道)的炎症状态。
在一个实例中,在表现出慢性鼻窦炎的受试者中,疾病相关鼻微生物群促进炎症(Chalermwatanachai等人,The microbiome of the upper airways:focus on chronicrhinosinusitis[上呼吸道的微生物组:聚焦慢性鼻窦炎],World Allergy Organ J[世界过敏组织杂志],2015,8:3)。
在另一个实例中,在表现出牙龈炎和牙周炎的受试者中,疾病相关口微生物群促进局部和全身炎症(Seymour等人,Relationship between periodontal infections andsystemic disease[牙周感染与全身疾病间的关系],Clin Microbiol Infect[临床微生物与感染],2007,增刊4:3)。
在又另一个实例中,在表现出细菌性阴道病(BV)的受试者中,疾病相关阴道微生物群促进炎症。阴道炎症增加对性传播感染的敏感性和早产或流产风险(Anahtar等人,Cervicovaginal bacteria are a major modulator of host inflammatory responsesin the female genital tract[子宫颈阴道细菌是女性生殖道中宿主炎症反应的主要调节剂],Immunity[免疫力],2015,42:965;Lamont等人,The vaginal microbiome:newinformation about genital tract flora using molecular based techniques[阴道微生物组:利用分子基技术获得的生殖道菌群的新信息],BJOG,2011,118:533)。
在一些实施例中,通过口服给予聚糖制剂调节非肠部位的炎症状态。在一些实施例中,聚糖制剂在肠道中的细菌发酵产生短链脂肪酸(SCFA)。通过肠道微生物群产生的SCFA充当结肠上皮细胞的能量来源,且被认为有助于维持肠道屏障功能,这进而限制血浆内毒素水平,并预防全身炎症(Cani等人,Changes in gut microbiota controlinflammation in obese mice through a mechanism involving GLP-2-drivenimprovement of gut permeability[肠道微生物群的变化通过涉及GLP-2驱动的肠道渗透性提高的机制控制肥胖小鼠的炎症],Gut[肠道],2009,58:1091)。此外,SCFA促进产生调节T(Treg)细胞,且被认为在限制炎症反应中起作用(Arpaia等人,Metabolites produced bycommensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation[通过共生细菌产生的代谢物促进外周调节T细胞产生],Nature[自然],2013,504:451)。在一些实施例中,聚糖制剂是口服给予,任选地与将聚糖制剂给予至非肠部位组合以诱导例如SCFA和其他微生物产生的免疫调节分子或代谢物的全身效果,以调节远端部位(诸如非肠部位,例如,鼻腔、口腔和阴道)的炎症状态。
在一些实施例中,驻留细菌分类群的调节可以通过测量一种或多种标记来评估。这些标记包括例如:i)微生物群的变化,ii)环境的整体代谢,诸如生产某些代谢物,和iii)调节免疫系统,评估炎症和免疫球蛋白。
本文提供了用于调节(例如增加或减少)含粘膜组织非肠部位(例如像,口腔、鼻腔和阴道)中的微生物多样性的方法。这些方法可以包括将聚糖制剂局部给予至有需要的受试者的该部位,用量和时间段有效调节非肠部位中的微生物多样性。
微生物多样性可以通过本领域已知的任何合适方法测量,包括本文所述的分析16S rDNA序列。可以例如利用Shannon多样性指数(Shannon熵)、观察到的OTU数量、Chao1指数等表示多样性。在一些实施例中,聚糖制剂调节(例如增加或减少)微生物群落(例如非肠粘膜部位(例如,口腔、鼻腔或阴道)的微生物群落)内的多样性,这可以用Shannon熵作为量度来表示。
在一些实施例中,本文所述的聚糖治疗剂使微生物多样性和相关Shannon熵增加0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、50%、100%、500%、1000%、5000%、或10000%。在一些实施例中,本文所述的聚糖治疗剂使微生物多样性和相关Shannon熵增加1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
在一些实施例中,本文所述的聚糖治疗剂使微生物多样性和相关Shannon熵降低0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或99%或更多。在一些实施例中,本文所述的聚糖治疗剂使微生物多样性和相关Shannon熵降低1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
在一些实施例中,较低微生物多样性状态在非肠粘膜部位处是期望的,且提供了降低微生物多样性的方法。在一些实施例中,高细菌多样性与生态失调相关。
药物组合物和单位剂型
本文提供了适合局部给予至含粘膜组织非肠部位(例如像鼻腔、口腔和阴道)的药物组合物和剂型。药物组合物和剂型包括本文所述的聚糖制剂,且任选地还包括第二(或第三、第四等)治疗剂或活性化合物,诸如药剂、有益细菌、另一种活性剂等,和/或赋形剂,诸如药学上可接受的赋形剂。在一个实施例中,该药剂或化合物是微量营养素,诸如维生素、矿物质或多酚化合物。在一个实施例中,该药剂或化合物是治疗性药物。
本文所述的药物组合物和剂型可用于例如调节受试者的非肠组织中细菌分类群的丰度,调节受试者的非肠组织中的微生物多样性、调节受试者的非肠组织的pH,调节受试者的非肠组织的微生物代谢物(例如,挥发性脂肪酸)的图谱和/或治疗受试者的非肠组织中的生态失调。
本文所述的药物组合物和剂型可用于治疗非肠部位疾病、障碍或病理状态。
此类疾病、障碍或病理状态包括例如,对于口腔:龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体结石、扁桃体炎、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)、和真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。
此类疾病、障碍或病理状态包括例如,对于鼻腔:鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖和哮喘。
此类疾病、障碍或病理状态包括例如,对于阴道:细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染以及早产或流产的风险。
在一些实施例中,包括聚糖制剂的药物组合物不含益生物质。在一些实施例中,包括聚糖制剂的药物组合物不含有益细菌。
在一些实施例中,药物组合物包括xyl100、rha100、ara100、gal100、glu100、fuc100、fru100或man100的聚糖制剂。
在一些实施例中,药物组合物包括ara50gal50、xyl75gal25、ara80xyl20、ara60xyl40、ara50xyl50、glu80man20、glu60man40、man60glu40、man80glu20、gal75xyl25、glu50gal50、man62glu38,以及混合聚糖glu90sor10或lu90gly10的聚糖制剂。
在一些实施例中,药物组合物包括xyl75glu12gal12、xyl33glu33gal33、glu33gal33fuc33、man52glu29gal19,和混合聚糖glu33gal33neu33的聚糖制剂。
在一些实施例中,药物组合物包括xyl100、ara100、gal100、glu100和man100的聚糖制剂。
在一些实施例中,药物组合物包括xyl75ara25、glu80man20、glu60man40、man60glu40、man80glu20、man80gal20、man66gal33和glu50gal50的聚糖制剂。
在一些实施例中,药物组合物包括glu33gal33fuc33和man52glu29gal19的聚糖制剂。
在一些实施例中,包括聚糖制剂的药物组合物(和包括聚糖制剂的试剂盒)包括一种或多种脂肪酸。在一些实施例中,脂肪酸包括短链脂肪酸(SCFA)、中链脂肪酸(MCFA)、长链脂肪酸(LCFA)或极长链脂肪酸(VLCFA)。在一些实施例中,短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、或辛酸。在一些实施例中,脂肪酸包括饱和或不饱和脂肪酸。
在一些实施例中,包括聚糖制剂的药物组合物(和包括聚糖制剂的试剂盒)包括一种或多种肽,例如,二肽、三肽、四肽或五肽、六肽或其他长度的肽。
在一些实施例中,包括聚糖制剂的药物组合物(和包括聚糖制剂的试剂盒)包括一种或多种微量营养素。在一些实施例中,微量营养素选自下组,该组由以下各项组成:微量矿物质、胆碱、维生素和多酚。
在一些实施例中,微量营养素是微量金属。适合作为微量营养素的微量矿物质包括硼、钴、铬、钙、铜、氟、碘、铁、镁、锰、钼、硒和锌。
在一些实施例中,微量营养素是维生素。适合作为微量营养素的维生素包括维生素B复合物、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸)、维生素B5(泛酸)、B6族维生素组(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)、维生素B7(生物素)、维生素B8(一磷酸腺苷(ergadenylic acid))、维生素B9(叶酸)、维生素B12(氰钴胺)、胆碱、维生素A(视黄醇)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D、维生素E(生育酚)、维生素K、类胡萝卜素(α胡萝卜素、β胡萝卜素、隐黄质、叶黄素、番茄红素)和玉米黄质。
在一些实施例中,微量营养素是多酚。多酚是特征为具有至少一个有一个或多个羟基基团的芳族环的化学化合物或分子。在一些实施例中,多酚是合成多酚或天然存在的多酚。在一些实施例中,多酚是天然存在的多酚且源自植物来源材料。
在一些实施例中,多酚是类黄酮或儿茶素。在一些实施例中,类黄酮或儿茶素选自花青素、查耳酮、二氢查耳酮、二氢黄酮醇、黄烷醇、黄烷酮、黄酮、黄酮醇和异黄酮。在一些实施例中,多酚是木脂素。
在一些实施例中,多酚选自烷基甲氧基酚、烷基酚、姜黄素、呋喃香豆素、羟基苯甲醛、羟基苯并酮、羟基肉桂醛、羟基香豆素、羟基苯基丙烯、甲氧基苯酚、萘醌、酚萜和酪醇。在一些实施例中,多酚是单宁或单宁酸。
在一些实施例中,多酚选自羟基苯甲酸、羟基肉桂酸、羟基苯基乙酸、羟基苯基丙酸和羟基苯基戊酸。在一些实施例中,多酚是芪。
在一些实施例中,包括本文所述的聚糖制剂的药物组合物还包括益生物质或其制剂。
益生元包括各种基于半乳聚糖和碳水化合物的树胶,诸如欧车前、瓜尔胶、角叉菜胶、结冷胶、乳果糖、和魔芋。在一些实施例中,益生元是以下项中的一种或多种:低聚半乳糖(GOS)、乳果糖、棉子糖、水苏糖、乳果糖、低聚果糖(FOS,例如果寡糖或寡果聚糖)、菊粉、异麦芽寡糖、木寡糖(XOS)、帕拉金糖(paratinose)寡糖、异麦芽糖寡糖(IMOS)、转半乳糖苷化寡糖(例如转半乳糖基-寡糖)、转半乳糖苷化二糖、大豆寡糖(例如大豆寡糖)、壳聚糖寡糖(chioses)、龙胆寡糖、大豆和果胶寡糖、葡萄糖寡糖、果胶寡糖、帕拉金糖缩聚物、二果糖酐III、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖醇、多元醇、聚葡萄糖、线性和分支葡聚糖、普鲁兰(pullalan)、半纤维素、还原帕拉金糖、纤维素、β-葡萄糖、β-半乳糖、β-果糖、毛蕊花糖、甜菜苷、木聚糖、菊粉、壳聚糖、β-葡聚糖、瓜尔胶、阿拉伯胶、果胶、高海藻酸钠、和λ角叉菜胶或其混合物。
在一些实施例中,包括聚糖制剂的药物组合物还包括源自例如公认安全(GRAS)的细菌培养物的有益细菌或其制剂或已知共生或有益微生物。
合适的有益细菌的实例包括:
口腔:口腔链球菌、乳房链球菌、大鼠链球菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、类干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊乳杆菌、大肠杆菌Nisle、唾液链球菌、融合魏斯氏菌、费氏丙酸杆菌
阴道:在一些实施例中,靶向阴道的有益细菌分类群选自鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、詹氏乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、阴道乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌、凝结芽孢杆菌。
鼻腔:清酒乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液链球菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌属物种B420、和乳杆菌GG。
在一些实施例中,有益或共生细菌包括表4-7中所列细菌中的一种或多种。
可以与本文所述的聚糖制剂组合生产组合物的益生物质和有益菌株可以通过标准方法以任何纯度水平分离,且可以通过本领域技术人员已知的常规方式(诸如蒸馏、重结晶和色谱法)进行纯化。如果需要,可以将培养细菌用于组合物中。可以通过任何方法(包括但不限于离心、过滤或倾析)从培养液中分离出细菌。从发酵液中分离出的细胞任选地用水、盐水(0.9%NaCl)或任何合适的缓冲液清洗。所得湿的细胞群可以通过任何合适的方法(例如通过冻干)干燥。
在一些实施例中,有益细菌是冻干的营养细胞。在一些实施例中,使用来自孢子生殖有益细菌的孢子制剂。
在一个实施例中,药物组合物包括聚糖制剂和活力已经部分减弱(例如包括10%、20%、30%、40%、50%或更多无活力细菌的混合物)的有益细菌或主要由无活力微生物组成的有益细菌(例如95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或100%)。这些组合物可以进一步包括已经从微生物或微生物囊泡中分离和纯化的微生物膜和/或细胞壁。如果需要,一种或多种有益微生物可以作为在水或另一液体或半固体培养基中的培养物掺入药物聚糖组合物中,在该液体或半固体培养基中,有益细菌保持活力。在另一技术中,可以通过混合或共混将含有有益细菌的冻干粉末掺入包括聚糖制剂的颗粒材料或液体或半固体材料中。
在一些实施例中,包括聚糖制剂的药物组合物还包括第二治疗剂或其制剂,诸如药物。
例如,第二治疗剂是类固醇,例如像泼尼松或地塞米松。
在一些实施例中,治疗剂是抗炎剂,例如像,NSAID,包括布洛芬、萘普生钠、阿司匹林、塞来昔布、苏灵大、奥沙普秦、水杨酰水杨酸、二氟尼柳、吡罗昔康、吲哚美辛、依托度酸、美洛昔康、纳布美通、酮咯酸氨丁三醇、萘普生/埃索美拉唑、或双氯芬酸。
在一些实施例中,第二治疗剂是抗微生物剂,诸如抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂。抗生素包括氨基糖苷类,如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素和妥布霉素;头孢菌素类,诸如头孢羟唑、头孢唑林、头孢氨苄、头孢来星、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林和头孢拉定;大环内酯类,诸如红霉素和醋竹桃霉素;青霉素类,诸如青霉素G、阿莫西林、氨苄青霉素、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、非奈西林和替卡西林;多肽抗生素类,诸如杆菌肽、粘杆菌素、粘菌素、多粘菌素B;四环素类,诸如金霉素、地美环素、多西环素、美他环素、米诺环素、四环素和土霉素;以及杂项抗生素类,诸如氯霉素、克林霉素、环丝氨酸、林可霉素、利福平、壮观霉素、万古霉素、紫霉素和甲硝唑。
例如,第二治疗剂是疼痛管理药物。在一些实施例中,疼痛管理药物是阿片样物质,例如像,可待因、芬太尼、氢可酮、氢可酮/对乙酰氨基酚、氢吗啡酮、哌替啶、美沙酮、吗啡、羟考酮、羟考酮和对乙酰氨基酚、或羟考酮和纳洛酮。在其他实施例中,疼痛管理药物是非阿片样物质,例如像,对乙酰氨基酚或非类固醇类抗炎药(NSAID),诸如阿司匹林和布洛芬。
本文所述的聚糖制剂和该治疗剂或活性化合物可以组合或混合在单种药物组合物中。在其他实施例中,可以将它们容纳在独立的容器中(和/或各种合适的单位剂型中),但一起包装在一个或多个试剂盒中。在一些实施例中,这些制剂或组合物未包装或放置在一起。
在一些实施例中,药物组合物包括0.1%与100%之间的聚糖制剂,以w/w、w/v、v/v或摩尔%计。在另一个实施例中,药物组合物包括约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%的聚糖制剂,以w/w、w/v、v/v或摩尔%计。在一个实施例中,药物组合物包括约1%-90%、约10%-90%、约20%-90%、约30%-90%、约40%-90%、约40%-80%、约40%-70%、约40%-60%、约40%-50%、约50%-90%、约50%-80%、约50%-70%、约50%-60%、约60%-90%、约60%-80%、约60%-70%、约70%-90%、约70%-80%、约70%-90%、约70%-80%、约80%-90%、约90%-96%、约93%-96%、约93%-95%、约94%-98%、约93%-99%或约90%-100%的聚糖制剂,以w/w、w/v、v/v或摩尔%计。
任选地,包括聚糖制剂的药物组合物包括一种或多种赋形剂或载体,包括稀释剂、粘合剂、崩解剂、分散剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、表面活性剂、矫味剂和着色剂。药物组合物可以包括从约1%至约90%的一种或多种赋形剂或载体,以w/w、w/v、v/v或摩尔%计。例如,药物组合物可以包括1%-90%、1%-75%、1%-60%、1%-55%、1%-50%、1%-45%、1%-40%、1%-25%、1%-15%、1%-10%、10%-90%、10%-75%、10%-60%、10%-55%、10%-50%、10%-45%、10%-40%、10%-25%、10%-15%、15%-90%、15%-75%、15%-60%、15%-55%、15%-50%、15%-45%、15%-40%、15%-25%、25%-90%、25%-75%、25%-60%、25%-55%、25%-50%、25%-45%、25%-40%、40%-90%、40%-75%、40%-60%、40%-55%、40%-50%、40%-45%、45%-90%、45%-75%、45%-60%、45%-55%、45%-50%、50%-90%、50%-75%、50%-60%、50%-55%、55%-90%、55%-75%、55%-60%、60%-90%、60%-75%、75%-90%的一种或多种赋形剂或载体,以w/w、w/v、v/v或摩尔%计。
适合将本文提供的药物聚糖组合物给予(例如局部给予)至非肠部位的药用载体或媒介物包括本领域技术人员已知适合特定给药模式的所有此类载体。此外,这些组合物可以包括一种或多种不削弱期望作用的组分,或补充期望作用的组分,或具有另一种作用的组分。
剂型
可以将本文所述的聚糖组合物配制成任何合适的剂型,包括半固体,例如像,凝胶、乳膏、软膏、雾剂、气溶胶,液体和固体,例如像,粉末或包衣,以及在适合装置和涂药器中配制,诸如贴片、膜、注射器、阴道环、刷子、喷雾瓶、喷射瓶、分配器等,或者可以配制成胶囊、片剂、小包、小袋、罐、安瓿、小模子、罐头、软包等。试剂盒或包装件可以包括散装包装的组合物(例如,在含有足够使受试者遵循整个治疗过程或治疗过程的确定部分的聚糖制剂或其他物质),或作为单个小包(例如,含有单剂量聚糖制剂任选地加上其他组分的小包,或含有聚糖制剂治疗方案的特定日子需要的量的聚糖制剂和其他组分的小包)。
阴道
阴道递送可以涉及将聚糖治疗性组合物引入阴道的任何区域或分部或周围区域上或中,包括阴唇、外阴、子宫颈、子宫、输卵管、卵巢、尿道、膀胱、肛门和直肠。在一些实施例中,阴道递送通过经阴道吸收到粘膜组织中而进行。用于阴道递送的示例性剂型包括栓剂(例如,阴道栓)、乳膏、软膏、溶液、悬浮液、乳液、阴道环、卫生棉条、垫、冲洗剂、海绵、杯剂、子宫内避孕器(IUD)、膀胱内输液剂、条、喷雾剂、泡沫、片剂、胶囊、丸剂、贴片、丸粒、盖、膜、纤维、涂药器、粘合剂、罩(例如安全套)或羊膜腔外输液剂。在一些实施例中,适合阴道递送的剂型能够在给予后维持特定形状或稠度。在一些实施例中,适合阴道递送的剂型在给予后溶解或改变形式。
示例性阴道施用包括局部、唇下、真皮内、肌肉内、腔内、皮下或吹入,或者可以通过直接注射或提供喷雾进行。阴道给予聚糖治疗性组合物可以涉及单个剂量,或者可以例如在选定时间段内分多个剂量进行。
在一些实施例中,适合阴道递送的剂型能够将聚糖治疗性组合物以受控方式递送至特定部位。在一些实施例中,将阴道剂型配制成定时释放或溶解形式,且可立即或在约2秒、约5秒、约10秒、约20秒、约30秒、约45秒、约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约4小时、约8小时、约12小时、约16小时、约20小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约4周或更长时间后释放聚糖治疗性组合物。
在一些实施例中,用于阴道递送示例性聚糖治疗性组合物的剂型包括两种或更多种组分。在一些实施例中,剂型的第一组分包括由固体柔性材料组成的容纳第二组分的装置,该第二组分包括介质,例如,凝胶或液体,其中溶解了或混合了聚糖治疗性组合物。这样的两组分系统可能需要在放置第二组分之前或之后将第一组分施用到阴道中或上,这允许控制递送剂型。例如,用于阴道递送的剂型可能需要包括聚糖治疗性组合物的半固体乳膏或液体以及给予至阴道腔中的注射器或其他注射装置。
在一些实施例中,用于阴道递送的剂型还包括避孕药(例如,杀精剂)、子宫内避孕器、激素避孕药或胶乳罩(例如,安全套)。在其他实施例中,用于阴道递送的剂型还包括预防或对抗性传播疾病(例如,病毒、真菌或细菌疾病或感染)的药剂,例如,壬苯醇醚-9、阿奇霉素、青霉素、头孢曲松、环丙沙星或甲硝唑。在其他实施例中,用于阴道递送的剂型还包括预防或对抗泌尿生殖道感染(例如,尿道感染、细菌性阴道病或与阴道腔相关的其他生态失调)的药剂(例如,咪康唑、特康唑)。
在一些实施例中,聚糖组合物经配制供局部阴道给予,诸如阴道内给予。剂型包括例如阴道片剂、阴道乳膏或凝胶、冲洗剂、阴道栓剂、阴道内植入物或阴道栓、卫生棉条或阴道环。
口腔
在一些实施例中,剂型经配制以供口服递送。口服递送可以涉及将聚糖治疗性组合物引入口腔的任何区域或分部,诸如口、嘴唇、牙龈、舌头、脸颊、腭、唾液腺、颌、咽、会厌、鼻腔、呼吸腔(例如,上肺腔或下肺腔)、喉和食道。口服递送还包括递送至例如口的皮肤或粘膜表面(例如,咀嚼和被覆粘膜)、喉、鼻道和呼吸腔。示例性口服剂型包括固体(例如,片剂、丸剂、胶囊、软锭剂、粒剂、糖果、滴剂、锭剂、树胶、粉末、糊剂、糖锭、晶体、咀嚼剂、溶解条、膜、快熔体、食品或半固体配制品)、液体(例如,饮料、悬浮液、糖浆、酏剂、溶液、止咳糖浆、糖浆、漱口剂、喷雾剂、酊剂、滴剂、输液剂或乳液)或凝胶(例如,牙膏或软膏)。在一些实施例中,将口服剂型配制成食物,例如,营养补充剂、烘焙食物、棒、饮料、软质食物(spread)、糖果、糖膏或稀释用粉末。
示例性口服施用包括局部、颊面、舌下、真皮内、肌肉内、皮下、吹入、或吸入给予,或者可以通过胃饲管进行。口服给予聚糖治疗性组合物可以涉及单个剂量,或者可以例如在选定时间段内分多个剂量进行。在一些实施例中,用于口服递送的剂型还包括预防龋齿、牙周炎和/或牙龈炎的药剂,例如,氟或抗菌剂。在其他实施例中,用于口服递送的剂型还包括预防或对抗口臭的药剂,例如,抗菌剂、锌或三氯生。在其他实施例中,用于口服递送的剂型还包括预防或对抗口腔疼痛(例如,感冒疮或口疮)的药剂(例如,抗病毒剂(例如,阿昔洛韦、伐米洛韦(famiciclovir)、伐昔洛韦)、赖氨酸、蜜蜂花、芦荟、锌、地塞米松、醋酸氟轻松、过氧化氢、秋水仙碱、硫糖铝、硝酸银或debacterol)。
在一些实施例中,适合口服递送的剂型能够将聚糖治疗性组合物以受控方式递送至特定部位。在一些实施例中,将口服剂型配制成定时释放或溶解形式,且可立即或在约2秒、约5秒、约10秒、约20秒、约30秒、约45秒、约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约4小时、约8小时、约12小时、约16小时、约20小时、约1天或更长时间后释放聚糖治疗性组合物。在一些实施例中,通过借助装置将口服剂型给予至口腔,诸如注射器、饲管、保持器、吸入器、喷雾器或生物粘附贴片。
在一些实施例中,口服递送包括递送至胃肠道。在其他实施例中,口服递送限制在口腔(例如,口、嘴唇、牙龈、舌头、脸颊、鼻腔、腭、唾液腺、颌、咽、会厌、喉和食道),且不进入胃肠道和/或具有最小身体暴露。在一些实施例中,受试者将口服剂型维持在口中而不吞咽。在一些实施例中,受试者在口中通过涡旋或漱口激活口服剂型。在一些实施例中,口服剂型在受试者的口腔中具有大于约5秒的停留时间,例如,大于约10秒、约15秒、约20秒、约25秒、约30秒、约45秒、约60秒、约90秒、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟或更长时间。在一些实施例中,口服剂型在受试者的口中具有大于约60秒的停留时间,例如,大于约90秒、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟或更长时间。
在一些实施例中,将聚糖组合物配制成用于局部口服给予。在一个实施例中,剂型包括例如喷雾剂、雾剂、凝胶、膜、树胶、冲洗剂(漱口水)、棒棒糖、片剂、胶囊、锭剂。
鼻腔
在一些实施例中,剂型经配制以供鼻递送。鼻递送可以涉及将聚糖治疗性组合物引入鼻腔的任何区域或分部,诸如鼻、鼻甲(例如,下鼻甲)、前庭、上颌骨、腭骨、翼突内侧板、筛骨迷路、鼻窦(例如鼻旁窦、额窦、上颌窦、蝶窦、筛窦)、口、鼻壁(例如,外侧鼻壁)、漏斗部、上颚、鼻咽部、嗅觉上皮、呼吸道上皮和犁鼻器。在一些实施例中,将剂型靶向鼻腔的嗅觉段和/或呼吸段。鼻递送还包括递送至例如鼻、鼻窦、鼻道和呼吸腔的皮肤或粘膜表面。示例性鼻剂型包括固体(例如,片剂、丸剂、胶囊、软锭剂、粒剂、粉末、糊剂、晶体、溶解条、膜或半固体配制品)、液体(例如,喷雾剂、雾剂、滴剂、悬浮液、溶液、酊剂、输液剂、气溶胶或乳液)或凝胶(例如,软膏)。在一些实施例中,鼻剂型通过吸入器(例如,定量吸入器、干粉吸入器)、雾化器、注射器、洗鼻壶、滴管、瓶、泵(例如雾化泵,雾化器)或加压气溶胶给予。鼻剂型可以作为具有离散尺寸的颗粒给予。在一些实施例中,鼻剂型的粒度在约1μm与约50μm(例如,约5μm与约30μm、约10μm与约20μm)之间。在一些实施例中,用于给予至鼻腔的剂型包括纳米颗粒(例如,粘液渗透颗粒)。
