CN111876437A

CN111876437A - 一种靶向cd19和干扰素增效的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN111876437A
Application number: CN201910842885.2A
Authority: CN
Inventors: 朱建高; 杨文君
Original assignee: Zhejiang Compvss Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Compvss Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2019-09-06
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2039-09-06
Also published as: CN111876437B

Abstract

本发明涉及嵌合抗原受体领域，公开了一种靶向CD19和干扰素增效的嵌合抗原受体及其应用，具体地，本发明公开了一种多核苷酸序列，选自：（1）：含有依次连接的抗CD19单链抗体的编码序列、人CD8铰链跨膜区的编码序列、人4‑1BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、人P2A肽的编码序列、EGFRt基因的编码序列、人P2A肽的编码序列和人IFN全长序列；和（2）：（1）中多核苷酸序列的互补序列。本发明还公开了相关的融合蛋白、核酸构建物、逆转录病毒和基因修饰的T细胞，以及上述物质在制备治疗CD19介导的疾病的药物中的用途。

Description

一种靶向CD19和干扰素增效的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及嵌合抗原受体领域，尤其涉及一种包含CD19-CAR并且分泌干扰素的嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞治疗是近年来免疫医学的重大突破之一。CAR-T技术的基本原理是将肿瘤患者自身的T细胞通过基因工程化改造，使T细胞表达CAR基因，转变为可特异性攻击肿瘤的CAR-T细胞，再回输到患者体内消融肿瘤。CAR-T技术最早在1993年由以色列科学家Eshhar Zelig设计并报道，并在之后的二十多年中不断优化和完善。在抗原存在情况下，T细胞需要按照一定顺序依次接受三种信号才能完全激活，并且正常的增殖和分化。这三种信号分别是：第一信号，抗原结合的T细胞受体（TCR），和CD3胞内免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）转导信号（CD3ζ）；第二信号，协同刺激信号，包括CD28、CD137、CD134等表面受体；第三信号，细胞因子，例如I型干扰素、白介素12（IL-12）等。CAR-T设计考虑到了T细胞激活的免疫学特性，CAR的结构包含胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8、CD28 等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序 (ITAM) CD3ζ及共刺激信号分子 CD28、CD137、CD134 等的胞内信号区。目前市场主流的CAR设计为第二代CAR，即在CAR的胞内信号区提供T细胞激活所必须的第一信号（ITAM结构域）和第二信号（B7/CD28或 4-1BB/CD137胞内结构域），能够引起T淋巴细胞的持续增殖，提高T细胞的细胞毒性、增殖活性等。

2010年，首例B细胞淋巴瘤患者接受靶向CD19的CAR-T细胞治疗并取得了令人振奋的积极效果。此后，越来越多的研究组通过临床试验证实了CAR-T技术治疗B细胞血液肿瘤的安全性和有效性。虽然相较传统疗法，CAR-T细胞治疗在血液肿瘤领域展现出巨大的优势，但是其存在的问题仍然不容回避。例如，对有些T细胞活性较差的病人，CAR-T细胞的增殖能力较差，对肿瘤细胞的杀伤效率较低。另外，现有大多数CAR-T普遍表现出体内持续存活能力不足的缺陷，易造成肿瘤复发。而盲目加大CAR-T细胞的使用剂量，容易造成较强的毒副作用，如炎症因子风暴和中枢神经系统毒性。因此，仍然迫切需要对CAR的设计进行改造，进一步提高CAR-T细胞的活性和增殖能力。

发明内容

为了进一步提高CAR-T对B细胞淋巴瘤的杀伤效果，本发明提供了一种包含CD19-CAR-EGFRt-IFN序列的嵌合抗原受体及其用途。本发明在靶向CD19的CAR设计基础上进行改进，在CD19-CAR的C末端增加EGFRt自杀基因片段和基因优化的人全长干扰素（IFN）片段。与仅表达CD19-CAR的CAR-T细胞相比，表达CD19-CAR-EGFRt-IFN的CAR-T细胞具有更强的肿瘤杀伤能力。

要提高CAR-T的抗肿瘤效果，一种思路是在肿瘤部位增加细胞因子的表达。细胞因子可以调节肿瘤组织周围的免疫微环境，同时作为第三信号，进一步提高CAR-T细胞的应答水平。细胞因子包括干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等，种类多达数百种。申请人在前期的研究过程中发现，并非任意的细胞因子都能对T细胞起到显著的增效作用，本发明选择I型干扰素作为第三信号，是基于以下几点原因。首先，申请人早期对I型干扰素进行过大量研究，对其生理功能和潜在副作用已有较深入和全面的认识；其次，I型干扰素具有多重调节作用，一方面可以直接通过抑制肿瘤细胞的增殖和调节凋亡、分化、迁移和细胞表面抗原表达，另一方面激活抗肿瘤免疫，包括：刺激先天性和适应性细胞毒性淋巴细胞如T细胞、NK细胞、树突状细胞、先天性淋巴细胞（ILC）和负性调节阻碍抗肿瘤活性的免疫抑制细胞如髓性抑制细胞（MDSCs）和调节性T（Treg）细胞。在现有技术中，干扰素对于恶性血液肿瘤具有较好的治疗效果，例如慢性髓细胞白血病（CML），IFNα2b重组蛋白注射联合化疗或靶向治疗可以有效提高患者生存期。但是由于直接注射的干扰素重组蛋白在体内半衰期短，且不易到达病灶部位，因此限制了此类治疗方法在临床上的应用。

