CN111867634A - 使用藻酸酯低聚物增强微米/纳米颗粒跨粘液层的易位 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了跨粘液层易位微米/纳米颗粒和由此携带的目标分子的方法。更具体地说，提供了一种使阳离子微米/纳米颗粒跨粘液层易位的方法，所述方法包括(a)使粘液层与至少一种藻酸酯低聚物以及阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，或(b)(i)使阳离子微米/纳米颗粒与具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物接触，从而形成带有所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和(b)(ii)使粘液层与在步骤(b)(i)中制备的微米/纳米颗粒接触。还提供了一种使目标分子跨粘液层易位的方法，所述方法包括使粘液层与由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒接触，其中至少一种是阳离子微米/纳米颗粒形成剂，至少一种是藻酸酯低聚物，其具有至少70％的甘露糖醛酸酯残基，并且还包含所述目标分子，任选地其中所述目标分子与一种或多种自组装微米/纳米颗粒形成组分共价结合。本发明进一步涉及藻酸酯低聚物在本发明的方法中的用途以及本发明的微米/纳米颗粒。

Description

使用藻酸酯低聚物增强微米/纳米颗粒跨粘液层的易位
本发明涉及藻酸酯低聚物用于增强微米/纳米颗粒跨粘液层的易位，特别是当以微米/纳米颗粒形式提供或由微米/纳米颗粒携带时增强治疗或诊断上有用分子的递送至粘膜的上皮细胞层，从而增强分子的局部递送和/或全身摄取。在离体和体外情况下，可以增强将微米/纳米颗粒递送至产生粘液层的已培养细胞或至携带粘膜的组织。更具体地，本发明提供了某类藻酸酯低聚物，即富含甘露糖醛酸酯的藻酸酯低聚物，以增强由阳离子组分形成的阳离子微米/纳米颗粒或自组装微米/纳米颗粒跨粘液层的易位，特别是异常粘度的粘液层，例如患有囊性纤维跨膜受体功能障碍的受试者的粘液。本发明在递送核酸例如治疗性核酸或生物活性有限的活性剂至粘液层下面的细胞中特别有用，特别是在CFTR功能障碍的受试者中。
现代精密药物的功效通常受到其达到靶目标的能力的限制。呼吸道、肠道和泌尿生殖道的粘膜表面由于其血管性和大表面积而成为药物递送的有吸引力的靶位。但是，此类表面的粘液屏障——包括粘蛋白、细菌和宿主衍生的多糖、细菌和细胞外DNA在内的组分的带电且复杂的聚合物“网”——代表了决定通过呼吸道或口服或直接递送至粘膜表面的那些药物的生物利用度、吸附和后续功效的主要障碍之一。此外，在许多慢性呼吸道和胃肠道疾病中，例如囊性纤维，高粘度粘液的产生阻碍了其清除并延长了感染和炎症。这种异常的粘液加重了在这类患者中跨越这些粘液屏障递送治疗的挑战。
正在开发许多药物，包括抗生素，用于吸入递送，尤其是那些常用于治疗囊性纤维化(CF)的药物。用于CF的疾病改良治疗剂也正在配制用于口服施用。但是，它们在水中的不溶性为这些药物的生物利用度带来了重大问题。
一种改善例如由于水溶性差、不稳定性或非特异性毒性而难以递送的治疗剂或诊断剂的整体生物利用度的有前途的方法是将此类药物掺入或形成为微米或纳米颗粒。此类颗粒包括囊泡(例如脂质体、聚合物体和类脂质体(niosome))，聚合物颗粒，金属颗粒，胶束，病毒，病毒样颗粒，树枝状聚合物，碳纳米管和这些实体的混合形式。颗粒递送系统也是基于核酸作为活性剂的疗法或诊断方法例如基因疗法、基因编辑、RNA干扰疗法、体外转录mRNA疗法、反义疗法以及使用核酸作为分子探针的共同特征，这是由于与将此类分子有效递送至靶细胞有关的问题。
然而，大多数基于颗粒的药物递送系统被粘液层捕获并随后被快速去除。因此，颗粒输送系统的功效受到强烈限制，并且是该领域中长期存在的挑战。
迄今为止，研究人员已采用多种技术来尝试改善跨粘膜药物/颗粒的递送(例如，粘膜粘附和粘液穿透颗粒)。然而，由于非特异性结合、粘液清除和毒性方面的问题，目前尚无一种药物被批准用于慢性呼吸道疾病。因此，迫切的未满足的需要是开发能够促进药物和小分子在人类疾病治疗和诊断中的跨粘膜递送的新型递送策略。
藻酸酯是天然存在的多糖，已经发现其在临床上(例如在伤口敷料中、作为药物载体和在抗胃灼热制剂中)和非临床上(例如在食品制剂中)具有多种用途。它们是(1-4)连接的β-D-甘露糖醛酸(M)和/或其C-5差向异构体α-L-古洛糖醛酸(G)的线性聚合物。藻酸酯的主要结构可以有很大的不同。M和G残基可以被组织为连续的M或G残基的均聚物嵌段，因为可以发现交替的M和G残基的嵌段以及单个M或G残基填布在这些嵌段结构之间。藻酸酯分子可以包含这些结构中的一些或全部，并且这种结构可能不会均匀地分布在整个聚合物中。极端地，存在古洛糖醛酸的均聚物(聚古洛糖醛酸酯)或甘露糖醛酸的均聚物(聚甘露糖醛酸酯)。