示例性鼻施用包括局部、真皮内、皮下、吹入、或吸入给予,或者可以通过鼻管进行。在一些实施例中,用于鼻递送的剂型还包括治疗或预防鼻窦炎(鼻窦感染,例如,急性鼻窦炎)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎或鼻疖的药剂,例如,抗生素(例如,阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、阿奇霉素、头孢丙烯、莫西沙星、红霉素、氨苄青霉素)、减充血剂(例如,伪麻黄碱、去氧肾上腺素、麻黄碱、左甲苯丙胺、萘甲唑啉、羟甲唑啉、苯丙醇胺、丙己君、辛弗林、四氢唑啉、赛洛唑啉、曲马唑啉)、皮质类固醇(例如,丙酸氟替卡松、曲安奈德)、或粘液溶解剂(例如,乙酰半胱氨酸、氨溴索、溴己新、羧甲司坦、多米奥醇、domase alfa、依普拉酮、厄多司坦、来托司坦、甘露糖醇、美司钠、奈替克新、sorberol、司替罗宁、硫普罗宁)。在一些实施例中,用于鼻递送的剂型还包括治疗或预防哮喘的药剂,例如,皮质类固醇(例如,倍氯米松)、长效β激动剂(例如,沙美特罗、福莫特罗)、短效β激动剂(例如,沙丁胺醇)、抗胆碱能剂(例如,异丙托溴铵)、抗白三烯剂(例如,孟鲁司特、扎鲁司特)、肥大细胞稳定剂(例如色甘酸钠)或硫酸镁。
鼻给予聚糖治疗性组合物可以涉及单个剂量,或者可以例如在选定时间段内分多个剂量进行。在一些实施例中,适合鼻递送的剂型能够将聚糖治疗性组合物以受控方式递送至特定部位。在一些实施例中,将鼻剂型配制成定时释放或溶解形式,且可立即或在约2秒、约5秒、约10秒、约20秒、约30秒、约45秒、约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约4小时、约8小时、约12小时、约16小时、约20小时、约1天或更长时间后释放聚糖治疗性组合物。
在一些实施例中,将聚糖组合物配制成用于局部鼻给予。在一个实施例中,剂型包括喷雾剂、雾剂、凝胶、软膏、(例如,施用至鼻孔)、拭子、滴剂、雾化剂、干粉吸入剂、片剂、胶囊和锭剂。
本文所述的剂型可以用本领域技术人员已知的方法制备。剂型可以适合任何给药途径,包括局部给予,例如,给予至非肠部位的粘膜或非粘膜组织。在一些实施例中,局部给予(local administration)是局部给予(topical administration)。
剂型可以是小包,诸如任何单个容纳药物聚糖治疗性组合物的容器,该药物聚糖治疗性组合物的形式是例如液体(洗剂/冲洗剂)、凝胶、乳膏、软膏、粉末、片剂、丸剂、胶囊、储存剂(depository)、一次性涂药器或医疗装置(例如注射器)。例如,还提供了制品,诸如包括药物聚糖组合物的单位剂型的容器,以及含有此类聚糖治疗剂的使用说明的标签。
本文提供的药物组合物可以呈单位剂型或多剂型。如本文所用,单位剂型是指适合给予有需要的人(例如局部给予至非肠部位)的物理离散单位。在一个实施例中,以包装件提供单位剂型。每个单位剂量可以含有预定量的足以与其他药用载体或赋形剂结合产生期望治疗效果的一种或多种活性成分。单位剂型的实例包括安瓿、注射器以及单独包装的片剂和胶囊。单位剂型可以按其分数或倍数给予。多剂型是多个包装在单个容器中的相同单位剂型,其可以分开的单位剂型给予。多剂型的实例包括片剂或胶囊的小瓶、瓶,或品脱或加仑瓶。在另一个实施例中,多剂型包括不同药物活性剂。例如,可以提供多剂型,其包括第一剂量元素,其包括包含聚糖制剂的组合物,以及第二剂量元素,其包括第二活性化合物,例如,第二聚糖制剂或治疗剂(例如药物)或有益细菌。剂量元素可以处于缓释形式。在这个实例中,一对剂量元素可以构成单个单位剂量。在一个实施例中,提供了包括多个单位剂量的试剂盒,其中每个单位包括第一剂量元素,其包括包含聚糖制剂的组合物,以及第二剂量元素,其包括第二活性化合物,例如,第二聚糖制剂、治疗剂(例如药剂)、有益细菌、微量营养素等或其组合。
在某些实施例中,单位剂型可以包括约1g至约5g、约1g至约10g、约1g至约15g、约1g至约20g、约1g至约25g、约1g至约30g、约1g至约40g、约1g至约50g、约5g至约10g、约5g至约15g、约5g至约20g、约5g至约25g、约5g至约30g、约10g至约20g、或约10g至约30g、约10g至约40g、约10g至约50g的聚糖制剂。
在某些实施例中,单位剂型包括约0.001mg至约100mg、约0.005mg至约75mg、约0.01mg至约50mg、约0.05mg至约25mg、约0.1mg至约10mg、约0.5mg至约7.5mg、或约1mg至约5mg的聚糖制剂。在其他实施例中,单位剂型包括约1mg至约100mg、约2.5mg至约75mg、约5mg至约50mg、或约10mg至约25mg的聚糖治疗剂。在其他实施例中,单位剂型包括约100mg至约10g、约250mg至约7.5g、约500mg至约5g、约750mg至约2.5g、或约1g至约2g的聚糖制剂。
在其他实施例中,单位剂型包括约0.001mL至约1000mL之间的聚糖制剂。例如,单位剂型可以包括约0.001mL至约950mL、约0.005mL至约900mL、约0.01mL至约850mL、约0.05mL至约800mL、约0.075mL至约750mL、约0.1mL至约700mL、约0.25mL至约650mL、约0.5mL至约600mL、约0.75mL至约550mL、约1mL至约500mL、约2.5mL至约450mL、约5mL至约400mL、约7.5mL至约350mL、约10mL至约300mL、约12.5mL至约250mL、约15mL至约200mL、约17.5mL至约150mL、约20mL至约100mL、或约25mL至约75mL的聚糖制剂。
在一些实施例中,单位剂型具有约0.1英寸至约1.5英寸(例如,约0.5英寸与约1英寸)、或约5mm至约50mm(例如,约10mm至约25mm)之间的体长。在一些实施例中,单位剂型,例如,片剂、胶囊(例如,硬胶囊、推入配合胶囊或软胶囊)、或软明胶,具有约0.05英寸至约1英寸(例如,约0.1英寸至约0.5英寸)、或约1mm至约25mm(例如,约5mm至约10mm)的外径。
本文所述的剂型可以用本领域技术人员已知的方法制备。
赋形剂和添加剂包括稀释剂、粘合剂、崩解剂、分散剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、表面活性剂、抗粘剂、吸附剂、甜味剂和着色剂或其组合。稀释剂的非限制性实例包括乳糖、纤维素、微晶纤维素、甘露糖醇、干淀粉、水解淀粉、粉末状糖、滑石、氯化钠、二氧化硅、氧化钛、二水合磷酸二钙、硫酸钙、碳酸钙、氧化铝和高岭土。合适的粘合剂的非限制性实例包括淀粉(包括玉米淀粉和预胶化淀粉)、明胶、糖(例如葡萄糖、右旋糖、蔗糖、乳糖和山梨醇)、纤维素、聚乙二醇、海藻酸、糊精、酪蛋白、甲基纤维素、蜡、天然和合成胶(例如阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、阿拉伯树胶、黄原胶)和合成聚合物(如聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、羟丙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮)。润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和聚乙二醇。崩解剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、交联聚合物(例如像,交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠)、羟乙酸淀粉钾或羟乙酸淀粉钠、粘土、纤维素(例如羧甲基纤维素(例如羧甲基纤维素(CMC)、CMC-Na、CMC-Ca))、淀粉、树胶等。合适的助流剂的非限制性实例包括二氧化硅、滑石等。稳定剂可以抑制或延迟药物分解反应,包括氧化反应。表面活性剂还可以包括且可以是阴离子的、阳离子的、两性的或非离子的。示例性甜味剂可以包括甜叶菊提取物、天冬甜素、蔗糖、阿力甜、糖精等。如果需要,这些组合物也可以包括无毒性辅助物质,诸如pH缓冲剂、防腐剂(例如,抗氧化剂)、润湿剂或乳化剂、增溶剂、包衣剂、调味剂(例如薄荷、樱桃、茴芹、桃、杏、甘草、覆盆子、香草)等。其他赋形剂和添加剂可以包括乙酸铝、苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯、丁基化羟基甲苯、乙二胺四乙酸二钠钙、二水磷酸氢钙、磷酸氢钙、磷酸三钙、小烛树蜡、carnuba蜡、氢化蓖麻油、氯化十六烷基吡啶、柠檬酸、胶体二氧化硅、共聚维酮、玉米淀粉、半胱氨酸盐酸盐、聚二甲基硅氧烷、磷酸氢二钠、赤藓红钠、乙基纤维素、明胶、甘油、甘油单油酸酯、甘油单硬脂酸酯、甘氨酸、HPMC邻苯二甲酸酯、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、氧化铁红或氧化铁、氧化铁黄、四氧化三铁或三氧化二铁、碳酸镁、氧化镁、硬脂酸镁、甲硫氨酸、甲基丙烯酸共聚物、对羟基苯甲酸甲酯、硅化微晶纤维素、矿物油、磷酸、纯磷酸钙、无水磷酸钙、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、纯泊洛沙姆、聚氧乙烯、聚氧140硬脂酸酯、聚山梨醇酯80、碳酸氢钾、山梨酸钾、马铃薯淀粉、聚维酮、丙二醇、对羟基苯甲酸亚丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、糖精钠、硒、二氧化硅、硅胶、煅制二氧化硅、苯甲酸钠、碳酸钠、柠檬酸钠二水合物、交联甲基纤维素钠、月桂基硫酸钠、焦亚硫酸钠、丙酸钠、淀粉钠、羟乙酸淀粉钠、硬脂酰富马酸钠、山梨酸、山梨醇、失水山梨醇单油酸酯、预胶化淀粉、琥珀酸、三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、植物脂、维生素A、维生素E、维生素C或其组合。可以基于与其他组分的关系和制剂特性以及生产方法适当选择这些赋形剂和添加剂的量。
在一些实施例中,本文所述的配制品包括针对于粘膜递送的赋形剂。此类赋形剂的实例包括微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、右旋糖、苯扎氯铵(例如,浓度为约0.01%-0.05%,例如,0.02%w/w)、聚山梨酸酯80、苯乙醇(例如,浓度为约0.1%-0.5%,例如,约0.25%w/w)或乙二胺四乙酸二钠。在其他实施例中,本文所述的配制品包括粘膜渗透剂,它可以增加活性剂通过粘膜的渗透性。示例性渗透增强剂包括表面活性剂、胆汁盐,非表面活性剂(例如环糊精,壳聚糖和氮酮)和/或脂肪酸。可用于粘膜递送的其他示例性赋形剂描述在Expert Opin Drug Deliv.[药物递送的专家观点]2012年6月;9(6):615-28中,通过引用并入本文。
在实施例中,将该组合物配制用于粘膜递送,例如,鼻粘膜递送或口粘膜递送。在实施例中,该组合物在聚合物中/上/内/掺入其中,例如,粘膜粘附聚合物,例如,水凝胶。不希望受理论的束缚,据信,将粘膜粘附聚合物纳入配制品中可以增加活性剂与粘膜的接触时间,例如,从而增加吸收的持续时间。示例性粘膜粘附聚合物包括Carbopol 934P、羟丙基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚(乙烯醇)、聚(异丁烯),、聚(异戊二烯)、黄原胶、刺槐豆胶、壳聚糖、果胶、聚卡波非、透明质酸苄酯、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯酸-共-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-共-丙烯酸丁酯)、与(聚丁二醇)共聚的HEMA、3M的(CP和PIB的生物粘附聚合共混物)、Carbopol EX-55、聚环氧乙烷、聚甲基乙烯基醚/马来酸酐(PME/MA)、黄蓍胶、丙烯酸和聚乙二醇单甲基醚单甲基丙烯酸酯的聚(丙烯酸-共-聚乙二醇)共聚物、聚乙二醇、鼓干蜡质玉米淀粉(DDWM)和硬脂酰富马酸钠。有效量的聚糖组合物的立即释放配制品可以包括允许快速释放(如在给予后从1分钟至1小时)药物活性剂的赋形剂的一种或多种组合。受控释放配制品(也称为缓释(SR)、延迟释放(ER、XR或XL)、定时释放(time-release或timed-release)、受控释放(CR)或连续释放)是指在将剂型给予受试者(例如,局部给予至非肠部位)后的特定期望时间点从剂型释放聚糖组合物。
在一个实施例中,受控释放剂型开始释放,并在延长时间段内持续释放。释放可以差不多立即开始或可以持续。释放可以是恒定的,可以随时间推移增加或减少,可以脉冲化,可以连续或间歇等。在一个实施例中,受控释放剂型是指从组合物或剂型释放药剂,其中该药剂是根据期望曲线在延长时间段内释放。在一个方面,受控释放是指延迟从组合物或剂型释放药剂,其中该药剂根据期望曲线释放,其中释放在一定时间段后发生。
在一些实施例中,剂型可以是泡腾剂剂型。泡腾剂意指在与液体(包括水和唾液)混合时产生气体的剂型。一些泡腾剂(或泡腾剂对)通过化学反应产生气体,该化学反应在泡腾剂崩解剂接触水或口中唾液时发生。这个反应可以是可溶性酸源与碱性一元碳酸盐或碳酸盐源反应的结果。这两种一般化合物在接触水或唾液时反应产生二氧化碳气体。
在另一个实施例中,剂型可以处于糖果形式(例如,基质),诸如棒棒糖或锭剂。在一个实施例中,将有效量的聚糖制剂分散在糖果基质中。在一个实施例中,糖果基质包括一种或多种糖(诸如右旋糖或蔗糖)。在另一个实施例中,糖果基质是无糖基质。特定糖果基质的选择取决于宽变量。可以使用常规甜味剂(例如,蔗糖)、适合糖尿病患者使用的糖醇(例如,山梨醇或甘露糖醇)或其他甜味剂(例如,本文所述的甜味剂)。糖果基可以很软且快速溶解,或可以是硬的且较缓慢溶解。各种形式在不同情形下将各有优点。
包括有效量的聚糖制剂的糖果块组合物可以口服给予有需要的受试者,使得糖果块溶解时将有效量的聚糖制剂局部释放到受试者口中。
本文所述的剂型也可以表现为由各种方法制造的药物颗粒形式,包括高压均化、湿法或干法球磨或小颗粒沉淀。其他可用于制造合适粉末配制品的方法是制备活性成分与赋形剂的溶液,然后沉淀、过滤和粉碎,或者然后通过冷冻干燥去除溶剂,然后将粉末粉碎成期望粒度。在一个实施例中,药物颗粒具有3-1000微米,诸如至多3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000微米的最终尺寸。在另一个实施例中,药物颗粒具有10-500微米的最终尺寸。在另一个实施例中,药物颗粒具有50-600微米的最终尺寸。在另一个实施例中,药物颗粒具有100-800微米的最终尺寸。
在另一个实施例中,提供了包括聚糖组合物的口服剂型,其中该口服剂型是糖浆。糖浆可以包括约1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、或85%的固体。糖浆可以包括约15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%的液体,例如,水。固体可以包括聚糖组合物。固体可以是例如,约1%-96%、10%-96%、20%-96%、30%-96%、40%-96%、50%-96%、60%-96%、70%-96%、80%-96%、或90%-96%的聚糖组合物。在另一个实施例中,将聚糖组合物配制成粘性液体。
在一个实施例中,组合物包括发泡组分或中和组分。发泡组分可以是至少一种选自下组的成员,该组由以下各项组成:碳酸氢钠、碳酸钠和碳酸钙。在一个实施例中,中和组分可以是至少一种选自下组的成员,该组由以下各项组成:柠檬酸、L-酒石酸、富马酸、L-抗坏血酸、DL-苹果酸、乙酸、乳酸、和无水柠檬酸。配制品可以含有蔗糖脂肪酸酯、糖粉、果汁粉和/或调味材料。
在一些实施例中,本文所述的药物聚糖组合物的剂型是粘膜粘附递送系统,其粘附至粘膜表面,诸如非肠部位(例如像,口腔、鼻腔和阴道)的粘膜表面。它们通常由具有许多氢键合基团的聚合物组成,例如,交联聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、角叉菜胶、Carbopol 934P或硫醇化聚卡波非。
在一些实施例中,本文所述的药物聚糖组合物的剂型是栓剂。栓剂是例如在插入阴道时熔化或溶解从而释放聚糖制剂的固体剂型。用于栓剂配制品的典型赋形剂包括可可油、聚乙二醇和琼脂。
本文还提供了制造本文所述的单位剂型的方法,这些方法包括提供聚糖制剂;将聚糖制剂配制成单位剂型,包装单位剂型,标记包装的单位剂型和/或出售或供应以销售经包装的经标记的单位剂型。
还可以加工本文所述的单位剂型。在一个实施例中,加工包括以下项中的一者或多者:将剂型加工成药物组合物,例如,与第二组分,例如,赋形剂或缓冲剂或第二化合物或治疗剂配制或组合;分成较小或较大等分式样;放到容器,例如,气密性或液密性容器;包装;与标记相联系;运送或移动到不同位置。在一个实施例中,加工包括以下项中的一者或多者:分类、选择、接受或丢弃、释放或保留、加工成药物组合物、运送、移动到不同位置、配制、标记、包装、投入商业中或出售或供应以销售,这取决于是否满足预定阈值。在一些实施例中,加工的剂型包括本文所述的聚糖制剂。
试剂盒
还涵盖试剂盒。例如,试剂盒可以包括药物聚糖组合物的单位剂型以及含有聚糖制剂的治疗疾病、障碍或病理状态的使用说明的包装说明书。试剂盒包括在适合有需要的受试者的包装中的药物聚糖组合物。本文所述的任何组合物都可以以试剂盒形式包装。试剂盒可以含有一定量的足够整个治疗过程或部分治疗过程使用的药物聚糖组合物(任选地另外包括有益细菌、微量营养素和/或第二治疗剂,诸如药物)。药物聚糖组合物的剂量可以单独包装,或者药物聚糖治疗性组合物可以散装提供,或其组合。因此,在一个实施例中,试剂盒以合适包装提供对应治疗方案中给药点的聚糖组合物的个别剂量,其中这些剂量包装在一个或多个小包中。
在一个实施例中,药物聚糖组合物可以散装提供在单个容器或在两个、三个、四个、五个或超过五个容器中。例如,每个容器可以含有足够进行一个月的治疗计划的特定一周使用的药物聚糖组合物。如果提供超过一个散装容器,这些散装容器可以适当地包装在一起,以提供足够所有或部分治疗期使用的药物聚糖组合物。该容器或这些容器可以用指示对有需要的受试者或对执行治疗方案(例如像给药时间表)的医师有用的信息的标记进行比较。
药物聚糖组合物可以与其他合适的物质(例如,第二活性化合物或治疗剂或缓冲剂/载体)一起包装。其他一种物质或多种物质可以与药物聚糖组合物分开包装,或与药物聚糖组合物混合,或其组合。因此,在一个实施例中,试剂盒包括含有所有打算用于治疗过程中的成分(例如,药物聚糖组合物和任选地第二活性化合物或治疗剂或缓冲剂/载体)的剂型。在一个实施例中,将药物聚糖组合物包装在一个包装或一组包装中,而其他组分(诸如有益细菌和治疗剂(例如,药物))与药物聚糖组合物分开包装。
试剂盒还可以包括书面材料,诸如说明书、预期结果、证明书、解释、警告、临床数据、健康专业人士的信息等。在一个实施例中,试剂盒含有指示该试剂盒只能在健康专业人士指导下使用的标记或其他信息。容器还可以包括匙、注射器、瓶、杯、涂药器或其他测量或服务装置。
给予受试者
可以通过各种途径将本文所述的聚糖制剂、药物组合物和治疗剂给予有需要的受试者。例如,可以将聚糖制剂局部给予至非肠部位。在一些实施例中,将聚糖制剂局部给予至口腔、鼻腔或阴道。在一个实施例中,将聚糖制剂给予至粘膜组织。如果需要,可以给予第二药剂,例如药物。可以将药物局部给予至例如非肠部位或全身地给予(例如口服地或静脉内地或通过任何其他合适的途径)。
活性化合物和药剂(例如,有益细菌或药物)可以分开给予,例如,在给予聚糖制剂之前、同时或之后,且不作为药物聚糖组合物的一部分(例如作为共同配制品)。在一些实施例中,药物聚糖组合物与推荐或处方饮食(例如富含含益生素、益生元和/或微量营养素的食物的饮食,诸如它可以通过医师或其他健康专业人士判定)组合给予。
另外的物质可以与聚糖组合物一起给予。这些物质可以增强聚糖制剂的作用或功效。这些物质可以在用聚糖制剂治疗之前、在用聚糖制剂治疗期间或在用聚糖制剂治疗之后给予,或其任何组合。如果在聚糖制剂治疗期间给予,它们可以随所给予的聚糖制剂的剂量给予,或在聚糖制剂的剂量之前或之后给予,或其任何组合。
治疗方法
本文提供了治疗受试者非肠组织中的生态失调的方法。本文还提供了治疗受试者非肠组织的疾病、障碍或病理状态的方法。这些方法可以包括调节受试者非肠组织的pH。这些方法还可以包括调节非肠组织的代谢图谱(例如,挥发性脂肪酸)。还提供了预防、治疗或减少或消除非肠部位相关疾病、障碍或病理状态的一种或多种症状的方法。
这些方法包括将本文所述的聚糖制剂局部(例如直接)给予至非肠部位(例如粘膜组织),量和时间有效地:治疗生态失调,治疗疾病、障碍或病理状态,调节pH,调节受试者非肠部位的代谢图谱,预防或治疗疾病、障碍或病症,或者减少或消除非肠部位相关疾病、障碍或病症的一种或多种症状。在一个实施例中,提供了预防、治疗、改善定殖在非肠部位处的病原体的症状和/或预防其复发的方法。在一些实施例中,非肠部位是口腔、鼻腔或阴道。
在一些实施例中,受试者在治疗后经历至少一种症状的减轻。在一些实施例中,可以测定(例如通过测量已知生物标记)治疗后症状严重程度的减轻,且大约是约3%、5%、7%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或约100%。在一些实施例中,与给予药物聚糖组合物之前的症状相比,如本文所述测量的症状平均减轻约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或约100%。在一些实施例中,治疗后,症状严重程度的减轻持续至少约一天、两天、三天、四天、五天、一周、两周、三周、一个月、3个月、6个月、9个月、一年、两年、五年、十年或永久减轻。
在一个实施例中,终止治疗后,受试者中症状保持部分地、基本上地或完全地消除或严重程度减轻至少约1天、1周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、一年、18个月、两年、三年、四年、五年、十年或超过十年。在另一个实施例中,终止治疗后,受试者中症状的严重程度永久消除或减轻。
在某些实施例中,受试者是非肠部位(诸如鼻腔、口腔和阴道)具有生态失调的一种或多种症状的人类受试者。生态失调的症状包括与健康个体相比非期望病原体或非期望细菌分类群过度生长、关键健康相关细菌分类群表示减少、微生物分类群的多样性减少或增加,和/或有益细菌分类群的总体丰度降低。
还提供了用于使非肠部位(重新)定殖有益共生分类群的方法。在一个实施例中,通过给予本文所述的聚糖制剂以治疗疾病、障碍或病理状态或预防非肠部位相关疾病、障碍或病理状态复发来增加有益分类群的相对丰度。在一个实施例中,有益分类群与本文所述的聚糖制剂共同给予,以治疗疾病、障碍或病理状态或预防非肠部位相关疾病、障碍或病理状态复发。
在一些实施例中,使用患者样品或来自患者样品的微生物培养物的微生物代谢图谱鉴定发展非肠疾病、障碍或病症的风险因素。出于诊断、预后风险评估或治疗评估目的的示例性代谢物包括表8中列出的那些。在一些实施例中,在受试者疾病和治疗期间的不同时间点取微生物代谢物图谱,以更好地评估受试者疾病状态,包括恢复或复发事件。这种监测对于降低受试者在例如非肠部位处发展新的疾病、障碍或病理状态的风险也是重要的。在一些实施例中,代谢物图谱明确了后续治疗。
在一些实施例中,聚糖组合物也可以与干扰非肠部位的正常微生物生长的抗生素组合。在抗生素治疗过程中,可以在开始抗生素治疗时提供聚糖组合物;在抗生素治疗不久后提供,例如治疗1、2、3、4、5、6、7或更多天后;或者可以在非肠部位诊断出非期望病原体生长时给予。
另外,如果被治疗医师或其他健康护理提供者判断为有用,本文所述的聚糖组合物可以与各种其他标准护理治疗组合给予。聚糖组合物可以在标准护理治疗之前、同时或治疗之后给予。在一些实例中,治疗破坏了非肠部位处正常微生物群的组成和健康,这可导致有害细菌或病原体的非期望增殖,这可引起本文所述症状中的一种或多种。在一些实施例中,给予本文所述的聚糖组合物有用于减轻那些症状,并恢复非肠部位处的正常微生物群落。
鼻腔
本文提供了治疗鼻疾病、障碍或病理状态的方法,这些方法包括将本文所述的聚糖制剂以有效治疗鼻疾病、障碍或病理状态的量(例如剂量)和时间(例如,治疗间隔)给予(例如局部)至鼻腔。在一些实施例中,鼻疾病、障碍或病理状态是鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖和哮喘。
在一些实施例中,本文所述的聚糖组合物与标准护理治疗组合给予。在一个实施例中,治疗涉及消除鼻金黄色葡萄球菌。在一些实施例中,治疗包括给予局部莫匹罗星施用或口服抗生素,诸如利福平和多西环素。
本文提供了治疗鼻生态失调的方法,这些方法包括将本文所述的聚糖制剂以有效治疗生态失调的量(例如剂量)和时间(例如,治疗间隔)给予(例如局部)至鼻腔。
在一些实施例中,生态失调包括例如以下属的疾病相关细菌、致病有机体或病原体的丰度增加(例如,相对于非生态失调状态):棒状杆菌属、狡诈菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、嗜胨菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属和链球菌属。
在一些实施例中,生态失调包括例如以下物种的疾病相关细菌、致病有机体或病原体的丰度增加(例如,相对于非生态失调状态):拥挤棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、结核硬脂酸棒状杆菌、懒惰狡诈球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉氏菌、Peptoniphilus rhinitidis、痤疮丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、和肺炎链球菌。
在一些实施例中,生态失调包括以下项中一种或多种的丰度调节(例如,相对于非生态失调状态)(例如,增加或减少):物种痤疮丙酸杆菌、拥挤棒状杆菌、结核硬脂酸棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、诡诈分支杆菌、产黏棒状杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、懒惰狡诈球菌、大芬戈尔德菌、和卡他莫拉氏菌,以及属嗜胨菌属、厌氧球菌属、托米泰拉属。
生态失调可以引起疾病、障碍或病症,例如像,鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖和哮喘。
在属水平上,已经通过16S rRNA测序在前鼻孔中表征了457种细菌(Zhou等人,2013)。在门水平上,鼻微生物组被放线菌门、厚壁菌门和变形菌门主导(Bassis等人,2014);在属水平上,棒状杆菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、和莫拉氏菌属是普遍的成员(Zhou等人,2013)。
