CN111868233A

CN111868233A - 作为系统性蛋白表达平台的基因工程化造血干细胞

Info

Publication number: CN111868233A
Application number: CN201980007965.4A
Authority: CN
Inventors: M·阿门多拉; G·帕瓦尼
Original assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon
Current assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon; Universite D'Evry Val D'Essonne
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2020-10-30
Also published as: EP3737744A1; JP2022191410A; US20200377857A1; JP7198823B2; EP3511412A1; WO2019138082A1; CA3088217A1; JP2021510302A

Abstract

本发明涉及一种基因修饰的造血干细胞，其在其基因组中包含的至少一个球蛋白基因中包含至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因，所述转基因处于所述球蛋白基因的内源性启动子的调控之下。

Description

作为系统性蛋白表达平台的基因工程化造血干细胞

技术领域

本发明涉及通过基因组工程化进行治疗的领域。

具体地，本发明涉及基因修饰的造血干细胞及其作为药物的用途。

背景技术

可以通过全身注射治疗性蛋白来治疗许多医学领域的许多缺陷、疾病和病理病症。这种治疗性蛋白确实可以代偿有需要的个体中不足或无功能的内源性蛋白，与肿瘤或病毒表面上的靶蛋白结合，或与化学试剂例如毒素结合。

通过频繁施用目标蛋白可以潜在地解决此类疾病，但是最近的方法允许递送编码用于治疗此类疾病的治疗性分子的核酸。递送编码治疗性蛋白的核酸，即基因治疗，确实有潜力提供优于需要施用治疗性蛋白质本身的常规疗法的显著优势。在显著的优势中，基因治疗可以使治疗性蛋白在患者细胞中长期且受调控地表达。稳定的蛋白表达水平(更好的药代动力学)导致较高治疗效率和较低副作用，并避免否则可能包含在可施用的蛋白质组合物中的有毒和传染性杂质。

通常使用载体来递送核酸，其中大多数是经修饰的病毒，以便将原始的致病基因除去并用编码治疗分子的核酸替代它们。

但是，由于病毒很少对一种类型的细胞具有特异性，因此该技术也存在许多风险，其中包括靶向非预期细胞；如果将新的治疗基因随机插入细胞的DNA中，则可能发生插入诱变和基因反式激活；针对所述病毒蛋白的有害免疫反应，可能导致炎症和感染细胞的破坏；并且在某些情况下，一旦将病毒引入个体体内，它就能设法恢复其引起疾病的初始能力。

该技术还存在许多缺点。例如，当使用AAV和腺病毒递送目标转基因时，缺乏稳定的附加体复制可能会限制有丝分裂活性组织中表达的持续时间。而且，即使转基因整合避免了复制引起的损失，也不能阻止融合到转基因上的外源启动子的最终沉默。随着时间的过去，这种沉默导致大多数随机插入的转基因表达降低。另外，转基因的整合很少在每个靶细胞中发生，这可能使得难以实现目的转基因的足够高的表达水平以实现所需的治疗效果。

近年来，开发出了一种新的转基因整合策略，其使用基因组DNA切割与位点特异性核酸酶来偏向插入选定基因座。一种方法涉及将转基因整合到其同源基因座中，例如，将野生型转基因插入内源基因座中以修正突变基因。或者，可将转基因插入根据其有益特性(例如永久、安全和很高水平的转基因表达)而选择的非同源基因座。用于说明，Sharma等(Blood,2015；126(15),1777-1784)通过锌指核酸酶方法通过体内AAV递送在肝脏中实现了将FVIII转基因整合在白蛋白基因内。

为了更安全和更可控的治疗，可以用编码目标治疗肽的核酸离体或体外感染细胞。然后可将这些细胞向有需要的个体施用，并起到基因递送系统的作用(参见如专利申请WO1999056785)。

尽管令人感兴趣，基因组编辑仍受到各种限制的约束，例如：存在抗AAV衣壳抗体和预先存在的肝损伤，这妨碍对大部分的患者的治疗(Boutin S.等,Hum.Gene Ther.,2010；21(6):704-712)；合成的核酸酶在体内长期表达，可能导致有毒的非预期基因组切割，并可能触发针对转导的肝细胞的免疫应答。

而且，尽管典型的基因组编辑方法针对疾病基因座本身，但由于修正的等位基因数量少，可能导致蛋白水平不足以减轻疾病表型。为了克服这一限制，可以将编码目标治疗分子的核酸整合到具有高转录活性且在干扰内源基因活性方面“安全”的基因座中(Sadelain等，Nat.Rev.Cancer,2011Dec 1；12(1):51-8)。

健康个体的正常造血功能每天可产生2.4.10¹¹个红细胞，因此有人提出重新定向一部分成熟的红细胞(约7.2gr/天)的球蛋白合成能力以产生分泌蛋白而不干扰红细胞的正常功能和稳态。

由于大量表达的红细胞以及球蛋白启动子的强大转录潜能，即使少量的成红细胞的修正(<7％；A.H.Chang等,Molecular Therapy.16,1745-1752(2008)；M.Sadelain等,Molecular Therapy.17,1994–1999(2009)；A.H.Chang,Nat Biotechnol.24(8):1017-21(2006))产生了高于治疗阈值的FIX转基因的强表达，为B型血友病提供临床益处。此外，甚至在蛋白攻击之后红细胞限制性的FIX表达也能够诱导经处理小鼠对FIX的免疫耐受性。

这一想法之后，也报道了红细胞表达的对腺苷脱氨酶、α-L-异泛酸酶和抗体的免疫耐受性(C.A.Montiel-Equihua，A.J.Thrasher,Curr.gene Ther.2012Feb 1；12(1):57-65以及D.Wang等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2009and 2013；Huang N.J.Nat Commun.8(1):423.(2017))。

尽管这些方法具有潜在的临床适用性，但它们都同样面临着与使用病毒载体递送和整合治疗性转基因相关的缺点：

i)插入突变的风险主要与整合位点处的基因失活和异常/嵌合转录物(A.Moiani等，J.Clin.Invest.122,1653-1666(2012))以及当存在强大的增强子/启动子元件时邻近基因的转录反式激活(P.W.Hargrove等，Molecular Therapy，16，525-533(2008))的产生有关；及

ii)人工启动子的局限性，由于递送载体的限制(例如大小限制)以及在不同染色体环境中的整合，人工启动子只能部分复制内源性启动子的复杂的生理学调控，导致无法预测的表达模式(W.Akthar等，Cell，154，914-927(2013))。

因此，需要设计一种新型的安全治疗平台，允许以足够高的水平高转录任意目标治疗性蛋白或治疗性核糖核酸，以缓解待治疗的疾病。

发明概述

本发明的第一个目的涉及一种基因修饰的造血干细胞，其在其基因组中包含的至少一个球蛋白基因中包含至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因，所述转基因处于所述至少一个球蛋白基因的内源性启动子调控之下。

在一个具体的实施方案中，至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因包含在所述至少一个球蛋白基因的5'区、3′非翻译区和/或内含子中。更具体地，所述至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因可以包含在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)和/或近端启动子和/或第二内含子(IVS2)中；优选地，包含在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)或近端启动子或第二内含子(IVS2)中。

在另一个具体的实施方案中，所述造血干细胞的基因组中包含的至少一个球蛋白基因选自ε球蛋白基因、γG球蛋白基因、γA球蛋白基因、δ球蛋白基因、β球蛋白基因、ζ球蛋白基因、伪ζ球蛋白基因、μ球蛋白基因、伪α-1球蛋白基因、α1球蛋白基因和α2球蛋白基因，尤其选自γG球蛋白基因、A球蛋白基因、δ球蛋白基因、β球蛋白基因、α1球蛋白基因和α2球蛋白基因组成的组；更具体地，选自α1球蛋白基因和α2球蛋白基因组成的组。

在另一个实施方案中，编码的治疗性蛋白选自细胞因子，具体是干扰素，更具体是干扰素-α、干扰素-β或干扰素-π；激素；趋化因子；抗体(包括纳米抗体)；抗血管生成因子；用于替代疗法的酶，例如腺苷脱氨酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-L-异戊二糖苷酶(也称为idua)和β-葡萄糖苷酶；白介素；胰岛素；G-CSF；GM-CSF；hPG-CSF；M-CSF；凝血因子，例如凝血因子VIII、凝血因子IX或tPA；跨膜蛋白，例如神经生长因子受体(NGFR)；溶酶体酶，例如α-半乳糖苷酶(GLA)、α-L-异戊糖苷酶(IDUA)、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)和半乳糖胺(N-乙酰基)-6硫酸酯酶(GALNS)；可以被工程化为分泌并最终被未修饰的细胞摄取的任何蛋白(Lawlor MW,Hum Mol Genet.22(8):1525–1538.(2013)；Puzzo F,Sci Transl Med.29；9(418)(2017)；Bolhassani A.Peptides.87:50-63.,(2017))及其组合，优选是凝血因子，更优选是凝血因子VIII；或溶酶体酶，尤其是溶酶体酸性脂肪酶(LAL)或半乳糖胺(N-乙酰基)-6硫酸酯酶(GALNS)。

本发明的另一目的涉及一种基因修饰的造血干细胞，其在其基因组中包含的至少一个球蛋白基因侧翼的基因间区中包含至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因，所述转基因处于所述至少一个球蛋白基因的内源性启动子的调控之下。

根据该实施方案，至少一个球蛋白基因和编码的治疗性蛋白可以如上文所定义。

在另一个实施方案中，本文所述的干细胞是哺乳动物细胞，尤其是人细胞。

本发明的另一个目的涉及源自如本文所述的基因修饰的造血干细胞的血细胞。

因此，在一个具体的实施方案中，所述血细胞选自巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、小淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、浆细胞及其所有前体。

本发明的另一个目的是一种药物组合物，其在药学上可接受的介质中包含至少一个本文所述的基因修饰的造血干细胞和/或至少一个本文所述的血细胞。

本发明的另一个目的是一种体内、离体或体外制备，尤其是离体或体外制备本文所述的造血干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(i)通过以下向所述干细胞提供定点基因工程化系统：

(a)向所述干细胞提供(1)与所选靶位点结合的至少一个向导核酸，或(2)与所选靶位点结合的含向导肽的核酸内切酶，所述靶位点位于所述造血干细胞的基因组中包含的编码球蛋白的内源基因中。

(b)当步骤a)中已提供了至少一个向导核酸时，进一步向所述干细胞提供至少一个无靶位点特异性的核酸内切酶；和

(c)进一步向所述干细胞提供编码至少一个治疗性蛋白或至少一个治疗性核糖核酸的转基因；

和

(ii)培养步骤(i)中得到的干细胞，以将所述转基因引入所述造血干细胞基因组中的所述选定的靶位点中。

在一个具体的实施方案中，所述靶位点位于所述至少一个球蛋白基因的5'区、3'非翻译区域(3'UTR)和/或内含子中，优选在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区域(5'UTR)和/或近端启动子和/或第二内含子(IVS2)中，尤其是在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)中或近端启动子或第二内含子(IVS2)中。

在另一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

(i)通过以下向所述干细胞提供定点基因工程化系统：

(a)向所述干细胞提供至少一个与选定的靶位点结合的向导核酸，所述靶位点位于所述造血干细胞的基因组中包含的编码球蛋白的内源基因中；

(b)进一步向所述干细胞提供至少一个无靶位点特异性的核酸内切酶；和

和

(ii)培养步骤(i)中得到的干细胞，以将所述转基因引入所述造血干细胞基因组中的所述选定的靶位点。

在一个具体的实施方案中，至少一个无靶位点特异性的核酸内切酶是簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白(Cas)，尤其是CRISPR相关蛋白9(Cas9)。

