CN111867678A - 治疗黑色素瘤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及预防和/或治疗黑色素瘤(例如浅表扩散性黑色素瘤，结节性黑色素瘤，恶性雀斑样痣黑色素瘤，和肢端雀斑痣性黑色素瘤)的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的达泮舒腈。该方法任选地包括将抗PD‑1抗体与达泮舒腈共同施用。优选的施用途径是口服施用。

Description

治疗黑色素瘤的方法

发明领域

本发明涉及通过施用有效量的达泮舒腈(dapansutrile)以治疗黑色素瘤的方法。

发明背景

肿瘤发生由基因组的改变引发，包括点突变，基因缺失，导致细胞转化的染色体重排，自足性(self-sufficient)增殖，对抗增殖信号的不敏感性，规避细胞凋亡和无限的复制潜力，最终导致组织浸润和转移。但是，肿瘤细胞的扩增(expansion)与涉及癌细胞和非癌细胞这两者的事件的复杂网络有关。慢性炎症是这种促进病症的典型例子(1，2)。

促炎性细胞因子IL-1β是许多慢性炎症性疾病的强力介导物(3)。同癌症与慢性炎症的联系一致，已证明IL-1β在数种肿瘤中过表达，并起到肿瘤促进机制(包括血管生成，免疫抑制，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的募集(recruitment)，和转移)的诱导物的作用(4-6)。

当未修复的脱氧核糖核酸(“DNA”)对皮肤细胞的损伤触发突变而导致皮肤细胞增殖时，就会发展出黑色素瘤，最终形成恶性肿瘤。这些肿瘤来源于位于表皮基底层内的黑色素细胞。黑色素瘤通常由紫外线(UV)暴露引起，并且是导致美国每年超过70,000人死亡的原因。

黑色素瘤有四种类型：浅表扩散性黑色素瘤，恶性雀斑样痣黑色素瘤，肢端雀斑痣性黑色素瘤，和结节性黑色素瘤。浅表扩散性黑色素瘤最常见，并沿着皮肤顶层生长，然后更深入地穿透入皮肤。恶性雀斑样痣黑色素瘤与浅表扩散性黑色素瘤相似，并且最常见于老年人，发生于长期暴露在阳光下的受损的皮肤。与浅表扩散性黑色素瘤和恶性雀斑样痣黑色素瘤相比，肢端雀斑痣性黑色素瘤也在更深入地穿透之前在浅表扩散，并且倾向于更频繁地进展为恶性肿瘤。初诊时，结节性黑色素瘤最经常为浸润性。

黑色素瘤按阶段划分，指的是厚度，穿透深度，以及黑色素瘤已经扩散的程度。早期黑色素瘤(0期和I期)通常是局部的。0期肿瘤通常为非浸润性，并且往往未穿透到表皮下。I期肿瘤往往侵入真皮，体积小，转移风险低。II期肿瘤是局部的，体积更大，并且转移风险高。一旦黑色素瘤肿瘤已发生转移，则根据转移程度将其划分为III期或IV期黑色素瘤。

NLRP3(NOD样受体家族，含热蛋白(pyrin)结构域3)，也称为NALP3或隐热蛋白(cryopyrin)，是炎症小体的传感器之一，所述炎症小体是一种参与白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18加工的大分子结构。NLRP3在胞内感染(细菌和病毒蛋白)或组织损伤(局部缺血)期间感知胞内危险。NLRP3的激活导致ASC(含羧基末端胱天蛋白酶募集域的凋亡相关斑点样蛋白)和胱天蛋白酶-1的募集，导致炎症小体形成并最终导致细胞死亡。

对治疗黑色素瘤的方法存在需求。该方法应该有效并且没有明显的副作用。

附图简要说明

图1A-1E示出了OLT1177^TM(达泮舒腈)减小肿瘤体积和与黑色素瘤相关的炎症。(1A)用标准或OLT1177^TM饮食饲喂的小鼠的肿瘤大小(N＝15)。(1B)用标准或OLT1177^TM饮食饲喂的荷瘤(tumor-bearing)小鼠中血浆IL-6的平均值±SEM(每组N＝6)。(1C)用标准或OLT1177^TM饮食饲喂的小鼠的血浆中G-CSF的平均值±SEM(每组N＝4-5)。(1D)对来自用标准或OLT1177^TM饮食饲喂的小鼠的脾源性(spleen-derived)细胞的L-22进行胞内细胞因子染色。(1E)对来自用标准或OLT1177^TM饮食饲喂的小鼠的脾源性细胞的IL-17进行胞内细胞因子染色。**p＜0.01，*p＜0.05。