鼻腔充当物种金黄色葡萄球菌的储库,且携带金黄色葡萄球菌是医院内金黄色葡萄球菌菌血症的重大风险因素(Wertheim等人,2004)。存在或不存在其他细菌物种也与金黄色葡萄球菌携带相关。例如,拥挤棒状杆菌物种在携带者中更常见,而假白喉棒状杆菌在非携带者中更常见(Yan等人,2013),且存在表皮葡萄球菌与存在金黄色葡萄球菌相关联(Iwase等人,2010)。鼻微生物组也被认为在慢性鼻窦炎(CRS)的发病机制中发挥作用。虽然CRS患者与健康对照的总细菌负荷类似,但CRS患者倾向于比对照具有多样性更小的微生物组,且某些细菌(例如,金黄色葡萄球菌)更普遍(Wilson和Hamilos,2014)。(Zhou,Y.等人(2013).Biogeography of the ecosystems of the healthy human body[健康人体的生态系统的生物地理].Genome Biol.[基因组生物学]14,R1;Bassis,C.M.,等人(2014).Thenasal cavity microbiota of healthy adults[健康成人的鼻腔微生物群].Microbiome[微生物组]2,27;Wertheim,H.F.L.等人(2004).Risk and outcome of nosocomialStaphylococcus aureus bacteraemia in nasal carriers versus non-carriers[鼻携带者与非携带者中医院内金黄色葡萄球菌菌血症的风险和结果].Lancet[柳叶刀英国伦敦]364,703–705;Yan,M.等人(2013).Nasal microenvironments and interspecificinteractions influence nasal microbiota complexity and S.aureuscarriage[鼻微环境和种间相互作用影响鼻微生物群复杂性和金黄色葡萄球菌携带].Cell Host Microbe[细胞宿主与微生物]14,631–640;Iwase,T.等人(2010).Staphylococcus epidermidisEsp inhibits Staphylococcus aureus biofilm formation and nasal colonization[表皮葡萄球菌Esp抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成和鼻定殖].Nature[自然]465,346–349;Wilson,M.T.和Hamilos,D.L.(2014).The nasal and sinus microbiome in healthand disease[健康与疾病状态下的鼻和窦微生物组].Curr.Allergy Asthma Rep[最新过敏症与哮喘报告].14,485.)
口腔
本文提供了治疗口疾病、障碍或病理状态的方法,这些方法包括将本文所述的聚糖制剂以有效治疗口疾病、障碍或病理状态的量(例如剂量)和时间(例如,治疗间隔)给予(例如局部)至口腔。在一些实施例中,口疾病、障碍或病理状态是龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体结石、扁桃体结石、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。
在一些实施例中,本文所述的聚糖组合物与标准护理治疗组合给予。在一个实施例中,治疗包括例如,抗生素治疗、去除牙斑的物理方法或给予有益细菌。
本文提供了治疗口生态失调的方法,这些方法包括将本文所述的聚糖制剂以有效治疗生态失调的量(例如剂量)和时间(例如,治疗间隔)给予(例如局部)至口腔。
在一些实施例中,生态失调包括例如以下属的疾病相关细菌、致病有机体或病原体的丰度增加(例如,相对于非生态失调状态):放线菌属、凝聚杆菌属、阿托波菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、棒状杆菌属、小杆菌属、真细菌属、梭杆菌属、孪生球菌属、颗粒链菌属、金氏菌属、乳杆菌属、纤毛菌属、欧氏菌属、类斯氏菌属、消化链球菌属、普氏菌属、卟啉单胞菌属、丙酸杆菌属、Pseudoramibacter、Selenemonas、鞘氨醇单胞菌属、链球菌属、坦纳菌属、硫单胞菌属、密螺旋体属和韦荣球菌属。
在一些实施例中,生态失调包括例如物种变异链球菌;远缘链球菌的疾病相关细菌、致病有机体或病原体的丰度增加(例如,相对于非生态失调状态)。
在一些实施例中,生态失调包括例如以下物种的疾病相关细菌、致病有机体或病原体的丰度增加(例如,相对于非生态失调状态):伴放线凝聚杆菌、牙龈卟啉单胞菌、直肠弯曲菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌、福赛斯坦纳菌和中间普氏菌。
在一些实施例中,生态失调包括例如以下种属的疾病相关细菌、致病有机体或病原体的丰度增加(例如,相对于非生态失调状态):韦荣球菌属、放线菌属、颗粒链菌属、纤毛菌属、硫单胞菌属、双歧杆菌属、普氏菌属、阿托波菌属、欧氏菌属、Pseudoramibacter、丙酸杆菌属、和Selenemonas。
在一些实施例中,生态失调包括例如以下物种的疾病相关细菌、致病有机体或病原体的丰度增加(例如,相对于非生态失调状态):戈氏放线菌、伴放线凝聚杆菌、微小阿托波菌、极小阿托波菌、龈裂阿托波菌、福氏拟杆菌、直肠弯曲菌、动物梭杆菌、具核梭杆菌、麻疹孪生球菌、口金氏菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、微小消化链球菌、普氏消化链球菌、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、生痰新月形单胞菌、有害新月形单胞菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、唾液链球菌、血链球菌、远缘链球菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体。
生态失调可以引起疾病、障碍或病症,例如像,龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体结石、扁桃体结石、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。
口腔含有多样但相对稳定的细菌物种群落(Zhou等人,2013)。已经通过16S rRNA测序在口腔中表征超过600个细菌物种(Dewhirst等人,2010)。表现在口微生物组中的主要门是放线菌门、拟杆菌门、衣原体门、绿弯菌门、广古菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、变形菌门、螺旋体门、SR1、互养菌门、软壁菌门和TM7(Dewhirst等人,2010)。虽然每个口部位(例如,牙齿与脸颊)的组成有一定重叠,但不同部位具有不同的特征性群体(Zhou等人,2013)。例如,唾液含有约1.4x 108CFU/mL的主要来自以下门的细菌:放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、变形菌门、螺旋体门和TM7。口微生物组直接参与口疾病(诸如龋齿(蛀牙)和牙周病)的发病,且还间接参与一系列其他疾病(综述于He等人,2014)。龋齿与存在物种变异链球菌相关;此外,其他细菌(包括链球菌属、韦荣球菌属、放线菌属、颗粒链菌属、纤毛菌属、硫单胞菌属、双歧杆菌属、和普氏菌属)与严重早期儿童龋齿(S-ECC)相关,且阿托波菌属、欧氏菌属、Pseudoramibacter、丙酸杆菌属、和Selenemonas与成人牙根龋(RC)相关。还在根尖周炎、牙周病(诸如牙龈炎和牙周炎)、口臭(口腔异味)和口腔鳞状细胞癌(OSCC)中记录了细菌群落的特征性变化。
阴道:
本文提供了治疗阴道疾病、障碍或病理状态的方法,这些方法包括将本文所述的聚糖制剂以有效治疗阴道疾病、障碍或病理状态的量(例如剂量)和时间(例如,治疗间隔)给予(例如局部)至阴道。在一些实施例中,阴道疾病、障碍或病理状态是细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染、早产或流产的风险。
在一些实施例中,本文所述的聚糖组合物与标准护理治疗组合给予。在一个实施例中,治疗包括例如,经口或阴道施用的抗生素(包括甲硝唑、克林霉素、替硝唑、和塞克硝唑)、抗真菌剂或经阴道施用的激素(包括雌二醇),例如呈乳膏形式。
在一些实施例中,提供了用于降低女性受试者阴道中的pH的方法。这些方法包括向有需要的女性受试者(例如表现出BV的受试者)给予有效降低阴道中pH的量的聚糖制剂(例如降至pH代表健康阴道环境的点)。可以使用例如pH和/或乳酸作为生物标记和/或监测/测定乳杆菌属(例如物种诸如卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、格氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和詹氏乳杆菌)的存在或者存在或不存在致病菌或致病有机体来评估治疗进程。
本文提供了治疗阴道生态失调的方法,这些方法包括将本文所述的聚糖制剂以有效治疗生态失调的量(例如剂量)和时间(例如,治疗间隔)给予(例如局部)至阴道。
在一些实施例中,生态失调包括例如以下属的疾病相关细菌、致病有机体或病原体的丰度增加(例如,相对于非生态失调状态):放线菌属、气球菌属、阿托波菌属、拟杆菌属、棒状杆菌属、小杆菌属、伊格尔兹氏菌属、埃希氏菌属、加德纳菌属、嗜血杆菌属、纤毛菌属、利斯特菌属、巨型球菌属、支原体属、动弯杆菌属、奈瑟氏菌、嗜胨菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、纤毛菌属、葡萄球菌属、链球菌属、和脲原体属,和梭菌目(例如细菌性阴道病相关细菌-1(BVAB-1)、BVAB-2、和BVAB-3)。
在一些实施例中,生态失调包括例如以下物种的疾病相关细菌、致病有机体或病原体的丰度增加(例如,相对于非生态失调状态):阴道加德纳菌、普氏菌属物种、卟啉单胞菌属物种、消化链球菌属物种、人支原体、和动弯杆菌属物种、梭杆菌属物种、阴道阿托波菌和屎肠球菌。
在一些实施例中,生态失调包括例如以下物种的疾病相关细菌、致病有机体或病原体的丰度增加(例如,相对于非生态失调状态):克里斯腾森气球菌、阴道阿托波菌、解脲拟杆菌、阴道棒状杆菌、Dialister micraerophilus、大肠杆菌、阴道加德纳菌、流感嗜血杆菌、绵羊纤毛菌、单核细胞增生利斯特菌、人支原体、淋病奈瑟氏菌、Peptoniphiluslacrimalis、不解糖卟啉单胞菌、Prevotella timonensis、Sneathia sanguinegens、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和尿素分解脲原体。
生态失调可以引起疾病、障碍或病症,例如像,细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染、早产或流产的风险。
在属水平上,已经通过16S rRNA测序在中阴中表征了218种细菌(Zhou等人,2013,Biogeography of the ecosystems of the healthy human body[健康人体的生态系统的生物地理].Genome Biol[基因组生物学].14,R1)。阴道微生物组由包括以下属的分类群组成:放线菌属、棒状杆菌属、拟杆菌属、普氏菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、链球菌属、厌氧球菌属、芬戈尔德菌属、嗜胨菌属、和小杆菌属(综述于Ma等人,2012,The vaginalmicrobiome:rethinking health and diseases[阴道微生物组:再认识健康和疾病].Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年鉴]66,371–389)。多数妇女的阴道微生物组被乳杆菌属主导,特别是卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、格氏乳杆菌和詹氏乳杆菌。通过这些细菌产生乳酸降低阴道的pH,且被认为有助于防护病原体。通过这些细菌产生过氧化氢也被认为有助于防护病原体。相比之下,在20%-30%的妇女中(且在黑人和西班牙妇女中比白人或亚洲妇女更常见),阴道微生物组不被乳杆菌属主导,而是充满了来自以下属的厌氧菌的多样混合物,包括阿托波菌属、棒状杆菌属、厌氧球菌属、嗜胨菌属、普氏菌属、加德纳菌属、纤毛菌属、伊格尔兹氏菌属、动弯杆菌属和芬戈尔德菌属。细菌性阴道病(BV)引起诸如阴道溢液等的症状,并增加性传播疾病、盆腔炎和早产的风险。BV由阴道微生物组失调引起。
在一些实施例中,药物聚糖组合物是以有效使受试者的非肠部位的状态改变或调整的量和时间给予。在一个实施例中,药物聚糖组合物是以有效使细菌分类群(例如,一个或多个、两个或更多个、三个或更多个等)改变或调整的量和时间给予。在一个实施例中,药物聚糖组合物是以有效使微生物功能(例如,代谢功能)改变或调整的量和时间给予。在一个实施例中,药物聚糖组合物是以有效使微生物组(基因组)、转录组、代谢组或蛋白质组改变或调整的量和时间给予。
在一些实施例中,给予药物聚糖组合物例如通过调节(例如增加或减少)生态位(例如,鼻腔、口腔或阴道)中微生物群落的一个或多个成员(诸如驻留共生细菌和/或获得的病原体或致病有机体)的生长或丰度改善宿主的健康和/或特定生态位(诸如非肠部位)的健康。
本文所述的聚糖制剂在以有效量给予受试者时可以调节一种或多种微生物代谢物在非肠部位的生产。聚糖制剂在以有效量给予受试者时可以调节(例如,增加或降低)一种或多种表8中所列微生物代谢物的生产或水平。在一些实施例中,给予聚糖制剂以调节共生细菌在非肠部位处的短链脂肪酸(SCFA)生产。
在一些实施例中,给予聚糖制剂以诱导例如SCFA和其他微生物生产的免疫调节分子或代谢物的全身效果,以调节远端部位的炎症状态。
在一些实施例中,提供了选择受试者进行治疗的方法(例如,用药物聚糖组合物进行治疗)。这些方法包括:(a)鉴定非肠部位(例如,鼻腔、口腔或阴道)有疾病、障碍或病理状态的受试者,并且(b)选择鉴定的受试者用本文所述的聚糖制剂进行治疗。在一些实施例中,进一步选择受试者用第二药物或治疗进行治疗。在一些实施例中,选择受试者进行治疗的方法包括选择未进行治疗的受试者(例如,相对于微生物治疗未进行治疗的受试者)。
在一些实施例中,选择受试者进行治疗的方法包括基于将为受试者提供的治疗益处选择聚糖治疗性制剂。在一些实施例中,选择受试者进行治疗的方法包括基于受试者将或预期从给予聚糖制剂所得益处选择受试者。
在一些实施例中,选择方法包括在例如治疗之前、期间和/或之后评估受试者的非肠部位微生物群。在一个实施例中,在开始治疗之前评估受试者的非肠部位微生物群。在一些实施例中,利用评估结果选择受试者进行治疗。可替代地或另外地,利用评估来鉴定治疗的剂量或剂量方案。
在一些实施例中,鉴定并选择响应聚糖制剂持续开始和/或继续治疗的受试者。可以利用一种或多种合适的参数(如由医师或其他健康护理提供者确定)鉴定响应者。这些参数包括以下项中的一者或多者:a)生理治疗效果(例如减少发烧、增进安康、增加能量等),b)(宿主)生物标记(例如炎症标记等)的期望变化,c)微生物分类群改变(例如,相对丰度、多样性变化等),d)微生物群的功能变化(例如代谢输出、微生物信号传导、微生物基因表达、微生物蛋白质表达的变化),e)不存在或存在期望细菌分类群(在宿主微生物群中)等。在一些实施例中,鉴定并选择非响应者。在一个实施例中,治疗方法包括使非响应者接受治疗。在一些实施例中,这可以包括向非响应者给予响应聚糖(和/或第二药剂)治疗的一个或多个细菌分类群(例如一个或多个共生体)。
在一些实施例中,提供了评估受试者的方法,例如以评估聚糖治疗的适当性、对聚糖治疗的响应性或聚糖治疗进展。任选地,聚糖治疗与另一治疗或疗法(例如,药物治疗)组合。可以评估各种合适的生物标记的变化。在一些实施例中,评估微生物群的变化,或获得对应值。在一些实施例中,评估微生物代谢(例如代谢物输入和/或输出)的变化,或获得对应值。在一些实施例中,评估微生物组的变化(例如基因组或转录组水平的变化),或获得对应值。在一些实施例中,评估微生物蛋白质组的变化,或获得对应值。在一些实施例中,评估宿主的变化,或获得对应值。在一些实施例中,评估宿主蛋白质组(例如蛋白质合成)、代谢组、转录组(例如基因转录/表达)、细胞信号传导等的变化,或获得对应值。在一些实施例中,这些方法包括a)获得与通过聚糖制剂(和/或组合治疗中的药物或疗法)调节的生物标记的水平相关的参数的值;b)响应该值,给受试者分类,为受试者选择治疗,或将该治疗给予受试者,从而评估受试者。
可以用一种或多种生物标记评估治疗响应性和/或进展。合适的生物标记可以由医师判定。聚糖治疗可导致一种或多种生物标记增加或减少,这些生物标记可以通过本领域已知的方法测定。研究人员可以判定在治疗期间的哪个或哪些点应该测量一种或多种生物标记,例如在治疗之前、在治疗期间的不同间隔和/或在治疗之后。可以从受试者获得任何合适的样品,例如非肠部位样品(例如像(粘膜)组织样品)或活检、拭子等,并且可以通过本领域已知的合适方法分析样品。在一些实施例中,可以检测生物标记的大幅增加或减少来评估治疗进展。
在一些实施例中,用聚糖制剂进行治疗导致微生物群释放短链脂肪酸,诸如丁酸盐、乙酸盐和丙酸盐和其他代谢物(例如胆汁酸和乳酸盐)。
细菌成分的鉴定
在一些实施例中,将本文所述的药物聚糖组合物给予受试者以增加非肠部位中有益细菌的生长和/或减少非肠部位中病原体的生长。在一些实施例中,通过聚糖制剂使微生物群落向健康状态转变。可以利用本领域已知和本文所述的任何数量的方法分析非肠部位的微生物变化。
作为一种用于测定聚糖制剂是否导致非肠部位细菌群落变化的定量方法,可以进行定量PCR(qPCR)。可以用可商购获得的试剂盒(诸如Mo Bio96孔土壤DNA分离试剂盒(莫生物实验室(Mo Bio Laboratories),加利福尼亚州卡尔斯巴德)、Mo BioDNA分离试剂盒(莫生物实验室,加利福尼亚州卡尔斯巴德)、或QIAamp DNA粪便迷你试剂盒(凯杰公司(QIAGEN),加利福尼亚州瓦巴伦西亚(Valencia)))根据制造商的说明书,或通过本领域技术人员已知的其他标准方法从样品中提取基因组DNA。
在一些实施例中,可以用HotMasterMix(5PRIME,马里兰州盖瑟斯堡)和对某些(例如有益或期望)细菌有特异性的引物进行qPCR,且可以在具有条形码的FastOptical 96孔反应板(0.1mL)(生命技术公司(Life Technologies),纽约州格兰德岛)上进行,以及在配备有CFX96TM实时系统和FAM和ROX通道荧光读数的BioRad C1000TM热循环仪(伯乐公司(BioRad),加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules))上进行。FAM通道上每个孔的Cq值是通过CFX ManagerTM软件2.1版测定。每个实验样品的log10(cfu/ml)是通过将给定样品的Cq值输入由标准曲线生成的线性回归模型,比较标准曲线孔的Cq值与那些样品的已知log10(cfu/ml)来计算。技术人员可以采用替代性qPCR模型。
在一些实施例中,通过表征微生物16S小亚基核糖体RNA基因(16S rRNA基因)的DNA序列鉴定微生物成分。16S rRNA基因的长度约为1,500个核苷酸,且通常在有机体间是高度保守的,但是含有特定的可变区和超变区(V1-V9),它们具有足以区分大多数有机体的物种水平和菌株水平分类群的核苷酸多样性。细菌中的这些区分别由核苷酸69-99、137-242、433-497、576-682、822-879、986-1043、1117-1173、1243-1294和1435-1465定义,使用基于大肠杆菌系统的命名法编号。(参见例如,Brosius等人,Complete nucleotidesequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli[来自大肠杆菌的16S核糖体RNA基因的完整核苷酸序列],PNAS 75(10):4801-4805(1978))。
微生物群落的组成可以通过给完整16S rRNA基因、或该基因的V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8和V9区中的至少一个测序,或者通过给来自该基因的可变区的任何组合(例如V1-3或V3-5)测序来推导。在一个实施例中,使用V1、V2和V3区表征微生物群。在另一个实施例中,使用V3、V4和V5区表征微生物群。在另一个实施例中,使用V4区表征微生物群。
将彼此间至少97%相同的序列归入操作分类单元(OTU)。含有具有97%相似性的序列的OTU大概对应物种水平分类群。选择来自每个OTU的至少一个代表性序列,并通过与高度管理的16S rRNA基因序列的参考数据库(诸如Greengenes或SILVA数据库)比较来用于获得OTU的分类分配。微生物群落中的OTU之间的关系可以通过从每个OTU的代表性序列构建系统发育树来推断。
使用已知技术,为了确定完整16S序列或16S序列的任何可变区的序列,从细菌样品中提取基因组DNA,使用聚合酶链反应(PCR)扩增16S rRNA(完整区或特定可变区),清洁PCR产物,并绘制核苷酸序列以确定16S rRNA基因或该基因的可变区的遗传组成。如果进行完整16S测序,则使用的测序方法可以是但不限于Sanger测序。如果使用一个或多个可变区(诸如V4区),则测序可以是但不限于使用Sanger方法或使用诸如Illumina方法等的下一代测序方法来进行。被设计成与16S rRNA基因的保守区退火的引物(例如用于扩增V4区的515F和805R引物)可以含有独特的条形码序列,以允许同时表征多个微生物群落。
作为另一种鉴定微生物组成的方法是表征核苷酸标记或基因,特别是高度保守的基因(例如,“管家”基因)或其组合或全基因组鸟枪序列(WGS)。使用确定的方法,从细菌样品中提取的DNA将具有使用PCR扩增的特定基因组区,并经测序以确定扩增产物的核苷酸序列。在WGS方法中,提取的DNA将被片段化成不同长度的碎片(从300到约40,000个核苷酸)并直接测序而不用扩增。可以使用任何测序技术生成序列数据,包括但不限于Sanger、Illumina、454Life Sciences、Ion Torrent、ABI、Pacific Biosciences和/或OxfordNanopore。
除了16S rRNA基因之外,分析已知为给定物种或分类群的标记基因的一组选定基因以评估微生物群落的组成。使用基于PCR的筛选策略可替代地测定这些基因。例如,使用编码以下项的基因来区分各种致病性大肠杆菌的菌株:热不稳定性(LTI、LTIIa和LTIIb)和热稳定性(STI和STII)毒素、1型、2型和2e型维罗毒素(分别为VT1、VT2型和VT2e)、细胞毒性坏死因子(CNF1和CNF2)、附着和抹去机制(eaeA)、肠集聚机制(Eagg)和肠侵袭机制(Einv)。基于序列的分类鉴定领域中的普通技术人员熟悉用于通过使用标记基因来确定微生物群落的分类组成的最佳基因。
用于微生物全基因组测序(WGS)的测序文库可以从细菌基因组DNA制备。对于从人或实验室动物样品分离的基因组DNA,可以任选地使用可商购获得的试剂盒(例如NEBNext微生物组DNA富集试剂盒(新英格兰生物实验室(New England Biolabs),麻省伊普斯威奇)或其他浓缩试剂盒)富集细菌DNA的DNA。测序文库也可以使用可商购获得的试剂盒(如Nextera Mate-Pair样品制备试剂盒、TruSeq DNA PCR-Free或TruSeq纳米DNA或NexteraXT样品制备试剂盒(依诺米那公司(Illumina),加利福尼亚州圣地亚哥))根据制造商的说明书从基因组DNA制备。可替代地,可以使用与Illumina测序平台兼容的其他试剂盒(如NEBNext DNA文库构建试剂盒(新英格兰生物实验室,麻省伊普斯威奇)制备文库。然后可以使用标准测序技术对文库进行测序,包括但不限于MiSeq、HiSeq或NextSeq测序仪(依诺米那公司,加利福尼亚州圣地亚哥)。
可替代地,使用本领域的标准方法制备全基因组鸟枪法片段文库。例如,可以使用GS FLX Titanium快速文库制备试剂盒(454生命科学公司(Life Sciences),康涅狄格州布兰福德)构建鸟枪法片段文库,用GS FLX Titanium emPCR试剂盒(454生命科学公司,康涅狄格州布兰福德)扩增,并在454测序仪(454生命科学公司,康涅狄格州布兰福德)上按照标准454焦磷酸测序方案测序。
细菌RNA可以通过可商购获得的试剂盒如RiboPure细菌RNA纯化试剂盒(生命技术公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)从含有细菌的微生物培养物或样品中分离。另一种用于分离细菌RNA的方法可以涉及通过去除tRNA富集细菌RNA的纯化样品中的mRNA。可替代地,可以使用标准方法如Nextera XT样品制备试剂盒(依诺米那公司,加利福尼亚州圣地亚哥)将RNA转化成cDNA,其用于产生测序文库。
使用序列相似性和系统发生放置法或两种策略的组合分析核酸序列以界定分类分配。使用类似的方法注释蛋白质名称、蛋白质功能、转录因子名称以及核酸序列的任何其他分类纲要。基于序列相似性的方法包括BLAST、BLASTx、tBLASTn、tBLASTx、RDP分类器、DNAclust、RapSearch2、DIAMOND、USEARCH以及这些算法的各种具体实施,例如QIIME或Mothur。这些方法将序列读数映射到参考数据库并选择最佳匹配。常用数据库包括KEGG、MetaCyc、NCBI非冗余数据库、Greengenes、RDP和Silva用于分类分配。对于功能分配,将读数映射到各种功能数据库,如COG、KEGG、BioCyc、MetaCyc和碳水化合物活性酶(CAZy)数据库。使用包括MetaPhlAn的软件分配微生物进化枝。
微生物群体的蛋白质组学分析
可以基于增加与健康状态相关的微生物蛋白质的表达或减少与疾病状态相关的微生物蛋白质的表达的能力来选择聚糖制剂。微生物群体的蛋白质组学分析可以按照本领域技术人员已知的方案进行(例如,Cordwell,Exploring and exploiting bacterialproteomes[探索和开发细菌蛋白质组],Methods in Molecular Biology[分子生物学方法],2004,266:115)。为了鉴定差异表达的蛋白质(例如,为了鉴定用聚糖治疗剂处理微生物群体后蛋白质表达的变化),蛋白质组学分析可以如例如Juste等人(Bacterial proteinsignals are associated with Crohn’s disease[细菌蛋白质信号与克罗恩病有关],Gut[肠道],2014,63:1566)中所述进行。例如,从两个样品(例如,未处理的微生物群体和已经用聚糖治疗剂处理的群体)的微生物裂解物中分离蛋白质。给每个蛋白质样品进行标记(例如用荧光染料,例如Cy3或Cy5 CyDye DIGE Fluor最小染料,通用电气医疗集团(GEHealthcare)),并通过二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)进行分析。将凝胶染色,并且将两个样品之间鉴定为显着不同的蛋白质点切除、消化,并通过液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)进行分析。X!TandemPipeline(http://pappso.inra.fr/bioinfo/xtandempipeline/)可用于鉴定差异表达的蛋白质。