在一个具体的实施方案中，所述一个或多个向导核酸是识别所述至少一个球蛋白基因的5'区、3'非翻译区域(3'UTR)和/或内含子中，优选5'非翻译区(5'UTR)和/或近端启动子和/或第二内含子(IVS2)中，尤其是造血干细胞基因组中包含的至少一个α球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)或近端启动子或第二内含子(IVS2)中，优选造血干细胞基因组中包含的至少一个α球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)或第二内含子(IVS2)中的靶位点的向导RNA。

本发明的另一个目的涉及本文所述的造血干细胞、或本文所述的血细胞、或本文所述的药物组合物作为药物的用途。

本发明还涉及本文所述的造血干细胞、本文所述的血细胞或本文所述的药物组合物在治疗以下疾病中的用途：

-选自自身免疫性疾病、病毒感染和肿瘤的疾病；和/或

-有其需求个体中由于缺乏某种蛋白或存在异常的无功能蛋白而引起的疾病。

根据一个具体的实施方案，由于缺乏某种蛋白或存在异常的无功能蛋白而引起的疾病可选自凝血障碍、溶酶体贮积症、激素缺陷和α-1抗胰蛋白酶缺乏症。

特别地，有其需求个体可以是哺乳动物，更具体地可以是人类。

本发明的另一个目的涉及一种产生转基因非人哺乳动物的方法，其包括向所述哺乳动物施用本文所述的造血干细胞、本文所述的血细胞或本文所述的药物组合物。

在一个具体的实施方案中，本发明的转基因非人哺乳动物编码人转基因。另外，可以在相应的内源基因座处敲除转基因动物，从而开发可独立研究人蛋白的体内系统。

根据本发明的转基因非人哺乳动物可以用于筛选目的以鉴定可以相互作用或修饰目标人蛋白的小分子、大生物分子或其他实体。在其他方面，转基因非人哺乳动物可以用于生产目的，例如生产抗体或其他目标生物分子。

附图说明

图1.K562红白血病细胞系中gRNA的设计和验证。

将表达不同gRNA的HBA或HBB质粒转染到稳定表达SpCas9的K562细胞中，并用TIDE软件测量它们的DNA切割活性(Tracking of InDels by Decomposition-Brinkman等Nucleic Acids Res.2014.42(22):E168)；www.tide.calculator.nk)。在图1中，独立测试各gRNA在进一步定义的基因的5'区(尤其是HBA的5'UTR和HBB的近端启动子)、所述基因的内含子1(IVS1-插入序列1)或内含子2(IVS2)中的活性，以InDel％(修饰等位基因的百分比)表示。InDel％越接近100％，所测试的gRNA效率越高。

横坐标：测试的gRNA靶向的区域：5'区、IVS1或IVS2；每个条形代表不同的gRNA。

纵坐标：InDel％。

图2.在HBA和HBB基因座中靶向整合转基因使得内源启动子调控所述转基因。

该图说明了用于转基因表达的HBA和HBB启动子的劫持现象。对在HBA或HBB基因的不同区域(5'区(HBA的5'UTR或HBB的近端启动子)、IVS1或IVS2)中GFP靶向整合的K562细胞进行GFP FACS分析。K562细胞向红细胞谱系分化。

呈现了糖蛋白A(GYPA)阳性(虚线)或GYPA阴性(填充直方图)K562细胞的GFP表达(横坐标)。

对照是GFP整合处于无关基因位点(非球蛋白基因)的细胞。

在所有小图中，显示未处理的GYPA阳性K562细胞作为参考(空白直方图)。

纵坐标：细胞数。

图3.在HBA中靶向整合供体DNA允许稳定表达不同的转基因。

该图说明了供体DNA在HBA中的靶向整合允许稳定表达不同转基因。

左图：嘌呤霉素选择的细胞用NGFR抗体(小鼠抗人CD271-APC，Miltenyi Biotec)染色，并通过流式细胞仪进行分析。此门显示NGFR阳性细胞。

纵坐标：前向角散射光(FSC)

右图：在HBA基因的5'区(尤其是5'UTR)整合F8-嘌呤霉素捕获的代表性克隆的F8表达(横坐标)(带虚线的直方图)。显示了K562的染色对照(空白直方图)。

纵坐标：细胞数。

图4.同源臂对造血干/祖细胞靶向整合效率的影响。

在初级HSPC中的HBA 1和HBA 2中靶向整合GFP-嘌呤霉素捕获。通过非同源末端连接(NHEJ，上图)或同源定向修复(HDR，下图)将无启动子GFP表达盒插入HBA 1或2的5'区(尤其是HBA 1或2的5'UTR)导致调控的GFP表达。GFP阳性细胞和荧光强度随红细胞分化而增加，代表了α-球蛋白的表达模式。将同源臂添加到供体DNA捕获中可极大提高其靶标整合效率。

纵坐标：自动荧光通道(AF)

图5.K562中各gRNA的靶向活性对HBA产生的影响。

在指定的HBA位点进行基因编辑后，K562细胞中胎儿血红蛋白(HbF)表达水平(横坐标)的直方图。在顶部显示修饰的等位基因百分比(InDel％)。胎儿血红蛋白由2个α和2个γ亚基形成，因此其表达与这些细胞的α球蛋白水平成正比。对照gRNA(KO)靶向HBA 1和2的第一外显子，产生敲除该基因并影响HbF表达的移码突变。

纵坐标：细胞数。

中图上，通过蛋白印迹分析相同细胞表面的α-球蛋白表达。每个泳道上样总蛋白量为30μg；微管蛋白用作负荷对照。在泳道下方，HBA基因具体位点的基因编辑效率以编辑的等位基因的百分比(InDel)表示。

下图上，将移动的外周血HSPC用靶向HBA中指定位点的gRNA核转染，并向红细胞谱系分化以激活球蛋白表达。在顶部显示修饰的等位基因百分比(InDel％)。对于每种测试的gRNA，红细胞分化结束时HbF的表达(反映α球蛋白表达；横坐标)。

纵坐标：前向散射(FSC)。

图6.编辑对HSPC衍生的成红细胞中HBA和HBB合成的影响。

该图说明了靶向HBA或HBB基因中不同具体位点的gRNA对成红细胞中HBA或HBB合成的影响。

将移动的外周血HSPC用靶向HBA或HBB基因中不同具体位点的gRNA进行核转染，并向红细胞谱系分化以激活球蛋白表达。

裂解HSPC衍生的成红细胞，并通过色谱法测量血红蛋白亚基含量。

该图表示α链和β样链之间的比率。在健康的供体细胞中，该比率接近于1(虚线以及未剪切的样品)，而显著偏差指示地中海贫血表型(α-地中海贫血成红细胞＜1，β-地中海贫血成红细胞＞1)。

作为对照，使用分别靶向HBA1/2和HBB的第一外显子并抑制链表达的HBA和HBB KO向导RNA产生了地中海贫血细胞。

横坐标中，结果从左到右对应于：

-靶向HBA的5'UTR的gRNA(HBA 5'UTR)；

-靶向HBA的第二内含子的gRNA(HBA IVS2)；

-靶向HBA的第一外显子的gRNA(HBA KO)；

-靶向HBB的5'UTR的gRNA(HBB 5'UTR)；

-靶向HBB的第二内含子的gRNA(HBB IVS2)；

-靶向HBB的第一外显子的gRNA(HBB KO)；

-作为对照的靶向无关AAVS1基因座的gRNA(AAVS1)；

-无gRNA无核转染对照细胞(NO CUT)。

纵坐标：α链和β样链(β，γ和δ球蛋白)之间的比率。

在该图中，“Ery培养物”和“CFC”分别表示通过液体培养物(HSPC在红细胞分化培养基中培养14天)或红色培养物(HSPC在半固体Methocult培养基(H4435，StemCellTechnologies)中持续培养14天进行集落形成细胞(CFC)测定)获得的结果。

图7：HBA中靶向整合VIII因子(FVIII)或IX因子(FIX)编码序列允许稳定表达这些转基因。

该图表明，FVIII或FIX编码序列在K562细胞的HBA中靶向整合允许通过内源性α-球蛋白启动子转录调控而实现功能性蛋白的稳定表达和分泌。

该图显示了在不同K562细胞克隆的上清液中分泌的FVIII和FIX的活性。未处理细胞的上清液用作对照(CTRL)。

纵坐标：活性水平测量为每10⁶个细胞每24小时ng/ml蛋白质。

横坐标：从左到右：因子VIII(FVIII)获得的结果，对照(CTRL)获得的结果和因子IX(FIX)获得的结果。

发明详述

本发明人设法产生了基因修饰的造血干细胞，当向红细胞谱系分化时，它们能够产生由其基因组中包含的至少一个球蛋白基因中包含(尤其是其球蛋白基因之一中包含)的至少一个转基因编码的一种或多种治疗性蛋白或一种或多种治疗性核糖核酸，所述转基因处于所述球蛋白基因的内源性启动子的调控之下。如本文所示，所述治疗性蛋白以高水平表达，允许获得治疗水平的治疗性蛋白或治疗核糖核酸。

如本文所述的基因修饰的造血干细胞有利地提供了目标治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的受控的高表达。

由本发明提供并在本发明实施例中说明的另一重要优点是，就血红蛋白或球蛋白单链而言，总体球蛋白表达水平不受影响。

通过转基因靶向整合到球蛋白安全的基因座中，本文所述离体或体外产生的造血干细胞的用途有利地将与使用半随机整合载体有关的插入诱变和致癌基因反式激活的风险以及基因反式激活的风险最小化，因为转基因表达不需要外源启动子/增强子元件并插入基因组。

此外，向有需要的个体施用如本文所述的造血干细胞(HSC)将允许通过在所述人体内恢复或提供这些干细胞的额外功能来长期校正本文中考虑的目标疾病。

该方法对有此需要的个体是高度有利的，因为本文所考虑的大多数疾病的目前治疗是频繁注射治疗性蛋白，所述注射治疗性蛋白是有需求的，昂贵的，长期无法治愈的，并导致比例很高的治疗患者产生抗蛋白中和抗体。

例如，考虑到有需要的个体中缺乏蛋白或存在异常的无功能蛋白引起的疾病时，大多数当前治疗在于频繁注射所述缺乏或无功能蛋白(“蛋白替代疗法”；例如，每周三次为A型血友病注射VIII因子(FVIII)。类似地，溶酶体贮积症患者通常需要通过大剂量静脉内注射来频繁注射以代偿功能异常的酶。这种治疗仅是对症治疗而不能治愈，因此患者在余生中必须重复施用这些蛋白，并且可能会产生针对注射蛋白的中和抗体。这些蛋白通常具有较短的血清半衰期，因此患者必须频繁输注该蛋白。

相反，本文所述的基于造血干细胞的治疗导致有限次数的重复施用甚至一次治愈性治疗，其具有两个主要益处：它将显著改善患者的生活质量，并且对于他们的家庭，这将减少与这些最常见的终生疾病的治疗有关的国家卫生系统的经济成本和负担(例如，对重组FVIII患者的终生治疗费用为2500-5000万美元)。