图2A-2C显示达泮舒腈减退内皮功能和血管生成。(2A)用标准或OLT1177^TM饮食饲喂的荷瘤小鼠中血浆VEGF的平均值±SEM(每组N＝4-5)。(2B)针对血管性血友病因子(VonWillebrand Factor)进行了染色的基质胶塞(matrigel plug)中内皮细胞激活的代表性图像(以箭头表示)，反映了用标准或OLT1177^TM饮食饲喂的小鼠新血管的形成(每张图片代表一只小鼠)。(2C)在存在和不存在OLT1177^TM的情况下，用黑色素瘤条件培养基(MCM)刺激后，HUVEC的管状结构的平均值±SEM。*p＜0.05。

图3A-3B示出了达泮舒腈减少肺和肝中的组织浸润和转移。(3A)接受标准或OLT1177^TM饮食的荷瘤小鼠肺中B16F10-GFP⁺细胞计数/视野面积(全芯片(chip)视野)的平均值±SEM，由不知情的显微镜工作者进行评估(每组N＝3)。****p＜0.0001，**p＜0.01，*p＜0.05。(3B)接受标准或OLT1177^TM饮食的荷瘤小鼠肝中盲法(blinded)GFP⁺细胞计数的平均值±SEM(每组N＝3)。****p＜0.0001。

图4A-4F示出了达泮舒腈减少MDSC的扩增。与标准(Standard)或OLT1177^TM饮食饲喂的荷瘤小鼠相比，非荷瘤小鼠(无肿瘤)中PMN-MDSC(CD11b⁺Ly6G⁺Ly6C^lo)的(4A)骨髓，(4B)脾脏，和(4C)淋巴结水平。与接受标准(Standard)或OLT1177^TM饮食的荷瘤小鼠相比，非荷瘤小鼠(无肿瘤)中M-MDSC(CD11b⁺Ly6G^-Ly6C^hi)的(4D)骨髓，(4E)脾脏，和(4F)淋巴结水平。数据表示为非荷瘤小鼠(无肿瘤)中设置为100的MDSC变化百分比。(每组N＝8-10)。***p＜0.001，*p＜0.05。

图5A-5D示出了达泮舒腈增强抗PD-1阻断的疗效。(5A)载剂(vehicle)，抗PD-1，和抗PD-1+OLT1177^TM饮食治疗的荷瘤小鼠的肿瘤大小(N＝13)。(5B)A所示的荷瘤小鼠中血浆IL-6的平均值±SEM(N＝8-9)。(5C)A所示的荷瘤小鼠中MPO的全血裂解液的平均值±SEM(N＝11)。(5D)A所示的小鼠中原发性肿瘤中的NK T细胞(CD3⁺CD8-CD161⁺CD335⁺)浸润。****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05。

发明详述

NLRP3炎症小体的激活会放大对组织损伤的炎症应答，并介导进一步的损害。达泮舒腈是一种选择性的NLRP3炎症小体抑制剂。达泮舒腈通过阻止NLRP3炎症小体的激活来减少炎症。达泮舒腈在体外抑制小鼠和人细胞中成熟IL-1β和IL-18的产生。通过这种作用机制，达泮舒腈阻止动物和人类受试者中IL-1β的产生和/或释放，并抑制NLRP3炎症小体的形成。

发明人发现，通过阻止IL-1β的产生，达泮舒腈提供以下效果：减少血管生成，减少IL-1依赖性血管内皮生长因子(VEGF)的产生，限制骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)的生成，阻止IL-8水平升高，抑制内皮前体细胞迁移入肿瘤，降低IL-6和其他基质因子的水平，减少中性粒细胞在肿瘤部位的积累，减少生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，FGF，和IL-1)的产生，，减少基质金属蛋白酶(MMP)的表达和环氧酶的产生。通过减少IL-1β的产生，达泮舒腈减少由IL-1诱导的影响。

MDSC是来自髓系(源于骨髓干细胞的细胞族)的免疫细胞的异质性群体。由于造血功能改变，MDSC在例如慢性感染和癌症等病理情况下迅速扩增。MDSC与其他髓样细胞类型有所区别，后者具有强免疫抑制活性而非免疫刺激特性。髓样来源的细胞(MDSC)的扩增通常与慢性炎症有关(10，11)，并且已证实MDSC在癌症介导的免疫抑制中起主要作用(12)。在黑色素瘤患者中，与具有较少数量MDSC(PMN-和M-MDSC)细胞的受试者相比，高水平的MDSC(PMN-和M-MDSC)与阶段，转移和不良预后相关(13)。

发明人已经证明，与在无肿瘤的野生型中观察到的那些相比，达泮舒腈减少小鼠中黑色素瘤的肿瘤体积，并且维持具有黑色素瘤的小鼠中的MDSC水平。发生这种情况的原因是达泮舒腈阻止MDSC扩增并恢复这些细胞的生理水平。

发明人已经证明，与标准饮食饲喂的荷瘤小鼠相比，以富含达泮舒腈的饮食饲喂的黑色素瘤荷瘤小鼠显示出IL-6，G-CSF，和VEGF的降低的循环水平。

转移的机制涉及从原发性肿瘤部位脱离，内渗进入循环，在循环中存活，从循环外渗，在继发性部位(secondary site)附着，以及继发性肿瘤部位发展的复杂的多步骤过程，每个过程都涉及由IL-1β诱导的介导物(23，24)。发明人已经证明，用达泮舒腈治疗的荷瘤小鼠在肺和肝中均显示出减少的转移。