还可以基于它们对微生物发酵产物的存在的影响选择给予人类受试者的聚糖制剂。例如,可以针对诱导或促进产生短链脂肪酸如丙酸盐(丙酸)、乙酸盐和/或丁酸盐(丁酸)的细菌生长的能力来选择聚糖制剂。类似地,可以针对诱导或促进产生乳酸的细菌生长的能力来选择聚糖制剂,乳酸可以通过产生酸性环境来调节其他细菌的生长。这种分析也可以用于将益生菌与聚糖制剂配对,使得聚糖制剂是用于生产期望发酵产物的底物。
存在于新鲜或用过的培养基或从人收集的生物样品中的代谢物可以使用本文所述的方法测定。可以用于确定样品中代谢物的相对浓度的无偏方法是本领域技术人员已知的,例如气相色谱或液相色谱与质谱或1H-NMR组合。这些测量可以通过运行代谢物标准品由相同的分析系统进行验证。
在气相色谱-质谱(GC-MS)或液相色谱-质谱(LC-MS)分析的情况下,极性代谢物和脂肪酸可以使用有机溶剂和含水样品的单相或双相系统进行提取并衍生化(Fendt等人,Reductive glutamine metabolism is a function of theα-ketoglutarate to citrateratio in cells[还原性谷氨酰胺代谢是细胞中α-酮戊二酸与柠檬酸比率的函数],NatCommun[自然通讯],2013,4:2236;Fendt等人,Metformin decreases glucose oxidationand increases the dependency of prostate cancer cells on reductive glutaminemetabolism[甲福明减少葡萄糖氧化并增加前列腺癌细胞对还原性谷氨酰胺代谢的依赖性],Cancer Res[癌症研究],2013,73:4429;Metallo等人,Reductive glutaminemetabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia[IDH1对还原性谷氨酰胺的代谢在低氧下介导脂肪生成],Nature[自然],2011,481:380)。用于极性代谢物的衍生化的示例性方案涉及通过用2%甲氧胺盐酸盐在吡啶中孵育代谢物,随后加入N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)与1%叔丁基二甲基氯硅烷(t-BDMCS)来形成甲氧肟-tBDMS衍生物。可以将非极性级分(包括三酰甘油酯和磷脂)皂化成游离脂肪酸,并且例如通过用甲醇中的2%H2SO4孵育或通过使用甲基-8试剂(赛墨科技公司(ThermoScientific))进行酯化以形成脂肪酸甲酯。然后可以使用标准LC-MS方法通过GC-MS分析衍生化样品,例如安装在与质谱仪(MS)接合的气相色谱仪(GC)上的DB-35MS柱(30m x 0.25mmid x0.25μm,安捷伦J&W科学公司(Agilent J&W Scientific))。可以通过整合代谢物离子片段来确定质量同位素分布,并使用如改编自Fernandez等人(Fernandez等人,Correctionof 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance[针对自然稳定的同位素丰度校正13C质量同位素分布],J Mass Spectrom[质谱测定法杂志],1996,31:255)的那些的标准算法对天然丰度进行校正。在液相色谱-质谱(LC-MS)的情况下,极性代谢物可以使用配备有柱(诸如SeQuant ZIC-pHILIC Polymeric柱(2.1x 150mm;EMD密理博公司(EMD Millipore))的标准台式LC-MS/MS进行分析。用于分离的示例性流动相可以包括调节至特定pH值的缓冲液和有机溶剂。
组合地或替代地,可以通过1H-核磁共振(1H-NMR)分析提取的样品。样品可以任选地在缓冲溶液(例如,在D2O中的Na2HPO4、NaH2PO4,pH7.4)存在下与同位素富集的溶剂(如D2O)合并。样品还可以补充有校准和化学位移测定用的参考标准品(例如5mM 2,2-二甲基-2-硅杂戊烷-5-磺酸钠盐(DSS-d6,Isotec公司,美国))。在分析之前,可以将溶液过滤或离心以去除任何沉积物或沉淀物,然后转移到合适的NMR管或容器中用于分析(例如,5mm NMR管)。可以在配备有5mm QXI-Z C/N/P探针头的标准NMR光谱仪(如Avance II+500Bruker光谱仪(500mHz)(布鲁克公司(Bruker),德国))上获得1H-NMR光谱并用光谱积分软件(如Chenomx NMR Suite 7.1;Chenomx公司,艾伯塔省埃德蒙顿(Edmonton,AB))进行分析。(Duarte等人,1H-NMR protocol for exometabolome analysis of cultured mammaliancells[用于培养的哺乳动物细胞的胞外代谢物组分析的1H-NMR方案],Methods Mol Biol[分子生物学方法],2014:237-47)。可替代地,1H-NMR可以按照本领域已知的其他公开方案进行(Chassaing等人,Lack of soluble fiber drives diet-induced adiposity inmice[可溶性纤维的缺乏驱动小鼠体内的食源性肥胖],Am J Physiol GastrointestLiver Physiol[美国生理学杂志—胃肠道和肝脏生理学],2015;Bai等人,Comparison ofStorage Conditions for Human Vaginal Microbiome Studies[对人类阴道微生物组研究的贮藏条件进行比较],PLoS ONE[公共科学图书馆·综合],2012:e36934)。
从人的含粘膜部位收集微生物样品和滴度测定
例如,为了收集用于核酸提取和分析的阴道微生物样品,将无菌全方位样品收集拭子(Catch-All Sample Collection Swab)(Epicentre生物技术公司(EpicentreBiotechnologies))放置在处于处女膜环/组织后面的阴道口并旋转五次。然后立即使拭子在样本收集管中的750μL的MoBio缓冲液中涡旋并且多次抵住管壁按压20秒。将Pederson窥器引入到阴道腔中,以相似的方式对后穹窿和阴道中点取样,每个部位使用单独的收集拭子。将样品保存在冰上直到处理。(McInnes&Cutting,Manual of Procedures for HumanMicrobiome Project:Core Microbiome Sampling Protocol A[人类微生物组工程的程序手册:核心微生物组取样方案A],v12.0,2010,http://hmpdacc.org/doc/HMP_MOP_Version12_0_072910.pdf)(Aagaard等人,A Metagenomic Approach toCharacterization of the Vaginal Microbiome Signature in Pregnancy[表征妊娠时阴道微生物组信号的元基因组方法],2012,PLoS ONE[公共科学图书馆·综合],7:e36466)。为了收集阴道微生物样品进行培养,根据制造商的说明书使用APTIMA阴道拭子标本收集试剂盒(豪洛捷公司(Hologic))。以与上述方案类似的方式进行取样,但是在取样后将拭子收集到含有2.9mL运送介质的运送管中。使用微电极pH计(Waterproof BigDisplaypH Spear,Oakton pH计)取样时测定阴道口和后穹窿处的pH值。
例如,为了准备从口腔中收集样品,要求受试者用水冲洗口腔1分钟。冲洗口腔后五分钟,要求受试者向50mL无菌锥形管(Falcon)中吐口水,直到收集2-5mL的唾液(Henson&Wong,Collection,storage,and processing of saliva samples for downstreammolecular applications[收集、存储和处理用于下游分子应用的唾液样品],2010,Methods Mol Biol[分子生物学方法],666:21-30)。通过使含有唾液的Falcon管以2600xg离心15分钟以沉积固体,然后将上清液转移到新的含有MoBio缓冲液(McInnes&Cutting)的2mL管中,制备唾液样品用于下游的核酸分析。口腔中的软组织部位(包括舌头、硬腭、颊粘膜、角质化(附着)牙龈、腭扁桃体和咽喉)通过用全方位样品收集拭子(Epicentre生物技术公司)擦拭该部位5–10秒进行取样。口腔中的硬组织部位(包括来自多个牙齿的龈上和龈下牙斑)通过用无菌Gracey刮匙轻轻刮擦该部位的牙斑进行取样。如果收集样品用于下游的核酸分析,则将拭子和牙斑收集到MoBio缓冲液中并储存在冰上直到处理。如果收集样品用于培养,则将拭子和牙斑收集到运送介质,如Hoover&Newbrun(Survival of Bacteriafrom Human Dental Plaque Under Various Transport Conditions[来自人牙斑菌的细菌在各种运送条件下的存活],1977,J Clin Microbiol[临床微生物学杂志],6:212-218)中所述。
例如,为了从鼻腔中收集微生物样品进行核酸提取和分析,使用无菌全方位样品收集拭子(Epicentre生物技术公司)轻轻摩擦前鼻孔的粘膜表面。对左侧和右侧鼻孔采样并合并在一起。然后立即使拭子在样本收集管中的750μL的MoBio缓冲液中涡旋并且多次抵住管壁按压20秒。将样品保存在冰上直到处理。(McInnes&Cutting)。为了从鼻腔中收集微生物样品进行培养,根据制造商的说明书使用BD CultureSwab标本收集和运送系统(碧迪公司(Becton,Dickinson and Company))。以与上述方案类似的方式进行取样,但取样后将拭子收集到Amies介质中(作为BD CultureSwab标本收集和运送系统的一部分)。
在一个实例中,为了确定常见阴道细菌(包括乳杆菌属和加德纳菌属)的滴度,收集含有阴道细菌的样品并制备成在5mL的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的悬浮液。在无菌PBS中制备十倍系列稀释液,并铺板(每种稀释液100μL)到乳杆菌MRS琼脂(厌氧菌系统公司(Anaerobe Systems))或有5%人血液的加德纳菌选择性琼脂(BD)上。使板在37℃下在厌氧条件下孵育。48小时后,对菌落计数并用于反向推算原始样品中活细胞的浓度。
在另一个实例中,为了确定口腔中常见细菌的滴度,收集含有来自口腔的细菌的样品,并制备成在5mL的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的悬浮液。在无菌PBS中制备十倍系列稀释液,并铺板(每种稀释液100μL)到胰蛋白酶大豆血清杆菌肽万古霉素琼脂(厌氧菌系统公司;以滴定伴放线凝聚杆菌,其与牙周炎相关)、具有亚碲酸盐的轻型唾液琼脂(厌氧菌系统公司;以滴定链球菌和肠球菌)或梭杆菌选择性琼脂(厌氧菌系统公司;以滴定梭杆菌,其与牙周炎相关)上。对于革兰氏阳性细菌的总滴度,将稀释液铺板到甘露糖醇盐琼脂(BD)上。对于革兰氏阴性细菌的总滴度,将稀释液铺板到伊红亚甲基蓝琼脂(BD)或麦康凯琼脂(BD)上。使板在适合目标物种的37℃有氧或厌氧条件下孵育。48小时后,对菌落计数并用于反向推算原始样品中活细胞的浓度。
在另一个实例中,为了确定鼻腔中常见细菌的滴度,收集含有来自鼻腔的细菌的样品,并制备成在5mL的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的悬浮液。在无菌PBS中制备十倍系列稀释液,并铺板(每种稀释液100μL)到结晶紫-萘啶酮酸-庆大霉素琼(以滴定肺炎链球菌)、甘露糖醇盐琼脂(BD;以滴定葡萄球菌属物种)或巧克力琼脂(厌氧菌系统公司;以滴定嗜血杆菌属和奈瑟氏菌属物种)上。可替代地,将稀释液铺板到脑心浸液琼脂(厌氧菌系统公司)或Luria-Bertani琼脂(BD)上,以非选择性地使鼻细菌(包括棒状杆菌属、葡萄球菌属和丙酸杆菌属)生长。使板在适合目标物种的37℃有氧或厌氧条件下孵育。48小时后,对菌落计数并用于反向推算原始样品中活细胞的浓度。
为了非选择性地培养含有从人或动物收集的细菌的样品,使用富培养基或琼脂,如布鲁氏菌血琼脂(厌氧菌系统公司)、脑心浸液琼脂(厌氧菌系统公司)或切碎肉汤(厌氧菌系统公司)。根据需要,补充有氨基酸、碳源或其他营养物的基本培养基配制品如M9(生命技术公司)用于在体外测定过程中非选择性地培养细菌,测试聚糖制剂或其他化合物对细菌群体的作用。可替代地,使用本领域技术人员已知的其他基本培养基配制品,例如,如Martens等人(Mucosal Glycan Foraging Enhances Fitness and Transmission of aSaccharolytic Human Gut Bacterial Symbiont[粘膜聚糖觅食增强糖分解人类肠道细菌共生有机体的适应性和传输],2008,Cell Host&Microbe[细菌宿主与微生物],4:447-457)中所报道。
本说明书中引述或引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文,如同每一独立的出版物、或专利公开案具体且单独地指明通过引用并入本文。
实例
本发明进一步通过以下实例说明。提供这些实例仅是出于说明的目的,并且不得以任何方式解释为限制本发明的范围或内容。除非另有说明,否则本发明的实施将使用本领域常规的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药学方法。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如,T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties[蛋白质:结构和分子特性](W.H.Freeman and Company[W.H.弗里曼公司],1993);Green&Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th Edition[分子克隆:实验室手册,第4版](Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],2012);Colowick&Kaplan,Methods In Enzymology[酶学方法](Academic Press[学术出版社]);Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nd Edition[雷明顿:药学科学与实践,第22版](Pharmaceutical Press[医药出版社],2012);Sundberg&Carey,AdvancedOrganic Chemistry:Parts A and B,5th Edition[高等有机化学:部分A和B,第5版](Springer[施普林格],2007)。
实例1.聚糖的制备
向配备有顶置式搅拌器和夹套式短路冷凝器的圆底烧瓶中加入一种或多种单糖或二糖以及干重3%-20%的一种或多种在美国专利号8,466,242和WO2014/031956(将其通过引用以其全文并入本文)中描述的催化剂。图1A-1B中描绘了部分示例性催化剂。将水(0.25重量当量)加入到干混合物中,并且使用大小匹配尽可能接近所选圆底烧瓶的轮廓的桨,将浆料以大约100rpm合并。然后将混合物加热至80℃-155℃,典型地在135℃-155℃之间。固体达到熔融状态后,将容器置于10-1000毫巴真空压力下,典型地在300-600毫巴之间。将反应搅拌30分钟至8小时,典型地1.5-4小时,不断从反应中除去水。通过HPLC监测反应进程。当发生足够的聚合反应时,关闭搅拌器,将反应物冷却至室温并排气至大气压力,并将固体物质溶解于足以产生大约50Brix(克糖/100g溶液)的溶液的容积的水中。溶解完成后,通过过滤除去固体催化剂,并通过旋转蒸发将含聚糖的溶液浓缩至大约65-75Brix。
制备约35种不同的聚糖制剂,多种情况下分几批(例如2和10批次之间),包括以多批次制备并且在本文所述的各种测定中测试的以下15种聚糖制剂:
单个聚糖单元(同聚糖制剂):xyl100、ara100、gal100、glu100和man100。
两个聚糖单元(异聚糖制剂):xyl75ara25、glu80man20、glu60man40、man60glu40、man80glu20、man80gal20、man66gal33和glu50gal50。
三个聚糖单元(异聚糖制剂):glu33gal33fuc33和man52glu29gal19。
另外的聚糖制剂及其制备描述于例如并入本文的WO/2016/122889GLYCANTHERAPEUTICS AND RELATED METHODS THEREOF[聚糖治疗剂及其相关方法]实例1中,并包括:a)同聚糖制剂:rha100、fuc100和fru100,b)异聚糖制剂:ara50gal50、ara80xyl20、ara60xyl40、ara50xyl50、gal75xyl25、man62glu38,杂合聚糖glu90sorl0和glu90glyl0,和c)异聚糖制剂:xyl75glul2gall2、xyl33glu33gal33。
聚糖通过代表单体糖组分的三字母代码随后是反映单体构成的材料的百分比的百分数来描述。因此,‘glu100’归于由100%D-葡萄糖(聚糖单元)输入产生的聚糖,并且‘glu50gal50’归于由50%D-葡萄糖和50%D-半乳糖(聚糖单元)输入或可替代地乳糖二聚体(聚糖单元)输入产生的聚糖。如本文所用:xyl=D-木糖;ara=D-阿拉伯糖或L-阿拉伯糖;gal=D-半乳糖;glu=D-葡萄糖;rha=L-鼠李糖;fuc=L-岩藻糖;man=D-甘露糖;sor=D-山梨醇;gly=D-甘油。
实例2.聚糖的纯化
将如实例1合成的聚糖(例如寡糖和多糖)溶于去离子水中至最终浓度为25-50Brix。然后使材料暴露于至少2质量当量的Dowex Monosphere 88离子交换树脂,通过湿浆液填充柱洗脱,只要停留时间足以使溶液达到3和5之间的最终pH,典型地为2-3个床体积/小时。用Dowex Monosphere 77离子交换树脂以类似的方式重复该过程,直至溶液pH高于5.5。最后,使溶液暴露于Dowex Optipore SD-2吸附剂脱色树脂,直至溶液充分澄清并通过0.2微米过滤器过滤以去除残留的树脂和树脂细粒。然后通过旋转蒸发将制备的所有35种聚糖制剂的最终溶液浓缩至50-85Brix,或通过冻干法浓缩成固体。
实例3:通过去除低分子量组分来修饰聚糖
如实例1和2中那样制备和纯化的聚糖任选被修饰以去除低分子量组分。通过渗透分离来实现分离。将来自光谱实验室(Spectrum Labs)的大约45cm的1.0kD MWCO BiotechCE透析管(31mm平宽)置于去离子水中并浸泡10分钟,然后用透析管夹将一端密封。将8克干聚糖制剂的25Brix溶液无菌过滤,并用第二夹连同几毫升空气密封入管中以使管漂浮。然后将填充管置于3加仑的去离子水槽中,用足够的力量搅拌以引起密封管缓慢涡旋。8小时后,更换槽中的水并允许将管再搅拌16小时。一旦透析完成并且材料具有80%和95%之间的DP2+产率以及75%和90%之间的DP3+产率,终点如所希望的那样,将稀溶液无菌过滤并真空浓缩至最终浓度为大约65Brix或冻干成固体,残留水分在1%和10%之间。可替代地,通过切向流过滤(TFF)来实现分离。在这种情况下,将100mL溶解在去离子水中并经过无菌过滤的25Brix制剂置于根据制造商的建议制备的Spectrum Labs KrosFlo Research IIiTFF系统的进料瓶中。然后在25psig的跨膜压力下将该聚糖制剂渗滤通过1kD mPESMidiKros中空纤维过滤器。使用每0.5个渗滤体积取的原料的HPLC样品来确定何时该材料具有80%和95%之间的DP2+产率以及75%和90%之间的DP3+产率,终点如所希望的那样,此时将溶液无菌过滤并真空浓缩至65Brix糖浆或冻干成固体,残留水分含量按质量计为1%-10%。也可通过用70%乙醇沉淀去除低分子量组分(如单体或二聚体或其他低分子量低聚体,例如三聚体和四聚体),如Gras等人Food Chem.[食品化学]2001,128,773–777中所述。也可以如Sanz等人Chromatographia[色谱学]2006,64,233-236中所述,通过活性碳色谱法将聚糖分馏成具有不同平均分子量的池。实例4:用于分析聚糖制剂的方法
通过液体折射测定来测量聚糖含量
针对制备的所有聚糖制剂,测定任何给定水溶液中聚糖的量。使用高纯度反渗透去离子水对Mettler-Toledo Refracto 30GS便携式糖折射仪进行校准。将几滴聚糖溶液通过0.2微米针筒式滤器直接过滤到折射仪的透镜上。在室温下进行测量,并报告为Brix。将聚糖制剂常规浓缩至60与75之间的Brix,在23℃时无明显固化或结晶。假设水的比密度等于1.0g/mL,则可以将Brix转化为溶解度。因此,75Brix(由75克聚糖和25克水组成的100克溶液)等于3.0g/mL的水溶解度。作为比较,据报道西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)的D-葡萄糖在25℃下的水溶解度为0.909g/mL(48Brix)。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)得到的分子量分布
量化给定聚糖制剂中分子量的分布。使用美国药典专论[Monograph of UnitedStates Pharmacopeia],38(6)In-Process Revision:Heparin Sodium[过程内修订:肝素钠](USP37-NF32)中描述的方法通过HPLC进行测量。在Agilent1200HPLC系统上经由GEsuperpose 12柱进行分离,使用50mM乙酸铵作为洗脱液(流速1.0mL/min)和ELSD检测器。柱温设定为30℃,并且使用葡聚糖(1kD、5kD、10kD重量)来绘制标准曲线。制备样品聚糖制剂的2mg/ml溶液并通过0.45μm旋转过滤器,随后40μl注射到HPLC中。基于所列标准品的对数分子量和洗脱体积构建三阶多项式曲线。通过与标准曲线进行比较来计算样品的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)和多分散指数(PDI)。图2显示了glu100样品SEC评估期间产生的示例性曲线,其中确定平均分子量为1212g/mol或大约DP7。如由在曲线前部的10%最大吸收时曲线上的点定义的材料的分子量的上限被确定为4559g/mol或大约DP28。连续取水下的缩合反应(实例1)通常产生聚糖制剂,该材料的分子量的上限典型地在约DP30。如由曲线后部的10%最大吸收定义的材料的分子量的下限被确定为200g/mol或大约DP1。15种示例性聚糖制剂的数据显示在表1中。可以控制聚合(或缩合)过程以产生如下聚糖制剂,其平均DP范围从小例如DP2.4(低Mw man100)到大例如DP18.86(高Mw gal100)。
通过离子亲和色谱法(IAC)得到的分子量分布
通过离子亲和色谱法确定DP大于或等于2(DP2+)和3(DP3+)的聚糖的比例。将样品聚糖制剂稀释至50-100mg/mL,并将10μL此溶液注射到配备有7.8x300 mm BioRad AminexHPX-42A柱和RI检测器的Agilent 1260BioPure HPLC上。使用纯HPLC级水作为洗脱液,将样品聚糖制剂以0.6mL/min通过80℃柱和保持在50℃的RI检测器进行洗脱。通过与参考标准品进行比较来分配代表DP1-6的峰,并使用Agilent ChemStation软件进行整合。典型地将峰整合为DP1、DP2、DP3、DP4-7和DP8+。使用以百分比表示的DP3+产率来监测反应的进展。图3显示DP3+产率与平均DP以串联方式变动,如man52glu29gal19的5种不同制剂所示的。平均DP的增加表明较小的聚糖如DP2和DP3的那些正在聚合成具有更高DP测量值的更大聚糖。五批相同的man52glu29gal19聚糖制剂也证明了批次的一致性(第1-3列),以及对一系列值中平均DP和DP3+产率的控制(第3-5列)。使用本文所述的受控过程可以实现针对15种示例性聚糖制剂所示的数据,该过程如所希望的产生聚糖制剂,其中DP3+从例如25%(低Mwman52glu29gal19)至例如87%(man80glu20),并且DP2+从例如54%(低Mwman52glu29gal19)至例如93%(man80glu20)。
通过2D NMR得到的α-/β-分布
通过二维NMR确定给定聚糖制剂内的α-糖苷键和β-糖苷键的比率。将大约150mg的65Brix聚糖溶液在45℃-95℃,400毫巴压力下在真空烘箱中干燥至稳定的质量。将样品聚糖制剂在D2O中进行两轮溶解并干燥以除去残余的H2O。干燥后,将样品聚糖制剂溶于具有0.1%丙酮的750μL D2O中,置于3mm NMR管中,并在配备有在21.1℃运行的Bruker BBFO探头的在500.13MHz 1H(125.77MHz 13C)下运行的Bruker Avance-III中分析。使用标准Bruker脉冲序列,使用杂原子单量子相干脉冲序列(HSQC)分析样品聚糖制剂。如Roslund等人(2008)Carbohydrate Res.[碳水化合物研究]343:101-112中报道的,通过类比葡萄糖分配4-6ppm(1H)和80-120ppm(13C)之间的异头质子。光谱参考内部丙酮信号:1H–2.22ppm;13C–30.89ppm。使用来自梅斯特实验室研究公司(Mestrelab Research)(圣地亚哥-德孔波斯特拉(Santiago de Compostela),西班牙)的MNova软件包,通过整合它们各自的峰来定量异构体。图4显示gal50glu50和glu100的两种示例性聚糖制剂的α-/β-比率尽管在平均DP上有变化,但并未显著改变,而man52glu29gal19制剂即使在具有低平均DP的制剂中也具有明显更高的α-/β-比率。当man52glu29gal19制剂的平均DP上升时,这个比率不会显著增加。虽然α-/β-比率和平均DP是独立特性,但它们可以独立控制。例如,可以通过选择相对于另一构型对一种构型具有固有偏好的单体来控制α-/β-比率。表1中的针对15种示例性聚糖制剂的数据显示,可以控制本文所述的过程以产生具有约1(1.136,glu50gal50)至约5(5.556,man80glu20)的α-/β-比率的聚糖。
支化分析