此外，向需要其的个体施用如本文所述的源自造血干细胞的成熟血细胞可诱导对如本文所述的转基因编码的蛋白的免疫耐受性。

如还在本文的实施例中说明的，发明人设法鉴定了使转基因的高表达和红细胞特异性表达的整合位点，而不影响总球蛋白(就血红蛋白或球蛋白单链而言)表达水平。

基因修饰的造血干细胞

如上所述，本发明首先涉及一种基因修饰的造血干细胞，其在其基因组中包含的至少一个球蛋白基因中包含至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因，所述转基因处于所述至少一个球蛋白基因的内源性启动子的调控之下。

造血干细胞(HSC)是能够自我更新的多能干细胞，其特征在于它们在允许的条件下产生造血系统的所有细胞类型的能力。造血干细胞不是全能细胞，即它们不能发育成完整的生物体。

在一个具体的实施方案中，根据本发明的造血干细胞衍生自胚胎干细胞，具体是人胚胎干细胞，因此是胚胎造血干细胞。

胚胎干细胞(ESC)是衍生自胚胎未分化内细胞群并能够自我更新的干细胞。在允许的条件下，这些多能干细胞能够分化成年体内的220多种细胞中的任何一种。胚胎干细胞不是全能细胞，即它们不能发育成完整的生物体。胚胎干细胞可以例如根据Young Chung等在Cell Stem Cell 2,2008February 7；2(2):113-7中指出的方法获得。

在另一个具体的实施方案中，根据本发明的造血干细胞是诱导的多能干细胞，更具体是人诱导的多能干细胞(hiPSC)。因此，根据一个具体的实施方案，本文所述的造血干细胞是造血诱导的多能干细胞。

诱导的多能干细胞是经过基因重编程的成年细胞，其表现出类似于胚胎干细胞的多能干细胞样状态。它们是人工产生的干细胞，未知存在于人体中，但显示出与胚胎干细胞相似的特质。产生此类细胞的方法是本领域众所周知的，如Ying WANG等(https://doi.org/10.1101/050021)以及Lapillonne H.等人(Haematologica.2010；95(10))和J.DIAS等人(Stem Cells Dev.2011；20(9):1639-1647)所述。

“自我更新”是指细胞分裂并产生至少一个具有与亲本细胞相同(例如，自我更新)特征的子细胞的能力。第二子细胞可参与特定的分化途径。例如，自我更新的造血干细胞可以分裂并形成一个子干细胞和参与髓样或淋巴途径中分化的另一个子细胞。自我更新为造血系统补充未分化干细胞的持续来源。

可用于鉴定HSC的标志物表型将是本领域通常已知的那些表型。对于人HSC，细胞标志物表型优选包括CD34⁺CD38^low/-Cd49f⁺CD59⁺CD90⁺CD45RA^-Thy1⁺C-kit⁺lin^-的任何组合(Notta F,Science.333(6039):218-21(2011)。对于小鼠HSC，细胞标志物表型可以是CD34^low/-Sca-1⁺C-kit⁺和lin^-CD150⁺CD48^-CD90.1.Thy1^+/low Flk2/flt3^-和CD117⁺的任何组合(参见，例如，Frascoli等(J.Vis.Exp.2012Jul 8；(65).Pii:3736.))。

优选纯化如本文所述的干细胞。这同样适用于本文所定义的血细胞。

纯化造血干细胞的许多方法是本领域已知的，例如EP1687411中所示。

如本文所用，“纯化的造血干细胞”或“纯化的血细胞”是指所记载的细胞构成纯化样品中至少50％的细胞；更优选构成纯化样品中至少51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多细胞。

细胞的选择和/或纯化可以包括阳性和阴性选择方法，以获得基本上纯的细胞群。

一方面，荧光激活细胞分选(FACS)，也称为流式细胞术，可以用于分选和分析不同的细胞群。具有对HSC或祖细胞群特异的细胞标志物的细胞用结合细胞标志物的抗体或通常为抗体混合物标记。将针对不同标志物的每种抗体缀合至可检测的分子，尤其是可以与偶联至其他抗体的其他荧光染料区分开的荧光染料。染色的细胞流通过激发荧光染料的光源，并且细胞的发射光谱检测到具体标记抗体的存在。通过同时检测不同的荧光染料，可以鉴定出显示出不同组细胞标志物的细胞，并将其与群体中的其他细胞分离。其他FACS参数，包括但不限于侧面散射(SSC)、前向散射(FSC)和重要染料染色(例如碘化丙啶)允许根据大小和生存力选择细胞。在Akashi，K等，Nature 404(6774)：193-197(2000)中描述了HSC和祖细胞的FACS分选和分析。

另一方面，免疫磁性标记可以用于分选不同的细胞群。该方法基于可磁化的小颗粒通过抗体或凝集素与细胞附着。当混合的细胞群置于磁场中时，附着有磁珠的细胞将被磁场吸引，因此可能与未标记的细胞分离。

在一个具体的实施方案中，本文所述的修饰的造血干细胞是哺乳动物细胞，尤其是人细胞。

在一个具体的实施方案中，造血干细胞和/或血细胞的原始群可以是自体的。

“自体”是指源自或起源于同一患者或个体。“自体移植”是指产生于受试者自身细胞或器官的再输注或移植。排他性或补充性使用自体细胞可以消除或减少将细胞送回宿主的许多不利影响，尤其是移植物抗宿主反应。

在这种情况下，根据本文所述的方法，从所述个体收集离体或体外经基因修饰的造血干细胞，并施用于同一个体。

在一个具体的实施方案中，造血干细胞和/或血细胞的原始群可以来自同种异体供体或多个同种异体供体。供体可以彼此相关或不相关，并且在移植中，可以与受体(或个体)相关或不相关。

因此，如本文所述待修饰的干细胞对于需要治疗的个体而言可以是外源的。

在施用如本文所述的外源性修饰干细胞的情况下，所述干细胞可以是同基因的、同种异体的、异种的或其混合。

“同基因的”是指源自、起源于、或为遗传上相同的相同物种的成员，尤其是在抗原或免疫应答方面。这些包括具有匹配的MHC类型的同卵双胞胎。因此，“同基因移植”是指细胞或器官从供体向遗传上与供体相同的受体的转移。

“同种异体的”是指源自、起源于或为相同物种的成员，其中成员是遗传相关或遗传无关但遗传相似的。“同种异体移植”是指将细胞或器官从供体转移到受体，其中受体与供体是相同物种。

“异种”是指源自、起源于或为不同物种的成员，例如人和啮齿动物、人和猪、人和黑猩猩等。“异种移植”是指细胞或器官从供体转移到受体，其中受体是不同于供体的物种。

本发明的利用内源性造血干细胞的其他实施方案涉及将所述干细胞从个体的一个解剖位点移动至全身循环，或转移至另一具体的解剖位点。这样的移动在本领域中是众所周知的，并且例如可以通过施用能够刺激来自隔室诸如骨髓的干细胞外排的因子引起。

在适用的情况下，可通过事先向受试者施用细胞因子或药物将干细胞和祖细胞从骨髓移动到外周血中(参见，例如Domingues等(Int.J.Hematol.2017feb；105(2):141-152))。能够诱导移动的细胞因子和趋化因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(Kiessinger,A.et al.,Exp.Hematol.23:609-612(1995))、干细胞因子(SCF)、AMD3100(AnorMed，加拿大温哥华)、白介素8(IL-8)以及这些因子的变体(例如聚乙二醇胃泌素、达博生成素)。

可将通过本文所述方法制备的细胞重悬于药学上可接受的载体中，并直接使用，或者可通过熟练技术人员可用的各种细胞纯化技术进行处理，例如FACS分选、磁亲和分离和免疫亲和柱。

如本文已经指定的，本文所述的造血干细胞和血细胞的至少一个球蛋白基因，尤其是至少一个内源性球蛋白基因经基因修饰。

球蛋白基因在造血干细胞和血细胞基因组中以簇的形式组织，这些簇被称为α-和β-样人球蛋白基因簇。

α样人球蛋白基因簇包括ζ、伪ζ(ψζ)、μ、伪α-1(ψα1)、伪α-2(ψα2)、α2、α1和θ球蛋白基因，且位于16号染色体上。

β样人球蛋白基因簇包含ε、γ-G(Gγ)、γ-A(Aγ)、δ和β球蛋白基因，且位于11号染色体上。

因此，包含在本文所述的细胞基因组中并包含至少一个转基因的至少一个球蛋白基因可以在α样人球蛋白基因簇和/或β样人球蛋白基因簇中，尤其是在α样人球蛋白基因簇中或在β样人球蛋白基因簇中。

在本文中，当提及术语“细胞”而没有提及任何进一步指示时，其既适用于造血干细胞，也适用于本文所述的血细胞。

根据一个实施方案，本文所述的至少一个球蛋白基因选自ε球蛋白基因、γG球蛋白基因、γA球蛋白基因、δ球蛋白基因、β球蛋白基因、ζ球蛋白基因、伪ζ球蛋白基因、μ球蛋白基因、伪α-1球蛋白基因、α1球蛋白基因和α2球蛋白基因。

在一个具体的实施方案中，本文所述的至少一个球蛋白基因选自γ一球蛋白基因、γA球蛋白基因、δ球蛋白基因、β球蛋白基因、α1球蛋白基因和β-球蛋白基因，更具体地选自β球蛋白基因、α1球蛋白基因和α2球蛋白基因。

在一个优选的实施方案中，本文所述的至少一个球蛋白基因选自α一球蛋白基因和α蛋球蛋白基因。

每个球蛋白基因的编码区被称为中间序列(IVS)或内含子的非编码DNA片段在两个位置所打断。

因此，从其5'端到其3'端，一个球蛋白基因由以下组成：

-近端启动子区域；

-5'的非翻译区域(UTR的5')；

-至少2个外显子，尤其是3个外显子；

-至少1个内含子，尤其是两个内含子；和/或

-3'非翻译区域(3'UTR)。

因此，在本文所述的细胞中，本文所述的细胞的至少一个球蛋白基因中包含的至少一个目标转基因可以包含在所述球蛋白基因的5'区、外显子、内含子和/或3'UTR中，尤其是在所述球蛋白基因的近端启动子区域、5'UTR、外显子和/或内含子中。

优选地，本文所述细胞的至少一个球蛋白基因中包含的至少一个目标转基因包含在所述球蛋白基因的5'区和/或内含子中，尤其是在所述球蛋白基因的5'UTR和近端启动子和/或内含子中，更具体地在所述球蛋白基因的所述5'UTR中或近端启动子或内含子中。

在一个具体的实施方案中，本文所述的细胞的至少一个球蛋白基因中包含的所述至少一个目标转基因包含在所述至少一个球蛋白的5'区和/或第二内含子(IVS2)中。

根据本发明的5'区域是所考虑的球蛋白基因的翻译起始密码子上游的区域。它包含基因的5'UTR序列和近端启动子。

具体地，根据本发明的球蛋白基因的5'区对应于直接在所考虑的球蛋白基因的所述翻译起始密码子上游的500个核苷酸序列，优选400个核苷酸，更优选300个核苷酸，更具体地直接在所考虑的球蛋白基因的所述翻译起始密码子的上游的250个核苷酸。

