CN111886253B - Pd-1激动剂抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗人PD‑1激动剂抗体，及其用于治疗自身免疫性病症、诸如类风湿性关节炎或用于减少移植细胞和/或组织的排斥的用途。

Description

PD-1激动剂抗体及其用途
本发明在医学领域中。更具体地，本发明涉及针对人程序性死亡1(PD-1；也称为CD279)的激动性抗体，包含此类抗人PD-1激动性抗体的组合物以及使用此类抗人PD-1激动性抗体用于治疗自身免疫性病症或移植排斥的方法。
免疫检查点途径调节自身免疫性应答和抗癌免疫应答两者(Isakov, N., J. Autoimmune Disorders 2016; 2(2):17)。在自身免疫性疾病疗法中，期望促进(即激动)免疫-抑制途径的作用，使得抑制免疫应答。相反，在癌症疗法中，期望抑制(即拮抗)免疫-抑制途径的作用，使得将免疫应答去抑制或刺激。
PD-1是I型细胞膜蛋白。PD-1属于含有细胞外IgV结构域、随后为跨膜和细胞内结构域的扩展的CD28/CTLA-4家族。PD-1途径的活化导致免疫细胞活化的抑制，诸如降低的细胞增殖，降低的细胞存活和炎性细胞因子(例如，IFNγ、TNFα和IL-2)的抑制。PD-1在最近活化的免疫细胞(诸如T细胞、B细胞、NKT细胞、单核细胞和树突状细胞)上表达；并且其表达受到严格调节。PD-1介导的信号传导在调节人免疫应答中的重要性通过用拮抗剂PD-1抗体治疗肿瘤患者的成功来证明。用PD-1拮抗剂抗体治疗的癌症患者倾向于具有不同的自身免疫性表现作为该治疗的副作用(Cappelli, L.C., 等人, 2017; Hoffman, L., 等人,2016)。此外，自身免疫性疾病活动和PD-1途径之间存在其他已知的相关性。例如，爆发的SLE患者倾向于具有低PD-L1表达(Mozaffarian, N., 等人, 2008)和针对PD-1的自身抗体(Shi, H., 等人, 2017)。
因此，增加PD-1介导的信号传导构成一种潜在的方法来管控自身免疫性病症，与当前的免疫调节性疗法相比，其可能导致深刻的疾病改变和应答的持久性以及关键的安全性益处。一般来说，这些当前的疗法广泛下调机体的免疫系统(例如，皮质类固醇和环磷酰胺)。然而，PD-1主要在活化的免疫细胞上表达。因此，抗PD-1抗体具有选择性靶向治疗时期间活化的细胞、使免疫细胞库的剩余部分完整的潜能。
该领域已经努力提供PD-1激动性抗体(Sharpe, A. 和Pauken, E., Nature Reviews Immunology (2017))。该困难至少部分地被认为是在体外或体内在生理环境中实现PD-1激动作用所需的复杂的细胞相互作用的结果。因此，当评价PD-1激动剂抗体活性时，用于鉴定治疗性抗体的测定或模型的背景清楚地是重要的。
美国专利申请公开US20170088618公开了抗人PD-1抗体，其在一些实施方案中，并且在某些体外测定中，表现为就PD-1细胞外结构域而言具有缔合和解离的速率的激动剂，导致KD值在19-22 nM之间(如通过使用BIAcore®T200的表面等离振子共振(SPR)所测定)。
因此，需要替代的抗人PD-1抗体，其1)以对于最佳的激动剂活性期望的缔合和解离速率结合人PD-1，2)在免疫学相关的背景下激动人PD-1以实现体内效力，3)作为用于治疗和/或预防自身免疫性病症或预防移植排斥的单一疗法，展示足够的功效，4)作为与用于治疗和/或预防自身免疫性病症或预防移植排斥的其他治疗剂的组合疗法的一部分，展示期望的活性，和/或5)当在用另一种抗人PD-1激动剂抗体治疗自身免疫性病症期间由于至少一种不良事件和/或无效(尤其是抗药物抗体(ADA)介导的效力降低)而暂停疗法时，为药物转换提供了有效的替代物。
因此，本发明提供了新型的人源化的抗人PD-1激动剂IgG1抗体。由于各种原因，本发明的抗体特别优于现有技术的抗PD-1抗体，所述原因包括但不限于以下：1)它们以期望的缔合和解离速率结合人PD-1(以及食蟹猴PD-1)，2)它们在较低剂量或较不频繁给药下可能治疗上有效，3)它们在体外抑制原代人T细胞增殖，4)它们调节人PD-1细胞表面表达，5)它们在体外NFAT报告子细胞测定中抑制T细胞受体信号传导活性，6)它们具有低治疗性蛋白免疫原性(即，抗药物抗体(ADA))潜能，7)它们在人源化GvHD模型中降低疾病活性，和/或8)在狼疮性肾炎体内模型中，它们抑制免疫细胞活化：
a)没有显著和/或可检测的补体-依赖性细胞毒性，
b)不与人PD-L1/2竞争结合人PD-1，
c)在体外测定中不诱导显著和/或可检测的细胞因子释放。
此外，本发明的示例性抗人PD-1激动剂IgG1抗体还表现出体内稳定性、物理和化学稳定性，包括但不限于热稳定性、溶解性、低自缔合和药代动力学特征，其对于开发和/或用于治疗自身免疫性病症和/或移植排斥(即移植物抗宿主病)是可接受的。另外，本文公开的编码本发明的示例性抗人PD-1激动剂IgG1抗体的多核苷酸序列经工程改造以使用优选的密码子来显著提高所述抗体在优选的哺乳动物细胞系表达系统、诸如CHO中的表达。
本发明通过提供组合物和方法而提供优于现有技术的进步，所述组合物和方法可用于通过使用显著工程改造的抗人PD-1激动剂IgG1抗体的免疫检查点刺激来预防、下调或改善自身免疫和/或免疫耐受相关的病症。本发明的抗人PD-1激动剂IgG1抗体能够改善或恢复免疫病理学，优选地，通过抑制免疫应答的适应性组，废除抗原特异性免疫过程，且由此直接解决潜在的疾病病理学。临床上使用此类抗体可以证明导致所治疗疾病的长期持久性或缓解。
本公开提供了抗人PD-1抗体，其包含：1)重链可变区(HCVR)，其包含具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；和2)轻链可变区(LCVR)，其包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR3，其中所述抗体是IgG同种型亚类1 (IgG1)。
在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体，其包含：1)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR；和2)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1。
在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体，其包含：1)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链；和2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体，其由以下组成：两条具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。
本公开还提供了能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体包含：1) HCVR，其包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；和2) LCVR，其包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR3，其中所述抗体是IgG1。
在一些实施方案中，本公开提供了能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体包含：1)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR；和2)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1。
在一些实施方案中，本公开提供了能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体包含：1)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链；和2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体由以下组成：两条具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。
本公开还提供了用于产生抗人PD-1抗体的方法，其包括：a)培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞，其中所述抗体包含：1) HCVR，其包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；和2) LCVR，其包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR3，其中所述抗体是IgG1；和b)回收所述抗体。
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生抗人PD-1抗体的方法，其包括：a)培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞，其中所述抗体包含：1)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR；和2)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1；和b)回收所述抗体。