量化给定聚糖内糖苷区域异构体的分布(支化)。对于糖基键分析,将样品聚糖制剂进行全甲基化、解聚、还原和乙酰化;并且通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析所得部分甲基化糖醇乙酸酯(PMAA),如Heiss等人(2009)Carbohydr.Res.[碳水化合物研究]344:915中所述。将样品聚糖制剂悬浮在200μl二甲基亚砜中并搅拌1天。通过用氢氧化钠(15min)和甲基碘(45min)处理两轮实现全甲基化。通过加入2M三氟乙酸并加热至121℃持续2小时将水溶液水解。将固体真空分离并在乙酸/三氟乙酸中乙酰化。在接合到5975C MSD(质量选择检测器,电子碰撞电离模式)的Agilent 7890A GC上分析所得PMAA;在30m Supelco SP-2331键合相熔融石英毛细管柱上进行分离。通过加上每个类型的支化单体的百分比并除以100来计算支化度(DB)。可以控制平均DB。图5显示平均DB与平均DP一起变动。DP<4的聚糖不能支化。随着聚糖寡聚体延长,链沿骨架侧部而不是在骨架末端伸长的统计可能性增加。表1中15种示例性聚糖制剂的数据显示,可以控制该过程以产生具有范围从约0.05(例如0.084,低Mw man52glu29gal19)至约0.6(例如0.632,高Mw xyl100)的平均DB的聚糖。
溶解度
针对溶解度的两个基准分析所有聚糖制剂:在水中在10%和75%w/w下。为了确定在水中在10%w/w下的溶解度,通过冻干或其他方法以干燥形式分离聚糖制剂,获得精确的重量,并将9x重量的水加入到聚糖中。聚糖被认为是可溶的,如果除了涡旋、超声处理或用温控热枪或水浴加热到45℃之外不使用溶解技术可以获得澄清溶液的话。如果溶解处理后聚糖溶液保持混浊,具有明显的颗粒物质,在无菌过滤后在实验上有显著的浓度变化,或在冷却时形成可见的凝胶或悬浮液,则认为聚糖不溶。为了测定在水中在75%w/w下的溶解度,将聚糖制剂完全溶于水中,然后使用旋转蒸发器从溶液中除去水,直至浓度达到75Brix,如用糖折射仪测量的。如果在4℃下储存24小时后糖浆保持澄清和无沉淀,则聚糖制剂被认为是可溶的。如果达到75Brix之前在糖浆中形成固体或在冷藏期间形成沉淀物,则聚糖制剂被认为是不溶的。制备的所有聚糖均可溶成60Brix和高达75Brix的溶液。
表1. 15种示例性聚糖制剂的表征。
并入本文的WO/2016/122889GLYCAN THERAPEUTICS AND RELATED METHODSTHEREOF[聚糖治疗剂及其相关方法]实例5中表征了另外的示例性聚糖制剂(例如通过折射测定、GC-MS、SEC、IAC、2D NMR/HSQC光谱和全甲基化)。
实例5:聚糖制剂调节来自体外繁殖的鼻和口人类样品的细菌群落。
进行离体测定以评估在暴露于不同聚糖制剂时健康人类志愿者前鼻孔(鼻腔)和唾液(口腔)中微生物群落中细菌分类群的生长和相对丰度的变化。设计该测定以评估不同聚糖制剂差异调节与人类的两个示例性粘膜部位(口腔和鼻腔)相关的细菌微生物群的能力。在测定中,15种示例性聚糖制剂:glu80man20、glu60man40、man80gal20、glu100、man66gal33、glu50gal50、man100、man52glu29gal19、man60glu40、man80glu20、glu33gal33fuc33、xyl75ara25、ara100、gal100、xyl100和可商购的对照低聚果糖FOS(Nutraflora FOS;NOW食品公司(NOW Foods),伊利诺斯州布鲁明戴尔(Bloomingdale IL))在水中以5%w/v制备,过滤灭菌并且加入到Costar 3370 96孔微量培养板中以达到0.5%w/v的终浓度,一式三份地测定每种聚糖制剂,并且供应右旋糖和水作为阳性和阴性对照。
人类鼻腔细菌群落
从健康人类志愿者获得鼻腔微生物群落,通过无菌拭子插入鼻孔大约半英寸,并沿着鼻孔内围将拭子擦拭3次。从每个鼻样品制备接种物,通过在补充有1%(v/v)最终切碎的肉葡萄糖肉汤(厌氧菌系统公司(Anaerobe Systems))的900mg/L氯化钠、26mg/L二水合氯化钙、20mg/L六水合氯化镁、10mg/L四水合氯化锰、40mg/L硫酸铵、4mg/L七水合硫酸铁、1mg/L六水合氯化钴、300mg/L磷酸氢二钾、1.5g/L磷酸氢二钠、5g/L碳酸氢钠、0.125mg/L生物素、1mg/L吡哆醇、1m/L泛酸盐、75mg/L组氨酸、75mg/L甘氨酸、75mg/L色氨酸、150mg/L精氨酸、150mg/L甲硫氨酸、150mg/L苏氨酸、225mg/L缬氨酸、225mg/L异亮氨酸、300mg/L亮氨酸、400mg/L半胱氨酸和450mg/L脯氨酸中搅拌拭子15秒(Theriot CM等人Nat Commun.[自然通讯]2014;5:3114)。
人类口腔细菌群落
由人类志愿者将唾液流到无菌收集管中获得口腔微生物群落。从每个唾液样品制备接种物,通过将唾液加入到100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)、15mM氯化钠、8.5mM硫酸铵、4mML-半胱氨酸、1.9μM血红素、200μM L-组氨酸、100μM氯化镁、1.4μM七水合硫酸铁、50μM氯化钙、1μg/mL维生素K3和5ng/mL维生素B12中至最终为1%v/v(Martens EC等人Cell Host&Microbe[细胞宿主与微生物]2008;4,447–457)。将接种物加入到测定板中,每孔200μL的最终测试体积以及0.5%w/v的聚糖和右旋糖的最终测试浓度,并且在37℃下有氧孵育4天。根据制造商的说明使用Biotek Synergy2读取器以Gen5 2.0软件获得孵育期结束时的OD600测量值。
16s测序
为了确定微生物群落的组成,使用MoBio Soil DNA提取从200uL在0、9、12、18.5和48小时收获的培养物中提取基因组DNA。使用515正向引物和806反向引物来扩增16S rRNA基因的V4区,如Caporaso JG,Lauber CL,Walters WA,Berg-Lyons D,Huntley J,FiererN,Owens SM,Betley J,Fraser L,Bauer M,Gormley N,Gilbert JA,Smith G,KnightR.2012.Ultra-high-throughput microbial community analysis on the IlluminaHiSeq and MiSeq platforms.[Illumina HiSeq和MiSeq平台上的超高通量微生物群落分析。]ISME J[ISME杂志]中所述。使用Illumina MiSeq仪器对扩增子进行测序,250bp长读数,使用配对末端化学。使用97%序列一致性分析操作分类单元(OTU)。在不同的粘膜部位和聚糖制剂中比较OTU的表示。在表2中总结了来自人类供体的离体繁殖群体中两个粘膜部位(鼻腔和口腔)的丰度最大的细菌分类群。对于鼻腔,丰度最大的细菌属包括棒状杆菌属、差异球菌属和葡萄球菌属。对于口腔,丰度最大的细菌属包括普氏菌属、奥里杆菌属、双歧杆菌属和莫氏菌属。
表2.鼻腔和口腔各自的离体群落中丰度最大的细菌分类群。平均占>5%的所有属。
鼻腔细菌分类群的调节以及与疾病和致病条件的关联
在鼻离体测定中,通过至少8种聚糖制剂差异调节棒状杆菌属和葡萄球菌属的相对丰度。相对于葡萄糖(基线),Ara100、Xyl100、Man80gal20、Gal100、xyl75ara25和Man66gal33倾向于促进棒状杆菌属超过葡萄球菌属生长,并使平衡有利于棒状杆菌属转变,离体培养物中存在更多的棒状杆菌属和更少的葡萄球菌属。
鼻腔可作为金黄色葡萄球菌物种的储库,并且金黄色葡萄球菌携带是医院内金黄色葡萄球菌菌血症的重要危险因素(Wertheim,H.F.L.等人(2004).Risk and outcome ofnosocomial Staphylococcus aureus bacteraemia in nasal carriers versus non-carriers[鼻携带者与非携带者相比医院内金黄色葡萄球菌菌血症的风险和结果].LancetLond.Engl.[柳叶刀英国伦敦]364,703–705)。鼻微生物组也被认为在慢性鼻窦炎(CRS)的发病机制中发挥作用。虽然CRS患者和健康对照的总细菌负荷相似,但CRS患者倾向于具有比对照多样性较小的微生物组且金黄色葡萄球菌更普遍(Wilson,M.T.和Hamilos,D.L.(2014).The nasal and sinus microbiome in health and disease[健康和疾病情况下的鼻腔和鼻窦微生物组].Curr.Allergy Asthma Rep.[变态反应与哮喘近期报告]14,485)。
在前鼻孔中,与中耳炎和鼻窦炎相关的机会致病菌莫拉氏菌属的增加与包括葡萄球菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属在内的属的减少相关。如表2所示,离体鼻测定中的聚糖制剂支持微生物群落的生长,其中棒状杆菌属和葡萄球菌属的平均相对丰度超过70%,是丰度最大的分类群中的两个。因此可以给予聚糖制剂来促进葡萄球菌属和棒状杆菌属等属的生长以获得治疗益处,包括以不利于机会致病菌如莫拉氏菌属的生长或繁殖的方式调节细菌平衡(例如,在生态位例如鼻腔中的相对丰度)。口腔细菌分类群的调节以及与疾病和致病条件的关联
在口腔离体测定中,20小时通过至少9种聚糖制剂来差异调节来自两名受试者的样品普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属和嗜血杆菌属的相对丰度,如图6所总结的。在来自一名或两名所述受试者的口腔微生物组样品的测定中,聚糖制剂产生与FOS不同的相对丰度。在来自两名受试者的样品的测定中,FOS导致主要为普氏菌属的高相对丰度。在来自受试者1007的样品中,在glu100、man66gal33和man60glu40上嗜血杆菌属的相对丰度大于普氏菌属。在来自受试者1002的样品中,在man80glu20和xyl100上,普氏菌属是丰度最大的,并且嗜血杆菌属、奈瑟氏菌属和奥里杆菌属的相对丰度通常为至少5%。此外,如图7所总结的,在来自一名或两名受试者的样品的测定中,相对于FOS和/或葡萄糖,通过至少4种聚糖制剂来各自调节普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属和嗜血杆菌属。在测定中,相对于FOS或葡萄糖,通过glu100、man80glu20、man60glu40和gal100增加了普氏菌属相对丰度。在测定中,相对于FOS或葡萄糖,用glu100、man80glu20、xyl100和man66glu33增加了奥里杆菌属。在测定中,相对于葡萄糖或FOS,用glu100、glu80man20、xyl100和glu50gal50增加了奈瑟氏菌属,包括针对有益细菌物种微黄奈瑟氏菌的OTU。在测定中,相对于FOS或葡萄糖,用glu100、glu80man20、glu33gal33fuc33和ara100增加了嗜血杆菌属。在本测定中,相对于FOS或葡萄糖,通过至少一种聚糖制剂显著增加了8个另外的属即双歧杆菌属、贫养菌属、梭菌目、卡氏菌属、Moryella、纤毛菌属、艾肯菌属和凝聚杆菌属的相对丰度。普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属和嗜血杆菌属以及微黄奈瑟氏菌物种已与良好的口腔健康和低牙菌斑相关(Pereira等人,Braz Dent J[巴西牙科杂志]2012)。在测定中通过聚糖制剂对口腔微生物群的调节支持这样的想法,即可以给予聚糖制剂来调节口腔微生物群并促进有益细菌的生长以改善或保持良好的口腔健康。
实例6:聚糖制剂在体外差异调节来自人鼻腔、口腔和阴道部位的细菌菌株。
进行体外测定以评估各个细菌菌株(包括含有粘膜组织的非肠部位如鼻孔(鼻腔)、阴道和口腔的共生菌)利用不同聚糖制剂作为生长基质的能力。设计本测定用于评估选择的聚糖制剂差异调节与各个非肠粘膜部位相关的细菌的生长的能力。在测定中有氧或厌氧地处理细菌分离株。对于厌氧培养,在特征在于钯催化剂的厌氧室(AS-580,厌氧菌系统公司)中在所有步骤中处理菌株。最初通过用5%氢气、5%二氧化碳和90%氮气的厌氧气体混合物进行吹扫来使该室厌氧化,并且随后使用这种相同的厌氧气体混合物来保持厌氧状态。每天使用在氧气存在下改变颜色的Oxoid厌氧指示剂条来确认该室的厌氧性。在与细菌接触之前,将用于测试厌氧培养物的所有培养基、测定板、其他试剂和塑料消耗品在厌氧室中预先还原24-48小时。在测定中,14种示例性聚糖制剂:glu80man20、glu60man40、man80gal20、glu100、man66gal33、glu50gal50、man100、man52glu29gal19、man60glu40、man80glu20、glu33gal33fuc33、xyl75ara25、gal100、xyl100和可商购的对照FOS(Nutraflora FOS;NOW食品公司,伊利诺斯州布鲁明戴尔)在水中以5%w/v制备,过滤灭菌并且加入到Costar 3370测定板中以达到0.5%w/v的终浓度,一式三份地测定每种聚糖,并且供应右旋糖(最终0.5%w/v)和水作为阳性和阴性对照。
从美国典型培养物保藏中心(ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯)获得细菌分离株。在37℃下,使表皮葡萄球菌(ATCC 14990,“SEP.55”)和人葡萄球菌(ATCC 27844,“SHO.56”)的培养物在脑心浸液肉汤(BHI,Teknova公司)(包括脑浸液、心浸液、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠和磷酸二钠的富浸液培养基)中有氧生长18-24小时。在37℃下,使卷曲乳杆菌(ATCC 33820,“LCR.43”)、格氏乳杆菌(ATCC 33323,“LGA.44”)、惰性乳杆菌(ATCC 55195,“LCR.45”)、痤疮丙酸杆菌(ATCC 6919,“PAC.48”)、金黄色葡萄球菌(ATCC 12600,“SAU.54”)和口腔链球菌(ATCC 35037,“SOR.60”)的培养物在布鲁氏菌血琼脂(厌氧菌系统公司,加利福尼亚州摩根山)(补充有维生素K、血红素和绵羊血的富集培养基)上厌氧生长18-48小时。从布鲁氏菌血琼脂上刮下菌落并将其悬浮在切碎的肉葡萄糖肉汤(CMG,厌氧菌系统公司)中,即包括绞碎的瘦牛肉、酪蛋白的酶消化物、酵母提取物、磷酸钾、右旋糖、半胱氨酸、血红素和维生素K1的预还原富集培养基。根据制造商的方案,通过在Costar 3370聚苯乙烯96孔平底测定板中使用Biotek Synergy 2读板器以Gen5 2.0一体化微板读取器软件(All-In-OneMicroplate Reader Software)测定每种液体培养物或细胞悬浮液在600nM(OD600)的光密度,并在没有糖的情况下制备的限定和半限定培养基中将细胞稀释至OD600最终为0.01,来制备接种物。在补充有0-3.5%(v/v)CMG的900mg/L氯化钠、26mg/L二水合氯化钙、20mg/L六水合氯化镁、10mg/L四水合氯化锰、40mg/L硫酸铵、4mg/L七水合硫酸铁、1mg/L六水合氯化钴、300mg/L磷酸氢二钾、1.5g/L磷酸氢二钠、5g/L碳酸氢钠、0.125mg/L生物素、1mg/L吡哆醇、1m/L泛酸盐、75mg/L组氨酸、75mg/L甘氨酸、75mg/L色氨酸、150mg/L精氨酸、150mg/L甲硫氨酸、150mg/L苏氨酸、225mg/L缬氨酸、225mg/L异亮氨酸、300mg/L亮氨酸、400mg/L半胱氨酸和450mg/L脯氨酸中测试痤疮丙酸杆菌和口腔链球菌分离株(Theriot CM等人NatCommun.[自然通讯]2014;5:3114)。在补充有0-5%无葡萄糖BHI的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)、15mM氯化钠、8.5mM硫酸铵、4mM L-半胱氨酸、1.9μM血红素、200μM L-组氨酸、100μM氯化镁、1.4μM七水合硫酸铁、50μM氯化钙、1μg/mL维生素K3和5ng/mL维生素B12中测试表皮葡萄球菌和人葡萄球菌(Martens EC等人.Cell Host&Microbe[细胞宿主与微生物]2008;4,447–457)。在10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、0.5g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.1M磷酸钾缓冲液pH 7.2、1μg/mL维生素K3、0.08%w/v氯化钙、0.4μg/mL七水合硫酸铁、1μg/mL刃天青、1.2μg/mL血色素、0.2mM组氨酸、0.05%Tween 80、0.5%肉膏(西格玛公司(Sigma))、1%痕量矿物质补充物(ATCC)、1%维生素补充物(ATCC)、0.017%v/v乙酸、0.001%v/v异戊酸、0.2%v/v丙酸和0.2%v/v N-丁酸中测试金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌和惰性乳杆菌(Romano KA等人mBio 2015;6(2):e02481-14)。有氧测试格氏乳杆菌、人葡萄球菌和表皮葡萄球菌,并厌氧测试痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、口腔链球菌、卷曲乳杆菌和惰性乳杆菌。在96孔微孔板(每孔200μL终体积)中,在37℃下,使细菌暴露于终浓度0.5%w/v的14种聚糖制剂glu80man20、glu60man40、man80gal20、glu100、man66gal33、glu50gal50、man100、man52glu29gal19、man60glu40、man80glu20、glu33gal33fuc33、xyl75ara25、gal100、xyl100以及FOS和右旋糖持续18-48小时。根据制造商的说明使用Biotek Synergy2读取器以Gen52.0软件获得孵育期结束时每个分离株的OD600测量值。通过将测试聚糖制剂上的分离株的OD600读数除以补充有0.5%w/v右旋糖的培养基中的分离株的平均OD600来获得标准化生长值(NGV),以促进比较在显著不同的OD600范围内生长的菌株的聚糖利用。表3总结了获得的结果。
表3.聚糖制剂差异地支持与非肠粘膜部位鼻腔、口腔和阴道相关的细菌生长。
在测定中,聚糖制剂差异地调节与粘膜部位相关的细菌菌株的生长。
阴道
在测定中,聚糖制剂glu80man20、glu100和glu60man40促进了阴道相关乳杆菌的最强生长,其中LCR.43和LGA.44的标准化生长值为0.3->0.7并且LIN.45的标准化生长值为0.1-0.3。在测定中,glu33gal33fuc33支持3种阴道相关乳杆菌的生长,标准化生长为至少0.1。在测定中,14种聚糖中的10种支持至少2种乳杆菌的生长,标准化生长值为至少0.1,而可商购比较物FOS仅支持1个乳酸菌分离株LCR.43的生长。
鼻腔
在测定中,glu33gal33fuc33也支持鼻共生菌表皮葡萄球菌(SEP.55)和人葡萄球菌(SHO.56)的生长,标准化生长值>0.1,但不支持痤疮丙酸杆菌(PAC.48)或金黄色葡萄球菌(SAU.54)的生长。在测定中,人葡萄球菌(SHO.56)是在gal100、xyl75ara25、glu50gal50和xyl100上标准化生长>0.1的唯一菌株。
口腔
在测定中,含有甘露糖-半乳糖的杂聚糖制剂(例如man80gal20、man66gal33和man100)促进口腔相关的口腔链球菌SOR.60的生长,标准化生长为至少0.1。
因此聚糖似乎差异地促进与各个人类粘膜部位相关的细菌分离株的生长。可以给予聚糖制剂以选择性地促进与疾病或生态失调状态相关的细菌物种具有拮抗关系或与其反向相关的微生物群的成员。
阴道细菌分类群和多样性的调节以及与疾病和致病条件的关联
包括卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌和惰性乳杆菌的乳杆菌与健康的人类阴道菌群相关,并且被认为通过乳酸产生来降低阴道pH而有助于抵御病原体。由乳杆菌占优势的阴道细菌群落与细菌性阴道病呈负相关(Ravel等人,PNAS2011第108卷)。一些乳酸菌产生过氧化氢也被认为有助于抵御病原体和保持阴道健康,并且已发现乳杆菌特别是过氧化氢产生物种的丰度在具有细菌性阴道病的女性中显著降低(Mijac等人,European Journal ofObstetrics&Gynecology and Reproductive Biol[欧洲产科和妇科以及生殖生物学杂志],2006)。给予聚糖制剂来选择性促进乳杆菌生长(并且可能进而降低阴道部位中的细菌多样性)可能对保持或恢复与健康相关的阴道微生物群有治疗益处,并且可能有益于治疗或预防与微生物组生态失调有关的病症如细菌性阴道病。
鼻腔细菌分类群的调节以及与疾病和致病条件的关联
给予聚糖制剂来选择性地促进某些共生菌的生长可能在鼻孔(和鼻腔)中具有治疗益处。葡萄球菌菌株代表鼻微生物组的重要组分,并且在鼻体外测定中以13%的平均丰度存在。单菌株生长测定数据显示不同葡萄球菌物种的差异调节,并且通过glu33gal33fuc33选择性促进一个物种(例如表皮葡萄球菌)的生长可以调节其他物种如金黄色葡萄球菌的生长或活性。通常在鼻和咽中发现的表皮葡萄球菌菌株的蛋白酶分泌已显示抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成和鼻定殖(Iwase等人,Nature[自然],2010)。在外科重症监护病房用洗必泰浴和鼻内给予抗生素莫匹罗星的患者中对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的去定殖已与MRSA感染率降低相关;然而,也与明显增加的莫匹罗星抗性相关(Cho等人,Am J Infect Control[美国传染病控制杂志],2016)。给予选择性促进表皮葡萄球菌生长的聚糖制剂可能有利于MRSA去定殖而不促进莫匹罗星抗性。
口腔细菌分类群的调节以及与疾病和致病条件的关联
口腔共生物种口腔链球菌与健康的人类口腔微生物群相关,并被认为对口腔健康有益。已经发现其通过产生过氧化氢抑制口腔病原体的生长(Herrero等人,Antimicrobialeffects of commensal oral species are regulated by environmental factors[共生口腔物种的抗微生物作用受环境因素调节]J.Dent[牙科杂志]2016)。在测定中,聚糖man80gal20、man66gal33和man100支持口腔链球菌的生长,标准化生长值>0.1。可以给予聚糖来支持口腔链球菌或其他有益细菌的生长以保持或改善口腔健康。
这些数据显示制备了至少35种不同的聚糖制剂,其包括由一种、两种或三种不同单体制备的制剂(实例1),其中有至少15种聚糖制剂或各个批次表征了选自DP2+(二聚体及以上)产率、DP3+(三聚体及以上)产率、重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、多分散指数(PDI)、平均聚合度(DP)、平均支化度(DB)和α糖苷键与β糖苷键比率(a/b比率)的至少6个特性(实例4)。
在来源于含粘膜组织的部位(鼻腔和口腔)的人类样品的细菌群落的2个离体测定(实例5)中,测试了至少15种表征的聚糖制剂。至少12种聚糖制剂调节了口腔的至少一种常见的细菌成分。至少9种聚糖制剂调节了被认为与口腔健康相关的至少一种细菌成分。至少8种聚糖制剂调节了离体鼻腔群落中至少两种丰度最大的细菌成分。
针对作为含有粘膜组织的3个部位(鼻腔、口腔和阴道)的代表性成员的一组8种体外细菌菌株(实例6)测试了至少14种表征的聚糖制剂。所有14种聚糖制剂均调节了至少一种细菌菌株的生长,至少10种聚糖制剂调节了至少5种测试细菌菌株(跨至少2个不同部位)。
实例7.用质谱(MS)或1H-核磁共振(1H-NMR)测量代谢物
基于它们对微生物发酵产物的存在的影响,选择聚糖制剂以给予动物或人类受试者。例如,针对诱导或促进产生短链脂肪酸如丙酸盐(丙酸)、乙酸和/或丁酸盐(丁酸)的细菌生长的能力来选择聚糖制剂群体。类似地,针对诱导或促进产生乳酸的细菌生长的能力来选择聚糖制剂群体,乳酸可通过产生酸性环境来调节其他细菌的生长。此类分析也可以用于将益生菌与聚糖制剂配对,使得聚糖制剂是用于产生希望的发酵产物的底物。
使用本文所述的方法测定新鲜或用过的培养基或从人或动物收集的生物样品中存在的代谢物。无偏方法用来确定样品中代谢物的相对浓度并且是本领域技术人员已知的。气相色谱或液相色谱组合质谱法用来确定上述样品中各种代谢物的量和身份。可替代地,1H-NMR用于无偏代谢组学分析。这些测量通过运行代谢物标准品由相同的分析系统进行验证。
气相色谱-质谱(GC-MS)
极性代谢物和脂肪酸使用有机溶剂和含水样品的单相或双相系统进行提取并衍生化(Fendt等人,Reductive glutamine metabolism is a function of theα-ketoglutarate to citrate ratio in cells[还原性谷氨酰胺代谢是细胞中α-酮戊二酸与柠檬酸比率的函数],Nat Commun[自然通讯],2013,4:2236)(Fendt等人,Metformindecreases glucose oxidation and increases the dependency of prostate cancercells on reductive glutamine metabolism[甲福明减少葡萄糖氧化并增加前列腺癌细胞对还原性谷氨酰胺代谢的依赖性],Cancer Res[癌症研究],2013,73:4429)(Metallo等人,Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia[IDH1对还原性谷氨酰胺的代谢在低氧下介导脂肪生成],Nature[自然],2011,481:380)。简言之,通过在吡啶(或MOX试剂(赛墨科技公司(Thermo Scientific)))中用2%甲氧基胺盐酸盐(MP生物医学公司(MP Biomedicals))孵育,随后加入N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)与1%叔丁基二甲基氯硅烷(t-BDMCS)(里吉斯技术公司(RegisTechnologies)),来衍生极性代谢物以形成甲氧肟-tBDMS衍生物。将非极性级分(包括三酰甘油酯和磷脂)皂化成游离脂肪酸,并通过用甲醇中的2%H2SO4孵育或通过使用甲基-8试剂(赛墨科技公司)进行酯化以形成脂肪酸甲酯。使用在接合到Agilent 5975C质谱仪(MS)的Agilent7890A气相色谱(GC)中安装的DB-35MS柱(30m x 0.25mm i.d.x 0.25μm,安捷伦J&W科学公司(Agilent J&W Scientific)),通过GC-MS分析衍生化样品。通过整合代谢物离子片段来确定质量同位素分布,并使用改编自Fernandez等人(Fernandez等人,Correctionof 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance[针对自然稳定的同位素丰度校正13C质量同位素分布],J Mass Spectrom[质谱测定法杂志],1996,31:255)的算法对天然丰度进行校正。