在一个具体的实施方案中，根据本发明的球蛋白基因的5'区对应于所考虑的球蛋白基因的近端启动子。

在另一个实施方案中，根据本发明的球蛋白基因的5'区域对应于所考虑的球蛋白基因的5'UTR(5'非翻译区)。

以下所有位置均基于人类Dec.2013GRCh38/hg38集的UCSC基因组。

具体地，当考虑HBA1(血红蛋白亚基α1)人基因，5’区域优选对应于该基因的5’UTR。此5’UTR对应位置chr16：176,651-176,716；66nt；参考序列：NM_000558.4。

具体地，当考虑HBA2(血红蛋白亚基α2)人基因，5’区域优选对应于该基因的5’UTR。此5’UTR对应位置chr16：172,847-172,912；66nt；参考序列：NM_000517.4。

当考虑HBB(血红蛋白亚基β)人类基因，5'区优选对应于该基因的近端启动子。该近端启动子对应于2人Dec.2013GRCh38/hg38集UCSC基因组的位置chr11：5,227,072-5,227,321。

更具体地，本文所述的细胞的至少一个球蛋白基因中包含的至少一个目标转基因可以包含在所述球蛋白基因的5'区、第一内含子(IVS1)和/或第二内含子(IVS2)中，优选在所述球蛋白基因的5'UTR和/或近端启动子和/或第二内含子(IVS2)中，更优选在所述球蛋白基因的5'UTR和/或近端启动子中或第二内含子(IVS2)中。

当考虑HBA1(血红蛋白亚基α1)人基因，第一内含子(IVS1)可以对应于该基因的第一外显子和第二外显子之间包含的117个核苷酸。该区域对应于位置chr16：176,812-176,928；117nt；参考序列：NM_000558.4。

当考虑HBA2(血红蛋白亚基α血)人基因，第一内含子(IVS1)可以对应于该基因的第一外显子和第二外显子之间包含的117个核苷酸。该区域对应于位置chr16：173,008-173,124；117nt；参考序列：NM_000517.4。

当考虑HBB(血红蛋白亚基β)人基因，第一内含子(IVS1)可以对应于该基因的第一外显子和第二外显子之间的130个核苷酸。该区域对应于位置chr11：5,226,800-5,226,929；130nt；参考序列：NM_000518.4。

当考虑HBA1(血红蛋白亚基α1)人基因，第二内含子(IVS2)可以对应于该基因的第二外显子和第三外显子之间包含的149个核苷酸。该区域对应于位置chr16：177,134-177,282；149nt；参考序列：NM_000558.4。

当考虑HBA2(血红蛋白亚基α2)人基因，第二内含子(IVS2)可以对应于该基因的第二外显子和第三外显子之间包含的142个核苷酸。该区域对应于位置chr16：173,330-173,471；142nt；参考序列：NM_000517.4。

当考虑HBB(血红蛋白亚基β)人基因，第二内含子(IVS2)可以对应于该基因的第二外显子和第三外显子之间包含的850个核苷酸。该区域对应于位置chr11：5,225,727-5,226,576；850nt；参考序列：NM_000518.4。

如所附实施例所示，发明人出乎意料地确定，当在球蛋白基因的选定位置发生基因组编辑时，获得了在本文中进一步定义的非常好的InDel百分比以及高转基因(GFP)表达。

因此，在具体的实施方案中，本文所述的细胞在其基因组中包含的至少一个其球蛋白基因中包含处于所述至少一个球蛋白基因的内源性启动子的调控之下的至少一个编码至少一个治疗性蛋白或至少一个治疗性核糖核酸的转基因；

至少一个球蛋白基因选自γG球蛋白基因、γA球蛋白基因、δ球蛋白基因、β球蛋白基因、α1球蛋白基因和α2球蛋白基因，更具体地选自由β球蛋白基因、α1球蛋白基因和α2球蛋白基因组成的组，优选地选自由α1球蛋白基因和α蛋球蛋白基因组成的组；和

至少一个转基因包含在所述球蛋白基因的5'区，第一内含子(IVS1)和/或第二内含子(IVS2)中，尤其是在所述球蛋白基因的5'UTR和/或近端启动子中和/或第二内含子(IVS2)中，优选在所述球蛋白基因的5'UTR中或近端启动子中或第二内含子(IVS2)中。

在一个具体的实施方案中，如本文所述的细胞在其基因组中包含的至少一个其HBA球蛋白基因中包含处于所述至少一个球蛋白基因的内源性启动子的调控之下的至少一个编码至少一个治疗性蛋白或至少一个治疗性核糖核酸的转基因，所述至少一个转基因包含在所述球蛋白基因的5'区、第一内含子(IVS1)和/或第二内含子(IVS2)中，尤其是在所述球蛋白基因的5UTR和/或近端启动子和/或第二内含子(IVS2)中，优选在所述球蛋白基因的5'UTR或第二内含子(IVS2)中。

在一个具体的实施方案中，如本文所述的细胞在其基因组中包含的至少一个其HBA球蛋白基因中包含处于所述至少一个球蛋白基因的内源性启动子的调控之下的至少一个编码至少一个治疗性蛋白或至少一个治疗性核糖核酸的转基因，所述至少一个转基因包含在所述球蛋白基因的5'区、第一内含子(IVS1)和/或第二内含子(IVS2)中，尤其是在所述球蛋白基因的5UTR和/或近端启动子和/或第二内含子(IVS2)中，优选在所述球蛋白基因的近端启动子或第二内含子(IVS2)中。

根据一个具体的实施方案，根据本发明的细胞是如此以至于：

-所述造血干细胞的基因组中包含的至少一个球蛋白基因为α1球蛋白基因和/或αα球蛋白基因，并且至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因包含在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)或内含子中，尤其包含在5'非翻译区(5'UTR)或第二内含子(IVS2)中；和/或

-所述造血干细胞的基因组中包含的至少一个球蛋白基因是β球蛋白基因，并且编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的至少一个转基因包含在所述至少一个球蛋白基因的近端启动子或第二内含子(IVS2)中。

本发明还涉及源自本文所述的基因修饰的干细胞的血细胞，或红细胞，优选纯化的红细胞样细胞。

修饰的干细胞尤其选自造血干细胞和胚胎干细胞，并且优选造血干细胞。在一个优选的实施方案中，本文所述的血细胞是来自造血系统的细胞。

造血干细胞可以分化为两种类型的祖细胞，即骨髓祖细胞或淋巴样祖细胞。骨髓祖细胞可分化为巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，而淋巴样祖细胞可分化为自然杀伤细胞(NK)、小淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和浆细胞。

因此，本文所述的“血细胞”可以选自淋巴样祖细胞、髓样祖细胞、巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、小细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和浆细胞。

造血干细胞以及淋巴样祖细胞和髓样祖细胞将不表达转基因，但是仍然有用，因为它们可以分化成能够表达转基因的细胞。

在一个优选的实施方案中，本文所述的血细胞选自巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、小淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和浆细胞。

转基因

本文所述的细胞中包含的转基因编码至少一个蛋白和/或至少一个核糖核酸，尤其编码至少一个治疗性蛋白和/或至少一个治疗性核糖核酸，尤其编码至少一个治疗性蛋白或至少一个治疗性核糖核酸。

本文所述细胞中的目标转基因处于包含所述转基因的球蛋白基因的内源启动子的调控之下。

在一个实施方案中，本文所述的细胞可在其球蛋白基因之一中仅包含一个转基因，所述转基因编码本文所述的仅一种治疗性蛋白或仅一种治疗核糖核酸。

在另一个实施方案中，本文所述的细胞可在其球蛋白基因之一中仅包含一个转基因，所述转基因编码本文所述的一种以上治疗性蛋白或一种以上治疗性核糖核酸，尤其是两个、三个、四个、五个或六个治疗性蛋白或治疗性核糖核酸，优选两个治疗性蛋白或治疗性核糖核酸。

当本文所述的转基因编码一种以上的治疗性蛋白或治疗性核糖核酸时，所述治疗性蛋白或治疗性核糖核酸可以彼此相同或不同。

此外，当本文所述的细胞中存在一个以上的转基因时，所述转基因可以独立地在相同或不同的球蛋白基因中，并且如果在相同的球蛋白基因中，则可以在该球蛋白基因相同或不同的部分中。

在另一个实施方案中，本文所述的细胞可在其至少一个球蛋白基因中包含多于一个的转基因，尤其是两个、三个、四个、五个或六个转基因。

根据该实施方案，不同的转基因可以独立地编码相同或互不相同的治疗性蛋白或治疗性核糖核酸。

还根据该实施方案，不同的转基因可以独立地编码一种或多于一种的本文描述的治疗性蛋白或治疗性核糖核酸。

特别地，所有转基因可以编码仅一种治疗性蛋白或仅一种治疗核糖核酸。或者，至少一个，尤其所有转基因可以编码一种以上，尤其是两个、三个、四个、五个或六个，更优选两个治疗性蛋白或治疗性核糖核酸。

而且，由不同转基因编码的治疗性蛋白或治疗性核糖核酸可以独立地相同或不同。

仍然根据该实施方案，如本文所述的细胞中的转基因可以独立地在相同或不同的球蛋白基因中，并且，如果在相同的球蛋白基因中，则可以在球蛋白基因的相同或不同部分中。

在一个具体的实施方案中，本文所述的治疗性蛋白可以由产生它的细胞自然分泌或被工程化以被分泌。

例如，可以通过向其序列添加至少一个信号肽来工程化治疗性蛋白。信号肽是存在于肽的N端的短序列，其可被细胞识别，并允许将产生的蛋白转运到细胞膜并分泌。

根据另一个实施方案，可以通过添加短序列来工程化根据本文的治疗性蛋白，所述短序列促进其被其他细胞摄取或穿越血脑屏障或与血浆或内皮细胞上的其他蛋白结合。

如本文所述的转基因可以编码任何类型的治疗性蛋白或治疗性核糖核酸。

例如，由本文所述的细胞的球蛋白基因中包含的转基因编码的治疗性蛋白可以选自细胞因子，尤其是干扰素；激素；趋化因子；抗体(包括纳米抗体)；抗血管生成因子；或用于替代疗法的蛋白，例如酶，尤其是α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶和VIII因子。

在一个具体的实施方案中，转基因与其插入的基因不同。

根据一个具体的实施方案，由本文所述的细胞的球蛋白基因中包含的转基因编码的治疗性蛋白可以选自可用于免疫或接种的生长因子、生长调节剂、抗体、抗原及其衍生物组成的组。这样的治疗性蛋白具体地可以选自白介素；胰岛素；G-CSF；GM-CSF；hPG-CSF；M-CSF；干扰素，如α-干扰素、β-干扰素或π-干扰素；凝血因子，例如凝血因子VIII、凝血因子IX或tPA，或其组合。它优选选自凝血因子，更具体是因子VIII。

因此，在一个具体的实施方案中，由本文所述的细胞的球蛋白基因中包含的转基因编码的治疗性蛋白可以选自细胞因子，尤其是干扰素(干扰素-α，-β或-γ)；激素；趋化因子；抗体(包括纳米抗体)；抗血管生成因子；用于替代疗法的酶如腺苷脱氨酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、伊杜阿和β-葡萄糖苷酶；白介素；胰岛素；G-CSF；GM-CSF；hPG-CSF；M-CSF；凝血因子，例如凝血因子VIII、凝血因子IX或tPA；跨膜蛋白，如神经生长因子受体(NGFR)；溶酶体酶，例如α-半乳糖苷酶(GLA)、α、A苷异戊糖苷酶(IDUA)、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)和半乳糖胺(N-乙酰基)-6硫酸酯酶(GALNS)；可以被工程化为能够被分泌并最终被疾病感染的细胞摄取的任何蛋白(例如Lawlor MW,Hum Mol Genet.22(8):1525–1538.(2013)；Puzzo F,Sci Transl Med.29；9(418)(2017)；Bolhassani A.Peptides.87:50-63.,(2017)))及其组合。