申请人在大量的前期研究中发现，在CAR的C末端串联表达人IFN全长基因，可以显著提高CAR-T细胞的应答水平。该设计的精妙之处在于，CAR基因和IFN基因之间用P2A肽分隔，因此可以同时表达CAR和分泌型的IFN蛋白。在CAR-T细胞到达肿瘤病灶并激活CAR基因的同时，P2A肽在细胞内的蛋白酶的作用下水解，释放游离的IFN，分泌到胞外发挥免疫激活功能。IFN的表达受到CAR基因的调控，因此可以在病灶部位释放IFN活性，起到精准增效的作用。

本发明的具体技术方案为：

第一，本发明公开了一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

（1）：含有依次连接的抗CD19单链抗体的编码序列、人CD8铰链跨膜区的编码序列、人4-1BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、人P2A肽的编码序列、EGFRt基因的编码序列、人P2A肽的编码序列和人IFN全长序列，和

（2）：（1）中多核苷酸序列的互补序列。

作为优选，所述多核苷酸序列在所述抗CD19单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，进一步优选地，所述信号肽的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第1-63位多核苷酸所示。

作为优选，所述抗CD19单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:1第64-789位多核苷酸所示。

作为优选，所述人CD8铰链跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:1 第790-996位多核苷酸所示。

作为优选，所述人4-1BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1 第997-1137位多核苷酸所示。

作为优选，所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1 第1138-1473位多核苷酸所示。

作为优选，所述人P2A肽的编码序列如SEQ ID NO:1第1474-1551位和第2623-2700位核苷酸序列所示。

作为优选，所述EGFRt基因的编码序列如SEQ ID NO:1中第1618-2622位多核苷酸序列所示。

作为优选，所述多核苷酸序列在所述EGFRt基因的编码序列N端含有CSF2RA信号肽；所述CSF2RA信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1中第1552-1617位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述人IFN为人IFNα2b，所述人IFNα2b全长序列为经过基因优化的人IFNα2b的全长cDNA序列，称为oIFNα2b。进一步优选地，所述oIFNα2b的编码序列如SEQ IDNO:1 第2701-3264位多核苷酸所示。

基因优化后，人IFNα2b基因序列的表达效率可较天然基因序列增强数十倍。

第二，本发明公开了一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：

(1) ：含有依次连接的抗CD19单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、人P2A肽、EGFRt、人P2A肽和人IFN的融合蛋白；和

(2) ：在（1）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且相似或相近生物学活性的由（1）衍生的融合蛋白。

作为优选，所述融合蛋白在所述抗CD19单链抗体的N端还含有CD8信号肽。进一步优选，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-21位氨基酸所示或与具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述抗CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第22-263位氨基酸所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述人CD8铰链跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 第264-332位氨基酸所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述人4-1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 第333-379位氨基酸所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 第380-491位氨基酸所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述人P2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第492-517位和第875-900位核苷酸序列所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述EGFRt氨基酸序列为SEQ ID NO:2第540-874位氨基酸或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述融合蛋白在所述EGFRt的 N端含有CSF2RA信号肽；所述CSF2RA信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第518-539位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述人IFN为人IFNα2b蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2第901-1088位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

第三，本发明公开了一种核酸构建物，所述核酸构建物含有前文所述的多核苷酸序列，或其他能够编码前文所述融合蛋白的多核苷酸序列。作为优选，所述核酸构建物为载体。进一步优选地，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’ LTR，5’LTR，前文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

第四，本发明公开了一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有前文所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。

第五，本发明公开了一种逆转录病毒的转导方法，所述转导方法包括小规模包装前文所述的逆转录病毒的方法、筛选和建立产毒细胞株的方法，以及用产毒细胞株上清大规模转导T细胞的方法。

第六，本发明公开了一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有前文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的核酸构建物，或感染了本文所述的逆转录病毒，或稳定表达前文所述的融合蛋白。