藻酸酯已从海褐藻例如丛梗藻属(Durvillea)、巨海藻属(Lessonia)和海带属(Laminaria)的某些物种)和细菌(如铜绿假单胞菌和棕色固氮菌)中分离出来。其他假单胞菌(例如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌和门氏假单胞菌)保留了产生藻酸酯的遗传能力，但在野生环境中它们不产生可检测水平的藻酸酯。通过突变，可以诱导这些非产生性假单胞菌稳定地产生大量藻酸酯。
藻酸酯被合成为聚甘露糖醛酸酯，G残基是通过差向异构酶(特别是C-5差向异构酶)对聚合物中M残基的作用而形成的。在从藻类中提取藻酸酯的情况下，G残基主要组织为G嵌段，因为参与藻类中藻酸酯生物合成的酶优先将G引入另一个G，从而将M残基的片段转化为G嵌段。对这些生物合成系统的阐明允许产生具有特定一级结构的藻酸酯(WO 94/09124，Gimmmestad，M等人，Journal of Bacteriology，2003，Vol 185(12)3515-3523和WO2004/011628)。
藻酸酯通常从天然来源分离为大的高分子量聚合物(例如平均分子量在300,000至500,000道尔顿范围内)。然而，已知这样的大藻酸酯聚合物可被降解或分解，例如通过化学或酶水解以产生较低分子量的藻酸酯结构。工业上使用的藻酸酯的平均分子量通常在100,000至300,000道尔顿的范围内(这种藻酸酯仍被认为是大聚合物)，尽管平均分子量约为35,000道尔顿的藻酸酯已被用作药物中的赋形剂。
WO2007/039754、WO2008/125828和WO2010/109180描述了低聚古洛糖醛酸酯(具有高比例的G残基的藻酸酯低聚物)对粘液粘度以及聚合物生物/大分子药物和阴离子纳米颗粒通过粘液的扩散的某些作用。WO2010/109176也描述了低聚古洛糖醛酸酯对携带阳离子脂质体纳米颗粒的核酸的转染特性的某些作用。WO2015/128495描述了某些含藻酸酯G残基的藻酸酯低聚物使具有CFTR功能障碍的患者(例如囊性纤维性患者)的粘液特性正常化的能力。
现已令人惊讶地发现，富含甘露糖醛酸盐的藻酸酯低聚物，而不是富含古洛糖酸盐的藻酸酯低聚物，增强了阳离子微米/纳米颗粒但不是阴离子微米/纳米颗粒跨粘液层的易位。这样的藻酸酯低聚物也可以与形成阳离子微米/纳米颗粒的组分一起掺入自组装的微米/纳米颗粒中，并且与在不存在这样的藻酸酯低聚物的情况下形成的等同的微米/纳米颗粒相比，预期这种微米/纳米颗粒以提高的效率跨粘液层易位。还已经发现，富含甘露糖醛酸酯的低聚物而不是富含古洛糖醛酸酯的藻酸酯低聚物降低了与阳离子微米/纳米颗粒和包含阳离子微米/纳米颗粒形成组分的微米/纳米颗粒相关的细胞毒性。
不希望受理论的束缚，据信富含甘露糖醛酸酯的藻酸酯低聚物具有这些特殊性质，但是富含古洛糖醛酸酯的藻酸酯低聚物由于它们的负电荷和柔性结构而没有。
粘液的各种成分使得该物质带有整体负电荷。在气道粘液分泌物中，MUC5AC和MUC5B是粘弹性凝胶中的主要粘蛋白。这些粘蛋白由在大部分苏氨酸和丝氨酸上糖基化的富含脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸(PTS结构域)的长串联重复序列组成。这些聚糖中的许多终止于带负电荷的羧基或硫酸根基团，在PTS结构域上赋予高负电荷。该负电荷促进阳离子颗粒的静电粘合捕集。在患有慢性气道炎症的受试者中，例如在CF中所见，发生粘蛋白过度分泌。这导致粘蛋白含量增加，赋予CF粘液更高的负电荷和粘弹性。粘蛋白含量的增加也降低了CF粘液网孔的尺寸。其他生物大分子，包括染色体DNA和F-肌动蛋白微丝，在患有慢性气道炎症的受试者的气道粘液分泌物中占主导地位，并且这种增加的DNA水平还赋予CF粘液更高的负电荷并减小了粘液网孔的尺寸。这种增加的负电荷和减小的网孔尺寸导致在这类受试者中阳离子颗粒例如微米/纳米颗粒的甚至更明显的粘合捕集。
藻酸酯低聚物是带负电荷的分子，当应用于粘液和/或阳离子微米/纳米颗粒或与形成阳离子微米/纳米颗粒的组分一起掺入时，认为会导致颗粒上的正电荷或甚至负电荷减少，并且这又减少或消除了由粘液的整体负电荷引起的阻碍作用。然而，据信，由于每种类型的低聚物的相对柔性，富含甘露糖醛酸酯的藻酸酯低聚物而不是富含古洛糖醛酸酯的藻酸酯低聚物能够增强阳离子微米/纳米颗粒的易位。古洛糖醛酸酯残基双轴结合相邻的古洛糖醛酸酯残基，这导致绕糖苷键的旋转受阻以及刚性和延伸的尿酸酯链。另一方面，甘露糖醛酸酯残基双赤道地结合相邻的甘露糖醛酸酯残基，这是受阻较少的布置，并且这产生了更加柔性的链。据信富含甘露糖醛酸酯的藻酸酯低聚物的柔韧性意味着这些分子通过粘液的粘蛋白网孔时，对微米/纳米颗粒的物理阻碍较小，而僵硬且不易弯曲的古洛糖醛酸酯低聚物更可能被捕获在粘液成分的复杂网络中。