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生抗人PD-1抗体的方法，其包括：a)培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞，其中所述抗体包含：1)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链；和2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链；和b)回收所述抗体。
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生抗人PD-1激动剂抗体的方法，其包括：a)培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞，其中所述抗体由以下组成：两条具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链；和b)回收所述抗体。
本公开还提供了通过前述方法产生的抗人PD-1抗体。
本公开还提供了药物组合物，其包含通过前述方法产生的抗人PD-1抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开还提供了DNA分子，其包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:11和12的序列的多核苷酸。本公开还提供了包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:11和12的序列的多核苷酸。
本公开提供了药物组合物，其包含：1)抗人PD-1抗体，其包含：a) HCVR，其包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；和b) LCVR，其包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR3，其中所述抗体是IgG1；和2)可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含：1)抗人PD-1抗体，其包含：a)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR；和b)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1；和2)可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开提供了药物组合物，其包含：1)抗人PD-1抗体，其包含：a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链；和b)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链；和2)可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，前述药物组合物的抗人PD-1抗体由以下组成：两条具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。
如本文所用，“PD-1”是指程序性细胞死亡1，也称为程序性死亡1 (PD-1; CD279)，属于含有细胞外IgV结构域、随后为跨膜和细胞内结构域的扩展的CD28/CTLA-4家族的I型细胞膜蛋白。
如本文所用，“hPD-1”或“人PD-1”是指野生型人PD-1，优选地，具有SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列的野生型人PD-1 (即，NCBI参考序列NP_005009.2)。
术语“食蟹猴(cyno)”、“食蟹猴(cynomolgus)”或“食蟹猴(cynomolgus monkey)”在本文可互换使用。当关于PD-1多肽使用时，意欲该术语是指野生型食蟹猴PD-1，和优选地，具有SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列的野生型食蟹猴PD-1。
PD-1多肽“细胞外结构域”或“ ECD”是指基本上不含跨膜和细胞质结构域的PD-1多肽的形式。优选地，PD-1 ECD具有小于1%的跨膜和细胞质结构域，更优选地，PD-1 ECD具有小于0.5%的此类结构域。甚至更优选地，人PD-1 ECD多肽如SEQ ID NO:14中所示，且食蟹猴PD-1 ECD多肽如SEQ ID NO:16中所示。PD-1多肽ECD可以使用本领域中已知的方法制备。或者，人PD-1多肽ECD可以从各种供应商、诸如Sino Biological (Beijing, China; 参考号10377-H08)和R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; 目录号8986-PD)商业购买。食蟹猴PD-1多肽ECD可以从R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; 目录号8509-PD)商业购买。
如本文所用，“抗人PD-1激动剂抗体”是指这样的抗体，其结合人PD-1，并且当在体内施用时，导致至少一种显著降低的自身免疫活性，诸如抗双链DNA (ds-DNA)滴度的降低，疾病评分的降低或炎性细胞因子的降低。
如本文所用，“抗体1”是指人PD-1结合抗体，其包含：1)具有SEQ ID NO:5的HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:6的HCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:7的HCDR3氨基酸序列的HCVR；和2)具有SEQ ID NO:8的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:9的LCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:10的LCDR3氨基酸序列的LCVR；SEQ ID NO:3的HCVR氨基酸序列、SEQ ID NO:4的LCVR氨基酸序列；SEQ ID NO:1的HC氨基酸序列和SEQ ID NO:2的LC氨基酸序列。
如本文所用的术语“抗体”是指工程改造的、非天然存在的多肽复合物，其具有两条重链(HC)和两条轻链(LC)，使得所述重链和所述轻链通过二硫键互连，其中所述抗体是IgG同种型抗体。如本文关于本发明的抗体所用，术语“抗体”是指作为IgG同种型亚类1(即IgG1)的抗体，并且具有经由链内和链间二硫键交联的“重”链和“轻”链。轻链各自与重链形成二硫键，并且两条重链在彼此之间形成两个二硫键。各重链由N-末端HCVR和重链恒定区("HCCR")构成。各轻链由N-末端LCVR和轻链恒定区("LCCR")构成。当在某些生物系统中表达时，具有天然人Fc序列的抗体在Fc区中被糖基化。通常，糖基化发生在抗体的Fc区中的高度保守的N-糖基化位点处。N-聚糖通常与天冬酰胺连接。抗体同样可在其他位置处被糖基化。
优选地，本发明的抗体含有作为人IgG1亚型的Fc部分。众所周知，人IgG1结合Fc-γ受体家族(FcγR)以及C1q。与这些受体的相互作用可诱导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
重链的恒定区含有CH1、CH2和CH3结构域。CH1在HCVR之后；CH1和HCVR形成Fab的重链部分。CH2在铰链区之后，并且在CH3之前。CH3在CH2之后，并且在重链的羧基-末端处。轻链的恒定区含有一个结构域CL。CL在LCVR之后；CL和LCVR形成Fab的轻链部分。优选地，本发明的抗人PD-1激动剂抗体的CL区域是人κ亚型的(例如，SEQ ID NO:18)。
本发明的DNA分子是包含非天然存在的多核苷酸序列的DNA分子，所述多核苷酸序列编码具有本发明的抗体中的至少一个多肽(例如，重链、轻链、可变重链和可变轻链)的氨基酸序列的多肽。
本发明的抗体的HCVR和LCVR区可进一步细分成间插有更保守区(称为框架区("FR"))的超变区(称为互补决定区("CDR"))。各HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR构成，其从氨基-末端至羧基-末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重链的三个CDR称为"HCDR1、HCDR2和HCDR3"且轻链的三个CDR称为"LCDR1、LCDR2和LCDR3"。CDR含有大多数与抗原形成特异性相互作用的残基。Kabat CDR定义(Kabat等人, “Sequencesof Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health,Bethesda, Md. (1991))基于抗体序列可变性。Chothia CDR定义(Chothia等人,“Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987)；Al-Lazikani等人, “Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins”, Journal ofMolecular Biology, 273, 927-948 (1997))基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学。除HCDR1和HCDR2外，Chothia CDR定义与Kabat CDR定义是相同的。North CDR定义(North等人, “A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”, Journal ofMolecular Biology, 406, 228-256 (2011))基于用大量晶体结构的亲和力传播聚类。为了本发明的目的，将氨基酸分配至本发明的抗体的LCVR和HCVR区域内的CDR结构域是基于众所周知的Kabat编号惯例(Kabat, 等人, Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971);Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991))，以及North编号惯例(North等人, A New Clustering of Antibody CDR LoopConformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011))。在本发明的抗体的轻链CDR的情况下，使用North CDR定义。在重链中，HCDR1和HCDR3两者均使用North定义。HCDR2使用North和Kabat定义的杂合体。North定义用于鉴定起始的N-末端位点，而Kabat用于定义最后的位置。