第七，本发明公开了前文所述的基因修饰的T细胞在制备治疗CD19介导的疾病的药物中的用途。

作为优选，所述CD19介导的疾病为B细胞淋巴瘤。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

本发明采用抗CD19单链抗体的基因序列，并从NCBI GenBank数据库中搜索到人的CD8铰链跨膜区、人的4-1BB胞内区、人的CD3ζ胞内区、人P2A肽和人IFN基因序列（人IFNα2b基因的cDNA全长序列）信息。所述人IFNα2b基因的cDNA全长序列经过基因优化得到在人T细胞中表达效率最高的IFN全长序列（oIFNα2b）。

本发明通过全基因合成嵌合抗原受体抗CD19 scFv-CD8铰链跨膜区-4-1BB-CD3ζ-EGFRt-oIFNα2b的基因片段，插入到逆转录病毒载体中。重组质粒在ECO细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明用嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的转导方法是基于逆转录病毒转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，批次稳定性高且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。转导的核酸通过转录、翻译表达在CAR-T细胞表面。用流式细胞术，通过检测EGFR的表达，可以计算出逆转录病毒感染的T淋巴细胞的比例和细胞表面CAR的表达情况。本发明通过逆转录病毒转导T淋巴细胞，得到CAR阳性T淋巴细胞的比例高达70%。体外通过酶联免疫反应（ELISA）检测发现，CAR-T细胞能分泌大量的IFN至培养基上清，说明逆转录病毒成功转导至T细胞并表达分泌型的IFN。CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞的杀伤功能可以通过乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测实验进行检测。本发明制备的CAR-T细胞对CD19阳性的肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，在效靶比是3比1的情况下，杀伤效率超过80％。另外，本发明在CAR基因中增加EGFRt序列。EGFRt基因片段表达的是通过基因改造去除了胞内和胞外信号转导活性片段的EGFR类似物，仅仅保留了能响应西妥昔单抗的片段结构域。因此，EGFRt作为一种先进的自杀基因开关，可以在单抗药物西妥昔单抗诱导下实现CAR-T细胞体内存留的完全可控，从而一定程度上避免了CAR-T细胞带来的潜在毒副作用危害。

本发明首次在CAR的C末端增加人IFN全长基因，获得同时表达CAR和释放分泌型人IFN蛋白的CAR-T细胞。动物体内的研究结果证明，CD19-CAR-EGFRt-IFN的设计可显著提高CAR-T细胞的肿瘤杀伤效率。因此，本发明增强了CAR-T细胞在CD19介导的疾病中的应用效果。

附图说明

图1为CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b全长序列示意图；ScFv：单链抗体可变区；Hinge：CD8铰链区；TM：CD8跨膜区。

图2为流式细胞术分析显示逆转录病毒感染T细胞3天后CD4⁺亚群和CD8⁺亚群的CTRT、CTR CAR T、CD19 T和CD19&IFNα2b T细胞表面EGFR的阳性率，即CAR的表达效率。CD19 T细胞为表达CD19-CAR的T细胞，CTR T细胞为未转导CAR的T细胞，CTR CAR T细胞为表达非CD19靶点的对照CAR-T细胞。

图3为酶联免疫反应（ELISA）检测逆转录病毒感染后，CD19&IFNα2b T，CD19 T和CTR CAR T细胞培养基上清中IFNα2b的含量。

图4为使用CAR-T细胞和靶细胞按照不同效靶比共培养后，用LDH法检测靶细胞裂解率。

图5为肿瘤移植模型中，尾静脉注射CAR-T细胞后，D-luciferin钠盐成像，观察不同时间点小鼠体内的肿瘤细胞残留情况。A，主要实验流程；B，统计不同时间点各组别小鼠体内的荧光素强度；C，图片显示各组别小鼠钠盐成像结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

本发明提供一种包含靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）的融合蛋白。该融合蛋白含有依次连接的抗CD19单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、人P2A肽和人IFN全长的片段。

本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

适用于本发明的人IFN全长片段的编码序列为经过基因优化的人IFN基因cDNA全长序列。应理解，基因优化又称为密码子优化，是指在不改变蛋白质氨基酸序列的情况下，通过替换编码某种蛋白质的多核苷酸序列中的一个或多个核苷酸，达到提高蛋白质在特定种属细胞中的表达水平和表达效率的目的。基因优化包括但不限于密码子偏好性优化、RNA高级结构优化、酶切位点优化和GC含量调整等方法。本发明包括运用上述基因优化方法得到的各种编码人IFN的多核苷酸序列（oIFN）。这些多核苷酸序列的共同特征是采用不同的核苷酸密码子，但是编码的氨基酸序列与野生型人IFN全长cDNA序列相同。可采用例如NCBI的BLAST和BLASTp计算两条比对的多核苷酸序列之间和氨基酸序列之间的序列相同性。作为示范性例子，本发明中oIFNα2b的编码序列如SEQ ID NO:1第2701-3264位多核苷酸所示。