这些发现特别值得注意，因为阳离子微米/纳米颗粒和包含阳离子微米/纳米颗粒形成成分的微米/纳米颗粒相对于阴离子微米/纳米颗粒具有某些优势，包括优越的细胞转染效率和卓越的阴离子药物(例如核酸)包封效率，但是在某些应用中面临严重的递送障碍，并被认为具有细胞毒性作用。因此，本发明通过减轻粘液的屏障作用，并且在某些实施方案中，降低此类颗粒的细胞毒性作用，促进了在粘液层以下的递送部位的背景下使用某些类型的高度有利的微米/纳米颗粒。
因此，在第一方面，本发明提供了一种将阳离子微米/纳米颗粒跨粘液层易位的方法，所述方法包括
(a)使所述粘液层与至少一种藻酸酯低聚物连同所述阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基；或
(b)(i)使所述阳离子微米/纳米颗粒与具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物接触，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)使所述粘液层与步骤(b)(i)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
本发明进一步提供了用于增强阳离子微米/纳米颗粒跨粘液层的易位的方法，所述方法包括
(a)使所述粘液层与至少一种藻酸酯低聚物连同所述阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基；或
(b)(i)使所述阳离子微米/纳米颗粒与具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的至少一种藻酸酯低聚物接触，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)使所述粘液层与步骤(b)(i)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
可以认为本发明进一步提供了一种用于将目标分子递送至粘膜表面的上皮细胞的方法，所述方法包括
(a)使所述粘膜表面的粘液层与至少一种藻酸酯低聚物连同包括所述目标分子的阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基；或
(b)(i)使包括所述分子的阳离子微米/纳米颗粒与至少一种藻酸酯低聚物接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)使所述粘膜表面的粘液层与步骤(b)(i)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
本发明进一步提供了一种通过阳离子微米/纳米颗粒增强目标分子向粘膜表面的上皮细胞的递送的方法，所述方法包括：
(a)使所述粘膜表面的粘液层与至少一种藻酸酯低聚物连同包括所述目标分子的阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基；或
(b)(i)使包括所述分子的阳离子微米/纳米颗粒与至少一种藻酸酯低聚物接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)使所述粘膜表面的粘液层与步骤(b)(i)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
在这些方面，微米/纳米颗粒可以例如携带目标分子，或者可以以其微米/纳米颗粒的形式提供所述分子。更具体地，目标分子可以共价结合至微米/纳米颗粒的另一组分，例如自组装组分，或者可以不同于微米/纳米颗粒的其他组分。目标分子可以被携带在微米/纳米颗粒的任何部分之中或之上，例如在表面上，在内部空隙中，或者在颗粒的一层或多层中或之上，或其组合。因此，该分子可以存在于层状相(层)内部，穿过层状相和/或与层状相的外表面缔合(例如结合)，或者可以被层状相包封，即发现该分子在中空微米/纳米颗粒的内部相中自由和/或与该微米/纳米颗粒的层状相的内表面缔合(例如结合)，但未发现其在层状相内部、穿过层状相或与层状相的外表面缔合(例如结合)。换句话说，在这样的实施方案中，基本上没有目标分子的任何部分暴露于外部相。在其中目标分子可能是有毒的、在脱靶位置可能具有有害作用、可能诱导有害的免疫应答或水溶性差的实施方案中，这样的布置可能是特别有用的。
本发明进一步提供了一种使目标分子跨粘液层易位的方法，所述方法包括使所述粘液层与微米/纳米颗粒接触，所述微米/纳米颗粒