可通过使编码HCVR的DNA可操作连接至编码重链恒定区的另一DNA分子，来将编码HCVR区的分离DNA转化成全长重链基因。人以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列是本领域中已知的。可例如通过标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。
可通过使编码LCVR的DNA可操作连接至编码轻链恒定区的另一DNA分子，来将编码LCVR区的分离DNA转化成全长轻链基因。人以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列是本领域中已知的。可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。优选地，对于本发明的抗体而言，轻链恒定区为κ恒定区。
可以在序列已可操作连接至表达控制序列之后在宿主细胞中表达本发明的多核苷酸。表达载体通常可在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体将含有选择标记(例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶)以允许检测用期望DNA序列转化的那些细胞。
本发明的抗体可容易在哺乳动物细胞(其非限制性实例包括CHO、NS0、HEK293或COS细胞)中产生。使用本领域中众所周知的技术培养宿主细胞。
可通过众所周知的方法将含有目标多核苷酸序列(例如，编码抗体的多肽的多核苷酸和表达控制序列)的载体转移至宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。
可以采用蛋白纯化的各种方法来纯化蛋白，包括但不限于抗体，并且此类方法是本领域中已知的。
在本发明的其他实施方案中，以分离形式提供抗体或编码其的核酸。如本文所用，术语"分离的"是指不含或基本上不含细胞环境中发现的任何其他大分子物质的蛋白、肽或核酸。如本文所用的"基本上不含"意指目标蛋白、肽或核酸占存在的大分子物质的大于80%(以摩尔计)、优选地大于90%和更优选地大于95%。
本发明的抗体或包含其的药物组合物可通过肠胃外途径(其非限制性实例为皮下施用和静脉内施用)施用。本发明的抗体可以连同药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以单个或多个剂量施用于患者。本发明的药物组合物可通过本领域中众所周知的方法制备(例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第22版 (2012), A. Loyd等人, Pharmaceutical Press)并且包含如本文所公开的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
如本文所用，术语“自身免疫性疾病”或“自身免疫性病症”在本文中可互换使用，并且是指由针对自身细胞和/或组织或移植的细胞和/或组织的不适当或不想要的免疫反应产生的不期望的病况。术语“自身免疫性疾病”或“自身免疫性病症”意在此类病况，无论它们是通过体液免疫应答还是细胞免疫应答介导。示例性自身免疫性疾病或病症包括但不限于移植物抗宿主病(GVHD)、实体器官移植排斥、血管炎、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病(T1DM)、多发性硬化症(MS)、巨细胞动脉炎(GCA)、牛皮癣(PsO)、牛皮癣关节炎(PsA)、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、强直性脊柱炎(AS)、肖格伦氏综合征(SjS)、自身免疫性肝炎、硬皮病、乳糜泻、艾迪生氏病、桥本氏病、格雷夫斯氏病、萎缩性胃炎/恶性贫血、后天的性腺功能减退/不育、甲状旁腺功能低下、库姆斯阳性-溶血性贫血、慢性过敏性疾病(诸如哮喘、枯草热或过敏性鼻炎)、克罗恩氏病、男性或女性不育、白塞氏病、韦格纳氏肉芽肿病、心肌炎、肌炎、风湿性多肌痛(PMR)、自发性流产、白癜风、动脉粥样硬化、自身免疫性胰腺炎、大疱性类天疱疮、慢性病毒感染和重症肌无力。为了本公开的目的，优选的自身免疫性疾病是移植物抗宿主病(GVHD)、实体器官移植排斥、血管炎、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病(T1DM)、多发性硬化症(MS) 、巨细胞动脉炎(GCA)、牛皮癣(PsO)、牛皮癣关节炎(PsA)、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、强直性脊柱炎(AS)、肖格伦氏综合征(SjS)、自身免疫性肝炎和硬皮病。
如本文所用，术语“约”暗示所述值或值范围的正负百分之十。例如：“约”12包括范围为10.8(包括端值)至13.2(包括端值)的值；约10 wt%涵盖包括9(包括端值)至11(包括端值) wt%之间的形式；等。
除非另有指示，否则如本文关于抗人PD-1激动剂IgG1抗体对人PD-1 (SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD、优选如SEQ ID NO:14中所示的人PD-1 ECD的亲和力所用的“结合”意指约1 x10-7 M、约1 x 10-8 M、约1 x 10-9 M、约5 x 10-9 M、约1 x 10-10 M的KD，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括，但不限于，在25℃或37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。更优选地，本发明的抗人PD-1激动剂IgG1抗体结合人PD-1(即，SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)，其中KD在约1 x 10-8 M和约5 x 10-10 M之间，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括通过在25℃或37℃下使用SPR生物传感器)所测定。甚至更优选地，这种抗体结合对于人PD-1(即，SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)的亲和力将为约5 x 10-8 M至约5 x 10-10 M，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括通过在25℃或37℃下使用SPR生物传感器)所测定。甚至更优选地，这种抗体对于人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)将分别具有约1.0 x 10-4至约1.0 x 10-3和约1.3 x 105至约2.0 x105的Kon和Koff值(如通过在基本上如本文所述的BIAcore®8K上的SPR所测定)。
在单克隆抗体的背景下，术语“人”、“人源化”和“完全人”是本领域普通技术人员众所周知的(Weiner LJ, J. Immunother. 2006; 29: 1-9; Mallbris L, 等人, J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2016; 9: 13-15)。
如本文所用，术语“适应性免疫”包括免疫应答的组，其与免疫应答的先天组相反，是抗原特异性的，并且在用相同抗原重新刺激后显示增强的次级抗原特异性免疫应答。
术语"治疗(treating)"(或"治疗(treat)"或"治疗(treatment)")是指减缓、中断、阻止、缓解、停止、减轻或逆转现有症状、病症、病况或疾病的进展或严重程度。