血管生成是肿瘤生长的标志，与大量浸润性免疫细胞以及促血管生成因子(如VEGF)的诱导有关，从而将慢性炎症与血管生成联系起来。发明人已经证明达泮舒腈减少与血管生成相关的炎症事件，降低循环VEGF血浆水平，并减少肿瘤血管生成。

免疫疗法在黑色素瘤晚期的治疗中已取得重大进展，并正在成为标准治疗(standard of care)。抗PD-1(纳武单抗(nivolumab))和CTLA-4(伊匹单抗(ipilimumab))的联合免疫疗法可导致肿瘤退化，响应率超过50％(7)。然而，免疫疗法通常与毒性相关，例如免疫疗法相关的不良反应(irAE)(8)，并且无响应者和复发病例的数量仍然是黑色素瘤治疗中的重要且未得到满足的临床需求。发明人已经证明，与抗PD-1单一疗法相比，抗PD-1抗体和达泮舒腈的联合疗法在减少肿瘤生长方面提供增强的疗效。

发明人认为，达泮舒腈通过阻断NLRP3炎症小体的组装并阻止IL-1β的产生和/或释放而有效地预防黑色素瘤生长。通过阻止黑色素瘤细胞中的IL-1β加工，达泮舒腈为黑色素瘤和耐受免疫疗法(immunotherapy-resistant)的癌症提供了一种新疗法。达泮舒腈减少许多癌症标志：肿瘤生长，免疫抑制，炎症，转移，以及血管生成，因此它提供了一种新的癌症疗法。

本发明涉及治疗黑色素瘤的方法，例如浅表扩散性黑色素瘤，结节性黑色素瘤，恶性雀斑样痣黑色素瘤，和肢端雀斑痣性黑色素瘤。

化合物

本发明使用达泮舒腈(3-甲磺酰基-丙腈)的纯化化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

达泮舒腈是β-磺酰基腈的合成小分子，已被证明可以选择性地抑制NLRP3炎症小体，并在口服施用给健康受试者时是安全的(9)。

如本文所用，“药学上可接受的盐”是保留母体化合物的所希望的生物学活性并且不赋予不希望的毒理学效应的盐。药学上可接受的盐的形式包括不同盐的多种结晶多晶型物以及无定形形式。药学上可接受的盐可以与金属或有机抗衡离子形成，并且包括但不限于碱金属盐，例如钠或钾；碱土金属盐，例如镁或钙；以及铵或四烷基铵盐，即NX₄+(其中X为C_1-4)。

如本文所用，“溶剂化物”是其中化合物与可接受的共溶剂以某个固定比例组合的加成络合物。共溶剂包括但不限于水，乙酸，乙醇，和其他合适的有机溶剂。

药学组合物

药学组合物中的活性化合物达泮舒腈，或其药学上可接受的盐或溶剂化物通常的量对于可注射制剂为约0.1-5％，对于片剂制剂为约1-90％，对于胶囊制剂为约1-100％，对于外用(topical)制剂为约0.01-20％，0.05-20％，0.1-20％，0.2-15％，0.5-10％，或1-5％(w/w)，并且对于贴剂制剂为约0.1-5％。

如在本申请中使用的“约”是指所述值的±10％。

作为非活性成分的药学上可接受的载体可以由本领域技术人员使用常规标准选择。药学上可接受的载体包括但不限于非水基溶液，悬浮液，乳剂，微乳剂，胶束溶液，凝胶，和软膏(ointment)。药学上可接受的载体还可以包含成分，包括但不限于盐水和电解质水溶液；离子和非离子渗透剂，例如氯化钠，氯化钾，甘油，和葡萄糖；pH调节剂和缓冲剂，例如氢氧化物，磷酸酯，柠檬酸酯，乙酸酯，硼酸酯的盐；和三乙醇胺；抗氧化剂，例如亚硫酸氢盐(bisulfite)，亚硫酸盐，偏亚硫酸氢盐，硫代亚硫酸盐，抗坏血酸，乙酰半胱氨酸，半胱氨酸，谷胱甘肽，丁基化羟基茴香醚，丁基化羟基甲苯，生育酚，和抗坏血酸棕榈酸酯的盐，酸和/或碱；表面活性剂，例如卵磷脂，磷脂，包括但不限于磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇；泊洛沙姆和泊洛沙明；聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯60，和聚山梨醇酯20，聚醚，例如聚乙二醇和聚丙二醇；聚乙烯，例如聚乙烯醇和聚维酮；纤维素衍生物，例如甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素及其盐；石油衍生物，例如矿物油和白凡士林；脂肪，例如羊毛脂，花生油，棕榈油，大豆油；甘油单，双，和三酯；丙烯酸的聚合物，例如羧基聚亚甲基凝胶，和疏水改性的交联丙烯酸酯共聚物；多糖，例如葡聚糖，和糖胺聚糖(glycosaminoglycan)，如透明质酸钠。可以使用众所周知的防腐剂保存此类药学上可接受的载体以防止细菌污染，这些防腐剂包括但不限于苯扎氯铵(benzalkonium chloride)，乙二胺四乙酸及其盐，苄索氯铵，氯己定(chlorhexidine)，氯代丁醇，对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben)，硫柳汞(thimerosal)，和苯乙醇，或可以配制成单次或多次使用的非防腐(non-preserved)的制剂。