(i)由自组装的微米/纳米颗粒形成组分形成，其中至少一种是阳离子微米/纳米颗粒形成剂，至少一种是具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物，和
(ii)还包含所述目标分子，任选地其中所述目标分子与一种或多种所述自组装的微米/纳米颗粒形成组分共价结合。
本发明进一步提供了用于将目标分子递送至粘膜表面的上皮细胞的方法，所述方法包括使所述粘膜表面的粘液层与微米/纳米颗粒接触，所述微米/纳米颗粒
(i)由自组装的微米/纳米颗粒形成组分形成，其中至少一种是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，至少一种是具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物，和
(ii)还包含所述目标分子，任选地其中所述目标分子与一种或多种所述自组装的微米/纳米颗粒形成组分共价结合。
本发明进一步提供了由自组装的微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒，其中
(i)至少一种自组装的微米/纳米颗粒形成组分是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，并且至少一种是具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物，和
(ii)所述微米/纳米颗粒还包含目标分子，任选地其中所述目标分子与一种或多种所述自组装的微米/纳米颗粒形成组分共价结合。
目标分子是技术人员具有特定预定效用的分子。例如，它可以是技术人员希望递送到目标部位以在目标部位或其他地方直接或间接执行功能或发挥作用的分子，或可直接或间接地提供关于目标部位或在该目标部位或其他地方发生的过程的信息的分子。因此，在使用本发明中使用的微米/纳米颗粒的特定情况下，此类分子的身份基本上仅受本领域技术人员的目的限制。在某些特定的实施方案中，分子可以是治疗和/或诊断用途的分子，例如药物(药)或诊断剂，并且在这些实施方案中，微米/纳米颗粒可以视情况被认为是治疗/诊断性微米/纳米颗粒。可以将术语目标分子扩展为分子的布置。
将立即意识到，根据本发明的目标分子不是如本文所定义的用于本发明中的富含甘露糖醛酸酯的藻酸酯低聚物，例如具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯或本文定义的任何其他藻酸酯低聚物。在其他实施方案中，根据本发明的目标分子不是如本文所定义的用于本发明的阳离子微米/纳米颗粒形成组分。在其他实施方案中，目标分子不是所讨论的微米/纳米颗粒的必要结构组分，例如自组装的微米/纳米颗粒形成组分。
在这些方面，目标分子可以共价结合至微米/纳米颗粒的自组装组分，或者可以不同于(不与之结缔合或结合，或者至少仅与之瞬时缔合或结合)微米/纳米颗粒的自组装组分。目标分子可以被携带在微米/纳米颗粒的任何部分之中或之上，例如在表面上，在内部空隙中，或者在颗粒的一层或多层中，或其组合。在这方面的上述讨论比照适用于本部分。
自组装微米/纳米颗粒形成组分是这样的化合物，其单独和/或与其他自组装微米/纳米颗粒形成化合物一起可以在合适的物理和/或化学条件下例如自发地排列成微米/纳米颗粒。在某些实施方案中，用于本发明的自组装微米/纳米颗粒形成组分可以是能够排列成微米/纳米囊泡和/或微米/纳米胶束的两亲性化合物，例如，在下文中详细描述的那些两亲性自组装微米/纳米颗粒形成化合物。在其他实施方案中，用于本发明的自组装微米/纳米颗粒形成组分可以是病毒或病毒样颗粒的结构组分，例如下面更详细讨论的那些。在某些实施方案中，阳离子微米/纳米颗粒形成组分和藻酸酯低聚物共价连接。
可以提供上述微米/纳米颗粒，特别是包含作为治疗性或诊断性分子的目标分子的那些，以用于治疗。
本发明进一步提供了藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，用于将治疗性或诊断性阳离子微米/纳米颗粒跨过受试者的粘液层易位的方法中，所述方法包括
(a)使所述粘液层与至少一种藻酸酯低聚物连同所述阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基；或
(b)(i)使所述阳离子微米/纳米颗粒与具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物接触，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)使所述粘液层与步骤(b)(i)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