"有效量"意指本发明的抗人PD-1激动剂IgG1抗体或包含这种抗体的药物组合物将引发研究者、医师或其他临床医师寻求的对组织、系统、动物、哺乳动物或人的生物或医学应答或期望治疗效果的量。抗体的有效量可根据因素而变化，所述因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量以及抗体在个体内引发期望应答的能力。有效量也是其中治疗有益效果胜过抗体的任何毒性或有害效果的量。这种益处包括以下中的任何一项或多项：增加的移植器官的免疫耐受；稳定的自身免疫性疾病或病症；或改善自身免疫性病症的体征或症状等。本领域技术人员可以通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果来容易地确定有效量。在确定用于患者的有效量时，参加的诊断专家考虑许多因素，包括但不限于：患者的体型、年龄和总体健康；所涉及的特定疾病或病症；所述疾病或病症的程度或参与或严重程度；个体患者的应答；施用的特定化合物；施用模式；所施用制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；伴随用药的使用；和其他相关情况。
如本文所用，术语患者的“有效应答”或患者对治疗的“应答性”是指在施用本公开的抗体后赋予患者的临床或治疗益处。这种益处包括以下中的任何一项或多项：增加的移植器官的免疫耐受；稳定的自身免疫性疾病或病症；或改善自身免疫性病症的体征或症状等。
本文公开的方法的潜在优点是，在患有自身免疫性病症的患者中产生显著和/或延长的缓解的可能性，其具有可接受的安全性概况，包括可接受的耐受性、毒性和/或不良事件，使得患者总体受益于治疗方法。可以通过通常用于评估各种自身免疫性病症的治疗的各种终点来测量本公开的疗效，所述终点包括但不限于美国风湿病学会(ACR) 20、ACR50、ACR70、牛皮癣面积和严重程度指数(PASI) 50、PASI75、PASI90、PASI100、系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLEDAI)。可以任选地采用确定本发明的任何特定疗法的效力的各种其他方法，包括例如免疫细胞活化标志物、炎症的量度、细胞周期依赖性生物标志物测量可视化和/或通过疼痛评价测量应答。
由于形成中和抗体或更快的药代动力学，对生物制剂形成抗药物抗体可以降低治疗的有效性。在一些罕见情况下，ADA也可以与安全性问题相关。自身免疫性疾病是慢性的，需要长期治疗。因此，当治疗性生物药物(例如，治疗性抗体)停止工作时，经常需要替代治疗。为了克服随着时间的免疫原性的挑战，依次使用生物制剂，甚至是靶标相同靶标的生物制剂，例如TNF抑制剂，是自身免疫领域中广泛接受和利用的治疗实践(参见，例如，Lloyd,S., 等人(2010) The effectiveness of anti-TNFα therapies when usedsequentially in rheumatoid arthritis patients: a systematic review and meta-analysis. Rheumatology, 49:2313-21)。
本公开提供了抗人PD-1抗体，其包含：
1) HCVR，其包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；和
2) LCVR，其包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR3，其中所述抗体是IgG1。优选地，这种抗体结合人PD-1(即，SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)，其中KD为约1 x 10-7 M，约1 x 10-8 M，约1 x 10-9 M，约5 x 10-9 M，或约1 x 10-10 M，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括，但不限于，在25℃或37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。优选地，这种抗体结合人PD-1(即，SEQ IDNO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)，其中KD在约1 x 10-8 M和约5 x 10-10 M之间，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括，但不限于，在25℃或37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。更优选地，这种抗体结合人PD-1(即，SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)，其中KD在约5 x 10-8 M和约5 x10-10 M之间，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括，但不限于，在25℃或37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。
在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体，其包含：
1)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR；和
2)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1。优选地，这种抗体结合人PD-1(即，SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)，其中KD为约1 x10-7M，约1 x 10-8 M，约1 x 10-9 M，约5 x 10-9 M，或约1 x 10-10 M，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括，但不限于，在25℃或37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。更优选地，这种抗体结合人PD-1(即，SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)，其中KD在约1 x 10-8 M和约5 x 10-10 M之间，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括，但不限于，在25℃或37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。甚至更优选地，这种抗体结合人PD-1(即，SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)，其中KD在约5 x 10-8 M和约5 x 10-10M之间，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括，但不限于，在25℃或37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。
在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体，其包含：
1)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链；和
2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体，其由以下组成：两条具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的轻链。优选地，这种抗体结合人PD-1(即，SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)，其中KD为约1 x10-7 M，约1 x 10-8 M，约1 x 10-9 M，约5 x 10-9 M，约1 x 10-10 M，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括，但不限于，在25℃或37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。更优选地，这种抗体结合人PD-1(即，SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)，其中KD在约1 x10-8 M和约5 x 10-10 M之间，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括，但不限于，在25℃或37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。甚至更优选地，这种抗体结合人PD-1(即，SEQ ID NO:13)或人PD-1 ECD(例如，SEQ ID NO:14)，其中KD在约5 x 10-8 M和约5 x 10-10 M之间，如通过本领域中已知的方法和/或通过基本上如本文所述的方法(包括，但不限于，在25℃或37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。
本公开提供了能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体包含：具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQID NO:7的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR3，其中所述抗体是IgG1。
在一些实施方案中，本公开提供了能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体包含：具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR，和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1。