例如，达泮舒腈的片剂或胶囊制剂可包含其他赋形剂，所述赋形剂不具有生物活性且不与活性化合物反应。片剂的赋形剂可包括填充剂，粘合剂，润滑剂和助流剂，崩解剂，湿润剂，和释放速率调节剂。粘合剂促进制剂颗粒的粘附，并且对于片剂制剂是重要的。粘合剂的实例包括但不限于羧甲基纤维素，纤维素，乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，甲基纤维素，卡拉胶，淀粉，淀粉，和黄芪胶，聚丙烯酸，和聚乙烯吡咯烷酮。

例如，达泮舒腈的贴剂制剂可以包含一些非活性成分，例如1，3-丁二醇，氨基乙酸二羟基铝(dihydroxyaluminum aminoacetate)，乙二胺四乙酸二钠，D-山梨醇，明胶，高岭土，对羟基苯甲酸甲酯，聚山梨醇酯80，聚维酮，丙二醇，对羟基苯甲酸丙酯，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸钠，酒石酸，二氧化钛，和纯净水。贴剂制剂还可以包含皮肤渗透性增强剂，例如乳酸酯(例如乳酸月桂酯)或二乙二醇单乙醚。

包括达泮舒腈的外用制剂的形式可以是凝胶，乳膏，洗剂，液体，乳剂，软膏，喷雾剂，溶液，和悬浮液。外用制剂中的非活性成分例如包括但不限于乳酸月桂酯(润肤剂/渗透促进剂)，二乙二醇单乙醚(润肤剂/渗透促进剂)，DMSO(溶解度增强剂)，有机硅弹性体(流变/质地改性剂)，辛酸/癸酸甘油三酸酯，(润肤剂)，辛酸盐，(润肤剂/紫外线过滤剂)，硅油(润肤剂/稀释剂)，角鲨烯(润肤剂)，向日葵油(润肤剂)，和二氧化硅氧烷(siliconedioxide)(增稠剂)。在一个实施方式中，外用凝胶制剂中包括二乙二醇单乙醚。

使用方法

通过抑制NLRP3炎症小体的组装，达泮舒腈阻止促炎性细胞因子IL-1β和IL-22的产生和/或释放，并最终减少小鼠中黑色素瘤的生长。

此外，达泮舒腈抑制IL-1β和IL-18的加工和释放，但不抑制IL-1β前体和其他炎症小体组分(包括NLRP3和ASC)的合成。达泮舒腈还抑制胱天蛋白酶-1的激活。此外，达泮舒腈通过不抑制其他炎症小体，如NLRC4和AIM2，构成性细胞因子(constitutive cytokine)，和防止细胞死亡来维持机体的免疫监视。

本发明涉及预防和/或治疗黑色素瘤的方法，例如浅表扩散性黑色素瘤，结节性黑色素瘤，恶性雀斑样痣黑色素瘤，和肢端雀斑痣性黑色素瘤。以上类型的黑色素瘤有一种炎症组分，该炎症组分是疾病的起因或一种事件的结果。该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的达泮舒腈的步骤。如本文所用，“有效量”是通过改善(ameliorating)病理状况，和/或减轻，改善，和/或消除疾病症状而能有效治疗疾病的量。例如，有效量是减少黑色素瘤生长(减少肿瘤大小)的量。

免疫疗法显著改善了黑色素瘤患者的标准治疗；然而，无响应者，和复发患者的数量仍然很高。因此，提高检查点抑制剂疗效的联合疗法代表了重要的临床益处。在一个实施方式中，本发明涉及一种通过结合达泮舒腈和检查点抑制剂(例如抗PD-1抗体)以治疗黑色素瘤的联合疗法。该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的达泮舒腈和有效量的抗PD-1抗体。达泮舒腈和抗PD-1抗体可以同时或依次施用。联合施用达泮舒腈与抗PD-1抗体是有利的，因为达泮舒腈提高抗PD-1的疗效，而且达泮舒腈具有安全的药物特性。联合施用还可以减少所需的抗PD-1抗体剂量，从而减少与免疫疗法相关的不良反应。