如本文所述，由包含在细胞的球蛋白基因中的转基因编码的治疗性蛋白具体是凝血因子，尤其是因子VIII；或溶酶体酶，例如溶酶体酸脂肪酶(LAL)或半乳糖胺(N-乙酰基)-6硫酸酯酶(GALNS)。

如本文所述，由包含在细胞的球蛋白基因中的转基因编码的治疗性蛋白更具体地是凝血因子，尤其是因子VIII。

例如，由本文所述的细胞的球蛋白基因中包含的转基因编码的治疗性核糖核酸可以选自miRNA、shRNA、siRNA、ncRNA和snRNA。

编码转基因的蛋白可以是野生型或密码子优化的形式，当非优化的目标蛋白长度很大时，密码子优化的形式尤为有意义。这样的优化序列可以有利地增加蛋白质的半衰期和稳定性。例如，在本文的实施例中使用了编码人FVIII优化的蛋白的转基因。

如本文所述的由转基因编码的治疗性蛋白也可以是可诱导免疫耐受性的蛋白。红细胞表达确实可以通过诱导调节性T细胞的形成来诱导反应性T细胞的缺失(Cremel等(Int.J.Pharm.2013Feb 25:443(1-2):39-49)；Grimm等(Sci.Rep.2015Oct 29；5:15907)Kontos et al(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2013Jan 2；110(1):E60-8)，一种可用于治疗自身免疫性疾病，例如II型糖尿病和(Pishesha等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2017Apr.25；114(17):E3583)，或用于避免针对治疗性蛋白(例如针对庞贝病和天冬酰胺酶的GAA)产生免疫应答的方法(Lorentz等(Sci.Adv.2015Jul 17；1(6):e1500112)；Cremel等(Int.J.Pharm.2015Aug 1；49(1-2):69-77)。

在一个具体的实施方案中，本文所述的转基因的大小小于15kb，更具体地小于10kb，优选地小于8kb。

制备如本文所述的造血干细胞的方法

用于制备如本文所述的修饰的造血干细胞的方法是体内、离体或体外的，优选离体或体外的。

本发明尤其涉及离体或体外制备本文所述的造血干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(i)通过以下向所述干细胞提供定点基因工程化系统：

(a)向所述干细胞提供(1)与所选靶位点结合的至少一个向导核酸，或(2)与所选靶位点结合的含向导肽的核酸内切酶，所述靶位点位于所述造血干细胞的基因组中包含的球蛋白编码基因中；

和

(ii)培养在步骤(i)中获得的干细胞，使得将所述转基因引入所述造血干细胞基因组中的所述选定的靶位点。

本文所述的靶位点可以存在于如上定义的球蛋白基因的结构域中，所述结构域选自：由球蛋白基因5'区、外显子结构域、内含子结构域和3'UTR结构域组成的组，尤其是由所述球蛋白基因的5'区、外显子结构域和内含子结构域组成的组，更具体地，是由所述球蛋白基因的5'UTR、近端启动子和内含子结构域组成的组。

在一个优选的实施方案中，所述靶位点位于所述至少一个球蛋白基因的5'区和/或内含子中，优选在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区域(5'UTR)和/或近端启动子中和/或第二内含子(IVS2)中，尤其是包含在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)中或在所述近端启动子中或在所述第二内含子(IVS2)中。

在一个具体的实施方案中，本文所述方法的步骤(i)(a)被定义为向所述干细胞提供与选定的靶位点结合的含向导肽的核酸内切酶。

在另一个实施方案中，本文所述方法的步骤(i)(a)被定义为向所述干细胞提供与选定的靶位点结合的至少一个向导核酸(或gRNA)。

gRNA是具有80个核苷酸的恒定区和通过Watson-Crick碱基配对结合DNA靶标的20个核苷酸的靶特异性短序列(在gRNA序列的5'端)。

在一个具体的实施方案中，本文所述方法的步骤(i)(a)被定义为向所述干细胞提供与同一球蛋白基因域中的两个不同靶位点结合的两个向导核酸(或gRNA)。

如上文所定义，仅当将本文所述方法的步骤(i)(a)定义为向所述干细胞提供至少一个与选定的靶位点结合的向导核酸(或gRNA)时，才存在本文所述方法的步骤(i)(b)。

本文所述的核酸内切酶被定义为无靶位点特异性，即所述核酸内切酶自身不能识别本文所述的造血干细胞基因组中的特异性靶位点。

为了在特定靶位点处特异性切割DNA，这种核酸内切酶需要与结合所选靶位点或向导肽的向导核酸结合。当与向导肽结合时，即为包含向导肽的核酸内切酶。

当通过向导肽或向导核酸(gRNA)引导至靶位点时，本文所述的核酸内切酶能够在所述靶位点诱导单链断裂或双链断裂。

具体地，当在如本文所述的方法的步骤(i)(a)中提供与所选靶位点结合的单个向导核酸分子(gRNA)或与所选靶位点结合的含向导肽的核酸内切酶时，则本文定义的方法的步骤(i)(b)的含向导肽的核酸内切酶的内切酶部分或核酸内切酶能够在靶位点处诱导双链断裂。

在另一个实施方案中，当在步骤(i)(a)中提供能够识别球蛋白基因的结构域中的两个不同靶位点的两个向导核酸分子(gRNA)时，本文所述方法的步骤(i)(b)中可提供一个或两个无靶位点特异性的核酸内切酶，所述一种或两种内切核酸酶能够在两个不同靶位点诱导单链断裂。

本文所述方法的步骤(i)(a)、(i)(b)和(i)(c)可以同时或彼此独立地实现。在一个优选的实施方案中，至少一个向导核酸与选定的靶位点结合或含向导肽的核酸内切酶与步骤(i)(a)的选定的靶位点结合，将步骤(i)(b)的至少一个无靶位点特异性的核酸内切酶和步骤(i)(c)的转基因同时提供给所述干细胞。

将体外、离体或体内蛋白和核酸分子引入细胞的方法是本领域众所周知的。将通常存在于载体中的核酸或蛋白引入细胞的传统方法包括显微注射、电穿孔和声穿孔。还可以提及基于物理、机械和生化方法的其他技术，例如磁转染、光注射、光穿孔、光学转染和激光转染(参见Stewart MP等，Nature，2016)。

在一个具体的实施方案中，步骤(i)(b)的无靶位点特异性的核酸内切酶是RNA引导的核酸内切酶。具体地，该RNA引导的核酸内切酶可以被gRNA引导以在靶位点内引入单链或双链断裂。

本文所述的RNA引导的内切核酸酶尤其可以是簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白(Cas)，具体是Lachnospiraceae，Acidaminococcus，Prevotella和Francisella 1(Cpf1)中的CRISPR相关蛋白9(Cas9)或CRISPR相关核酸内切酶。

用于基因组编辑的CRISPR-Cas系统是利用在工程化RNA和靶DNA位点之间的简单碱基配对规则的特定系统，而不是其他利用蛋白-DNA相互作用进行靶向的系统。

CRISPR-Cas RNA引导的核酸酶源自适应性免疫系统，该系统在细菌中进化以防御入侵的质粒和病毒。

根据第一实施方案，其在于将侵入的核酸的短序列掺入CRISPR基因座的机制。然后将它们转录并加工成CRISPR RNA(crRNA)，再将其与反式激活的crRNA(tracrRNA)一起与CRISPR相关蛋白(Cas)复合以指示Cas核酸酶通过核酸之间的Watson-Crick碱基配对的特异性切割DNA。crRNA带有一个称为“前间隔”序列的可变序列。如果crRNA的前间隔序列编码部分与称为“前间隔序列相邻基序”(PAM)的短序列相邻，则引导Cas9切割互补的靶DNA序列。CRISPR基因座中的前间隔序列不被切割，因为它们不存在于PAM序列旁(参见Mali等(Nat.Methods,2013Oct；10(10):957-63)；及Wright等(2016Jan.14；164(1-2):29-44Cell))。

根据该第一实施方案，本文所述的向导RNA(gRNA)或对应于单链RNA(以下称为sgRNA)，或对应于crRNA和tracrRNA的融合物。本文中使用的术语“向导RNA”或“gRNA”指定这两种形式，除非具体指出了特定形式。

在根据该实施方案并且对应于crRNA和tracrRNA的融合物的gRNA中，核苷酸1-32是天然存在的crRNA，而核苷酸37-100是天然存在的tracrRNA，核苷酸33-36对应于这两个gRNA片段之间的GAAA接头(参见Jinek等(2012)Science 337:816-821以及Cong等(2013)Science；339(6121):819-823)。

此类gRNA有利地用于CRISPR-Cas9系统。

gRNA是人工合成的，并且自然界中不存在。

如本文所述的优选的gRNA可以选自包含选自以下的核酸序列的gRNA：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ IDNO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ IDNO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：61和SEQ ID NO：63。

如本文所述，具体优选的gRNA可以选自包含选自以下的核酸序列的gRNA：SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：17，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ IDNO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ IDNO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：61和SEQ ID NO：63，更优选包含选自SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：37。

如本文所述的优选gRNA可以选自包含选自以下的核酸序列的gRNA：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ IDNO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：62和SEQ ID NO：64。

如本文所述的具体优选的gRNA可以选自在于以下核酸序列的gRNA：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：62和SEQ ID NO：64，更优选包含选自SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38的核酸序列。

可以设计可与不同Cas或具有不同PAM的Cas9核酸酶一起使用的其他gRNA，并用于根据本发明的方法中。

所述20个核苷酸的核酸序列对应于gRNA序列5'端处的前20个核苷酸，并且在本第一实施方案中，直接在PAM序列之前，优选在PAM序列NGG之前，即序列SEQ ID NO：1-8表示gRNA序列的核苷酸1-20，并且PAM信号为核苷酸21-23。

在PAM序列中，N可以是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)。

如实施例中所示，在许多设计的靶向HBA1/2和HBB基因的5'区(5'UTR或近端启动子)或内含子(IVS1或IVS2)的gRNA中，发明人选择了特异性的gRNA，以将如果Cas9诱导的双链断裂(DSB)没有导致阳性dDNA整合事件而产生等位基因KO的可能性最小化。

根据另一个实施方案，该机制与上述第一实施方案的机制相似，除了不使用反式激活crRNA(tracrRNA)。实际上，在该实施方案中，CRISPR RNA(crRNA)与CRISPR相关蛋白(Cas)形成复合物以通过核酸之间的Watson-Crick碱基配对引导Cas核酸酶切割DNA的特异性。根据该实施方案，Cas蛋白有利地是Cpf1。实际上，Cpf1和Cas9之间的重要区别是，例如，Cpf1是不需要tracrRNA的单RNA引导的核酸酶。

Cpf1酶从细菌弗朗西斯菌(Francisella novicida)中分离。Cpf1蛋白包含预测的RuvC样核酸内切酶结构域，该结构域与Cas9的各个核酸酶结构域远相关。但是，Cpf1与Cas9的不同之处在于它缺少HNH，HNH是Cas9的RuvC样结构域中存在的第二核酸内切酶结构域。Cpf1在引导5'侧识别富含T的PAM，即TTTN，这使其与在引导3'侧使用NGG PAM的Cas9有所不同。