在一些实施方案中，本公开提供了能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体包括包含以下的抗人PD-1抗体：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开提供了能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体包括由以下组成的抗人PD-1抗体：两条具有SEQID NO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。
本公开提供了用于产生抗人PD-1抗体的方法，其包括：1)培养能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体包含：具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQID NO:8的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的LCDR3，其中所述抗体是IgG1；和2)回收所述抗体。
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生抗人PD-1抗体的方法，其包括：1)培养能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体包含：具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR，和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1，和2)回收所述抗体。
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生抗人PD-1抗体的方法，其包括：1)培养能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体包含：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链；和2)回收所述抗体。在一些实施方案中，本公开提供了用于产生抗人PD-1抗体的方法，其包括：1)培养能够表达抗人PD-1抗体的哺乳动物细胞，所述抗人PD-1抗体由以下组成：两条具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链；和2)回收所述抗体。本公开还提供了通过所述方法产生的抗人PD-1抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开提供了DNA分子，其包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:11和12的序列的多核苷酸。本公开还提供了包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:11和12的序列的多核苷酸。
本公开提供了药物组合物，其包含：1)抗人PD-1抗体，其包含：具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR3，其中所述抗体是IgG1，和2)可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，所述抗人PD-1抗体包含：具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR，和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1。在一些实施方案中，所述抗人PD-1抗体包含：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述抗人PD-1抗体由以下组成：两条具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。
PD-1途径作为免疫检查点的作用已得到广泛研究。已知当刺激PD-1途径时，免疫系统活性通常降低，其可用于治疗自身免疫性病症，诱导免疫耐受和/或减少移植物抗宿主疾病。
本公开提供了治疗自身免疫性病症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人PD-1抗体，所述抗人PD-1抗体包含：1) HCVR，其包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR3；和2) LCVR，其包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR3，其中所述抗体是IgG1。在一些实施方案中，本公开提供了治疗自身免疫性病症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人PD-1抗体，所述抗人PD-1抗体包含：1)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR；和2)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1。在一些实施方案中，本公开提供了治疗自身免疫性病症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人PD-1抗体，所述抗人PD-1抗体包含：1)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开还提供了所述抗体由以下组成：两条具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。在此类实施方案中，本公开还提供了所述自身免疫性病症是GVHD、实体器官移植排斥、血管炎、SLE、T1DM、MS、GCA、PsO、PsA、RA、IBD、UC、AS、SjS、自身免疫性肝炎、硬皮病、乳糜泻、艾迪生氏病、桥本氏病、格雷夫斯氏病、萎缩性胃炎/恶性贫血、后天的性腺功能减退/不育、甲状旁腺功能低下、库姆斯阳性-溶血性贫血、慢性过敏性疾病(诸如哮喘、枯草热或过敏性鼻炎)、克罗恩氏病、男性或女性不育、白塞氏病、韦格纳氏肉芽肿病、心肌炎、肌炎、PMR、自发性流产、白癜风、动脉粥样硬化、自身免疫性胰腺炎、大疱性类天疱疮、慢性病毒感染或重症肌无力。
在一些实施方案中，本公开还提供了所述抗体与用于治疗自身免疫性病症的其他治疗剂组合施用。
本公开提供了本发明的抗人PD-1抗体，其用于疗法中。在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体，其包含：1)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR；和2)具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1，所述抗人PD-1抗体用于疗法中。在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体，其包含：1)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链，所述抗人PD-1抗体用于疗法中。在一些实施方案中，本公开还提供了所述抗体由以下组成：两条具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开提供了所述疗法用于治疗自身免疫性病症。在一些实施方案中，本公开提供了所述自身免疫性病症是GVHD、实体器官移植排斥、血管炎、SLE、T1DM、MS、GCA、PsO、PsA、RA、IBD、UC、AS、SjS、自身免疫性肝炎、硬皮病、乳糜泻、艾迪生氏病、桥本氏病、格雷夫斯氏病、萎缩性胃炎/恶性贫血、后天的性腺功能减退/不育、甲状旁腺功能低下、库姆斯阳性-溶血性贫血、慢性过敏性疾病(诸如哮喘、枯草热或过敏性鼻炎)、克罗恩氏病、男性或女性不育、白塞氏病、韦格纳氏肉芽肿病、心肌炎、肌炎、PMR、自发性流产、白癜风、动脉粥样硬化、自身免疫性胰腺炎、大疱性类天疱疮、慢性病毒感染或重症肌无力。在一些实施方案中，本公开提供了所述抗体与用于治疗自身免疫性病症的另一种治疗剂组合施用。在一些实施方案中，本公开还提供了所述抗体与用于治疗自身免疫性病症的另一种治疗剂同时、分开或依次组合施用(或待施用)。
本公开提供了本发明的抗人PD-1抗体，其用于制备用于治疗自身免疫性病症的药物。在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体，其包含：1)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCVR；和2)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCVR，其中所述抗体是IgG1，所述抗人PD-1抗体用于制备用于治疗自身免疫性病症的药物。在一些实施方案中，本公开提供了抗人PD-1抗体，其包含：1)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链；和2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链，所述抗人PD-1抗体用于制备用于治疗自身免疫性病症的药物。在一些实施方案中，本公开还提供了所述抗体由以下组成：两条具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链，和两条具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，本公开提供了所述药物用于治疗自身免疫性病症。在一些实施方案中，本公开提供了所述药物用于治疗GVHD、实体器官移植排斥、血管炎、SLE、T1DM、MS、GCA、PsO、PsA、RA、IBD、UC、AS、SjS、自身免疫性肝炎、硬皮病、乳糜泻、艾迪生氏病、桥本氏病、格雷夫斯氏病、萎缩性胃炎/恶性贫血、后天的性腺功能减退/不育、甲状旁腺功能低下、库姆斯阳性-溶血性贫血、慢性过敏性疾病(诸如哮喘、枯草热或过敏性鼻炎)、克罗恩氏病、男性或女性不育、白塞氏病、韦格纳氏肉芽肿病、心肌炎、肌炎、PMR、自发性流产、白癜风、动脉粥样硬化、自身免疫性胰腺炎、大疱性类天疱疮、慢性病毒感染或重症肌无力。