达泮舒腈和抗PD-1的联合治疗可同时抑制肿瘤诱导的免疫抑制并提高T细胞活性。此外，炎性细胞因子(如IL-6)的增加与irAE的病理生理学有关。达泮舒腈增强抗PD-1的效果，并进一步降低IL-6(一种黑色素瘤预后不良的标志物)的循环水平。联合疗法还可以增强肿瘤特异性Th1响应，这表明较少的肿瘤诱导的免疫抑制和更多的T细胞激活导致更强的抗肿瘤响应。因此，在抗PD-1的基础上加用达泮舒腈的治疗增强了单一疗法的效果，为耐受疗法的癌症创造了另一种选择。

本发明的药学组合物可以通过全身施用或局部施用来应用。全身施用包括，但不限于口服，肠胃外(例如静脉内，肌内，皮下，或直肠)，以及吸入施用。在全身施用中，活性化合物首先到达血浆，然后分布到目标组织中。口服施用是本发明的优选施用途径。局部施用(local administration)包括外用施用(topical administration)。

组合物的剂量可以根据受试者的黑色素瘤的程度和每个患者的个体响应而变化。对于全身施用，所递送的活性化合物的血浆浓度可以变化；但通常为1x10^-10-1x10^-4摩尔/升，优选为1x1^-8-1x10^-5摩尔/升。

在一个实施方式中，将药学组合物口服施用于受试者。口服施用剂量通常为0.1-100，0.1-20，或1-100mg/kg/天，取决于受试者的年龄和状况。例如，对于人类受试者，口服施用的剂量为0.1-10，0.5-10，1-10，1-5，5-50，或5-100mg/kg/天。在一个实施方式中，将活性化合物以10-100，10-500，20-2000，50-2000，或100-2500mg/剂的量口服施用于人类受试者，每天1-4次，取决于受试者的年龄和状况。

在一个实施方式中，将药学组合物静脉内施用于受试者。静脉内推注或静脉内输注的剂量通常为0.03至5或0.03至1mg/kg/天。

在一个实施方式中，将药学组合物皮下施用于受试者。皮下施用的剂量通常为0.3-20，0.3-3，或0.1-1mg/kg/天。

在一个实施方式中，外用(topically)施用组合物。外用施用该组合物至少一天1或2次，或每天3至4次，取决于医学问题和疾病病理学。一般而言，外用组合物包含约0.01-20％，或0.05-20％，或0.1-20％，或0.2-15％，0.5-10，或1-5％(w/w)的活性化合物。通常，每剂向个体施用0.2-10mL外用组合物。

本领域技术人员将认识到，多种多样的递送机制同样适用于本发明。

本发明可用于治疗哺乳动物受试者，例如人，马，狗，和猫。本发明在治疗人类时特别有用。

下列实施例进一步说明本发明。这些实施例仅旨在说明本发明，而不应理解为是限制性的。

实施例

在下面描述的实验中使用以下方案。

缩写。IL-1β(白细胞介素1β)，IL-6(白细胞介素6)，G-CSF(粒细胞集落刺激因子)，VEGF(血管内皮生长因子)，IL-22(白细胞介素22)，IL-17(白细胞介素17)，PMN-MDSC(多形核MDSC)，M-MDSC(单核MDSC)，PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)，MCM(黑色素瘤条件培养基)，HUVEC(人脐静脉内皮细胞)，PBMC(外周血单核细胞)，VWF(血管性血友病因子)。

细胞培养。在RPMI中培养1205Lu人黑色素瘤细胞。各自辅以10％的FBS，100单位/mL青霉素，0.1mg/mL链霉素。将细胞于37℃保持在湿化的5％CO₂环境中。在24孔板中将人转移性黑色素瘤细胞系1205Lu以2.5x10⁵/孔接种入RPMI，并使其黏附过夜。第二天，将培养基替换为新鲜的RPMI 10％FBS(含或不含OLT1177T^M(达泮舒腈))。使用IL-1α(20ng/ml)以诱导细胞因子的产生。在进行刺激之前30分钟加入OLT1177^TM。在24小时的非刺激和刺激条件下收集上清液。

1205Lu NLRP3 siRNA。1205Lu细胞(2x10⁵)与标靶NLRP3的siRNA或加扰(scrambled)siRNA一起孵育以用于非特异性基因沉默(SantaCruz生物技术)。根据制造商的说明书，使用siRNA转染介质进行siRNA双链体(2nM)的转染。24小时后，将介质替换为RPMI 10％FBS(500μl)，并将细胞再另外孵育24小时。收集上清液以通过ELISA测量IL-1β水平。在细胞裂解液中用免疫印迹法(Westem blotting)测定NLRP3沉默的效果。

细胞因子测量。根据制造商的说明书(DuoSet，R&D系统，明尼阿波利斯，MN)，通过特异性ELISA测量上清液和细胞裂解液中的细胞因子。

黑色素瘤条件培养基实验。根据COMIRB，从同意的健康供体中分离出PBMC，并以每孔(5x10⁵)接种入96孔板。然后将来自经OLT1177^TM治疗的1205Lu细胞的上清液添加到PBMC(1∶2)中，并将细胞孵育72小时。将NLRP3缺陷型THP-1细胞(1x10⁵)全部接种在96孔板中，并用10ug/mL的LPS激活3小时。然后将MCM(1∶2)添加到孔中作为刺激。将细胞孵育3天，并测定上清液的细胞因子分泌。