极性代谢物的液相色谱-质谱(LC-MS)
提取后,将样品转移到聚丙烯小瓶中,并使用Q Exactive Benchtop LC-MS/MS(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))分析样品。通过在SeQuant ZIC-pHILICPolymeric柱(2.1x 150mm;EMD密理博公司(EMD Millipore))上注入2μL样品来实现色谱分离。流速设定为100μL/min,柱室设定为25℃,并且自动进样器样品盘设定为4℃。流动相A由水中的20mM碳酸铵和0.1%氢氧化铵组成。流动相B是100%乙腈。流动相梯度(%B)如下:0min 80%,5min 80%,30min 20%,31min 80%,并且42min 80%。将所有的流动相引入配备有HESI II探头组的Ion Max源中,参数如下:鞘流气=40,辅助气=15,扫气=1,喷雾电压=3.1kV,毛细管温度=275℃,S-透镜RF水平=40,加热器温度=350℃。使用全扫描或靶向选择离子监测(tSIM)方法,以负或正模式监测代谢物。对于tSIM方法,通过在自然丰度的一组相邻运行中以实验方式测量四极偏差,针对四极偏差来校正原始计数。用m-1、m0、m1和m2中心扫描,通过监测所有物种天然丰度的测量与理论m1/m0比率,测量所有物种的四极偏差。另外针对天然丰度校正四极偏差校正计数,以获得每个样品中每种化合物的最终质量同位素分布。
1H-核磁共振(1H-NMR)
为了制备提取的样品用于通过1H-NMR进行分析,将400μL样品与200μL补充有5mM2,2-二甲基-2-硅杂戊烷-5-磺酸钠盐(DSS-d6,针对化学位移的标准和参考;Isotec公司,美国)的50mM磷酸盐缓冲液(用D2O中的Na2HPO4、NaH2PO4制备,pH 7.4)合并并短暂涡旋。将溶液以1000g离心1min,并且然后将500μL转移至5mm NMR管(VWR)。在配备有5mm QXI-Z C/N/P探针头的NMR光谱仪(Avance II+500Bruker光谱仪(500mHz)(布鲁克公司(Bruker),德国))上获得1H-NMR光谱并用光谱积分软件(Chenomx NMR Suite 7.1;Chenomx公司,艾伯塔省埃德蒙顿(Edmonton,AB))进行分析。(Duarte等人,1H-NMR protocol for exometabolomeanalysis of cultured mammalian cells[用于培养的哺乳动物细胞的胞外代谢组分析的1H-NMR方案],Methods Mol Biol[分子生物学方法],2014:237-47)。可替代地,按照其他公开的方案进行1H-NMR。(Chassaing等人,Lack of soluble fiber drives diet-inducedadiposity in mice[可溶性纤维的缺乏驱动小鼠体内的食源性肥胖],Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol[美国生理学杂志—胃肠道和肝脏生理学],2015)(Bai等人,Comparison of Storage Conditions for Human Vaginal Microbiome Studies[对人类阴道微生物组研究的贮藏条件进行比较],PLoS ONE[公共科学图书馆·综合],2012:e36934)
实例8.聚糖制剂对鼻微生物组的作用
聚糖制剂是以这样的方式配制的,使得通过喷雾剂或局部施用的凝胶将它们直接给予在鼻腔中。可替代地,聚糖制剂通过胶囊或片剂形式口服给予,使得它们通过由肠道微生物群形成的代谢物或通过肠道微生物群对宿主的其他调节而提供对鼻微生物群的间接作用。在通过拭子施用聚糖制剂配制品之前和之后获得鼻微生物群的样品。然后通过16SrRNA基因测序、全基因组测序或RNA-Seq研究微生物群体转变,以确定给予的聚糖制剂的作用。测量微生物代谢物的转变,例如,如实例7中所述。将处理后样品与预处理样品进行比较。
在本实例中,在已知具有金黄色葡萄球菌或甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)鼻携带的人类受试者中评估聚糖制剂的作用。通过培养在含有7.5%氯化钠和1%甘露醇的胰蛋白胨基肉汤(Difco m葡萄球菌肉汤;碧迪公司(Becton Dickinson))中孵育过夜的鼻拭子来确定携带,并继代培养到补充有苯唑西林(2mg/mL;Quelab公司)的甘露糖醇-盐琼脂上。使用标准方法鉴定MRSA,包括用于检测青霉素结合蛋白2a的乳胶凝集测试(MRSA-Screen;日本生研公司(Denka Seiken))。如上所述,聚糖制剂是鼻内或口服施用的。给予聚糖制剂是用于缺乏由医师确定的共同治疗的情况下。可替代地,在用标准护理治疗之前、同时或治疗之后给予聚糖制剂以从鼻腔去除金黄色葡萄球菌,包括局部施用莫匹罗星或口服抗生素如利福平和多西环素;聚糖制剂也可以与有益细菌联合给予。在合适的治疗期内,观察到鼻腔中金黄色葡萄球菌或MRSA的减少。另外,对于摄入并且产生全身作用导致解决了鼻腔中疾病状态的聚糖制剂,观察到以下变化:肠道微生物群远离疾病状态且向着健康状态转变或短链脂肪酸增加。
实例9.聚糖制剂在金黄色葡萄球菌鼻定殖的动物模型中的作用
使用已建立的动物模型,测试聚糖制剂减少或消除金黄色葡萄球菌鼻定殖的能力。此类模型存在于棉鼠(Methods Mol Biol.[分子生物学方法]2008;431:241-54TheCotton Rat as a Model for Staphylococcus aureus nasal colonization in humans:cotton rat S.aureus nasal colonization model[棉鼠作为金黄色葡萄球菌在人鼻中定殖的模型:棉鼠金黄色葡萄球菌鼻定殖模型])、猪(Szabó,István等人ColonizationKinetics of Different Methicillin-ResistantStaphylococcus aureus SequenceTypes in Pigs and Host Susceptibilities[在猪中不同甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌序列类型的定殖动力学和宿主易感性].Applied and Environmental Microbiology[应用与环境微生物学]78.2(2012):541–548)和小鼠(Holtfreter,Silva等人Characterizationof a Mouse-Adapted Staphylococcus aureus Strain[小鼠适应金黄色葡萄球菌菌株的表征].PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]8.9(2013):e71142;Park,Bonggoo,TadayukiIwase和George Y.Liu.Intranasal Application of S.Epidermidis PreventsColonization by Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus in Mice[鼻内施用表皮葡萄球菌阻止了甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在小鼠中的定殖].PLoS ONE 6.10[公共科学图书馆·综合](2011):e25880)中。对于小鼠模型,使用含链霉素的培养基,金黄色葡萄球菌菌株(人致病性菌株,如MRSA USA500或小鼠适应性菌株JSNZ)被赋予链霉素抗性,使得来自鼻组织的天然细菌菌群可从平板计数中消除。使细菌通常生长过夜并直接接种到初试小鼠的鼻孔中。在接种后的不同时间,将小鼠安乐死,并将鼻组织切除并均化。然后将匀浆的稀释液施用于含链霉素和不含链霉素的TSA琼脂板上。然后枚举菌落以确定金黄色葡萄球菌定殖的水平。给予聚糖制剂是在几种方案之后进行的,包括唯独在金黄色葡萄球菌接种之前、金黄色葡萄球菌接种后或整个研究中。通过将液体溶液直接滴入鼻孔或口服来给予聚糖制剂。通过如上所述的细菌枚举来确定聚糖制剂与安慰剂(对照)的作用。此外,通过对鼻匀浆进行DNA或RNA分离和16S或转录组分析来确定聚糖制剂对天然微生物群的作用。
实例10:用于治疗慢性鼻窦炎的鼻腔喷雾剂的配制和功效
进行本研究以确定给予示例性聚糖制剂(例如,如本文所述)与丙酸氟替卡松组合对于治疗慢性鼻窦炎的有效性。制备包括高达75%(例如在50%和75%之间)的聚糖制剂、微细丙酸氟替卡松(50mcg,任选地在10mcg和100mcg之间)和任选地以下各项中的一种或多种的水性悬浮液:微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、右旋糖、苯扎氯铵、聚山梨醇酯80和苯乙醇(0.25%w/w),并将其装入计量雾化喷雾泵中。对患有慢性鼻窦炎的受试者给予该鼻腔喷雾剂并指示每天一次(或多次,例如2-5次)将该喷雾剂给予于鼻孔。一周后,与使用不含聚糖制剂的鼻腔喷雾剂遵循相同方案的受试者相比,对受试者的症状总体改善进行检查。
实例11:用于鼻前庭炎的吸入治疗剂的配制和功效
进行本研究以确定给予示例性聚糖制剂(例如,如本文所述)与莫匹罗星组合对于治疗鼻前庭炎的功效。在白水混溶软膏基质中制备包括高达75%(例如在50%和75%之间)的聚糖制剂、莫匹罗星(2%,任选地在1%和5%之间)和任选地PEG 400和PEG 3350的软膏,并且给予于单次使用的管中。患有鼻前庭炎的受试者被指示将来自单次使用的管的全部内容物每天一次(或多次,例如2-5次)局部施用至鼻孔,持续五天,在每次施用后按摩鼻通道一分钟。一周后,与使用不含聚糖制剂的软膏遵循相同方案的受试者相比,对受试者的症状总体改善进行检查。
实例12.聚糖制剂对口腔微生物组的作用
在液体、锭剂、舌下膜、糊剂或树胶中配制聚糖制剂,以便将它们直接给予于口腔中。液体施用包括“冲洗和吐”局部施用。此外,给予用于以液体、胶囊或片剂形式摄入的聚糖制剂可以通过由肠道微生物群形成的代谢物或通过肠道微生物群对宿主的其他调节来提供对口腔微生物群的间接作用。口腔微生物群的样品在施用聚糖制剂之前和之后通过流涎拭子、刮擦或收集来获得。然后如所述的通过16S rRNA基因测序、全基因组测序或RNA-Seq研究微生物群体转变,以确定给予的聚糖制剂的作用。测量微生物代谢物的转变,如实例7中所述。将处理后样品与预处理样品进行比较。在本实例中,在具有口腔疾病或病症的人类受试者中评估聚糖制剂的作用。例如,被诊断患有牙周病的其他方面健康的受试者被招募或纳入临床研究中。通过使用标准测量来确定诊断和严重程度,如用校准探针测量的齿龈探测深度、临床附着水平和探查评分时的牙龈出血。这样的受试者包括具有不同水平的牙周病的那些,范围从牙龈轻度至中度炎症到口腔骨流失。给予聚糖制剂是用于缺乏由医师确定的共同治疗的情况下。可替代地,在用标准护理治疗(包括抗生素、去除斑块的物理方法和益生菌)之前、同时或治疗之后给予聚糖制剂群体。在合适的治疗期内,观察到以下改变:牙周症状解决(根据上面列出的诊断标准评估)、牙菌斑减少、致病性口腔细菌如变异链球菌水平降低和/或与健康口腔微生物组相关的细菌水平增加。另外,对于摄入并且产生全身作用导致解决了牙周病症状的聚糖制剂,观察到以下变化:肠道微生物群远离疾病状态且向着健康状态转变或短链脂肪酸增加。
实例13.聚糖制剂在牙周炎动物模型中的作用
在多种牙周炎动物模型中测试了聚糖制剂。模型存在于啮齿动物、兔、猪、狗和非人灵长类动物中(Oz,Helieh S.和David A.Puleo.“Animal Models for PeriodontalDisease[牙周病动物模型].”Journal of Biomedicine and Biotechnology[生物医学和生物技术杂志]2011文章ID:754857)。沼泽水稻大鼠特别容易快速发展饮食诱发的牙周炎(Leonard,E.P.“Periodontitis.Animal Model:Periodontitis in the Rice Rat(Oryzomys Palustris)[牙周炎动物模型:水稻大鼠(稻鼠)的牙周炎].”The AmericanJournal of Pathology[美国病理学杂志]96.2(1979):643–646)。
在一种大鼠模型中,将动物麻醉且无菌,3-0黑色编织尼龙线(舒雅活公司(surgilon);USS/DG,美国康涅狄格州诺沃克)放置在双侧下颌第一磨牙的颈缘周围并向正中打结。结扎周围的区域容易形成生物膜,并引入特定物种的致病细菌(例如,牙龈卟啉单胞菌)以增加生物膜形成和发病机制。结扎后7天将大鼠在麻醉下处死。在从邻近结扎的组织取斑块/细菌样品之后,将下颌骨的一侧用于对石蜡进行常规组织学处理,并且将另一侧用于细菌分析。可替代地,通过对受影响区域的拭子采样随时间推移进行采样。给予聚糖制剂群体是在几种方案之后进行的,包括仅在起始事件(结扎放置或致病细菌接种)之前、起始后或整个研究中。通过将液体溶液直接滴入口腔或口服来给予聚糖制剂。可替代地,聚糖制剂被掺入食物或水中。通过细菌枚举来确定聚糖制剂与安慰剂(对照)的作用。此外,通过对口腔拭子样品或组织匀浆进行DNA或RNA分离和16S或转录组分析来确定聚糖治疗剂对天然微生物群的作用。还进行组织病理学分析以确定疾病状态的程度。
实例14.聚糖制剂对牙齿生物膜和牙齿腐烂的作用
牙齿生物膜(斑块)在牙齿表面形成,并且由多种微生物物种及其相关的细胞外基质组成。与其浮游(自由浮动)相对物相比,生物膜中生长的细菌可以展示出不同的代谢和表型特性。牙齿表面生物膜的形成和微生物组成对牙齿健康有重要意义;例如,含有过量细菌或过量产酸细菌的斑块可导致龋齿(蛀牙)形成。为了确定有益的聚糖制剂群体,使牙齿生物膜体外模型在聚糖制剂的存在下生长并测定它们的致龋特性、生长、群落组成、代谢物产生以及表型或转录组特性。聚糖制剂是基于它们在牙齿生物膜内引发所希望特性的能力来选择的。本测定之后是确保所选择的聚糖制剂促进包括治疗组合物的健康状态微生物群和/或一种或多种微生物的生长而不增加与疾病状态相关的微生物(例如,变异链球菌,与龋齿有关)的生长的步骤。通过针对在选定的疾病状态中过多或过低表达的一组生物膜细菌(单独地或成群地)测试聚糖制剂,选择了选择性增强健康状态细菌超过疾病状态细菌生长的聚糖制剂。
按照制造商的方案,使用卡尔加里生物膜装置(Calgary Biofilm Device)(MBECAssay;Innovotech公司),使牙齿生物膜在涂有羟基磷灰石的固体支持物(以模拟牙齿表面)上生长。可替代地,根据已建立的方案(Salli&Ouwehand,The use of in vitro modelsystems to study dental biofilms associated with caries:a short review[使用体外模型系统研究与龋齿相关的牙齿生物膜:短篇综述],2015,Journal of OralMicrobiology[口腔微生物学杂志],7:26149)(Edlund等人,An in vitro biofilm modelsystem maintaining a highly reproducible species and metabolic diversityapproaching that of the human oral microbiome[维持高度可再生的物种的体外生物膜模型系统和接近人类口腔微生物组的代谢多样性的代谢多样性],2013,Microbiome[微生物组],1:25),构建流式细胞生物膜模型或连续生物膜模型如人造口模型(AMM)。可替代地,使用如下模型,其中使生物膜生长在从动物或人牙齿获得的釉质板上(Steiner-Oliveira等人,An in vitro microbial model for producing caries-like lesions onenamel[用于产生釉质龋齿样损伤的体外微生物模型],2007,Braz J Oral Sci[巴西口腔科学杂志],6:1392)。模型中使用的微生物培养物包括单一培养物、混合培养物、从多个人或动物中分离的培养物、从一个人或动物中分离且掺有分离物或分离物集合的培养物、或者从一个人或动物中分离且耗尽物种集合(例如,通过施用抗生素)的培养物。培养物包括在体外牙齿生物膜模型中常用的微生物物种,如口腔链球菌、远缘链球菌、内氏放线菌、殊异韦荣菌、具核梭杆菌和白色念珠菌(苏黎世生物膜模型),并且还可以涵盖与形成龋齿相关的物种(变异链球菌)。将聚糖制剂制备成无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的浓缩储备溶液,并将其加入到与牙齿生物膜接触的介质中以达到所需的工作浓度。在37℃下适当的孵育期后,使用标准方案定量牙齿生物膜的组成和特性。对于采用来自动物或人牙齿的釉质板的体外模型,在测定结束时检查各板的龋齿样损伤。此外,在抗生素或其他测试化合物存在下进行本测定。此外,于通过在生长培养基中包括1%蔗糖而模拟致龋激发的条件下进行本测定(Koo等人,Exopolysaccharides Produced by Streptococcus mutansGlucosyltransferases Modulate the Establishment of Microcolonies withinMultispecies Biofilms[由变异链球菌葡糖基转移酶产生的胞外多糖调节多物种生物膜内微菌落的建立],2010,Journal of Bacteriology[细菌学杂志],192:3024)。
实例15:用于治疗龋齿和牙周炎的漱口剂的配制和功效
进行本研究以确定给予示例性聚糖制剂(例如,如本文所述)与氟化物和益生菌(例如有益细菌)组合对于治疗龋齿和/或牙周炎的有效性。制备在水中包括1%聚糖组合物、氟化钠(0.05%,0.02%w/v氟离子)、益生菌菌株(例如干酪乳杆菌,每50mL溶液7.0x109个活细胞)、山梨醇、丙二醇、水杨酸甲酯、调味剂(薄荷醇)、着色剂(绿3,黄5)和防腐剂(苯甲酸钠、乙二胺四乙酸和氯化十六烷基吡啶)的漱口剂溶液并以10mL的剂量提供给5名正经历龋齿和/或牙周炎的受试者。可替代地,五名受试者将接受运载体,其中制备类似的漱口剂,其包括除了示例性聚糖组合物之外的所有上述组分。指示受试者每天两次在口中将该漱口剂涡旋30秒,以实现在牙齿和牙龈上的均匀分布,然后在不吞咽的情况下排出该漱口剂。在研究过程中鼓励进行常规刷牙和口腔护理。6个月后,将检查受试者的牙齿健康整体改善,包括龋齿和牙周炎症状的进展。
实例16:用于治疗牙周炎的锭剂的配制和功效
将进行本研究以评价包括示例性聚糖制剂(例如,如本文所述)的硬锭剂治疗牙周炎的功效。制备包括高达85%(例如在50%和85%之间)聚糖组合物和任选地以下各项中的一种或多种的粘稠糖浆:另外的增稠剂、另外的甜味剂、丙二醇、pH调节剂(碳酸钙、三硅酸镁)、着色剂(绿3,黄5)和防腐剂(苯甲酸钠、乙二胺和氯化十六烷基吡啶)。使用标准技术将混合物煮沸并配成单硬锭剂。向每名具有牙周炎的受试者每天提供一个(或多个,例如2-5个)锭剂,而另外的受试者每名都接受不含聚糖组合物的运载体。指导受试者允许让锭剂溶解在口中,并且然后在高达30分钟后不吃或喝任何东西。在研究过程中鼓励进行常规刷牙和口腔护理。6个月后,将检查受试者的牙齿健康整体改善,包括牙周炎症状的进展。
实例17.聚糖制剂对阴道微生物组的作用
聚糖制剂在液体溶液中配制,使得通过冲洗涂药器或类似的递送装置给予它们。可替代地,聚糖制剂以片剂、栓剂或卫生棉条制备,使得它们被引入阴道内。聚糖制剂的持续释放是通过将其包含在阴道环中来实现的。可替代地,以液体、片剂或胶囊形式口服递送聚糖制剂通过由肠道微生物群形成的代谢物或通过肠道微生物群对宿主的其他调节来提供对阴道菌群的间接作用。在使阴道暴露于聚糖制剂之后,使用无菌拭子从阴道后穹窿直接观察来收集阴道液样品。然后通过16S rRNA基因测序、全基因组测序或RNA-Seq分析流体的特定代谢物或微生物群体的转变,以确定给予的聚糖制剂的作用。将处理后样品与预处理样品进行比较。在本实例中,在人类受试者中评估聚糖制剂的作用。被诊断患有细菌性阴道病(BV)的其他方面健康的受试者被招募或纳入临床研究中。这样的受试者包括具有新诊断的BV、复发性BV或与妊娠相关的BV的那些。通过满足阴道液样品中存在的四种临床(Amsel)标准(阴道pH>4.5,盐水显微镜下的线索细胞>20%的上皮细胞,添加氢氧化钾时的胺气味和均匀的阴道分泌物)中的三种和阴道液的革兰氏染色以确认异常菌群(Nugent得分>3)来诊断BV。给予聚糖制剂是用于缺乏由医师确定的共同治疗的情况下。可替代地,如医师所规定的,在标准护理治疗如口服或阴道施用的抗生素(包括甲硝唑、克林霉素、替硝唑和塞克硝唑)、抗真菌剂或阴道施用的激素(包括雌二醇)和益生菌之前、同时或治疗之后给予聚糖制剂。在合适的治疗期内,观察到以下变化:BV的症状解决(根据上面列出的标准诊断标准评估),阴道中乳杆菌属物种的水平增加,和/或总厌氧菌、总革兰氏阴性菌、阴道加德纳菌、阴道阿托波氏菌或与阴道中疾病状态相关的其他细菌减少。
实例18.聚糖制剂在细菌性阴道病动物模型中的作用
在由加德纳菌引发的细菌性阴道病小鼠模型中测试了聚糖制剂。在这个模型中(Gilbert NM,Lewis WG,Lewis AL(2013)Clinical Features of Bacterial Vaginosisin a Murine Model of Vaginal Infection with Gardnerella vaginalis[阴道加德纳菌阴道感染鼠模型中细菌性阴道病的临床特征].PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]8(3):e59539),在接种前三天和接种当天,将雌性C57/B16小鼠腹膜内注射在100μL过滤灭菌的芝麻油中的0.5mgβ-雌二醇以同步它们的发情周期。然后将小鼠阴道接种在20μL无菌PBS中的阴道加德纳菌。使用阴道加德纳菌的链霉素抗性菌株。为了枚举阴道加德纳菌,通过用50μL无菌PBS冲洗阴道在不同时间点收集阴道洗涤液。通过在PBS中(在厌氧室中)制备10倍系列稀释液并将5μL每份稀释液一式四份地点到1mg/mL链霉素选择板(加德纳菌半选择性培养基或NYC III琼脂)上来从洗涤液确认阴道加德纳菌滴度。然后枚举菌落并报告为每mL阴道液的菌落形成单位(CFU)。也在阴道组织和子宫角中评估阴道加德纳菌的枚举。将来自每只小鼠的一个子宫角和一半阴道(纵向平分)均质化,随后连续稀释并关于阴道洗涤液铺平。枚举菌落并报告为CFU/克组织。在本模型中,通过阴道内给予液体配制品、通过管饲法口服给予或通过将聚糖包含在动物的饮用水或饮食中来进行小鼠中的聚糖制剂给予。给药频率是可变的,如在整个研究过程中(即,在雌二醇治疗到研究结束期间)或在“治疗”范例中,其中只有已经在动物中建立阴道加德纳菌定殖后才向小鼠给予聚糖制剂。该研究的终点包括聚糖制剂与安慰剂(对照)对阴道洗涤液和组织中的加德纳菌CFU计数的作用。还测试了小鼠阴道洗涤液中的唾液酸酶活性(人类疾病的标志)。高水平的唾液酸酶指示加德纳菌的高度定殖。
实例19:用于治疗细菌性阴道病的液体阴道喷雾剂的配制和功效
配制用于治疗细菌性阴道病的液体喷雾剂并将其用于治疗展现出细菌性阴道病的症状的女性。将以下组分溶于水(8mL)和苯甲醇(2mL)的混合物中:示例性聚糖组合物(浓度高达3g/ml,例如在0.5g/ml和3g/ml之间,可替代地高达4g/ml)、乳酸(4mg)、PEG 400(126mg)、二甘醇单乙醚(80mg)、糖原质(80mg)和乙基纤维素(8mg)。在小喷雾瓶中向每名女性患者提供液体剂型,并指示其每天晚上(或一天两次、三次或四次)给予该喷雾剂,持续长达2周。由三至五天后症状的抑制确定功效。
实例20:用于治疗脱屑性炎性阴道炎的阴道栓的配制和功效
进行本研究以评价包括示例性聚糖制剂(例如,如本文所述)和任选地益生菌的阴道栓配制品的治疗脱屑性炎性阴道炎的功效。制备包括高达75%(例如在50%和75%之间)聚糖组合物、任选地益生菌(有益)菌株(例如,嗜酸乳杆菌,每5mL剂量1x 108个活细胞)和任选地以下各项中的一种或多种:PEG-12、PEG-150、蒜头粉和香味剂(玫瑰花油)的阴道栓混合物,并将其填充到可溶性蜡模中。向每名正经历脱屑性炎性阴道炎症状的受试者提供了阴道栓,并指示每天插入阴道并使其不受干扰过夜。另外的受试者每名都接受不含聚糖组合物的运载体。指示受试者每天一次使用阴道栓共持续6天,并评价症状的整体改善。
实例21.用于测试聚糖制剂对于宿主对鼻腔、口腔和阴道部位的细菌群落反应的作用的体外共培养模型
细菌可以引发来自宿主(哺乳动物)细胞的促炎和抗炎反应,并且不同的细菌物种可以引发不同的宿主反应。使用聚糖制剂来改变细菌群体以引发希望的宿主反应。使用体外共培养模型来测量由在聚糖制剂存在下生长的细菌群体引发的宿主反应。使用本测定来选择促进细菌群体的聚糖制剂,这些细菌种群引发有益的宿主反应或最小化有害的宿主反应。
鼻腔:通过浅表鼻刮活检从人类受试者获得原代鼻上皮细胞并使其扩增(Müller等人,Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface[在空气液体界面培养人鼻上皮细胞],2013,Journal of Visualized Experiments[可视化实验杂志],80:e50646)(Comer等人,Comparison of Nasal and Bronchial EpithelialCells Obtained from Patients with COPD[从COPD患者获得的鼻和支气管上皮细胞的比较],2012,PLoS ONE[公共科学图书馆·综合],7:e32924)。可替代地,从供应商(例如PromoCell公司)获得冷冻保存的人鼻上皮细胞并遵循供应商提供的方案进行培养。分别地,使细菌培养物在聚糖制剂存在下生长。
口腔:在共培养测定中使用原代人牙龈上皮细胞(HGEC)(Guggenheim等人,Invitro modeling of host-parasite interactions:the‘subgingival’biofilmchallenge of primary human epithelial cells[宿主-寄生虫相互作用的体外建模:原代人上皮细胞的‘龈下’生物膜激发],2009,BMC Microbiology[BMC微生物学],9:280)。从正经受牙周手术的人类受试者获得的牙龈组织活检中分离HGEC。将HGEC接种在涂有I型胶原(BD Biocoat)的塑料组织培养板上并维持在KSFM培养基(英杰公司(Invitrogen))中。可替代地,在不含抗生素的培养基中培养具有颊表型的正常人类口腔角质形成细胞(NHOK)(EpiOral Tissue Model;马迪克公司(MatTek Corporation),马萨诸塞州阿什兰)。分别地,使细菌培养物在聚糖制剂存在下生长。