剂量方案可以进行调整以提供最佳的期望应答(例如，治疗效果)。可以滴定治疗剂量以优化安全性和效力。对于静脉内(i.v.)或非静脉内施用、皮下(s.c.)局部或全身或其组合的给药时间表将通常范围为单次推注剂量或连续输注至每月多次皮下施用，优选每天不超过一次，或更优选地，每周不超过一次，甚至更优选地，每两周不超过一次，甚至更优选地，每月不超过一次，或者如治疗医师和患者的病况所指示。给药量和频率可以由治疗患者的医师确定。
实施例1：抗体表达和纯化
以下在标题为“氨基酸和核苷酸序列”的部分中列出了抗体1的重链和轻链的可变区的CDR的氨基酸序列、完整的重链和轻链氨基酸序列以及编码其的核苷酸序列。此外，在下表1(a)中显示抗体1的轻链、重链、LCVR和HCVR的氨基酸序列的SEQ ID NO。此外，在表1(a)中显示抗体1的HC可变区和LC可变区的CDR的氨基酸序列的SEQ ID NO。
基本上可以如下制备和纯化本发明的抗体，包括但不限于抗体1。适当的宿主细胞，诸如但不限于HEK 293或CHO，可以使用例如编码重链和轻链表达的单一载体或两种载体(一种编码重链，且一种编码轻链(使用最佳的预定HC:LC载体比率(诸如1:3或1:2)))，用分泌抗体的表达系统瞬时或稳定转染。
由于治疗性抗体在哺乳动物细胞中的有效表达经常是治疗性抗体的商业成功的关键因素，所以通过测试多种密码子变体(包括从信号序列和可变区的市售密码子优化服务商获得的一些)来优化编码抗体1的cDNA。如分别编码抗体1的重链和轻链的SEQ ID NO:11和12中所示的多核苷酸用于生成细胞系，与表达如SEQ ID NO:12中所示的多核苷酸和就在稳定CHO细胞系的密码子使用而言未优化的编码抗体1的重链的多核苷酸的类似CHO细胞系相比，所述细胞系有效产生增加的滴度(例如，优选地，高最多达约6倍，更优选地，最多达约7倍，甚至更优选地，最多达约8倍，甚至更优选地，最多达约9倍，甚至更优选地，最多达10倍，甚至更优选地，最多达11倍)。
可使用许多常用技术中的任一者纯化其中已分泌抗体1的培养基。例如，可将培养基施加至已用相容缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4))平衡的MabSelect柱(GEHealthcare)或KappaSelect柱(GE Healthcare)(用于Fab片段)。可洗涤该柱以除去非特异性结合组分。可例如通过pH梯度(诸如20mM Tris缓冲液(pH 7)至10mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)或磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)至100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0))洗脱结合抗体。可诸如通过UV吸收或SDS-PAGE检测抗体级分，且然后可合并。可通过常用技术(包括大小排阻、疏水性相互作用、离子交换、多模式或羟基磷灰石色谱)有效除去可溶性聚集物和多聚体。可以使用常规技术将抗体浓缩，缓冲液交换和/或无菌过滤。该产物可以在4-5℃下储存或立即在-80℃下冷冻或可以冻干。
表1(a)：抗人PD-1激动剂抗体的SEQ ID NO
表 1(b)：PD-1序列的SEQ ID NO
。
实施例2：抗体1结合细胞表面上的人和食蟹猴PD-1
可以使用流式细胞术测定法测量本文公开的抗人PD-1激动剂抗体结合细胞表面人或食蟹猴PD-1的能力。通过根据建立的方案使用电穿孔系统(Gene Pulser Xcell;BioRad)将人或食蟹猴PD-1质粒DNA转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO-k1; Lonza)中，生成表达人和食蟹猴PD-1(即，分别如SEQ ID NO:13和15中所示)的稳定细胞。在培养基中使用500µg/mL G418 (Thermo Scientific)从单一分离的细胞选择稳定的细胞。对于流式细胞术，将细胞以1 x 105个细胞/孔的密度转移至96-孔V-型底板中。用1x FACS缓冲液(BectonDickinson #554656)洗涤细胞。添加抗体1或对照人IgG1(在FACS缓冲液中以抗体的三倍12点滴定稀释，在100微克/mL开始)(在100微升中)，并将细胞在4℃下孵育30分钟。
在FACS缓冲液中洗涤两次之后，以1:200稀释度添加FITC缀合的F(ab’)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-096-170)，并将细胞在4℃下孵育30分钟。在FACS缓冲液中洗涤两次之后，根据制造商的方案使用SytoxBlue (Invitrogen, #S34857)进行活/死细胞染色。细胞在Fortessa、Fortessa Fx或LSRII流式细胞仪上处理。使用FlowJo软件分析流式细胞术数据。几何平均荧光强度(GMFI)值用于基于4-参数逻辑回归计算相对EC50。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体1能够分别以1.30 +/- 0.16 µg/mL和1.09+/- 0.30 µg/mL的平均EC50结合细胞膜表达的人或食蟹猴PD-1。该数据表明抗体1能够以相似的亲和力结合人和食蟹猴膜结合的PD-1两者。
实施例3：抗体1对于人和食蟹猴PD-1 ECD的结合动力学/亲和力
本发明的抗人PD-1激动剂抗体与人和食蟹猴PD-1 ECD的结合动力学可以通过使用表面等离振子共振生物传感器、诸如BIAcore®2000、BIAcore®3000、BIAcore® 8K或BIAcore® T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)来测定。简要地描述，使用BIAcore®8K仪器在25℃下经由表面等离振子共振(SPR)测量抗体1与人和食蟹猴PD1-细胞外结构域(ECD)-His的结合动力学。将样品溶解于1X HBS-EP+ 运行缓冲液(Teknova目录号H8022)中，并利用蛋白A偶联的CM5系列S传感器芯片(GE Healthcare目录号29139131-AA)来捕获mAb。含有C-末端8x组氨酸标签的人和食蟹猴PD1-ECD蛋白在CHO细胞中表达，并通过镍负载的IMAC、随后大小排阻进行纯化。
使用多个分析循环来评估结合。每个循环都在25℃下以10μl/min的流速进行，用于mAb捕获，并且以30μl/min的流速进行，用于配体缔合和解离。每个循环由以下步骤组成：在流通室2上以2 μg/ml注入mAb，持续60s接触时间，目标为近似220 RU的捕获水平，注入150秒的人或食蟹猴PD1-ECD-his (通过四倍连续稀释，浓度范围为400 nM至1.6 nM)，随后为600秒解离阶段，并经30秒接触时间使用10 mM甘氨酸盐酸盐(pH 1.5)进行再生。使用标准的双重参考，评估每个循环的缔合(即，Kon)和解离速率(即，Koff)，并且以平行动力学批处理模式在Biacore 8K评估中拟合至“1:1 (Langmuir)结合”模型。根据关系KD = Koff/Kon由结合动力学计算亲和力(KD)。
在随后的实验中，使用Biacore通过BIAcore® T200在37℃下经由表面等离振子共振(SPR)测量抗体1与人和食蟹猴PD1-细胞外结构域(ECD)-His的结合动力学。对于在37℃下的分析，使用多个分析循环评估结合。每个循环都在37℃下以10μl/min的流速进行，用于mAb捕获，并且以100μl/min的流速进行，用于配体缔合和解离。每个循环由以下步骤组成：在流通室2上以2.5 μg/ml注入mAb，目标为近似220 RU的捕获水平，注入180秒的人或食蟹猴PD1-ECD-his (通过2倍连续稀释，浓度范围为1000 nM至1.6 nM)，随后为600秒解离阶段，并经30秒接触时间使用10 mM甘氨酸盐酸盐(pH 1.5)进行再生。Kon、Koff和KD基本上如上所述进行计算。亲和力数据报告为从三次独立实验中的一式三份测量测定的平均值和标准偏差(平均值 ± SD，n = 9)。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体1结合人和食蟹猴PD1-ECD-his两者，如通过Biacore在25℃ (n=1)和37℃ (n=9)所测定，并且如表2中所举例说明。
表2. 抗体1与PD-1 ECD的结合的动力学和亲和力
。
如表2中所示，抗体1以纳摩尔亲和力结合人和食蟹猴PD-1 ECD，并证明对人和食蟹猴PD-1 ECD两者相似的结合动力学。
实施例4：抗体1不阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合