血管生成实验(HUVEC)。将HUVEC细胞接种在没有生长因子的培养基上过夜。在24孔板中将细胞以每孔8×10⁴个细胞平板接种到Matrigel(Corning)包覆的孔上。然后将细胞在HUVEC完全培养基(对照)，MCM或用OLT1177^TM治疗了1205Lu细胞的MCM的存在下孵育5小时。添加MCM且不稀释。然后除去培养基，基质胶保留在PFA4％中。以40倍拍摄图片，并使用交叉法(cross method)对分支点进行计数。

联合疗法模型。如所述注射B16F10细胞。滴注Matrigel塞(plug)四天后，开始以OLT1177^TM饮食饲喂小鼠，或继续以标准饮食饲喂，在第7天，腹腔注射针对PD-1的中和抗体(200ug/小鼠；BioXCell，West Lebanon，NH)。自B16F10滴注15天后处死小鼠。

肿瘤血管生成模型。在用标准或OLT1177^TM饮食饲喂的小鼠的肩胛间区皮下注射Matrigel和B16F10(2x10⁵)的混合物。植入后7天，移除塞，固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蜡中并切片(4μm)。随后，将切片脱蜡，水合，并用苏木精/曙红染色。于95℃对分开的切片进行15分钟的热诱导的抗原修复(10mM柠檬酸盐0.05％吐温20-pH6.0)。然后将切片置于湿润的玻片室中，在10％正常驴血清(杰克逊免疫学(Jackson Immunologicals))中封闭1小时，并使用针对血管性血友病因子的抗体(1∶100，Millipore-Sigma，Burlington，MA)于4℃进行免疫染色并过夜，以鉴定新血管的形成。在室温下，将抗兔辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗体(1∶100，杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，WestGrove，PA)用作第二抗体，持续2小时。然后按照制造商的说明书(NovaRED底物，Vector实验室，Burlingame，CA)将切片与HRP底物孵育5-10分钟。使用Mayer的苏木精对比染色(counterstaining)(赛默飞世尔科技公司，MA)实现细胞核对比染色。

转移模型。对用标准或OLT1177^TM饮食饲喂的小鼠尾静脉(i.v.)注射B16F10-GFP(1x10⁶)细胞后确定转移的形成。注射前，通过流式细胞仪对B16F10-GFP⁺细胞进行分选，仅对最亮的10％细胞进行注射。自细胞注射21天后处死小鼠，分离肺和肝并准备用于组织学。在先前的分离中，用含0.5％低熔点琼脂糖的溶液使肺膨胀，以避免组织塌陷。通过荧光显微镜检查，在荷瘤小鼠的肺和肝中存在GFP阳性细胞。组织切片用Alexa Fluor共轭WGA染色，用于细胞膜检测，以及用DAPI染色，用于细胞核染色。在整个组织切片上盲目且随机地获取图像，以从每个组织切片获得7-10张图像。在每幅图像中对GFP阳性细胞计数并将结果报告为GFP⁺细胞的数量/视野面积(全芯片视野)。

统计分析。使用Prism 7.0版软件(GraphPad Software，La Jolla，CA，USA)，通过双尾学生t检验对差异的统计显著性进行评估。统计显著性设定为p＜0.05。

实施例1.达泮舒腈减少肿瘤生长和肿瘤诱导的炎症

用标准饮食或含有OLT-1177^TM(达泮舒腈)的饮食(每Kg食物7.5g的剂量)随意饲喂6-8周大的C57BL/6J雄性小鼠(杰克逊实验室)一周，然后在小鼠后肢皮下滴注Matrigel和B16F10细胞(2x10⁵)的混合物。基于7.5g/kg的饲料浓度和4g/天的食物消耗量，该剂量约为100mg/kg/天。肿瘤植入后继续进行这些饮食。塞滴注15天后处死小鼠。接种后15天后评估组织和血浆。

与标准饮食饲喂的小鼠相比，以OLT1177^TM饮食饲喂的荷瘤小鼠显示出减小的肿瘤体积(图1A)。

与非荷瘤小鼠相比，以标准饮食饲喂的荷瘤小鼠表现出显著更高的IL-6血浆水平(图1B)和显著更高的粒细胞集落刺激因子(G-CSF，图1C)血浆水平。以OLT1177^TM饮食饲喂的小鼠中，这些水平显著降低(图1B，1C)。

在体内，与非荷瘤组相比，在荷瘤小鼠中观察到循环IL-6和G-CSF水平的升高，证实了黑色素瘤进展与炎症的关系。用达泮舒腈治疗显著限制了这些炎症介质。与全身炎症减轻一致，OLT1177^TM治疗显示肿瘤体积减少。