阴道:来自女性生殖道的上皮细胞系或组织用于共培养模型(Fichorova等人,Novel Vaginal Microflora Colonization Model Providing New Insight intoMicrobicide Mechanism of Action[新的阴道微生物定殖模型提供对杀微生物剂作用机制的新见解],2011,mBio,2(6):e00168-11)(Anahtar等人,Cervicovaginal Bacteria Area Major Modulator of Host Inflammatory Responses in the Female Genital Tract[子宫颈阴道细菌是女性生殖道中宿主炎症反应的主要调节剂],2015,Immunity[免疫力],42:965-976)。在补充有牛垂体提取物、表皮生长因子和氯化钙的无抗生素角质形成细胞无血清培养基(KSFM)(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)中,人永生化宫颈内(End1/E6E7)、宫颈外(Ect1/E6E7)和阴道(Vk2/E6E7)上皮细胞系作为单层生长。可替代地,将来源于在可渗透膜支架(VEC-100;马迪克公司,马萨诸塞州阿什兰)上生长的原代人宫颈外上皮细胞的极化组织在无抗生素培养基中进行培养。分别地,使细菌培养物在聚糖制剂群体存在下生长。
在所有情况下,在聚糖制剂存在下生长16-24小时后,在无抗生素培养基中制备细菌悬浮液,并以104–107CFU/cm2加入人细胞培养物中。将共培养物在有氧条件下在37℃孵育24小时。
在共孵育期结束时,收集上清液并分析炎性和免疫调节细胞因子,包括IL-1α、IL-1β、TNF、IL-8、RANTES、IL-10、TGF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23。遵循标准方案,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或其他可比的定量技术(例如Luminex测定;生命技术公司(Life Technologies),加利福尼亚州卡尔斯巴德)进行本分析。为了分析更宽范围的反应,通过裂解细胞、纯化RNA并遵循标准方案进行基因表达(例如通过微阵列)或转录组学(例如通过RNA-Seq)分析。使用本程序来分析编码炎性细胞因子、免疫调节细胞因子、抗微生物肽和其他相关宿主反应的基因的表达。
实例22.聚糖制剂对小鼠模型中基因表达的作用
用两组小鼠进行该试验。对于对照组小鼠,每天仅将运载体给予至鼻腔、口腔或阴道。对于处理组小鼠,每天两次、每天或每周1-7次将含有聚糖制剂的运载体给予至鼻腔、口腔或阴道。在1-30天后,将小鼠处死并且提取鼻组织、口腔组分(包括例如舌头、脸颊和腭)以及阴道组织并储存在-80℃下。RNA是从组织中分离并转化成cDNA。使用GeneChip MouseGenome430 2.0Array(美国昂飞公司(Affymetrix))来分析大约14,000个鼠基因的差异表达。根据制造商的说明书和标准方案进行实验方案和原始数据分析。差异表达基因的生物学功能及其在各个过程中的参与可从以下数据库获得:RefGene(基因、蛋白质和抗体的参考(Reference for genes,proteins andantibodies);http://refgene.com/)、CTD(比较毒性基因组学数据库(Comparative Toxicogenomics Database);http://ctd.mdibl.org/)、MGI(小鼠基因组学信息学(Mouse Genomics Informatics);http://www.informatics.jax.org/)、KEGG(京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes);http://www.genome.jp/kegg/genes.html)。使用本程序来鉴定编码炎性细胞因子、免疫调节细胞因子、抗微生物肽和其他相关效应分子的基因的差异表达。
表4:鼻群落(鼻腔/鼻孔)的属级微生物成分。
表5:牙齿(口腔)的属级微生物成分
表6:口(口腔)的属级微生物成分
表7:阴道群落的属级微生物成分
表8:微生物代谢物
表9:多酚
等效物和范围
本申请引用了不同发布的专利、出版的专利申请、杂志文章和其他出版物,将其全部通过引用并入本文。如果在任一个并入的参考文献和本说明书之间有冲突,以本说明书为准。另外,在现有技术之内的本发明的任何具体的实施例可以从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为此类实施例被视为对于本领域的技术人员是已知的,因此它们可以被排除,即使该排除在本文没有被明确陈述。本发明的任何具体的实施例可以因为任何原因从任一权利要求中排除,不管是否与存在的现有技术有关。
本领域的普通技术人员只使用常规实验就将认识到或能够确定本文描述的具体实施例的许多等效形式。本文描述的实施例的范围不旨在限制以上说明书、附图或实例,而是如在所附权利要求中所陈述的。本领域的普通技术人员要认识到的是,在不脱离如在以下权利要求中所定义的本发明的精神或范围下,可以对本说明书进行多种改变和修饰。
本申请包括以下技术方案:
1.一种调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度的方法,该方法包括:向该非肠身体部位局部给予药物组合物,该药物组合物包括有效于调节该人类受试者的该含粘膜组织非肠身体部位中的该细菌分类群的量的聚糖制剂,其中该聚糖制剂具有以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及任选地
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限。
2.如实施方案1所述的方法,其中人类受试者的该含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。
3.如实施方案1所述的方法,其中人类受试者的该含粘膜组织非肠身体部位是口腔。
4.如实施方案1所述的方法,其中人类受试者的该含粘膜组织非肠身体部位是阴道。
5.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.05和约0.6之间。
6.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中该聚糖制剂的平均DP为以下之一:在约DP3和约DP15之间、在约DP3和约DP8之间、在约DP5和约DP10之间、或在约DP6和约DP18之间。
7.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1和约5:1之间。
8.如实施方案2所述的方法,其中调节了鼻腔中棒状杆菌属、差异球菌属、或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。
9.如实施方案2所述的方法,其中调节了鼻腔中棒状杆菌属或葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。
10.如实施方案2所述的方法,其中调节了鼻腔中棒状杆菌属和葡萄球菌属的细菌分类群的丰度。
11.如实施方案2所述的方法,其中调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌的细菌分类群的丰度。
12.如实施方案2所述的方法,其中调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。
13.如实施方案2所述的方法,其中调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少三个细菌分类群的丰度。
14.如实施方案3所述的方法,其中调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、双歧杆菌属、或莫氏菌属的细菌分类群的丰度。
15.如实施方案3所述的方法,其中调节了口腔中双歧杆菌属、贫养菌属、梭菌目、卡氏菌属、莫氏菌属、纤毛菌属、艾肯菌属、凝聚杆菌属、普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。
16.如实施方案3所述的方法,其中调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属的细菌分类群的丰度。
17.如实施方案3所述的方法,其中调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少两个细菌分类群的丰度。
18.如实施方案3所述的方法,其中调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属或嗜血杆菌属中至少三个细菌分类群的丰度。
19.如实施方案3所述的方法,其中调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌或口腔链球菌的细菌分类群的丰度。
20.如实施方案3所述的方法,其中调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌和口腔链球菌的细菌分类群的丰度。
21.如实施方案4所述的方法,其中调节了阴道中乳杆菌属的细菌分类群的丰度。
22.如实施方案4所述的方法,其中调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌的细菌分类群的丰度。
23.如实施方案4所述的方法,其中调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌中至少两个细菌分类群的丰度。
24.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节包括增加该细菌分类群的丰度(例如增加至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、250%、500%、750%、或增加至少1000%)。
25.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节包括降低该细菌分类群的丰度(例如降低至少5%、10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或降低至少99.9%)。
26.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节包括将该细菌分类群的相对丰度增加或降低至少5%、10%、或增加或降低至少20%。
27.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节包括相对于该非肠身体部位中的细菌群落,增加或降低该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度。
28.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节包括i)相对于该非肠身体部位处第二细菌分类群的丰度,或者ii)相对于参考值(例如数值或非数值),增加或降低该细菌分类群的丰度,任选地,
i)其中该参考值是在将该聚糖制剂给予至该非肠身体部位之前(例如,在不存在聚糖制剂的情况下)该非肠身体部位处该细菌分类群的丰度的函数,
ii)其中该参考值是具有生态失调的受试者的该非肠身体部位处或该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度的函数,
iii)其中该参考值是具有疾病、障碍、或病理状态的一个或多个个体(例如在该非肠身体部位)的该细菌分类群的丰度的函数
iv)其中该参考值是不具有障碍或生态失调的受试者的该非肠身体部位处或该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度的函数,
v)其中该参考值是不具有障碍、生态失调的一个或多个个体的该细菌分类群的丰度值的函数,并且进一步任选地包括将作为该受试者的丰度的函数的值与该参考值进行比较。
29.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度治疗了该非肠身体部位中的生态失调。
30.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位的微生物多样性。
31.如实施方案30所述的方法,其中微生物多样性降低(例如,因细菌分类群损失,或降低至少5%或至少0.3对数倍,例如如通过Shannon多样性指数测量)。
32.如实施方案30所述的方法,其中微生物多样性增加(例如,因细菌分类群增加,或增加至少5%或至少0.3对数倍,例如如通过Shannon多样性指数测量)。
33.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位的pH。
34.如实施方案33所述的方法,其中pH变得更具碱性(例如,增加至少约0.25个pH单位或至少0.5个pH单位)。
35.如实施方案33所述的方法,其中pH变得更具酸性(例如,降低至少约0.25个pH单位或至少0.5个pH单位)。
36.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位中微生物代谢物的图谱。
37.如实施方案36所述的方法,其中调节包括增加该非肠身体部位中微生物代谢物的水平。
38.如实施方案36所述的方法,其中调节包括降低该非肠身体部位中微生物代谢物的水平。
39.如实施方案36所述的方法,其中调节包括调节该非肠身体部位中挥发性脂肪酸的水平。
40.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了、治疗了该非肠身体部位处的疾病、障碍或病理状态。
41.如实施方案40所述的方法,其中人类受试者的该含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。
42.如实施方案41所述的方法,其中鼻腔处的该疾病、障碍或病理状态是鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖或哮喘。
43.如实施方案40所述的方法,其中人类受试者的该含粘膜组织非肠身体部位是口腔。
44.如实施方案43所述的方法,其中口腔处的该疾病、障碍或病理状态是龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体炎、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)、或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。
45.如实施方案40所述的方法,其中人类受试者的该含粘膜组织非肠身体部位是阴道。
46.如实施方案45所述的方法,其中阴道处的该疾病、障碍或病理状态是细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染以及早产或流产的风险。
47.如前述实施方案中任一项所述的方法,该方法进一步包括局部或全身给予抗微生物剂(例如,抗生素、抗真菌剂、或抗病毒剂)。
48.如前述实施方案中任一项所述的方法,该方法进一步包括局部或全身给予抗炎剂或类固醇。
49.如前述实施方案中任一项所述的方法,该方法进一步包括将有益细菌分类群(例如,驻留在本文所述的健康或非生态失调的非肠身体部位中的共生细菌分类群)局部给予至该非肠身体部位。
50.如实施方案49所述的方法,其中该有益细菌分类群选自链球菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、埃希氏菌属、魏斯氏菌属、丙酸杆菌属、或芽孢杆菌属。
51.如前述实施方案中任一项所述的方法,该方法进一步包括选择需要调节含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度的受试者。
52.如实施方案51所述的方法,其中选择包括获得代表该非肠身体部位处的生态失调的值(例如,该部位的样品的微生物测序分析),并且如果存在生态失调,则选择该受试者。
53.如实施方案51所述的方法,其中选择包括获得代表该非肠身体部位处选定的细菌分类群的丰度的值(例如,该部位的样品的微生物测序分析),并且如果该非肠身体部位处该细菌分类群的丰度与该非肠身体部位的预定值(例如,在多名受试者中处于健康状态的分类群的丰度范围)不同,则选择该受试者。
54.如前述实施方案中任一项所述的方法,该方法包括在第一或初始期过程中给予该聚糖制剂的第一单位剂型,并且在第二或后续期过程中给予该聚糖制剂的第二剂型。
55.如实施方案54所述的方法,其中该第一或初始期包括调理或改变该分类群以代谢该聚糖制剂,并且该第二或后续期包括调节该受试者的该非肠身体部位处该细菌分类群的丰度。
56.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中该聚糖制剂作为适合局部给予至该受试者的该非肠身体部位(例如粘膜组织)的单位剂型给予。
57.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中该聚糖制剂在通过胃肠道之前接触该非肠身体部位。
58.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中局部给予的该聚糖制剂的按重量计小于约90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、或5%进入或通过胃肠道,例如通过胃。
59.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中该聚糖制剂通过阴道口引入。
60.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中该聚糖制剂通过鼻孔(鼻孔内壁)引入。
61.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中该聚糖制剂通过口引入。
62.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中调节人类受试者的该含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度减少了由该部位产生的气味(例如恶臭)。
63.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中在体外条件下对调节人类受试者的该含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度进行确定。
64.如实施方案63所述的方法,其中用于调节细菌分类群丰度的值是从人非肠身体部位收集的生物样品(例如唾液、粘液、排泄物、腔拭子等)繁殖的体外微生物培养物获得的。
65.如实施方案63所述的方法,其中用于调节细菌分类群丰度的值是从已知在体内与该非肠身体部位相关并在体外繁殖的单菌株细菌(例如,葡萄球菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属、棒状杆菌属、罗氏菌属、普氏菌属、链球菌属、纤毛菌属、金氏菌属、奈瑟氏菌属、嗜血杆菌属、奥里杆菌属等的菌株)获得的。
66.以下中任何一项的一种方法:
a)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度,
b)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的微生物多样性,
c)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的pH,
d)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的微生物代谢物的图谱,
e)治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的生态失调,或
f)治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位的疾病、障碍或病理状态,
该方法包括:
将聚糖制剂局部给予至该受试者的该含粘膜组织非肠身体部位,
其中该聚糖制剂具有两个或更多个(例如3、4、5或6个)以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
从而a)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的细菌分类群的丰度,b)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的微生物多样性,c)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的pH,d)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的微生物代谢物的图谱,e)治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位的生态失调,或f)治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的障碍。
67.如实施方案66所述的方法,其中该含粘膜组织非肠身体部位是口腔、鼻腔、或阴道。
68.一种用于局部给予至受试者的含粘膜组织非肠身体部位的聚糖制剂的配制品,
其中该聚糖制剂具有两个或更多个(例如3、4、5或6个)以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限。
69.如实施方案68所述的配制品,该配制品作为单位剂型提供。
70.如前述实施方案中任一项所述的配制品,该配制品进一步包括糖、糖醇、氨基酸、肽、微量营养素、脂肪酸、或多酚。
71.如实施方案70所述的配制品,其中该糖或糖醇包括葡萄糖、半乳糖、果糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、蔗糖、山梨糖、乳糖、山梨醇、麦芽糖、甘露醇、乳果糖、乳糖醇、赤藓糖醇、塔格糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖、甘露二糖、蜜二酮糖、芸香酮糖、或木二糖。
72.如实施方案70所述的配制品,其中该微量营养素包括维生素、元素、或矿物质。
73.如实施方案70所述的配制品,其中该脂肪酸包括短链脂肪酸(SCFA)、中链脂肪酸(MCFA)、长链脂肪酸(LCFA)、或极长链脂肪酸(VLCFA)。
74.如实施方案70所述的配制品,其中该多酚包括儿茶素、鞣花丹宁、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮、花青素、或木质素。
75.如前述实施方案中任一项所述的配制品,该配制品进一步包括治疗剂(例如标准护理治疗剂)。
76.如实施方案75所述的配制品,其中该治疗剂包括抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、氟化物治疗剂、类固醇、硝酸银、糖或糖醇(例如,乳果糖、木糖醇)、油(例如,椰子油、MCT油、茶树油)、锌、碘、异黄酮(例如,大豆)、酸(例如,乙酸、硼酸)、天然提取物(例如,接骨木果、奶蓟、薰衣草)、抗氧化剂(例如,维生素C)、或大蒜。
77.如前述实施方案中任一项所述的配制品,该配制品进一步包括抗微生物剂(例如,抗生素、抗真菌剂、或抗病毒剂)。
78.如前述实施方案中任一项所述的配制品,该配制品进一步包括抗炎剂或类固醇。
79.如前述实施方案中任一项所述的配制品,该配制品进一步包括有益细菌分类群(例如,驻留在本文所述的健康或非生态失调的非肠身体部位中的共生细菌分类群)。
80.如实施方案79所述的配制品,其中该有益细菌分类群来自链球菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、埃希氏菌属、魏斯氏菌属、丙酸杆菌属、或芽孢杆菌属。
81.如实施方案69所述的配制品,其中该单位剂型被制备用于给予至口腔、鼻腔、或阴道。
82.如实施方案81所述的配制品,其中用于给予至口腔的该单位剂型包括快速溶解于口中的固体(例如,溶解条、膜、快熔体)、液体(例如,漱口剂、喷雾剂、酊剂、滴剂)或凝胶(例如,牙膏、乳膏或软膏)。
83.如实施方案81所述的配制品,其中用于给予至阴道的该单位剂型包括栓剂(例如,阴道栓)、乳膏、软膏、溶液、悬浮液、乳液、阴道环、卫生棉条、垫、冲洗剂、海绵、条、喷雾剂、泡沫、涂药器、或粘合剂。
84.如实施方案81所述的配制品,其中用于给予至口腔的该单位剂型包括雾(例如,水雾)、干粉、喷雾剂、泡沫、涂药器、乳膏、软膏、溶液、悬浮液、乳液。
85.一个包括适合局部给予至非肠身体部位的多个单位剂型的聚糖制剂的容器。
86.如实施方案85所述的容器,其中所述容器包括包含第一单位剂型的第一隔室和包含第二剂型的第二隔室。
87.如实施方案86所述的容器,其中该第一和第二剂型是相同的。
88.如实施方案86所述的容器,其中该第一和第二剂型彼此不同,例如它们具有不同量的聚糖制剂,具有不同的释放特性,包括不同的赋形剂,或包括不同或不同量的药物。
89.如实施方案88所述的容器,其中该容器包括在第一或初始期过程中给予该受试者的第一单位剂型和在第二或后续期给予该受试者的第二单位剂型。
90.如实施方案89所述的容器,其中该第一期是适应期,并且该第二期是维持期。
91.一种包括用于局部给予至含粘膜组织非肠身体部位的聚糖制剂的试剂盒,其中该聚糖制剂具有两个或更多个(例如3、4、5或6个)以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间或在0.05和约0.5之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP2和约DP20之间、在约DP3和约DP15之间、在约DP3和约DP8之间、在约DP5和约DP10之间、或在约DP6和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1和约5:1之间或在约0.8:1和约5:1之间,和/或
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限。
92.如实施方案91所述的试剂盒,该试剂盒进一步包括治疗剂。
93.如实施方案92所述的试剂盒,其中该治疗剂是抗生素(例如,应用于口腔、鼻腔、或阴道的抗生素,或全身应用的抗生素)。
94.如实施方案93所述的试剂盒,其中该抗生素包括甲硝唑、克林霉素、替硝唑、和塞克硝唑、莫匹罗星、利福平、以及多西环素。
95.如实施方案92所述的试剂盒,其中该治疗剂是类固醇、减充血剂、抗组胺剂、鼻润滑剂、防腐剂、氟化物冲洗剂、咳嗽抑制剂、唾液替代物、阴道应用的激素(例如,雌二醇)、抗真菌剂、或有益的细菌。
