CN111876366A - 米卡芬净钠中间体fr901379的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法。该米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法包括该方法在FR901379发酵过程中加入大豆油作为FR901379脂肪酸侧链前体物质,促进FR901379的合成,同时在发酵过程中加入L‑鸟氨酸盐酸盐和谷氨酸钠作为FR901379环肽链前体。本发明具有能够大幅度提高FR901379发酵单位,降低了生产成本,有利于工业化生产的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域,特别涉及米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法。
背景技术
近年来,由于免疫低下患者逐年增多,真菌感染发病率明显升高,尤其是深部真菌感染的发病率和病死率显著增加。棘白菌素类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物,具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链,能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1-3-葡聚糖合成酶的活性,从而达到抗真菌的目的。与传统抗真菌药物相比,该类药物具有作用机制独特,毒副作用低,且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性,是目前临床治疗深部真菌感染的常用药物。F DA已批准上市的这类药物包括卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungin)和阿尼芬净(Anidulafungin)。米卡芬净药用盐为米卡芬净钠。
FR901379是合成米卡芬净类药物的重要前体物质,由Colephoma empetri经突变后获得的高产菌株发酵所得。FR 901379通过脱酰酶脱除侧链后得到米卡芬净母核FR179642,FR179642经过化学修饰得到米卡芬净钠。
FR901379的结构如下:
发明内容
根据本发明的一个方面,提供了米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,该方法为在发酵FR901379的过程中,向发酵液中加入大豆油和L-鸟氨酸盐酸盐以及L-谷氨酸钠。
在一些实施方式中,步骤如下:
S1,发酵培养基的制备;
S2,将菌株Colephoma empetri种子培养液接种于发酵培养基进行发酵;
S3,在发酵培养48~72h后,向发酵液中补加大豆油;
S4,在发酵培养48~72h后,向发酵液中补加L-鸟氨酸盐酸盐;
S5,在发酵培养96~120h后,向发酵液中补加L-谷氨酸钠;
S6,当发酵培养192h后,FR901379的浓度不在增长时,发酵结束。
在一些实施方式中,向发酵液加入大豆油的质量体积比为3.0%~5.0%。
在一些实施方式中,向发酵液加入L-鸟氨酸盐酸盐的质量体积比为0.5%~0.8%。
在一些实施方式中,向发酵液加入L-谷氨酸钠的质量体积比为0.8%~1.2%。
在一些实施方式中,发酵培养基组成为:葡萄糖、山梨醇、黄豆饼粉、柠檬酸三铵、硫酸亚铁、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙、磷酸氢二钾、消泡剂、水。
在一些实施方式中,发酵培养基组成的质量体积比为:葡萄糖10、山梨醇100、黄豆饼粉18、柠檬酸三铵3、硫酸亚铁0.3、硫酸铵3、硫酸锰0.5、硫酸镁2、碳酸钙4、磷酸氢二钾1、消泡剂0.5,其余为水。
在一些实施方式中,发酵过程中控制温度26℃,通气量1VVM。
在一些实施方式中,发酵过程中初始转速50rpm,过程中调控转速50~160rpm之间使溶氧不低于20%。
本发明的米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,其有益效果是,该方法在FR901379发酵过程中加入大豆油作为FR901379脂肪酸侧链前体物质,促进FR901379的合成,同时在发酵过程中加入L-鸟氨酸盐酸盐和谷氨酸钠作为FR901379环肽链前体。通过本发明所述方法大幅度提高了FR901379发酵单位,降低了生产成本,有利于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
S1,将培养好的种子液以5%(v/v)的接种量转入2000L的121℃灭菌30min后冷却至26℃的发酵培养基中,该培养基组成,质量(g)/体积(L)比为:葡萄糖10、山梨醇100、黄豆饼粉18、柠檬酸三铵3、硫酸亚铁0.3、硫酸铵3、硫酸锰0.5、硫酸镁2、碳酸钙4、磷酸氢二钾1、消泡剂0.5,其余为水;
S2,发酵过程中控制温度26℃,通气量1VVM,初始转速50rpm,过程中调控转速50~160rpm之间使溶氧不低于20%;
S3,大豆油121℃灭菌20min后待用,L-鸟氨酸盐酸盐配制成80g/L的溶液115℃灭菌15min后待用,L-谷氨酸钠配制成80g/L的溶液115℃灭菌15min后待用;
S4,在发酵培养48h后,向发酵液中补加5%质量体积比的大豆油;
S5,在发酵培养72h后,向发酵液中补加200升80g/L的L-鸟氨酸盐酸盐溶液(相当于加入质量体积比为0.8%的L-鸟氨酸盐酸盐)。