可以如下测定本发明的抗体阻断PD-1与PD-L1和PD-L2结合的能力。简要地描述，通过根据建立的方案使用电穿孔系统(Gene Pulser Xcell; BioRad)将人PD-1质粒DNA转染至CHO-k1细胞(Lonza)中而生成表达人PD-1的稳定细胞。在培养基中使用500 µg/mLG418 (Thermo Scientific)从单一分离的细胞选择稳定的细胞。将200 µg/mL或在100 µg/mL开始、随后在FACS缓冲液中的12倍7点抗体滴定的测试PD-1抗体在4℃下孵育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次。将细胞重悬浮于50 µl具有20 µg/mL生物素化的人PD-L1(Acros, #PD-1-H82F3)或PD-L2 (Abcam, ab198764)的FACS缓冲液中，并在4℃下孵育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并重悬浮于100微升具有在FACS缓冲液中1:200稀释的链霉抗生物素蛋白-APC (BD Bioscienses, #554067)的FACS缓冲液中，并在4℃下孵育30分钟。在FACS缓冲液中洗涤两次后，根据制造商的方案使用SytoxBlue (Invitrogen, #S34857)进行活/死细胞染色。细胞在Fortessa、Fortessa Fx或LSRII流式细胞仪上进行处理。使用FlowJo软件分析流式细胞术数据。平均荧光强度(MFI)值用于基于4参数逻辑回归计算相对IC50。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体1和同种型对照抗体既不阻断PD-L1结合，也不阻断PD-L2结合，阳性对照抗体(PD-1特异性拮抗剂抗体(尼沃单抗的同源物)的IC50，对于PD-L1为0.22 +/- 0.02 μg/mL，且对于PD-L2为0.42 +/- 0.12 μg/mL。这些数据证明抗体1不阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合。
实施例5：抗体1抑制T细胞受体活化诱导的NFAT信号传导
NFAT(活化的T细胞的核因子)是一种转录因子，其通过调节编码炎性细胞因子(例如TNF、IL-2)以及几种细胞表面受体的基因的表达，在介导T细胞受体活化至免疫应答中发挥重要作用。可以如下测量本文公开的抗体抑制T细胞受体活化诱导的NFAT信号传导的能力。
简要地描述，用人CD3抗体和THP-1细胞(ATCC®)活化用NFAT荧光素酶报告子和人PD-1 (Promega)转染的Jurkat T细胞。将THP-1细胞(40,000个细胞/孔)以100 µl铺板至白色的96-孔板(Corning, #3917)中。将20 µg/mL的最终浓度或在10 µg/mL开始的5倍7点滴定的2 µg/mL抗人CD3抗体(OKT3)(eBioscience, #16-0037)和治疗抗体(抗体1或同种型对照抗体)添加至THP-1细胞上。将细胞和抗体混合物在37℃、5% CO2下孵育30分钟。将表达PD-1的NFAT-荧光素酶Jurkat报告子细胞(50,000个细胞/孔)添加至96-孔板上的THP-1细胞、CD3抗体和处理抗体混合物上，并在37℃、5% CO2下孵育5小时。在孵育结束时，将板置于室温10分钟。将八十(80)微升的BioGlo试剂(Promega, #G7940)添加至孔中，并在室温下孵育10分钟。通过LMaxII384 (Molecular Devices)或Envision 2105 (Perkin Elmer)准备发光。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体1和同种型对照抗体抑制人PD-1 NFAT-荧光素酶报告子细胞活性，其中来自四次独立实验的平均IC50为75.2 +/- 37.6 ng/mL，而同种型对照抗体没有显著抑制NFAT信号传导。这些数据证明抗体1能够抑制T细胞受体活化诱导的NFAT信号传导。
实施例6：抗体1抑制人原代T细胞增殖
可以如下测量本文公开的抗体抑制由T细胞受体活化诱导的T细胞增殖的能力。简要地描述，使用Ficoll密度梯度离心方法通过将35 mL稀释的血液(在没有钙或镁的PBS中稀释十倍)覆盖至50 mL锥形管中的15 mL 37℃ Ficoll (Ficoll-Paque Plus, GEHealthcare; #17144002)上，从健康的人Trima LRS (San Diego Blood Bank; SanDiego, CA)分离人外周血单核细胞(PBMC)。将该管在室温下以900xG离心30分钟。将细胞界面转移至新的50 mL锥形管中。将最终体积用室温PBS(没有钙或镁)调节至50 mL。在PBS中洗涤两次后，将细胞重悬浮于完全CTS培养基(Gibco, #A1048501; #A10484-02)中。
分离的人PBMC用CFSE (Biolegend，目录号79898)标记。PBMC在无血清RPMI中洗涤3次。CFSE标记在无血清培养基中在1 µM CFSE存在的情况下在37℃与5% CO2下实施20分钟。将CFSE用完全CTS培养基淬灭，随后进行洗涤步骤。
将CFSE标记的PBMC(150,000个细胞/孔)添加至每个含有抗体1或同种型对照抗体的96-孔圆底孔中。在37℃与5% CO2下，将细胞用4 ng/mL超抗原(葡萄球菌肠毒素，SEB)(Toxin Technologies BT2021MG)刺激72小时。
孵育后的板用FACS缓冲液(Miltenyi Biotec; #130-091-221)洗涤，与人Fc封闭试剂(Miltenyi Biotec, #130-059-901)孵育10分钟，随后用标记的针对CD4 (Biolegend,#317426)和PD-1(eBioscience, #17-2799-42)的抗体在冰上染色30分钟。在FACS缓冲液中洗涤后，根据制造商的方案使用SytoxBlue (Invitrogen, #S34857)进行活/死细胞染色。在CountBright珠粒(Invitrogen, #C36950)存在的情况下，在Fortessa X20流式细胞仪上处理细胞以定量细胞数。使用FlowJo软件分析流式细胞术数据。使用CFSE染色和CountBright珠粒计算分裂中的CD4阳性细胞的绝对计数。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体1能够抑制人原代T细胞增殖，其中对于八个不同的供体，平均IC50为175 +/- 128 ng/mL，而同种型对照抗体没有抑制原代T细胞增殖。这些数据证明抗体1能够在体外抑制T细胞增殖。
实施例7：体外细胞因子释放研究
该研究的目的是测试抗体1是否诱导从未刺激的人PBMC释放细胞因子。
简要地描述，将从健康受试者新鲜分离的PBMC与经0.5 µg至1.5 µg的滴定范围的板结合的抗体1或对照抗体孵育24小时。阳性对照是市售的抗人CD3ε抗体OKT3，和CD28-特异性超激动剂治疗性抗体的同源物TGN1412。已知两种抗体均引起细胞因子释放综合征，一种可能威胁生命的全身性炎性应答综合征的形式。阴性对照是人IgG1野生型(WT)同种型对照抗体。使用基于Mesoscale平台的市售多重测定，在细胞培养上清液中测量5种细胞因子，包括IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α。
在基本上如上所述进行的实验中，人PBMC与浓度为0.5、1或1.5 µg/孔的抗体1的孵育不导致IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的显著水平的细胞因子释放。相反，PBMC与1µg/孔的抗CD3ε和TGN1412阳性对照抗体的孵育导致大多数供体中的IL-2、IFN-γ、IL-10和TNF-α的稳健产生。
实施例8：小鼠移植物抗宿主病(GVHD)体内模型
基于用人PBMC注射的免疫缺陷品系的异种-GvHD的人源化小鼠模型(“Hu-PBMC小鼠”)是研究体内人免疫功能的重要工具。在Hu-PBMC小鼠模型中评估本文公开的抗体保护小鼠免于GvHD的能力。
简要地描述，将雌性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, JAX Labs,库存号05557)以每笼3只在72℃下圈养于12小时光照：黑暗周期下，并且允许随意获取食物和水(n=78)。根据制造商的说明(STEMCELL Technologies, Vancouver, BC)，使用SepMate50 Ficoll制备管从获得自两个供体的LRS管(San Diego Blood Bank)分离人PBMC。将新鲜分离的PBMC以1.2 x 108个细胞/mL悬浮于PBS中，并在第0天用100μL PBMC悬浮液静脉内移植小鼠(1.2 x 107/小鼠)；36只小鼠接受来自供体1的PBMC，36只小鼠接受来自供体2的PBMC，且6只小鼠仍然是未移植的对照。随后对于每个供体遵循相同的方案。在第1天，将小鼠分为四个重量匹配的组/供体，并用同种型对照或抗体1以0.1、1.0或10.0 mg/kg皮下给药(200 µL/小鼠)。对于实验的剩余部分中，每周两次继续给药。定期进行健康检查和体重测量。将损失20%的其起始重量或处在明显痛苦中的小鼠安乐死。当大多数同种型对照小鼠由于疾病进展而需要安乐死时，将所有小鼠处死。对于所有安乐死的小鼠，在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺将血液收集至EDTA管中用于FACS分析，并通过离心进行澄清用于血浆分析。体重和临床观察：小鼠在BSL2通风橱中称重，并且2-3次/周评价痛苦的临床体征。该模型常见的临床体征是毛发不整齐，身体蜷缩，消瘦以及呼吸或运动费力。体重变化被计算为其基线重量的百分比：(天(x)重量/第0天重量)*100。