96.一种制备适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型的方法,该方法包括:
提供第一量的该聚糖制剂;
将该第一量的该聚糖制剂分成适合局部给予至受试者的非肠身体部位的多个单位剂型,
从而制备适合给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型。
97.一种制备适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型的方法,该方法包括:
(a)提供聚糖制剂;
(b)获得该聚糖制剂的一个或多个以下特征的值:
(i)聚合度(DP),
(ii)平均支化度(DB),或
(iii)α-糖苷键与β-糖苷键的比率,并且
(c)如果满足一个或多个以下标准,则将该制剂配制成适合局部给予至受试者的非肠身体部位的单位剂型:
(i)该制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的DP,
(ii)该制剂中的这些聚糖的平均支化度(DB)为至少0.01,
(iii)该制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1至约5:1之间,
从而制备适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型。
98.如实施方案97所述的方法,该方法进一步包括:
获得该制剂的任何一个或两个附加特征的值:
(iv)这些聚糖单元的身份,
(v)聚糖单元的比率,并且
将该制剂配制成药物组合物,如果:
(vi)该制剂中的聚糖单元比率与该聚糖单元输入的比率大约相同。
99.如实施方案97-98中任一项所述的方法,该方法进一步包括:
b)获得该制剂的任何一个或两个附加特征的值:
(iv)已知与该非肠身体部位相关(或驻留于此)的至少一个共生细菌分类群(例如,细菌菌株)在补充有该聚糖制剂的培养基中的细菌生长水平,并且
c)如果i)相对于预定水平(例如,对照碳源如例如糖单体或二聚体例如葡萄糖的预定水平)或ii)相对于另一个预定细菌分类群(例如,病原体或致病有机体),该聚糖制剂调节(例如增加)该细菌分类群的生长,则将该制剂配制成药物组合物。
100.如实施方案99所述的方法,其中该细菌分类群是乳杆菌属,例如卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、格氏乳杆菌、和詹氏乳杆菌,并且该非肠身体部位是阴道。
101.如实施方案99所述的方法,其中该细菌分类群是奈瑟氏菌属(例如粘膜奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌和微黄奈瑟氏菌)、罗氏菌属(例如粘滑罗氏菌)、链球菌属(例如唾液链球菌)、或韦荣球菌属(例如小韦荣球菌),并且该非肠身体部位是口腔。
102.如实施方案99所述的方法,其中该细菌分类群是变异链球菌,并且相对于另一预定细菌分类群(例如奈瑟氏菌属(例如粘膜奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌和微黄奈瑟氏菌)、罗氏菌属(例如粘滑罗氏菌)、链球菌属(例如唾液链球菌)、或韦荣球菌属(例如小韦荣球菌))其生长减少,并且该非肠身体部位是口腔。
103.如实施方案99所述的方法,其中该细菌分类群是假白喉棒状杆菌或表皮葡萄球菌,并且该非肠身体部位是鼻腔。
104.如实施方案99所述的方法,其中该细菌分类群是金黄色葡萄球菌或拥挤棒状杆菌,并且相对于另一预定细菌分类群(例如假白喉棒状杆菌或表皮葡萄球菌)其生长减少,并且该非肠身体部位是鼻腔。
105.如实施方案99-104中任一项所述的方法,其中将该制剂配制成药物组合物的步骤包括以下中的一个或多个:
i)从该制剂中除去不想要的成分,
ii)减少该制剂的体积,
iii)将该制剂灭菌,
iv)将该制剂与药学上可接受的赋形剂或载体混合,
v)将该制剂与第二药物或药剂混合,
vi)将该制剂配制成适用于该非肠身体部位的剂型。
106.如实施方案99-105中任一项所述的方法,其中将该制剂配制成药物组合物的步骤包括以下中的一个或多个:
(i)包装该制剂,
(ii)标记该经包装的制剂,以及
(iii)出售或供应以销售该经包装的和经标记的制剂。
107.一种制备药物组合物的方法,该方法包括:
(i)提供包括选自下组的至少一种聚糖单元的聚糖制剂(例如,治疗性聚糖制剂),该组由以下各项组成:葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、和甘露糖,
(ii)确定预选的NMR峰或NMR峰组是否与该聚糖制剂相关,并且
(iii)如果存在该预选峰或峰组,则将该制剂配制成药物组合物。
108.一种药物组合物,该药物组合物包括适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型,其包括分支聚糖的混合物,其中该制剂中这些聚糖的平均支化度(DB)为至少0.01,并且其中
i)该制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
ii)该聚糖制剂包括α-糖苷键和β-糖苷键两者,
iii)该制剂的这些聚糖中存在的这些糖苷键中的至少一个包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键或1->6糖苷键,
iv)该制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1至约5:1之间。
109.如实施方案108所述的组合物,其中这些糖苷键中的至少两个独立地包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键或1->6糖苷键。
110.如实施方案108-109中任一项所述的组合物,其中这些糖苷键中的至少三个独立地包括l->2糖苷键、l->3糖苷键、l->4糖苷键或l->6糖苷键。
111.如实施方案108-110中任一项所述的组合物,其中该聚糖单元包括选自下组的至少一种单糖,该组由以下各项组成:葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、和鼠李糖。
112.如实施方案108-111中任一项所述的组合物,其中该制剂中至少20%(按重量或数目计)的聚糖不包括超过预选参考水平的2个聚糖单元的重复单元。
113.如实施方案108-112中任一项所述的组合物,其中该聚糖制剂是合成的并且不是从天然寡糖或多糖源分离。
114.如实施方案108-113中任一项所述的组合物,该组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。
115.如实施方案108-114中任一项所述的组合物,其中该组合物被配制成单位剂型。
116.如实施方案108-115中任一项所述的组合物,其中该单位剂型被配制成延迟释放或时间控制系统。
117.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中局部给予至含粘膜组织非肠身体部位包括局部给予至该非肠身体部位的粘膜组织。
118.如前述实施方案中任一项所述的组合物或配制品,其中该组合物或配制品是用于局部给予至该非肠身体部位的粘膜组织。
119.如前述实施方案中任一项所述的方法,其中:
调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度,调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的微生物多样性,调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的pH,调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的微生物代谢物的图谱,治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的生态失调,或治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位的疾病、障碍或病理状态包括:
调节受试者的该非肠身体部位的粘膜组织中的细菌分类群的丰度,调节受试者的该非肠身体部位的粘膜组织中的微生物多样性,调节受试者的该非肠身体部位的粘膜组织的pH,调节受试者的该非肠身体部位的粘膜组织的微生物代谢物的图谱,治疗受试者的该非肠身体部位的粘膜组织中的生态失调,或治疗受试者的该非肠身体部位的粘膜组织的疾病、障碍或病理状态。
Claims (43)
1.聚糖制剂的配制品在制备用于调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度的药物中的用途,其中该聚糖制剂具有以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及任选地
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
其中该含粘膜组织非肠身体部位是鼻腔。
2.聚糖制剂的配制品在制备用于调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度的药物中的用途,其中该聚糖制剂具有以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及任选地
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
其中该含粘膜组织非肠身体部位是口腔。
3.聚糖制剂的配制品在制备用于调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度的药物中的用途,其中该聚糖制剂具有以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及任选地
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
其中该含粘膜组织非肠身体部位是阴道。
4.聚糖制剂的配制品在制备用于治疗人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的疾病、障碍、或病理状态的药物中的用途,其中该聚糖制剂具有以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及任选地
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
其中该疾病、障碍或病理状态是鼻窦炎(鼻窦感染)、慢性鼻窦炎(CRS)、金黄色葡萄球菌感染或携带、鼻前庭炎、鼻疖或哮喘。
5.聚糖制剂的配制品在制备用于治疗人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的疾病、障碍、或病理状态的药物中的用途,其中该聚糖制剂具有以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及任选地
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
其中该疾病、障碍或病理状态是龋齿(蛀牙)、牙周病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎、口臭(口腔异味)、严重早期儿童龋齿(S-ECC)、牙根龋(RC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、扁桃体炎、牙槽脓肿、牙周脓肿、路德维希咽峡炎、病毒感染(例如,疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)、或真菌/酵母感染(例如念珠菌病)。
6.聚糖制剂的配制品在制备用于治疗人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的疾病、障碍、或病理状态的药物中的用途,其中该聚糖制剂具有以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及任选地
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
其中该疾病、障碍或病理状态是细菌性阴道病(BV)、阴道溢液、盆腔炎、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染、B组链球菌感染、性传播感染性疾病(包括微生物性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病)、子宫颈炎、脱屑性炎性阴道炎(DIV)、阴道葡萄球菌感染以及早产或流产的风险。
7.聚糖制剂的配制品在制备用于调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度的药物中的用途,其中该聚糖制剂具有以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.05和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及任选地
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
其中该调节进一步包括局部或全身给予抗微生物剂(例如,抗生素、抗真菌剂、或抗病毒剂)。
8.聚糖制剂的配制品在制备用于调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度的药物中的用途,其中该聚糖制剂具有以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.05和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及任选地
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
其中该调节进一步包括局部或全身给予抗炎剂或类固醇。
9.聚糖制剂的配制品在制备用于调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度的药物中的用途,其中该聚糖制剂具有以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.05和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及任选地
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
其中该调节进一步包括将有益细菌分类群(例如,驻留在本文所述的健康或非生态失调的非肠身体部位中的共生细菌分类群)局部给予至该非肠身体部位。
10.如权利要求1、4或7-9中任一项所述的用途,其中调节了鼻腔中棒状杆菌属、差异球菌属、葡萄球菌属或其组合的细菌分类群的丰度。
11.如权利要求1、4或7-10中任一项所述的用途,其中调节了鼻腔中物种表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、或痤疮丙酸杆菌中至少一个、两个或三个细菌分类群的丰度。
12.如权利要求2、5或7-9中任一项所述的用途,其中调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、双歧杆菌属、或莫氏菌属的细菌分类群的丰度。
13.如权利要求2、5、7-9或12中任一项所述的用途,其中调节了口腔中普氏菌属、奥里杆菌属、奈瑟氏菌属、或嗜血杆菌属中至少一个、两个或三个细菌分类群的丰度。
14.如权利要求2、5、7-9、12或13中任一项所述的用途,其中调节了口腔中物种微黄奈瑟氏菌或口腔链球菌中的一个或两个细菌分类群的丰度。
15.如权利要求3或6-9中任一项所述的用途,其中调节了阴道中乳杆菌属的细菌分类群的丰度。
16.如权利要求3、6-9或15中任一项所述的用途,其中调节了阴道中物种卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、或惰性乳杆菌中至少一个或两个细菌分类群的丰度。
17.如前述权利要求中任一项所述的用途,其中调节包括相对于该非肠身体部位中的细菌群落,增加或降低该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度。
18.如前述权利要求中任一项所述的用途,其中调节包括i)相对于该非肠身体部位处第二细菌分类群的丰度,或者ii)相对于参考值(例如数值或非数值),增加或降低该细菌分类群的丰度,任选地,
i)其中该参考值是在将该聚糖制剂给予至该非肠身体部位之前(例如,在不存在聚糖制剂的情况下)该非肠身体部位处该细菌分类群的丰度的函数,
ii)其中该参考值是具有生态失调的受试者的该非肠身体部位处或该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度的函数,
iii)其中该参考值是具有疾病、障碍、或病理状态的一个或多个个体(例如在该非肠身体部位)的该细菌分类群的丰度的函数
iv)其中该参考值是不具有障碍或生态失调的受试者的该非肠身体部位处或该非肠身体部位中该细菌分类群的丰度的函数,
v)其中该参考值是不具有障碍、生态失调的一个或多个个体的该细菌分类群的丰度值的函数,并且进一步任选地包括将作为该受试者的丰度的函数的值与该参考值进行比较。
19.如前述权利要求中任一项所述的用途,其中调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度治疗了该非肠身体部位中的生态失调。
20.如前述权利要求中任一项所述的用途,其中调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位的微生物多样性。
21.如前述权利要求中任一项所述的用途,其中调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位的pH。
22.如前述权利要求中任一项所述的用途,其中调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了该非肠身体部位中微生物代谢物的图谱。
23.如前述权利要求中任一项所述的用途,其中调节人类受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度调节了、治疗了该非肠身体部位处的疾病、障碍或病理状态。
24.如前述权利要求中任一项所述的用途,进一步包括选择需要调节含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度的受试者。
25.如权利要求24所述的用途,其中选择包括获得代表该非肠身体部位处的生态失调的值(例如,该部位的样品的微生物测序分析),并且如果存在生态失调,则选择该受试者。
26.如权利要求24所述的用途,其中选择包括获得代表该非肠身体部位处选定的细菌分类群的丰度的值(例如,该部位的样品的微生物测序分析),并且如果该非肠身体部位处该细菌分类群的丰度与该非肠身体部位的预定值(例如,在多名受试者中处于健康状态的分类群的丰度范围)不同,则选择该受试者。
27.如前述权利要求中任一项所述的用途,其中该聚糖制剂作为适合局部给予至该受试者的该非肠身体部位(例如粘膜组织)的单位剂型给予。
28.聚糖制剂的配制品在制备用于以下中任何一项的药物中的用途:
a)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的微生物多样性,
b)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的pH,
c)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的微生物代谢物的图谱,
其中该聚糖制剂具有两个或更多个(例如3、4、5或6个)以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP3和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1和约5:1之间,以及
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限,
从而a)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的细菌分类群的丰度,b)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的微生物多样性,c)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的pH,d)调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的微生物代谢物的图谱,e)治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位的生态失调,或f)治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的障碍。
29.如权利要求28所述的用途,其中该含粘膜组织非肠身体部位是口腔、鼻腔、或阴道。
30.如前述权利要求中任一项所述的用途,其中该聚糖制剂作为单位剂型提供。
31.如前述权利要求中任一项所述的用途,进一步包括糖、糖醇、氨基酸、肽、微量营养素、脂肪酸、或多酚。
32.如前述权利要求中任一项所述的用途,进一步包括治疗剂(例如标准护理治疗剂)。
33.如权利要求30所述的用途,其中该单位剂型被制备用于给予至口腔、鼻腔、或阴道。
34.一个包括适合局部给予至非肠身体部位的多个单位剂型的聚糖制剂的容器。
35.一种包括用于局部给予至含粘膜组织非肠身体部位的聚糖制剂的试剂盒,其中该聚糖制剂具有两个或更多个(例如3、4、5或6个)以下特性:
i)该聚糖制剂包括分支聚糖,这些分支聚糖包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、或鼠李糖聚糖单元,
ii)该聚糖制剂中的这些分支聚糖的平均支化度(DB)在约0.01和约0.6之间或在0.05和约0.5之间,
iii)该聚糖制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
iv)该聚糖制剂的平均DP在约DP2和约DP20之间、在约DP3和约DP15之间、在约DP3和约DP8之间、在约DP5和约DP10之间、或在约DP6和约DP18之间,
v)该聚糖制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1和约5:1之间或在约0.8:1和约5:1之间,和/或
vi)该聚糖制剂在23℃时在水中具有至少约60Brix的最终溶解度极限。
36.一种制备适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型的方法,该方法包括:
提供第一量的该聚糖制剂;
将该第一量的该聚糖制剂分成适合局部给予至受试者的非肠身体部位的多个单位剂型,
从而制备适合给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型。
37.一种制备适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型的方法,该方法包括:
(a)提供聚糖制剂;
(b)获得该聚糖制剂的一个或多个以下特征的值:
(i)聚合度(DP),
(ii)平均支化度(DB),或
(iii)α-糖苷键与β-糖苷键的比率,并且
(c)如果满足一个或多个以下标准,则将该制剂配制成适合局部给予至受试者的非肠身体部位的单位剂型:
(i)该制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的DP,
(ii)该制剂中的这些聚糖的平均支化度(DB)为至少0.01,
(iii)该制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约0.8:1至约5:1之间,
从而制备适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型。
38.一种药物组合物,该药物组合物包括适合局部给予至受试者的非肠身体部位的聚糖制剂单位剂型,其包括分支聚糖的混合物,其中该制剂中这些聚糖的平均支化度(DB)为至少0.01,并且其中
i)该制剂中至少50%的聚糖具有至少3个且少于30个聚糖单元的聚合度(DP),
ii)该聚糖制剂包括α-糖苷键和β-糖苷键两者,
iii)该制剂的这些聚糖中存在的这些糖苷键中的至少一个包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键或1->6糖苷键,
iv)该制剂的这些聚糖中存在的α-糖苷键与β-糖苷键的比率在约1:1至约5:1之间。
39.如权利要求38所述的组合物,其中这些糖苷键中的至少两个或至少三个独立地包括1->2糖苷键、1->3糖苷键、1->4糖苷键或1->6糖苷键。
40.如权利要求38-39中任一项所述的组合物,其中该聚糖单元包括选自下组的至少一种单糖,该组由以下各项组成:葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖、岩藻糖、和鼠李糖。
41.如前述权利要求中任一项所述的用途或方法,其中局部给予至含粘膜组织非肠身体部位包括局部给予至该非肠身体部位的粘膜组织。
42.如前述权利要求中任一项所述的组合物或用途,其中该组合物或配制品是用于局部给予至该非肠身体部位的粘膜组织。
43.如前述权利要求中任一项所述的用途,其中:
调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的细菌分类群的丰度,调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的微生物多样性,调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的pH,调节受试者的含粘膜组织非肠身体部位的微生物代谢物的图谱,治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位中的生态失调,或治疗受试者的含粘膜组织非肠身体部位的疾病、障碍或病理状态包括:
调节受试者的该非肠身体部位的粘膜组织中的细菌分类群的丰度,调节受试者的该非肠身体部位的粘膜组织中的微生物多样性,调节受试者的该非肠身体部位的粘膜组织的pH,调节受试者的该非肠身体部位的粘膜组织的微生物代谢物的图谱,治疗受试者的该非肠身体部位的粘膜组织中的生态失调,或治疗受试者的该非肠身体部位的粘膜组织的疾病、障碍或病理状态。
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