S6,在发酵培养96h后,向发酵液中补加300升80g/L的L-谷氨酸钠溶液(相当于加入质量体积比为1.2%的L-谷氨酸钠)。
S7,在发酵培养216h后,测定FR901379放罐浓度为2.86g/L。
实施例2
S1,将培养好的种子液以5%(v/v)的接种量转入2000L的121℃灭菌30min后冷却至26℃的发酵培养基中,该培养基组成,质量(g)/体积(L)比为:葡萄糖10、山梨醇100、黄豆饼粉18、柠檬酸三铵3、硫酸亚铁0.3、硫酸铵3、硫酸锰0.5、硫酸镁2、碳酸钙4、磷酸氢二钾1、消泡剂0.5,其余为水;
S2,发酵过程中控制温度26℃,通气量1VVM,初始转速50rpm,过程中调控转速50~160rpm之间使溶氧不低于20%;
S3,大豆油121℃灭菌20min后待用,L-鸟氨酸盐酸盐配制成80g/L的溶液115℃灭菌15min后待用,L-谷氨酸钠配制成80g/L的溶液115℃灭菌15min后待用;
S4,在发酵培养48h后,向发酵液中补加3%质量体积比的大豆油;
S5,在发酵培养72h后,向发酵液中补加125升80g/L的L-鸟氨酸盐酸盐溶液(相当于加入质量体积比为0.5%的L-鸟氨酸盐酸盐)。
S6,在发酵培养96h后,向发酵液中补加200升80g/L的L-谷氨酸钠溶液(相当于加入质量体积比为0.8%的L-谷氨酸钠)。
S7在发酵培养198h后,测定FR901379放罐浓度为2.62g/L。
实施例3
S1,将培养好的种子液以5%(v/v)的接种量转入2000L的121℃灭菌30min后冷却至26℃的发酵培养基中,该培养基组成,质量(g)/体积(L)比为:葡萄糖10、山梨醇100、黄豆饼粉18、柠檬酸三铵3、硫酸亚铁0.3、硫酸铵3、硫酸锰0.5、硫酸镁2、碳酸钙4、磷酸氢二钾1、消泡剂0.5,其余为水;
S2,发酵过程中控制温度26℃,通气量1VVM,初始转速50rpm,过程中调控转速50~160rpm之间使溶氧不低于20%;
S3,大豆油121℃灭菌20min后待用,L-鸟氨酸盐酸盐配制成80g/L的溶液115℃灭菌15min后待用,L-谷氨酸钠配制成80g/L的溶液115℃灭菌15min后待用;
S4,在发酵培养48h后,向发酵液中补加4%质量体积比的大豆油;
S5,在发酵培养72h后,向发酵液中补加150升80g/L的L-鸟氨酸盐酸盐溶液(相当于加入质量体积比为0.6%的L-鸟氨酸盐酸盐)。
S6,在发酵培养96h后,向发酵液中补加250升80g/L的L-谷氨酸钠溶液(相当于加入质量体积比为1.0%的L-谷氨酸钠)。
S7,在发酵培养208h后,测定FR901379放罐浓度为2.74g/L。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,其特征在于,该方法为在发酵FR901379的过程中,向发酵液中加入大豆油和L-鸟氨酸盐酸盐以及L-谷氨酸钠。
2.根据权利要求1所述的米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,其特征在于,步骤如下:
S1,发酵培养基的制备;
S2,将菌株Colephoma empetri种子培养液接种于发酵培养基进行发酵;
S3,在发酵培养48~72h后,向发酵液中补加大豆油;
S4,在发酵培养48~72h后,向发酵液中补加L-鸟氨酸盐酸盐;
S5,在发酵培养96~120h后,向发酵液中补加L-谷氨酸钠;
S6,当发酵培养192h后,FR901379的浓度不在增长时,发酵结束。
3.根据权利要求1或2所述的米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,其特征在于,向发酵液加入的所述大豆油的质量体积比为3.0%~5.0%。
4.根据权利要求1或2所述的米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,其特征在于,向发酵液加入的所述L-鸟氨酸盐酸盐的质量体积比为0.5%~0.8%。
5.根据权利要求1或2所述的米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,其特征在于,向发酵液加入的所述L-谷氨酸钠的质量体积比为0.8%~1.2%。
6.根据权利要求2所述的米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,其特征在于,发酵培养基组成为:葡萄糖、山梨醇、黄豆饼粉、柠檬酸三铵、硫酸亚铁、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙、磷酸氢二钾、消泡剂、水。
7.根据权利要求5所述的米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,其特征在于,发酵培养基组成的质量体积比为:葡萄糖10、山梨醇100、黄豆饼粉18、柠檬酸三铵3、硫酸亚铁0.3、硫酸铵3、硫酸锰0.5、硫酸镁2、碳酸钙4、磷酸氢二钾1、消泡剂0.5,其余为水。
8.根据权利要求2所述的米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,其特征在于,发酵过程中控制温度26℃,通气量1VVM。
9.根据权利要求2所述的米卡芬净钠中间体FR901379的发酵方法,其特征在于,发酵过程中初始转速50rpm,过程中调控转速50~160rpm之间使溶氧不低于20%。
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