适用于本发明的抗CD19单链抗体可衍生自本领域周知的各种抗CD19单克隆抗体。单链抗体的基本结构包含轻链可变区，接头序列和重链可变区。优选地，轻链可变区为κ链类型。作为示范性例子，本发明中抗CD19单链抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第22-128位氨基酸所示。作为示范性例子，本发明中抗CD19单链抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第144-263位氨基酸所示。单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间由接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。优选地，基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG，接头包含1~5个重复基序，相邻重复基序之间没有插入氨基酸残基。作为示范性例子，本发明抗CD19单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间由（GGGGS）3连接，接头序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第129-143位氨基酸所示。

适用于本发明的人CD8铰链跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8铰链跨膜区序列。作为示范性例子，本发明中人CD8α铰链跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第264-332位氨基酸所示。

适用于本发明的人4-1BB胞内区可以是本领域已知的各种用于CAR的人4-1BB胞内区。作为示范性例子，本发明使用的人4-1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第333-379位所示。

适用于本发明的人CD3ζ胞内区可以是本领域常规用于CAR的各种人CD3ζ胞内区。作为示范性例子，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第380-491位氨基酸所示。

适用于本发明的人P2A肽可以是本领域常规用于CAR的各种自剪切序列。作为示范性例子，所述人P2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第492-517位和第875-900位氨基酸所示。

适用于本发明的信号肽为CD8信号肽和CSF2RA信号肽，以及本领域内常规用于使外源表达重组蛋白定位于细胞膜的信号肽。作为示范性例子，所述CD8信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第1-21位氨基酸所示。作为示范性例子，所述CSF2RA信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第518-539位氨基酸所示。

本发明也包括SEQ ID NO:2第22-491位氨基酸序列所示的CAR、SEQ ID NO:2第22-874位氨基酸序列所示的CAR、SEQ ID NO:2第22-1088位氨基酸序列所示的CAR、SEQ ID NO:2第1-491位氨基酸序列所示的CAR、SEQ ID NO:2第1-874位氨基酸序列所示的CAR或SEQ IDNO:2所示的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。

突变体还包括：SEQ ID NO:2第22-491位所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2第22-874位所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2第22-1088位所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2第1-491位所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2第1-874位所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:2中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

本发明采用抗CD19单链抗体（具体是衍生自克隆号C11D5.3的scFV）的基因序列，并从NCBI GenBank数据库中搜索到人的CD8铰链跨膜区、人的4-1BB胞内区、人的CD3ζ胞内区、人P2A肽和人IFN基因序列（人IFNα2b的cDNA全长序列）信息。所述人IFN基因序列经过基因优化得到在人T细胞中表达效率最高的IFN全长序列（oIFNα2b）。

本发明通过全基因合成嵌合抗原受体抗CD19 scFv-CD8铰链跨膜区-4-1BB-CD3ζ-oIFN的基因片段，插入到逆转录病毒载体中。重组质粒在ECO细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明用嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的转导方法是基于逆转录病毒转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，批次稳定性高且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。转导的核酸通过转录、翻译表达在CAR-T细胞表面。用流式细胞术，通过EGFR抗体检测与CAR基因共表达的EGFRt的含量，可以计算出逆转录病毒感染的T淋巴细胞的比例和细胞表面CAR的表达情况。本发明通过逆转录病毒转导T淋巴细胞，得到CAR阳性T淋巴细胞的比例高达70%。体外通过酶联免疫反应（ELISA）检测发现，CAR-T细胞能分泌大量的IFN蛋白至培养基上清，说明逆转录病毒成功转导至T细胞并表达分泌型的IFN蛋白。CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞的杀伤功能可以通过乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测实验进行检测。本发明制备的CAR-T细胞对CD19阳性的肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，在效靶比是3比1的情况下，杀伤效率超过80％。

本发明通过在CD19-CAR多核苷酸序列的C末端增加基因优化的人IFN全长编码序列，得到CD19-CAR-EGFRt-IFN多核苷酸序列。其中IFN基因序列可以是人IFNα2a、人IFNα2b和人IFNβ三者之中任一基因的全长序列。人IFNα2a和人IFNα2b的氨基酸序列高度相似，仅在第23位氨基酸不同（人IFNα2a第23位氨基酸是K，人IFNα2b第23位氨基酸是R，属于保守性取代）。而人IFNβ同样属于I型干扰素，与上述二者相比生物学功能相近，均具有诱导肿瘤细胞凋亡和调节免疫细胞活性的作用。临床研究中常常将IFNα2和IFNβ互相替代使用。动物实验表明，在CD19-CAR的C末端增加人IFNα2b基因全长片段后，较CD19-CAR序列相比，表达CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b的CAR-T细胞在动物体内具有更强的肿瘤杀伤能力。因此申请人认为上述三种基因的任一种均能起到对CAR-T细胞的增效作用。