在PAM序列TTTN中，N可以是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)。

根据本实施方案，本文所述的向导RNA(gRNA)对应于唯一的crRNA，并且不需要与tracrRNA融合。此类gRNA有利地用于CRISPR-Cpf1系统。

根据一个具体的实施方案，与本文定义的方法的步骤(i)(a)的选定靶位点结合的含向导肽的核酸内切酶是转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶。

TALEN技术包含与特异性DNA结合域融合的非特异性DNA切割域(核酸酶)。特异性DNA结合结构域由高度保守的重复序列组成，这些重复序列来自作为由黄单胞菌真菌Xanthomonas分泌的蛋白的转录激活子样效应物(TALE)，从而改变宿主植物细胞中基因的转录。可以使用例如Fok I的各种限制性核酸内切酶和/或归巢核酸内切酶(例如Fok IType IIS限制性核酸内切酶)得到DNA切割结构域或切割半结构域(参见Wright等(Biochem.J.2014Aug.15；462(1):15-24))。

锌指核酸酶(ZFN)技术在于使用锌指DNA结合域与DNA裂解域(核酸酶)融合产生的人工合成的限制性酶。锌指结构域特异性靶向所需DNA序列，从而使所述相关的核酸酶靶向复杂基因组内的独特序列。

锌指DNA结合结构域包含两个指模块链，每个模块识别一个特定的DNA六聚体(6bp)序列。两个指模块拼合在一起形成锌指蛋白。如同TALEN技术一样，DNA切割域包含FokI的核酸酶结构域(Carroll D,Genetics,2011Aug；188(4):773-782；Urnov F.D.Nat RevGenet.(9):636-46,(2010))。

关于本文所述方法的步骤(i)(c)的转基因，所述转基因优选不在启动子的调控下，和/或提供的转基因在不会插入干细胞的基因组中的启动子的调控下。

确实，如前所述，如本文所述的以及可以通过前述的方法获得的基因修饰的造血干细胞使得球蛋白基因中包含的至少一个转基因处于其插入的所述球蛋白基因的内源性启动子的调控之下。

使用如本文所述的干细胞的球蛋白基因的内源性启动子有利地允许如上所述的细胞中转基因的高水平和组织特异性转录。

在本文所述方法的步骤(ii)中，培养步骤(i)中获得的干细胞，使得将所述转基因引入所述造血干细胞基因组中的所述选定靶位点。

在一个具体的实施方案中，如本文所述的制备造血干细胞的离体或体外方法包括以下步骤：

(i)通过以下向所述干细胞提供定点基因工程化系统：

(a)向所述干细胞提供至少一个与选定的靶位点结合的向导核酸，所述靶位点位于所述造血干细胞的基因组中包含的球蛋白编码基因中；

和

如前所述，至少一个球蛋白基因优选选自ε球蛋白基因、γG球蛋白基因、γ蛋球蛋白基因、δ球蛋白基因、β球蛋白基因、ζ球蛋白基因、伪ζ球蛋白基因、μ球蛋白基因、伪α蛋白球蛋白基因、α蛋球蛋白基因和α蛋球蛋白基因，尤其选自γG球蛋白基因、γA球蛋白基因、δ球蛋白基因、β球蛋白基因、α1球蛋白基因和α2球蛋白基因，更具体地选自α1球蛋白基因和α2球蛋白基因。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及体内、离体或体外制备，尤其是离体或体外制备根据权利要求1-5中任一项的造血干细胞的方法，包括以下步骤：

(i)通过以下向所述干细胞提供定点基因工程化系统：

(a)向所述干细胞提供至少一个与所选靶位点结合的向导核酸，所述靶位点位于所述造血干细胞的基因组中包含的内源球蛋白编码基因的5'区和/或第二内含子(IVS2)中；

(b)进一步向所述干细胞提供至少一个簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸酶，尤其是CRISPR相关蛋白9(Cas9)；和

和

(ii)培养在步骤(i)结束时获得的干细胞，使得将所述转基因引入所述造血干细胞基因组中的所述选定的靶位点。

(i)通过以下向所述干细胞提供定点基因工程化系统：

和

(ii)培养在步骤(i)结束时获得的干细胞，使得将所述转基因引入所述造血干细胞基因组中的所述选定靶位点，

与选定的靶位点结合的所述至少一个向导核酸选自在于选自下组的核酸序列的gRNA：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ IDNO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64，优选包含选自SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：32和SEQID NO：38的核酸序列。

药物组合物

如本说明书中其他地方已经描述的，本发明还涉及一种药物组合物，其包含在药学上可接受的介质中的至少一个本文所述的基因修饰的造血干细胞和/或本文所述的至少一个血细胞(或红细胞样细胞)。

具体地，如本文所述的药学上可接受的介质适合于向哺乳动物个体施用。

“药学上可接受的介质”包括本领域普通技术人员已知的配制药物组合物的任何标准药学上可接受的介质，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇水溶液，或葡萄糖溶液、甘露醇、右旋糖酐、丙二醇、油(例如，植物油、动物油、合成油等)、微晶纤维素、羧乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸钙、明胶或聚山梨酯80等。

本文所述的药物组合物通常还包含一种或多种缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)；碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐)；甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚等)；抑菌剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；使制剂与受体血液等渗、低渗或弱高渗的溶质；悬浮剂；增稠剂和/或防腐剂。

当然，载体的类型通常将根据施用方式而变化。

在一个实施方案中，本文所述的细胞可以与治疗化合物组合用于组合物中，所述治疗化合物可有效治疗有需要的个体中待治疗的疾病相关的病症/疾病。例如，本文所述的细胞可以与抗细菌、抗真菌或抗病毒化合物一起施用，以预防个体中的机会性感染或已经进行的感染。例如，可以将血小板与本文所述的细胞一起以本文所述的组合物形式施用，作为将血小板计数恢复至安全水平的临时措施。

在一个实施方案中，本文所述的细胞可以与其他上文定义的造血干细胞或血细胞组合用于本文所述但未如本文所述修饰的组合物中。

在一个实施方案中，本文所述的细胞可以与增强所施用细胞的治疗效果的其他试剂和化合物组合用于本文所述的组合物中。

在另一个实施方案中，本文所述的细胞可以与增强如本文所述的造血干细胞或祖细胞的分化的治疗性化合物一起以本文所述的组合物施用。这些治疗性化合物具有诱导造血干细胞和/或内源性祖细胞和/或作为治疗的一部分向个体施用的那些的分化和移动的作用。

基因修饰的细胞用作药物

本发明的另一个目的是本文所述的造血干细胞、或本文所述的血细胞或本文所述的药物组合物作为药物的用途。

本文所述的细胞通过任何合适的途径(例如静脉内、心内、鞘内、肌内、关节内或骨髓内注射)并以足以提供治疗益处的剂量施用于受试者。

为了达到具体的目的，将根据常规方法凭经验确定达到治疗效果所需的细胞量。

通常，为了治疗目的，以药理学有效剂量施用细胞。

“药理学有效量”或“药理学有效剂量”是指足以产生所需的生理作用的量或能够达到所需结果的量，尤其用于治疗疾病或病症，包括减轻或消除病症或疾病的一种或多种的表现。

例如，向患有中性白细胞减少症的患者施用细胞不仅提供消除或改善潜在病症的治疗益处，而且提供降低患者与疾病相关的症状的严重程度或持续时间的治疗益处。治疗益处还包括中止或减慢潜在疾病或病症的进展，无论是否实现改善。

通过本领域众所周知的方法来施用细胞。在一实施方案中，施用是通过静脉内输注。在另一种方法中，施用是通过骨髓内注射。

输注的细胞数将考虑因素如性别、年龄、体重、疾病或病症类型、疾病阶段、所需细胞在细胞群中的百分比(例如，细胞群的纯度)和产生治疗益处所需的细胞数。

通常，输注的细胞数可以是1.10⁴-5.10⁶个细胞/kg体重，具体是1.10⁵-10.10⁶个细胞/kg体重，优选是5.10⁵-约5.10⁶个细胞/kg体重。

如前所述，如本文所述的药物组合物可用于将如本文所述的细胞施用于有需要的个体。

细胞的施用可以通过单次施用或连续施用。当连续施用时，可以每次施用不同的细胞数和/或不同的细胞群。

例如，第一次施用可以是本文所述的细胞或细胞群，其提供立即的治疗益处以及延长的效果(红细胞和/或普通骨髓祖细胞(CMP)和/或造血干细胞(HSC)+粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)+中性粒细胞)，而第二次施用包括本文所述的提供延长效果的细胞(例如CMP和/或HSC)，以扩展第一次施用的治疗作用。

本文所述的干细胞、血细胞或药物组合物可用于在有需要的个体中治疗：

-选自自身免疫性疾病、病毒感染和肿瘤的疾病；和/或

-缺乏蛋白或存在异常的无功能蛋白而引起的疾病。

因此，本发明的另一个目的是本文所述的基因修饰的造血干细胞，或本文所述的血细胞，或本文所述的药物组合物，其用于在有需要的个体中治疗：

-选自自身免疫性疾病、病毒感染和肿瘤的疾病；和/或

-由蛋白缺乏或存在异常的无功能蛋白而引起的疾病。

还提及一种在有需要的个体中治疗以下疾病的方法：

-选自自身免疫性疾病、病毒感染和肿瘤的疾病；和/或

-由蛋白缺乏或存在异常的无功能蛋白而引起的疾病，

包括向有需要的个体施用如本文所述的造血干细胞、本发明的血细胞和/或如本文所述的药物组合物。

本发明还涉及本文所述的造血干细胞、本发明的血细胞和/或本文所述的药物组合物在制备用于在有需要的个体中治疗以下疾病的药物中的用途：

-选自自身免疫性疾病、病毒感染和肿瘤的疾病；和/或

-由蛋白缺乏或存在异常的无功能蛋白而引起的疾病。

在一个具体的实施方案中，本文所述的干细胞、血细胞或药物组合物可以用于治疗由缺乏分泌的蛋白或由于存在异常的无功能分泌的蛋白而引起的疾病。

所述疾病可以例如选自凝血障碍、溶酶体贮积障碍、激素缺陷和α述疾抗胰蛋白酶缺乏症。

溶酶体贮积障碍可以例如选自高雪氏病(葡萄糖脑苷脂酶缺乏症-基因名称：GBA)、法布里氏病(α半乳糖苷酶缺乏症-GLA)、亨特氏病(异氰酸酯2-硫酸酯酶缺乏症-IDS)、霍勒氏病(α勒氏糖醛酸苷酶缺乏症-IDUA)和尼曼-皮克氏病(鞘磷脂磷酸二酯酶1缺乏症-SMPD1)。

在另一个实施方案中，本文所述的干细胞、血细胞或药物组合物可用于治疗选自自身免疫性疾病、病毒感染和肿瘤的疾病。

实际上，根据本发明的一个实施方案，本发明的治疗性蛋白可以是可用于中和靶蛋白(如细菌毒素)或直接引起疾病的蛋白(例如黄斑变性中的VEGF)的治疗性抗体，以及用于高度选择性杀死其存在和复制危害宿主的细胞(例如癌细胞以及自身免疫性疾病中的某些免疫细胞)的治疗性抗体。