与标准饮食饲喂的小鼠相比，脾源性T细胞中的胞内细胞因子染色(ICCS)在OLT1177^TM饮食饲喂的荷瘤小鼠中显示IL-22水平降低(图1D)。没有观察到IL-17的变化(图1E)。

这些数据表明，通过达泮舒腈进行口服治疗可减少肿瘤体积和减轻与黑色素瘤相关的炎症。

实施例2.达泮舒腈减退内皮功能和血管生成

然后我们测定达泮舒腈抑制血管生成的能力，血管生成是肿瘤细胞维持血液供应以滋养不断增长的肿瘤团块的后天(acquired)能力。如上所述，将含有B16F10黑色素瘤细胞的Matrigel塞按饮食注射入小鼠。使内皮细胞浸润7天后，移除塞，并测定血浆VEGF水平。如图2A所示，与标准饮食饲喂的荷瘤小鼠相比，接受OLT1177^TM饮食的小鼠表现出显著更低的循环VEGF水平。

为了进一步研究达泮舒腈在体内对血管生成的抑制作用，收集基质胶塞，并进行血管性血友病因子(VWF)的免疫组织化学以确定新血管的形成。如图2B所示，与标准饮食饲喂的小鼠相比，从饲喂OLT1177^TM的小鼠获得的塞显示出减少的VWF染色的内皮细胞。

使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在体外测定了达泮舒腈对血管生成的影响。与对照条件相比，MCM促进Matrigel上接种的HUVEC中管状结构的形成，模仿体内新血管生成。如通过图2C中减少的分支点数量所示，源自用OLT1177^TM治疗的1205Lu细胞的MCM显著降低了HUVEC取向。这些研究与IL-1β在促进小鼠黑色素瘤模型(包括内皮细胞分支)中的血管生成以及VEGF和VEGF受体表达中的作用相一致。

血管生成是肿瘤生长的标志，与大量浸润性免疫细胞以及促血管生成因子(如VEGF)的诱导有关，从而将慢性炎症与血管生成联系起来。此处示出，与对照细胞相比，用源于达泮舒腈治疗的1205Lu细胞的MCM刺激接种于基质胶上的HUVEC，导致管状结构的数量减少。此外，与标准饮食饲喂的小鼠相比，达泮舒腈饮食饲喂的小鼠表现出循环VEGF的减少。组织学分析表明，通过血管性血友病因子染色进行测量，植入的包埋有B16F10细胞的基质胶塞包含的新血管数量减少。这些数据表明，达泮舒腈的全身治疗减少了与血管生成有关的炎症事件，并减少了血管生成。

实施例3.达泮舒腈减少组织浸润和转移

转移的机制涉及从原发性肿瘤部位脱离，内渗进入循环，在循环中存活，从循环外渗，在继发性部位(secondary site)附着，以及继发性肿瘤部位发展的复杂的多步骤过程。

为了确定达泮舒腈是否能减少组织浸润和转移，将B16F10-GFP标记的细胞静脉注射到用标准或OLT1177^TM饮食饲喂的小鼠中。

肺和肝的免疫荧光分析显示，与标准饮食相比，接受OLT1177^TM的小鼠中GFP⁺细胞数量减少。在图3A中，通过达泮舒腈治疗，肺中的GFP⁺细胞数量减少了66％(p＜0.0001)。在肝中观察到GFP⁺B1610细胞数量的类似减少(-60％；p＜0.001)(图3B)。总体上，肺和肝中转移细胞数量的减少表明，达泮舒腈减少了组织浸润并减少了肝和肺中的转移。

实施例4.达泮舒腈通过限制MDSC的扩增来降低肿瘤进展

肿瘤进展和免疫系统规避通常与肿瘤诱导的MDSC扩增有关(27，28)。表征了两个群体：PMN-MDSC和M-MDSC(29)。

流式细胞仪分析用于评估NLRP3抑制对MDSC激活和扩增的影响，MDSC是肿瘤相关免疫抑制的关键介导物。分离骨髓，脾脏，和淋巴结来源的细胞，并分析两种主要的MDSC亚型：表达CD11b⁺Ly6G⁺Ly6C^lo的多形核MDSC(PMN-MDSC)和表达CD11b⁺Ly6G-Ly6C^hi的单核MDSC(M-MDSC)。与非荷瘤小鼠相比，来自荷瘤小鼠的骨髓细胞显示出减少的PMN-MDSC(图4A)。在脾脏中，与非荷瘤小鼠相比，荷瘤小鼠中PMN-MDSC的水平增加(图4B)。但是，在用达泮舒腈饮食饲喂的小鼠中，我们观察到PMN-MDSC群体恢复至非荷瘤小鼠中观察到的水平(图4A-4B)。淋巴结的分析显示，与标准饮食相比，用达泮舒腈饮食饲喂的小鼠中PMN-MDSC减少(图4C)。与荷瘤小鼠和非荷瘤小鼠中PMN-MDSC相比，对骨髓，脾脏和淋巴结中M-MDSC群体的分析显示出相反的特性。如图4D-4F所示，与非荷瘤小鼠相比，用标准饮食饲喂的荷瘤小鼠的骨髓中M-MDSC细胞增加，脾脏和淋巴结中水平降低。达泮舒腈的治疗阻止了对M-MDSC扩增的肿瘤诱导的影响，使群体正常化至非荷瘤小鼠的水平(图4D-4F)。