以下以CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b设计为例，通过一系列实验实施例，对本发明进行进一步详细描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例1：CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b基因序列的确定和逆转录病毒载体的构建

从NCBI网站数据库搜索到人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、EGFRt和人IFNα2b全长cDNA序列信息。野生型人IFNα2b基因cDNA全长序列称为nIFNα2b。将nIFNα2b序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化得到oIFNα2b，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。

按照CD19 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、人P2A肽、EGFRt、人P2A肽、oIFNα2b的顺序得到CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b全长多核苷酸序列。同时构建仅包含CD19 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、人P2A肽和EGFRt的CD19-CAR-EGFRt全长多核苷酸序列。CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b全长多核苷酸序列信息见核苷酸序列表（SEQ ID NO.1）。CD19-CAR-EGFRt全长多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第1-874位多核苷酸所示。以上全部多核苷酸在擎科生物科技有限公司合成，克隆在pUC57载体上，并再次测序确定。

用NotI（NEB）和EcoRI（NEB）双酶切CAR-EGFRt-IFNα2b的核苷酸序列，经T4连接酶（NEB）连接后，插入逆转录病毒（MP71）的NotI-EcoRI位点，转化到感受态大肠杆菌（DH5α）。

使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到的CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b质粒可进行逆转录病毒包装实验。

按照上述同样方法将CD19-CAR-EGFRt序列插入逆转录病毒载体，构建得到包含CD19-CAR-EGFRt序列的逆转录病毒载体。提取质粒进行逆转录病毒包装。

本实施例所构建得到的CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b质粒图谱如图1所示。

实施例2：逆转录病毒包装和产毒株的建立

使用实施例1制备得到的包含CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b和CD19-CAR-EGFRt的逆转录病毒载体，按照以下方法分别包装两种逆转录病毒：

1. 第1天：Phoenix Ecotropic（ECO）细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6×10⁶ /ml细胞密度铺板，10cm皿添加10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜；

2. 第2天：ECO细胞融合度达到90％左右进行转染（通常是铺板14-18h左右）；准备质粒MP71-目的基因12.5μg，1.25M CaCl₂ 250μl，H₂O 1ml，总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的2× HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到ECO皿中，37℃培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基。

3. 第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后，即得到逆转录病毒溶液，分装保存于-80℃。

4. 产毒株的建立：从上得到的逆转录病毒再感染HY268细胞，感染两天后进行流式细胞分选，筛选分泌逆病毒滴度最高的单细胞来源的细胞株并长期保存。利用此细胞株可以大规模制备逆转录病毒上清用于基因转导制备CAR-T细胞。

实施例3：逆转录病毒感染人的T细胞

1. 复苏冻存的健康人外周血PBMC，用含10% FBS的RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为1-2×10⁶/ml。

2. Ficoll分离液（天津灏洋）收集PBMC，磁珠法分离获得较纯的CD3⁺T细胞，按磁珠:CD3⁺细胞比为3:1加入临床级Dynabeads Human T Expander CD3/CD28磁珠（Invitrogen）活化T细胞。

3. T细胞活化后第二天，用PBS稀释至终浓度为15μg/ml的Retronectin （Takara）包被非组织处理培养板，6孔板每孔1.2 ml。避光，4℃过夜备用。

4. T细胞活化培养两天后，取出包被好的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。

5. 实施例2制备的逆转录病毒液加入孔内，每孔加5-6ml，32℃，2000×g，离心2h。每孔加入含hIL-2（100 U/ml）的新鲜完全培养基3 ml，继续培养1天。

6. 细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100 U/ml的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×10⁵/ml左右，便于细胞扩增。

7.由此获得分别感染了实施例2制备的两种逆转录病毒的CAR-T细胞，分别命名为CD19&IFNα2b T细胞（表达实施例1的CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b）和CD19 T细胞（表达实施例1的CD19-CAR-EGFRt）。

8. 设置不感染病毒的对照组，用等体积PBS溶液替代逆转录病毒液，按照上述同样的方法得到Control T（CTR T）细胞。

9. 设置非CD19靶点的CAR-T对照组，用非CD19靶点的CAR替代CD19-CAR-EGFRt-IFNα2b，按照上述同样的方法得到Control CAR T（CTR CAR T）细胞。

实施例4：感染后CAR阳性T淋巴细胞的比例、表面CAR蛋白的表达及上清中IFNα2含量检测

我们用FACS方法通过检测EGFR表达来说明CAR阳性T淋巴细胞的比例和CAR蛋白的表达。同时用酶联免疫反应（ELISA）检测细胞培养上清中IFNα2含量。

图2显示，使用实施例3制备得到的逆转录病毒感染T细胞3天后，CD4⁺T细胞和CD8+T细胞中EGFR（CAR）的阳性率均达到80％。

分别离心收集感染后72小时的实施例3制备得到的两种CAR-T细胞、CTR T细胞和CTR CAR T细胞（对照组），收集培养后的上清液。ELISA检测上清中IFNα2的含量。