血浆分析：将来自心脏穿刺的血液收集至EDTA包被的管中，通过离心进行澄清，并将所得的血浆储存在-80℃用于将来处理。根据制造商的说明，使用Mesoscale DiscoveryHuman Th1/Th2 10-Vplex (Rockville, Maryland)测量血浆细胞因子。
统计学：使用Prism软件(GraphPad, San Diego, CA)对数据进行图表化并计算统计学。各组之间的重量的差异通过双向RM-ANOVA与Tukey氏事后检验进行测定。末端血浆细胞因子水平的差异通过单向ANOVA与Tukey氏事后检验进行测定。如果p <0.05，则认为各测试组之间的差异是显著的。
在基本上如上所述进行的实验中，来自供体1或供体2的人PBMC的移植引发GvHD，如通过NSG小鼠中的显著消瘦所证明。与分别在第26天和第40天由于显著的重量减轻具有研究终止的供体1相比，用供体2 PBMC移植的小鼠中的疾病进展更快。用抗体1的治疗显著减弱疾病进展，如通过用任一供体移植的小鼠中的重量减轻的减少所测量。此外，抗体1抑制与疾病进展相关的血浆人Th1(IFN-γ)和Th2(IL-13)细胞因子的明显增加。因此，抗体1在人源化GvHD模型中显著降低疾病进展。
实施例9：hPD-1 KI至狼疮性肾炎的Bm12慢性GvHD小鼠模型
通过注射来自在C57BL/6背景上表达人PD-1的供体小鼠的脾细胞，可以在Bm12小鼠中诱导特征在于自身抗体的发展和与人狼疮性肾炎类似的病理的慢性GvHD (cGvHD)。在本实施例9中描述的研究中，将来自hPD-1 KI小鼠(C57BL/6-Pdcd1<tm1606.1)的脾细胞注射至B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ (Bm12)小鼠中。随后，宿主小鼠发展缓慢进展的SLE样疾病，其特征在于针对dsDNA的自身抗体的发展以及肾脏中免疫-复合物沉积。因此，可以如下在该狼疮性肾炎模型中评估PD-1激动剂抗体的活性。
简要地描述，雄性人PD-1敲入小鼠(Taconic Laboratories)在到达时为9周龄，且雄性Bm12小鼠(Jackson Laboratories)在到达时为11周龄。所有小鼠都以4只/笼圈养，并在研究开始前适应1周。向小鼠喂食Teklad Global Rodent Diet 2014 (Harlan)和自由饮水。在设定为68-79°F的环境温度下，以12-小时光照/黑暗周期圈养小鼠。研究开始前四天，基于体重随机分选小鼠，并经由尾部切口收集75 µl全血。通过以10,000 rpm离心5分钟从全血分离血清，并用于定量抗dsDNA滴度。然后将小鼠分配至以下治疗组中：(1) 10.0 mg/kg hIgG1同种型对照，(2) 1.0 mg/kg抗体1，(3) 10.0 mg/kg抗体1。在第0天开始，向小鼠皮下给药人IgG1同种型对照和抗体1，每周两次。每2周经由尾部切口从小鼠收集血清样品，直至治疗开始后42天研究终止。
血清抗dsDNA水平通过定制ELISA测量。将板(96孔)在4℃下用10 µg/ml小牛胸腺DNA (R&D Systems)包被过夜。用PBS-Tween (0.05%)洗涤后，添加2 µl样品(1:100稀释)并1:3连续稀释。在室温下孵育2小时后，将板洗涤，并以1:2000稀释度添加山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)，持续90分钟。洗涤板，并添加Ultra-TMB (ThermoSciPierce)，持续15分钟，并用1N H2S04终止反应。在450 nm波长处读取OD，并计算EC50值。
在基本上如上面实施例9中所述进行的实验中，在研究过程期间用抗体1治疗以剂量依赖的方式减少针对双链DNA的自身抗体(抗dsDNA)的滴度。在1 mg/kg和10 mg/kg的抗体1的剂量下，在第28天和第42天，抗dsDNA水平与人IgG1同种型对照组相比的降低是统计学显著的。抗dsDNA AUC也被抗体1剂量依赖性地降低。10 mg/kg的抗体1能够从人IgG1同种型对照显著降低抗dsDNA AUC。因此，抗体1可以在狼疮的cGvHD模型中显著降低疾病进展。
氨基酸和核苷酸序列
抗体1的重链(SEQ ID NO:1)
抗体1的轻链(SEQ ID NO:2)
抗体1的重链可变区(SEQ ID NO:3)
抗体1的轻链可变区(SEQ ID NO:4)
抗体1的HCDR1 (SEQ ID NO:5)
抗体1的HCDR2 (SEQ ID NO:6)
抗体1的HCDR3 (SEQ ID NO:7)
抗体1的LCDR1 (SEQ ID NO:8)
抗体1的LCDR2 (SEQ ID NO:9)
抗体1的LCDR3 (SEQ ID NO:10)
编码抗体1的重链的DNA(SEQ ID NO:11)
编码抗体1的轻链的DNA(SEQ ID NO:12)
人PD-1的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
人PD-1 ECD的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)
食蟹猴PD-1的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)
食蟹猴PD-1 ECD的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)
人IgG1的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)：
野生型人κ的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)
野生型人λ的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)

Claims (15)

1.结合人PD-1的抗体，其包含：1)重链可变区(HCVR)；和2)轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:5，所述HCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:6，且所述HCDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:7，所述LCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:8，所述LCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:9，且所述LCDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:10。
2.权利要求1的抗体，其中所述HCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO:3，且所述LCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO:4。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体是IgG1。
4.权利要求2的抗体，其包含：1)HC；和2)LC，其中所述HC的氨基酸序列是SEQ ID NO:1，且所述LC的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
5.权利要求4的抗体，其包含两条HC和两条LC，其中所述HC各自的氨基酸序列是SEQ IDNO:1，且所述LC各自的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
6.权利要求1-5中任一项的抗体，其中所述抗体是人PD-1的激动剂，如在自身免疫性病症或移植排斥的体内模型中所确定。
7.权利要求6的抗体，其中所述体内模型是GVHD、实体器官移植排斥、血管炎、SLE、T1DM、MS、GCA、PsO、PsA、RA、IBD、UC、AS、SjS、自身免疫性肝炎或硬皮病的模型。
8.权利要求6的抗体，其中所述体内模型是GVHD和/或狼疮性肾炎的小鼠模型。
9.药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.权利要求1-8中任一项的抗体用于制备用于治疗自身免疫性疾病的药物的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述自身免疫性疾病是GVHD、实体器官移植排斥、血管炎、T1DM、MS、GCA、PsO、PsA、RA、IBD、AS、SjS、自身免疫性肝炎、硬皮病、乳糜泻、艾迪生氏病、桥本氏病、格雷夫斯氏病、萎缩性胃炎/恶性贫血、甲状旁腺功能低下、库姆斯阳性-溶血性贫血、慢性过敏性疾病、男性或女性不育、白塞氏病、韦格纳氏肉芽肿病、心肌炎、肌炎、PMR、自发性流产、白癜风、动脉粥样硬化、自身免疫性胰腺炎、大疱性类天疱疮、慢性病毒感染或重症肌无力。
12.权利要求11的用途，其中所述自身免疫性疾病是RA。
13.权利要求11的用途，其中所述慢性过敏性疾病是哮喘、枯草热或过敏性鼻炎。
14.权利要求10的用途，其中所述自身免疫性疾病是后天的性腺功能减退/不育。
15.权利要求10-11中任一项的用途，其中所述药物还包含对于自身免疫性疾病的治疗有效的另一种治疗剂，其与所述抗体同时、分开或依次组合施用。
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