在这里我们观察到，用达泮舒腈饮食饲喂的小鼠中NLRP3炎症小体的抑制使MDSC群体逆转为缺乏慢性或肿瘤相关炎症的非荷瘤小鼠。这些发现表明，达泮舒腈可有效逆转黑色素瘤中肿瘤诱导的免疫抑制。此外，我们观察到，与非荷瘤小鼠相比，PMN-MDSC和M-MDSC扩增中不同的肿瘤诱导的变化。看起来，PMN-MDSC从骨髓迁移以浸润到外周组织(如脾脏和淋巴结)，而M-MDSC在骨髓中增加了扩增。此处示出，用达泮舒腈治疗的荷瘤小鼠脾源性T细胞刺激表达出显著较低的IL-22水平。这些结果与在用达泮舒腈治疗的荷瘤小鼠中观察到的肿瘤生长的减少一致。

实施例5.抗PD-1和OLT1177^TM联合疗法可提高抗肿瘤疗效

我们使用针对PD-1的抗体，评估达泮舒腈与免疫疗法标准治疗相结合的效果。将小鼠置于标准饮食下并皮下注射B16F10细胞(实验第0天)。B16F10滴注后四天，开始用OLT1177^TM饮食饲喂小鼠或保持标准饮食。三天后(实验第7天)，给小鼠腹腔注射抗PD-1抗体。如图5A所示，与单独的抗PD-1相比，在抗PD-1之前用OLT1177^TM治疗显著减小了肿瘤大小。与载剂相比，抗PD-1的肿瘤体积减少43％(p＜0.05)，而联合疗法使得肿瘤大小减少了72％(p＜0.0001)。

我们还观察到，与单一治疗相比，联合疗法中循环IL-6减少的趋势(-25.3％，p＝0.2，图5B)。与单一疗法相比，全血裂解液显示了在接受联合疗法的荷瘤小鼠中髓过氧化物酶(MPO)的急剧降低(图5C)。当与单独的抗PD-1治疗相比时，OLT1177^TM和抗PD-1治疗还显示出在原发性肿瘤中NK细胞增加的趋势(图5D)。这些数据表明，与单独的免疫疗法相比，达泮舒腈治疗与检查点抑制剂的组合增加了抗肿瘤免疫应答。

应当理解，前述内容描述了本发明的优选实施方式，并且可以在不脱离权利要求书所阐述的本发明范围的情况下进行修改。

参考文献

1.Y.Guo等。《癌症研究》Cancer Res 77，6429-6441(2017)。

2.S.Shalapour等。《临床研究杂志》J Clin Invest 125，3347-3355(2015)。

3.C.A.Dinarello。《血液》(Blood)117，3720-3732(2011)。

4.R.N.Apte等。《癌症转移评论》(Cancer Metastasis Rev)25，387-408(2006)。

5.C.A.Dinarello。《癌症转移评论》(Cancer Metastasis Rev)29，317-329(2010)。

6.B.Guo等。《科学报告》Sci Rep 6，36107(2016)。

7.D.N.Khalil等。《自然评论：临床肿瘤学》(Nat Rev Clin Oncol)13，273-290(2016)。

8.M.A.Postow等。《新英格兰医学杂志》N Engl J Med 378，158-168(2018)。

9.C.Marchetti等。《美国科学院院报》Proc Natl Acad Sci U S A 115，

E1530-E1539(2018)。

10.C.R.Millrud等。《肿瘤标靶》Oncotarget 8，3649-3665(2017)。

11.S.Ostrand-Rosenberg等。《免疫学杂志》(J Immunol)182，4499-4506(2009)。

12.V.Umansky等。《疫苗》(Vaccines)(Basel)4，E36(2016)。

13.K.R.Jordan等。《癌症免疫现状》(Cancer Immunol Immunother)62，1711-1722(2013)。

Claims (6)

1.一种预防和/或治疗受试者的黑色素瘤的方法，包括步骤：

向患有所述黑色素瘤的所述受试者施用有效量的达泮舒腈，或其药学上可接受的溶剂化物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述黑色素瘤选自：浅表扩散性黑色素瘤，结节性黑色素瘤，恶性雀斑样痣黑色素瘤，和肢端雀斑痣性黑色素瘤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中达泮舒腈通过全身施用来施用。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述达泮舒腈通过口服施用来施用。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法通过减小黑色素瘤的大小来治疗黑色素瘤。

6.根据权利要求1所述的方法，还包括向所述受试者施用抗PD-1抗体。

Images