图3显示ELISA的检测结果，CD19&IFNα2b T细胞上清中的IFNα2含量显著高于CTRT和CD19 T细胞。该结果确证CD19&IFNα2b T细胞可以表达分泌型的IFNα2。

实施例5：乳酸脱氢酶（LDH）法检测肿瘤特异性细胞杀伤作用

1. 调整靶细胞（TX858）浓度为4×10⁵个/mL，取靶细胞和效应细胞（效靶比分别为3:1,1:1, 1:3）各50μl，加入U型96孔培养板中。效应细胞分别是CTR CAR T细胞，CD19 T细胞和CD19&IFNα2b T细胞。另外，设置靶细胞自然释放孔、效应细胞自然释放孔和靶细胞最大释放孔，加靶细胞和培养液各50μl。上述各项均设三个复孔。

2. 上述细胞在37℃、5% CO₂培养箱中培养4 h。

3. 终止细胞培养前45 min, 靶细胞最大释放孔加裂解液10μl。

4. 96孔板以1500 rpm/min离心5 min，每孔吸取上清50μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH底物50μl，室温避光反应30 min。

5. 每孔加入50μl 1mol/L的醋酸溶液终止，在酶标仪490nm处测定光密度值（A490），使用630 nm波长作为参考波长进行双波长测定。

% 细胞毒性率=（实验组–效应细胞自放组–靶细胞自放组）×100/（靶细胞最大释放组–靶细胞自放组）

图4显示，使用CD19&IFNα2b T细胞和靶细胞TX858按照不同效靶比3:1, 1:1, 1:3共培养后，用LDH法检测靶细胞裂解率。结果表明，在效靶比3比1时，细胞裂解率达到80%以上；效靶比1比3时，细胞裂解率仍有20%左右。

实施例6：肿瘤移植模型检测CAR-T细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用

1. B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠（百奥赛图）的尾静脉接种带有荧光素标记的人淋巴瘤细胞Raji-Luc。接种量为1×10⁶/0.3ml。随机分为3个实验组，分别是感染非CD19替代CAR病毒的T细胞对照组（CTR CAR T），CD19 T细胞对照组，和CD19&IFNα2b T细胞组，每组各6只小鼠。

2. 接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉分别注射不同类型的CAR-T细胞，注射的CAR-T细胞量为5×10⁶ CAR⁺T/0.2 ml。

3. 分别在注射CAR-T细胞7天、14天、21天和28天后，在小鼠腹腔注射3mg的D-luciferin进行钠盐成像。观察小鼠体内残留肿瘤细胞的数量，统计荧光素强度（光子密度）。

图5显示，与CTR CAR T对照组相比，注射CD19 T和CD19&IFNα2b T的小鼠体内的人淋巴瘤细胞残留明显减少。尤其值得注意的是，CD19 T并不能杀灭的微小肿瘤细胞残留，在28天后呈克隆样迅速生长，形成新的肿瘤，这种现象基本模拟了临床研究中CAR-T治疗后肿瘤复发的表型。相比之下，CD19&IFNα2b T细胞杀伤肿瘤的效果更好，说明CD19&IFNα2b T在防止肿瘤复发方面可能起到重要作用。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 浙江康佰裕生物科技有限公司

<120> 一种靶向CD19和干扰素增效的嵌合抗原受体及其应用

<130> 2019

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3264

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacattc agatgactca gaccacaagc agcctcagtg cgagcctggg ggacagggtg 120

actatcagct gccgggccag ccaggacatt tccaagtacc tgaattggta ccagcagaag 180

cccgatggta ctgtgaaact cctgatatat catacttcta ggctccattc cggggttcca 240

agccgattca gtggctccgg ttccggtaca gattattccc tgaccattag caacttggaa 300

caggaggaca ttgcaacgta tttctgtcag caaggcaaca cattgcccta cacattcggg 360

ggcgggacta aactcgaaat aactggcggc gggggttctg gtggcggcgg cagcggcggt 420

ggaggatcag aagtgaagct gcaggaaagt ggccccgggc tggtagcccc aagtcagtcc 480

ctgagtgtaa cctgtacagt gagtggagtg tctcttcctg actacggggt aagttggatt 540

cggcaacctc cacgcaaggg cctggagtgg ctcggcgtga tttggggatc tgagacaact 600

tactacaatt ccgccctgaa gagcaggctg accatcatta aggacaatag caagtcacag 660

gtgtttctga agatgaactc actgcagacc gacgacaccg ccatctatta ctgcgccaaa 720

cattattatt atggcgggag ttatgctatg gactactggg gccagggcac tagcgtcacc 780

gtcagcagta ctacaactcc agcacccaga ccccctacac ctgctccaac tatcgcaagt 840

cagcccctgt cactgcgccc tgaagcctgt cgccctgctg ccgggggagc tgtgcatact 900

cggggactgg actttgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaggt tcagtgtcgt gaagagaggc 1020

cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cctttcatga ggcccgtgca gactacccag 1080

gaggaagatg gatgcagctg tagattccct gaagaggagg aaggaggctg tgagctgaga 1140

gtgaagttct cccgaagcgc agatgcccca gcctatcagc agggacagaa tcagctgtac 1200

aacgagctga acctgggaag acgggaggaa tacgatgtgc tggacaaaag gcggggcaga 1260

gatcctgaga tgggcggcaa accaagacgg aagaaccccc aggaaggtct gtataatgag 1320

ctgcagaaag acaagatggc tgaggcctac tcagaaatcg ggatgaaggg cgaaagaagg 1380

agaggaaaag gccacgacgg actgtaccag gggctgagta cagcaacaaa agacacctat 1440

gacgctctgc acatgcaggc tctgccacca agacgagcta aacgaggctc aggcgcgacg 1500

aactttagtt tgctgaagca agctggggat gtagaggaaa atccgggtcc catgttgctc 1560

cttgtgacga gcctcctgct ctgcgagctg ccccatccag ccttcctcct catcccgcgg 1620

aaggtgtgca atggcatagg cattggcgag tttaaagatt ctctgagcat aaatgctacg 1680

aatattaagc atttcaagaa ttgtacttct attagtggcg acctccatat tcttccggtt 1740

gccttcaggg gtgactcttt cacccacaca cctccattgg atccacaaga acttgacatc 1800

ctgaagacgg ttaaagagat tacaggcttc ctccttatcc aagcgtggcc cgagaacaga 1860

acggacttgc acgcctttga gaacctcgaa ataatacggg gtcggacgaa gcaacacggc 1920

caatttagcc ttgcggttgt tagtctgaac attacttctc tcggccttcg ctctttgaaa 1980

gaaatcagcg acggagatgt catcattagt ggaaacaaga acctgtgcta cgcgaacaca 2040

atcaactgga agaagctctt cggtacttca ggccaaaaga caaagattat tagtaacaga 2100

ggagagaata gctgtaaggc taccggacaa gtttgtcacg ccttgtgtag tccagagggt 2160

tgctggggac cggaaccaag ggattgcgtc agttgccgga acgtgagtcg cggacgcgag 2220

tgtgtggata agtgcaatct tctggaaggg gaaccgcgag agtttgtaga aaattccgaa 2280

tgtatacagt gtcatcccga gtgtcttcca caagcaatga atatcacatg tacagggagg 2340

ggtcctgata actgtatcca atgtgcacac tacatagatg gtcctcactg tgtaaagacg 2400

tgccccgccg gagtaatggg tgaaaacaac accctcgtgt ggaagtacgc cgatgccggg 2460

catgtctgtc atttgtgtca tcccaactgc acatatggct gtaccggtcc tggattggag 2520

ggctgtccaa caaacgggcc gaaaataccg agtatcgcaa caggcatggt gggagcactt 2580

ttgcttctcc tcgttgtcgc cctgggcatc ggcttgttca tgcgagctaa acgaggctca 2640

ggcgcgacga actttagttt gctgaagcaa gctggggatg tagaggaaaa tccgggtccc 2700

atggccctga ccttcgccct gctggtggcc ctgctggtcc tgagctgcaa gagctcctgc 2760

agcgtggggt gcgacctgcc ccagacccac agcctgggct ccagaagaac cctgatgctg 2820

ctggcccaga tgagaagaat cagtctgttc agctgcctga aagacagaca cgactttggc 2880

ttccctcagg aggaatttgg aaaccagttc cagaaggccg aaaccatccc cgtgctgcac 2940

gagatgatcc agcagatctt caacctgttc tccaccaaag atagcagcgc agcctgggac 3000

gaaaccctgc tggacaagtt ctacaccgag ctgtaccagc agctgaacga cctggaggcc 3060

tgcgtgatcc agggcgtggg agtgaccgag acaccactga tgaaagagga tagcattctg 3120

gccgtgagga aatacttcca gagaatcacc ctgtacctga aagagaaaaa gtacagtccc 3180

tgcgcctggg aggtggtgag agccgagatc atgagaagct tcagcctgag caccaatctg 3240

caggaaagcc tgagaagcaa ggag 3264

<210> 2

<211> 1088

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val

325 330 335

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

340 345 350

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

355 360 365

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

370 375 380

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

385 390 395 400

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

405 410 415

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

420 425 430

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

435 440 445

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

450 455 460

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

465 470 475 480

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Gly

485 490 495

Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu

500 505 510

Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys

515 520 525

Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn

530 535 540

Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr

545 550 555 560

Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His

565 570 575

Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro

580 585 590

Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr

595 600 605

Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His

610 615 620

Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly

625 630 635 640

Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu

645 650 655

Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn

660 665 670

Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly

675 680 685

Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser

690 695 700

Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly

705 710 715 720

Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser

725 730 735

Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro

740 745 750

Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys

755 760 765

Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn

770 775 780

Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr

785 790 795 800

Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr

805 810 815

Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr

820 825 830

Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys

835 840 845

Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu

850 855 860

Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Ala Lys Arg Gly Ser

865 870 875 880

Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu

885 890 895

Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu

900 905 910

Val Leu Ser Cys Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln

915 920 925

Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met

930 935 940

Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly

945 950 955 960

Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile

965 970 975

Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr

980 985 990

Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr

995 1000 1005

Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln

1010 1015 1020

Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu

1025 1030 1035 1040

Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys

1045 1050 1055

Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg

1060 1065 1070

Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu

1075 1080 1085

Claims

1.一种多核苷酸序列，其特征在于：所述多核苷酸序列选自：

（1）：含有依次连接的抗CD19单链抗体的编码序列、人CD8铰链跨膜区的编码序列、人4-1BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、人P2A肽的编码序列、EGFRt基因的编码序列、人P2A肽的编码序列和人IFN全长序列；和

（2）：（1）中多核苷酸序列的互补序列。

2.如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于：

所述多核苷酸序列在所述抗CD19单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1中第1-63位多核苷酸序列所示；和/或

所述抗CD19单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:1第64-789位多核苷酸序列所示；和/或

所述人CD8铰链跨膜区的编码序列为SEQ ID NO:1中第790-996位多核苷酸序列所示；和/或

所述人4-1BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1中第997-1137位多核苷酸序列所示；和/或

所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1中第1138-1473位多核苷酸序列所示；和/或

所述人P2A肽的编码序列如SEQ ID NO:1中第1474-1551位和第2623-2700位多核苷酸序列所示；和/或

所述EGFRt基因的编码序列如SEQ ID NO:1中第1618-2622位多核苷酸序列所示；和/或

所述多核苷酸序列在所述EGFRt基因的编码序列N端含有CSF2RA信号肽；所述CSF2RA信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1中第1552-1617位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列；和/或

所述人IFN全长序列为人IFNα2b的全长序列，或人IFNα2b经过基因优化后的全长cDNA序列，所述全长cDNA序列称为oIFNα2b；所述oIFNα2b的编码序列如SEQ ID NO:1中第2701-3264位多核苷酸序列所示。

3.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白选自：

（1）：含有依次连接的抗CD19单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、人P2A肽、EGFRt、人P2A肽和人IFN的融合蛋白；和

（2）：在（1）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且相似或相近生物学活性的由（1）衍生的融合蛋白。

4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：

所述融合蛋白在所述抗CD19单链抗体的N端还含有CD8信号肽；所述CD8信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第1-21位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列；和/或

所述抗CD19单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第22-263位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列；和/或

所述人CD8铰链跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第264-332位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列；和/或

所述人4-1BB胞内区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第333-379位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列；和/或

所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第380-491位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列；和/或

所述人P2A肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第492-517位和第875-900位，或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列所示；和/或

所述EGFRt的氨基酸序列为SEQ ID NO:2第540-874位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列；和/或

所述融合蛋白在所述EGFRt的N端含有CSF2RA信号肽；所述CSF2RA信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第518-539位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列；和/或

所述人IFN为人IFNα2b蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2第901-1088位或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

5.一种核酸构建物，其特征在于：含有可编码权利要求3或4中所述融合蛋白的多核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于：所述多核苷酸序列为权利要求2所述的多核苷酸序列。

7.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于：所述核酸构建物为载体。

8.如权利要求7所述的核酸构建物，其特征在于：所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’ LTR，5’ LTR，权利要求2所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

9.一种逆转录病毒，其特征在于：所述逆转录病毒含有权利要求5-8之一所述的核酸构建物。

10.一种逆转录病毒的转导方法，其特征在于：所述转导方法包括小规模包装如权利要求9所述的逆转录病毒的方法、筛选和建立产毒细胞株的方法，以及用产毒细胞株上清大规模转导T细胞的方法。

11.一种基因修饰的T细胞，其特征在于：所述T细胞含有如权利要求2所述的多核苷酸序列，或含有权利要求5-8之一所述的核酸构建物，或感染了如权利要求9所述的逆转录病毒，或稳定表达如权利要求3或4所述的融合蛋白。

12.如权利要求11所述基因修饰的T细胞在制备治疗CD19介导的疾病的药物中的用途。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于：所述CD19介导的疾病为B细胞淋巴瘤。