本发明还涉及本文所述的基因修饰的造血干细胞或本文所述的血细胞或本文所述的药物组合物在诱导对需要其的个体的免疫耐受性的用途。

通过但不限于本文的实施例进一步说明本发明。

具体实施方式

实施例1：K562红白血病细胞系中gRNA的设计与验证

如前所述，发明人设计了几种靶向HBA1/2或HBB基因的5'区(5'UTR或近端启动子)或内含子之一(IVS1或IVS2)的gRNA。

将编码质粒的gRNA候选物核转染入组成型表达SpCas9(K562-Cas9)的未定K562细胞克隆中。

本实施例中使用的gRNA候选物是具有以下序列的那些：

对于HBA，从左到右：SEQ ID NO：4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38；

对于HBB，从左到右：SEQ ID NO：40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62和64。

更具体地，将K562(

CCL-243)保存在含有2mM谷氨酰胺并补充有10％的胎牛血清(FBS，BioWhittaker，Lonza)、HEPES(10mM，LifeTechnologies)、丙酮酸钠(1mM，LifeTechnologies)以及青霉素和链霉素(每个100U/ml，LifeTechnologies)的RPMI 1640培养基(Gibco)中。用表达spCas9和抗杀稻瘟菌素表达盒的慢病毒载体(Addgene#52962)感染、选择并亚克隆K562-Cas9的稳定克隆。

使用Nucleofector Amaxa 4D(Lonza)和SF Cell Line4D-Nucleofectof试剂盒，将20μL体积的200ng含gRNA载体(Addgene#53188)转染2.5x10⁵个K562-Cas9细胞。

核转染后48小时，将细胞沉淀，并使用MagNA Pure 96DNA和Viral NA SmallVolume试剂盒(Roche)提取DNA。使用KAPA2G Fast ReadyMix(Kapa Biosystem)，使用50ng基因组DNA扩增跨各gRNA切割位点的区域。Sanger测序后，通过软件TIDE使用该网站www.tide.calculator.nk计算倒位和缺失的百分比(InDel)(通过分解追踪InDels-Brinkman等Nucleic Acids Res.2014.42(22):e168)。

InDel是基因组中由核酸酶活性产生的DNA末端的非同源末端连接(NHEJ)DNA修复引起的碱基的插入或缺失。其在Brinkman等(Brinkman等Nucleic Acids Res.2014.42(22):e168)中明确定义。因此，InDel结果越接近100％，测试的gRNA越有效。

进一步测试了针对HBA的靶基因座5'区，尤其是5'UTR、IVS1和IVS2的性能最佳的gRNA(分别是针对5'区的具有序列SEQ ID NO：12的gRNA，针对IVS1的具有序列SEQ ID NO：32的gRNA和针对IVS2的具有序列SEQ ID NO：38的gRNA)的包含供体DNA(dDNA)的转基因的整合和表达。作为dDNA，产生编码无启动子的GFP的整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV)，预期在成功靶向后处于内源性α源性球蛋白启动子的调控之下，并编码嘌呤霉素表达盒以富集含dDNA的细胞。

为了测试dDNA整合，首先用整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV)转导K562-Cas9细胞，然后在24小时后用所选的gRNA编码质粒转染。嘌呤霉素选择后，对于所有测试的gRNA和dDNA，观察到高百分比的GFP阳性细胞(数据未显示)，而该表达盒随机整合后未检测到显著的GFP表达(未显示)。

发明人然后诱导K562的红细胞分化来上调HBA和HBB转录，并观察到GFP表达的伴随增加，证实了报道基因确实处于内源球蛋白启动子的转录调控下(数据未显示)。最后，在单个GFP+细胞克隆上通过PCR和Sanger测序验证了所有gRNA/dDNA组合的正确整合(数据未显示)。

总之，发明人鉴定了几种有效的gRNA，并设计了dDNA表达盒以在内源性红细胞α和β-球蛋白启动子的调控下实现精确和功能性的转基因靶向整合。

实施例2：在转基因的HBA和HBB基因座中的靶向整合使得能够对所述转基因进行内源性启动子调节

发明人证实了插入球蛋白基因座中的转基因处于相应球蛋白基因的内源启动子的调控下。

因此，根据下文指出的方案，在其HBA或HBB基因的各个结构域中插入GFP基因的转染的K562细胞在用血红素诱导后进行红细胞分化。所述分化导致HBA或HBB转录物的上调，监测并比较未分化细胞(GPA-)和分化细胞(GPA+)中的GFP表达。

用含有无启动子的GFP和组成型表达的嘌呤霉素抗性基因的IDLV转导5×10⁵个K562-Cas9细胞。

这些捕获设计为在整合到HBA或HBB 5'区(HBA的5'UTR，HBB的近端启动子)或内含子时表达。转导后的第二天，洗涤细胞，并使用带有SF Cell Line 4D-Nucleofector试剂盒的NucleofectorAmaxa 4D(Lonza)用200ng含gRNA的载体转染2.5x10⁵个转导的细胞。

两周后，用嘌呤霉素(5ug/ml)选择细胞以富集IDLV整合，并使用MoFlocell分选仪(Beckman Coulter)分选GFP阳性细胞。通过向培养基中添加血红素(50uM)，将每种gRNA/IDLV组合的GFP阳性细胞分化4天。由于K562分化不是均匀的，为了确定分化状态，用抗糖蛋白A(GPA或GYPA)抗体(PECy7小鼠抗人类CD235a，CLONE GA-R2，BD Bioscience)染色细胞，并通过流式细胞仪分析GFP表达。

获得的结果(参见图2)显示了在红细胞诱导后在靶细胞中而不是在对照细胞中的GFP表达增加(IDLV整合入AAVS1基因座中(gRNA AAVS1)或随机(gRNA Luc)中)。

这些结果说明报告基因转基因确实处于内源性球蛋白启动子的转录调控之下的事实。

实施例3：供体DNA在HBA中的靶向整合允许稳定表达不同的转基因

发明人证实了在根据本发明的相应球蛋白基因的内源性启动子的调控下，可以成功地将不同的转基因插入到球蛋白基因座中。

用含有无启动子的截短神经生长因子受体(DNGFR)或密码子优化的因子VIII(F8)和组成型表达的嘌呤霉素抗性基因的整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV)转导5x10⁵个K562-Cas9细胞。将捕获设计为在目标整合时表达。转导细胞洗涤后的第二天，使用NucleofectorAmaxa 4D(Lonza)和SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit，用200ng含HBA 5’UTR gRNA的载体转染2.5x10⁵个转导的细胞。

2周后，用嘌呤霉素(5ug/ml)选择细胞以富集IDLV整合。

获得的结果如图3所示。

左图：用抗-NGFR(小鼠抗人CD271-APC，Miltenyi Biotec)对嘌呤霉素选择的细胞染色，并通过流式细胞仪进行分析。

右图：在HBA中整合了F8-嘌呤霉素捕获的嘌呤霉素选择细胞的代表性克隆。

使用Cytofix/Cytoperm^TM(BD Bioscience)固定和透化细胞，并通过流式细胞仪(小鼠抗人FVIII GMA-8015，Green Mountain和山羊抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 488，Invitrogen)监测F8表达。

发明人证明，根据本发明的方法诱导目标细胞的球蛋白基因中不同转基因的稳定表达。

实施例4：同源臂对造血干/祖细胞靶整合效率的影响

观察了向供体DNA捕获中添加同源臂的效果。

将运动的外周血HSPC解冻并在预刺激培养基中培养48h(StemSpan，干细胞技术；rhSCF 300ng/ml，Flt3-L 300ng/ml，rhTPO 100ng/ml和IL-3 20ng/mL，CellGenix)。

按照制造商的指示，对用于gRNA 5’UTR的特异性crRNA和支架tracrRNA(Integrated DNA Technologies)进行退火，并与30pmol的spCas9形成核糖核蛋白复合物(比例1：1.5)。使用P3原代细胞4D-Nucleofector试剂盒(Lonza)，用RNP复合物对每种条件2x10⁵个细胞进行核转染，并用GFP-Puromycin载体捕获进行转导，该捕获带有或不带有5'UTR gRNA靶位点的同源臂(转基因两侧各250bp)。

捕获提供为IDLV(无同源性，MOI 100，上图)或AAV6载体(同源臂，MOI 15000，下图)。洗涤转导后，在Stemregenin1(0.75uM，Stem Cell Technologies)和Z-VAD pan半胱天冬酶抑制剂(120uM，InvivoGen)存在下将细胞洗涤并在预刺激培养基中再放置48小时，并在红细胞分化培养基(StemSpan，干细胞技术；SCF 20ng/ml，Epo 1u/mL，IL3 5ng/ml，地塞米松2μM和甜菜碱1μM)中培养14天。

通过流式细胞术监测红细胞分化过程中的GFP表达。

获得的结果如图4所示。

可以看出，通过向AAV递送的供体DNA捕获添加同源臂，靶整合效率极大提高。

实施例5：每个gRNA的靶向活性对K562中HBA产生的影响

为了评估在没有供体DNA整合的情况下Cas9/gRNA诱导的DNA双链断裂是否可以影响HBA表达，我们转染了Cas9-K562中的候选gRNA，并通过Western blot监测了HBA的表达或通过FACS检测HbF(胎儿血红蛋白，由2个HBA和2条HBG链组成)的表达。

首先，使用带有SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit的NucleofectorAmaxa 4D(Lonza)，用200ng含gRNA的载体转染2.5x10⁵个K562-Cas9细胞。基因组编辑效率通过PCR产物的TIDE分析来测量。

核转染后一周，使用Cytofix/Cytoperm^TM(BD Bioscience)固定并透化细胞，并通过流式细胞仪(APC小鼠抗人类胎儿血红蛋白CLONE2D12，BD Bioscience)监测HbF表达。

获得的结果显示在图5的上部。

HBA基因特异性位点的基因组编辑效率在每个直方图的上方表示为已编辑等位基因(InDel)的百分比。

此外，在补充有Complete^TM、蛋白酶抑制剂(罗氏)的RIPA缓冲液(50mM的Tris-HClpH 7.4、150mM的NaCl，1％的Triton x-100、1％的脱氧胆酸钠，0.1％的SDS)中溶解上百万个被核感染的细胞。

细胞裂解物通过BCA蛋白测定(Thermofisher)进行定量。在1x还原剂和上样染料(Invitrogen)存在下，将样品在90℃下变性5分钟。200V下，使用Bolt Bis-Tris 4-12％Plus Gel(Invitrogen)在MES1x(Invitrogen)中运行30ug总蛋白；通过IBlot2系统(Invitrogen)将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用Odyssey TBS封闭缓冲液(Li-Cor)封闭2小时后，将膜与抗α球蛋白(山羊抗血红蛋白α抗体D-16，圣克鲁斯)和β圣微管蛋白(兔多克隆抗体，Li-Cor)的一抗孵育，并在TBS-0,1％Tween20中洗涤。使用物种特异性的二抗(比例为1：10000)(驴抗兔IrDye 800和鼠抗兔IrDye 680，Li-Cor)。使用Odyssey红外成像系统获取数据，并使用Image Studio Lite分析。

获得的结果显示在图5的中部。

在泳道下方，HBA基因特异性位点的基因编辑效率以编辑的等位基因(InDel)的百分比表示。

尽管我们获得了高水平的gRNA诱导的基因组双链断裂(InDel百分比)，但未检测到对HBB或HbF表达的影响，表明Cas9诱导的DSB不会影响/减少α-球蛋白链的内源性表达。

在此实施例中，使用的gRNA如下：

-对于5'UTR，gRNA具有序列SEQ ID NO：12；

-对于KO，gRNA具有序列SEQ ID NO：14；

-对于IVS1，gRNA具有序列SEQ ID NO：32；和

-对于IVS2，gRNA具有序列SEQ ID NO：38。

UT是对照细胞(未转染)。

此外，将运动的外周血HSPC解冻并在预刺激培养基中培养48小时(StemSpan，StemCell technologies；rhSCF 300ng/ml，Flt3-L 300ng/ml，rhTPO 100ng/ml和IL-3 20ng/mL，CellGenix)。按照制造商的说明对特异性crRNA和支架tracrRNA(Integrated DNATechnologies)进行退火，并用30pmol的spCas9形成核糖核蛋白复合物(比率1：1.5)。使用P3原代细胞4D-Nucleofector试剂盒(Lonza)，用RNP复合物对2×10⁵个细胞进行核转染，并在类红细胞分化培养基(StemSpan，Stem Cell Technologies；SCF 20ng/ml，Epo 1μ/mL，IL3 5ng/ml，地塞米松2μM和甜菜碱1μM)。使用Cytofix/Cytoperm^TM(BD Bioscience)固定和透化细胞，并通过流式细胞仪(APC小鼠抗人类胎儿血红蛋白CLONE 2D12)监测HbF表达。

获得的结果显示在图5的下部。

HBA基因特异性位点的基因组编辑效率在图表上方以编辑的等位基因的百分比(InDel)表示。

在这里，虽然我们获得了高水平的gRNA诱导的基因组双链断裂(InDel百分比)，但未检测到对HBB或HbF表达的影响，这表明由我们的HBA gRNA候选物诱导的DSB不会影响/减少人HSPC衍生的红细胞中α-球蛋白链的内源性表达。

实施例6：本发明整合的靶向位点不会严重影响HSPC衍生的成红细胞中的HBA或HBB合成

运动的外周血HSPC已用靶向HBA或HBB基因中不同特异性位点(5'UTR、第二内含子(IVS2)或第一外显子(KO))的gRNA进行核转染，并向红细胞谱系分化以激活球蛋白表达。

用于靶向HBB中第一外显子的gRNA(HBB KO)具有部分序列CTTGCCCCACAGGGCAGTAA(SEQ ID NO：65)和完整序列CTTGCCCCACAGGGCAGTAACGG(SEQ ID NO：66)。

用于靶向AAVS1基因(AAVS1)的gRNA具有部分序列gtcccctccaccccacagtg(SEQ IDNO：67)和完整序列gtcccctccaccccacagtgGGG(SEQ ID NO：68)。

用于靶向HBA1/2(HBA KO)中第一外显子的gRNA是名为HBA16.1的gRNA，具有部分序列GTCGGCAGGAGACAGCACCA(SEQ ID NO：13)和完整序列GTCGGCAGGAGACAGCACCATGG(SEQID NO：14)

尤其是，将运动的外周血HSPC解冻并在预刺激培养基中培养48小时(StemSpan，Stem Cell technologies；rhSCF 300ng/ml，Flt3-L 300ng/ml，rhTPO 100ng/ml和IL-320ng/mL，CellGenix)。按照制造商的说明对具体的crRNA和支架tracrRNA(Integrated DNATechnologies)进行退火，并用30pmol的spCas9形成核糖核蛋白复合物(比率1：1.5)。

使用P3原代细胞4D-Nucleofector试剂盒(Lonza)，用Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物对2.10⁵个细胞进行核转染，并在红细胞分化培养基(StemSpan，Stem CellTechnologies；SCF 20ng/ml，Epo 1μg/mL，IL3 5ng/ml，地塞米松2μM和甜菜碱1μM)或在半固体Methocult培养基(H4435，StemCell Technologies)中放置14天，用于集落形成细胞(CFC)测定。

然后将分化的HSPC衍生的成红细胞在水中裂解，并通过色谱法测量血红蛋白亚基的含量。

使用NexeraX2 SIL-30AC色谱仪(Shimadzu，Kyoto，日本)进行高效液相色谱(HPLC)分析，并使用LC Solution软件进行分析。

球蛋白链使用250x4.6 mm，3.6μm Aeris Widepore色谱柱(Phenomenex)进行分离。用溶液A(水/乙腈/三氟乙酸，95：5：0.1)和溶液B(水/乙腈/三氟乙酸，5：95：0.1)的梯度混合物洗脱样品，监测220nm处的吸光度。

获得的结果如图6所示。

如通过HPLC定量分析液体培养物和红色菌落中血红蛋白亚基，使用RNP核转染，发明人证明编辑本发明中考虑的HBA和HBB的特异性区域不会显著改变HSPC衍生的成红细胞中的HBA或HBB合成。相反，当靶向这些基因的编码序列时，观察到主要变化(HBA KO和HBBKO对照)。

实施例7：供体DNA在HBA中的靶向整合允许稳定表达FVIII或FIX转基因

将不同的转基因整合到HBA基因中，并分泌利用内源性α-球蛋白启动子转录调控的功能性凝血因子。

实验上，用含有无启动子的FIX或密码子优化的因子VIII(F8)转基因的IDLV转导K562-Cas9细胞。这些IDLV在靶标整合时表达。

24小时后，用表达gRNA的质粒转染细胞，以在HBA位点的5'UTR处产生双链断裂。选择具有单等位基因靶向整合FVIII或FIX表达盒的单细胞克隆，通过活化的部分凝血活酶时间测定(aPTT)来测量细胞上清液中分泌的FVIII和FIX的活性。

使用未转导细胞的上清液作为对照(CTRL)，进行了类似的测量。

获得的结果如图7所示。

本发明使得在目标细胞的球蛋白基因靶向整合时稳定表达不同的转基因，在本例中为FVIII和FIX。

序列表

Claims

1.一种基因修饰的造血干细胞，在其基因组中包含的至少一个球蛋白基因中包含至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因，所述转基因处于所述至少一个球蛋白基因的内源性启动子的调控之下，

所述至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因包含在所述至少一个球蛋白基因的5'区、3'非翻译区域(3'UTR)和/或内含子中。

2.根据权利要求1所述的造血干细胞，其中所述至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因包含在所述至少一个球蛋白基因的5'区和/或第二内含子(IVS2)中。

3.根据权利要求1或2所述的造血干细胞，其中所述至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因包含在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)中和/或近端启动子和/或第二内含子(IVS2)中，优选包含在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)或近端启动子中或第二内含子(IVS2)中。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的造血干细胞，其中所述造血干细胞的基因组中包含的至少一个球蛋白基因选自ε球蛋白基因、γG球蛋白基因、γA球蛋白基因、δ球蛋白基因、β球蛋白基因、ζ球蛋白基因、伪ζ球蛋白基因、μ球蛋白基因、伪α-1球蛋白基因、α1球蛋白基因和α2球蛋白基因，尤其选自γG球蛋白基因、γA球蛋白基因、δ球蛋白基因、β球蛋白基因、α1球蛋白基因和α2球蛋白基因，更具体地选自α1球蛋白基因和α2蛋球蛋白基因。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的造血干细胞，其中：

-所述造血干细胞的基因组中包含的至少一个球蛋白基因是α1球蛋白基因和/或α2球蛋白基因，尤其是α1球蛋白基因和α2球蛋白基因；所述至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因包含在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)或内含子中，尤其是5'非翻译区(5'UTR)或第二内含子(IVS2)中；和/或

-所述造血干细胞的基因组中包含的至少一个球蛋白基因是β球蛋白基因，并且至少一个编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因包含在所述至少一个球蛋白基因的近端启动子或第二内含子(IVS2)中。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的造血干细胞，其中所述编码的治疗性蛋白选自细胞因子，尤其是干扰素，更具体是干扰素-α、干扰素-β或干扰素-π；激素；趋化因子；抗体(包括纳米抗体)；抗血管生成因子；用于替代疗法的酶，例如腺苷脱氨酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-L-异戊糖苷酶和β-葡萄糖苷酶；白介素；胰岛素；G-CSF；GM-CSF；hPG-CSF；M-CSF；凝血因子，例如凝血因子VIII、凝血因子IX或tPA；跨膜蛋白，例如神经生长因子受体(NGFR)；溶酶体酶，例如α-半乳糖苷酶(GLA)、α-L-异戊糖苷酶(IDUA)、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)和半乳糖胺(N-乙酰基)-6硫酸酯酶(GALNS)；可以被工程化以被非修饰的细胞分泌并最终被其摄取的任何蛋白及其组合，并且优选为凝血因子，更优选为因子VIII；或溶酶体酶，尤其是溶酶体酸性脂肪酶(LAL)或半乳糖胺(N-乙酰基)-6硫酸酯酶(GALNS)。

7.一种血细胞，其源自权利要求1至6中任一项的基因修饰的造血干细胞。

8.一种药物组合物，其在药学上可接受的介质中包含至少一个根据权利要求1至6中任一项所述的基因修饰的造血干细胞和/或至少一个根据权利要求7所述的血细胞。

9.一种离体或体外制备，尤其是离体或体外制备根据权利要求1至6中任一项所述的造血干细胞的方法，其包括以下步骤：

(i)通过以下向所述干细胞提供定点基因工程化系统：

(A)向所述干细胞提供(1)与所选靶位点结合的至少一个向导核酸，或(2)与所选靶位点结合的含向导肽的核酸内切酶，所述靶位点位于所述造血干细胞的基因组中包含的编码球蛋白的内源基因。

和

(ii)培养在步骤(i)中获得的干细胞，使得将所述转基因引入所述造血干细胞基因组中的所述选定的靶位点，

所述靶位点优选位于所述至少一个球蛋白基因的5'区和/或内含子中，尤其是在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区域(5'UTR)中和/或在近端启动子和/或在内含子中，优选在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)中和/或在近端启动子中和/或在第二内含子(IVS2)中，尤其是包含在所述至少一个球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)或近端启动子或第二内含子(IVS2)中。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)通过以下向所述干细胞提供定点基因工程化系统：

和

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述至少一个无靶位点特异性的核酸内切酶是簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸酶，尤其是CRISPR相关蛋白9(Cas9)。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述一个或多个向导核酸是向导RNA，其识别包含在所述至少一个球蛋白基因的5'区和/或内含子中的靶位点，尤其在5'非翻译区(5'UTR)和/或在近端启动子和/或内含子中，优选在5'非翻译区(5'UTR)和/或近端启动子和/或第二内含子(IVS2)中，尤其包含在造血干细胞基因组中包含的至少一个α球蛋白基因的5'非翻译区(5'UTR)或第二内含子(IVS2)中。

13.根据权利要求1至6中任一项所述的造血干细、根据权利要求7所述的血细胞或根据权利要求8所述的药物组合物作为药物的用途。

14.根据权利要求1至6中任一项所述的造血干细胞、根据权利要求7所述的血细胞或根据权利要求8所述的药物组合物在有其需求个体中治疗以下疾病中的用途：

-选自自身免疫性疾病、病毒感染和肿瘤的疾病；和/或

-由于缺乏蛋白或存在异常的无功能蛋白而引起的疾病。

15.根据权利要求1至6中任一项的造血干细胞、根据权利要求7的血细胞或根据权利要求8的药物组合物用于诱导有需要的个体的免疫耐受性的用途。