本发明进一步提供了藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，用于将治疗性或诊断性目标分子递送至受试者粘膜表面的上皮细胞的方法中，所述方法包括
(a)使所述粘膜表面的粘液层与至少一种藻酸酯低聚物连同包括所述治疗性或诊断性目标分子的阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基；或
(b)(i)使包括所述治疗性或诊断性目标分子的阳离子微米/纳米颗粒与至少一种藻酸酯低聚物接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)使所述粘膜表面的粘液层与步骤(b)(i)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
本发明还提供了藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，用于跨受试者的粘液层易位治疗性或诊断性目标分子的方法中，所述方法包括
(a)制备由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒，其中至少一种自组装微米/纳米颗粒形成组分是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，并且至少一种是所述藻酸酯低聚物，所述微米/纳米颗粒进一步包含治疗性或诊断性目标分子，任选地其中治疗性或诊断性分子共价结合至一种或多种所述自组装微米/纳米颗粒形成组分，和
(b)使粘液层与步骤(a)中制备的微米/纳米颗粒接触。
本发明也提供了藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，用于将治疗性或诊断性目标分子递送至受试者粘膜表面的上皮细胞的方法中，所述方法包括
(a)制备由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒，其中至少一种自组装微米/纳米颗粒形成组分是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，并且至少一种是所述藻酸酯低聚物，所述微米/纳米颗粒进一步包含所述治疗性或诊断性目标分子，任选地其中治疗性或诊断性分子共价结合至一种或多种所述自组装微米/纳米颗粒形成组分，和
(b)使所述粘膜表面的粘液层与步骤(a)中制备的微米/纳米颗粒接触。
在这些方面，可以认为所述易位或所述递送被增强。
在某些实施方案中，本发明的涉及由自组装微米/纳米颗粒形成化合物形成的微米/纳米颗粒的方法和用途可以包括进一步的步骤，其中制备了微米/纳米颗粒，例如，如下面更详细地描述的。
本发明还提供了藻酸酯低聚物在制造用于上述方法的药物中的用途，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基。在某些实施方案中，药物可以是带有藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒或由本文所述的自组装微米/纳米颗粒形成化合物形成的微米/纳米颗粒。
本发明还进一步提供了例如本文所定义的治疗性或诊断性阳离子微米/纳米颗粒的用于制造用于上述方法中的药物的用途。在某些实施方案中，药物可以是带有藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒或由本文所述的自组装微米/纳米颗粒形成化合物形成的微米/纳米颗粒。
在其中藻酸酯低聚物与治疗性或诊断性阳离子微米/纳米颗粒一起与粘液层接触的某些实施方案中，或者在其中在使如此形成的微米/纳米颗粒与粘液层接触之前使藻酸酯低聚物与治疗性或诊断性微米/纳米颗粒接触的实施方案中，药物可以进一步包含治疗性或诊断性阳离子微米/纳米颗粒。
药物可以是包含藻酸酯低聚物和阳离子微米/纳米颗粒的单一组合物或制剂的形式，或者可以制备和使用分别包含藻酸酯低聚物或阳离子微米/纳米颗粒的单独的组合物或制剂。
因此，本发明提供了具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物和治疗性或诊断性阳离子微米/纳米颗粒用于制造药物的用途，所述药物用于其中将粘液层与具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的至少一种藻酸酯低聚物连同治疗性或诊断性阳离子微米/纳米颗粒接触的上述方法的实施方案中，或用于其中具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的至少一种藻酸酯低聚物与治疗性或诊断性微米/纳米颗粒接触，然后使如此形成的微米/纳米颗粒与粘液层接触的实施方案中。
如上所述，微米/纳米颗粒可与藻酸酯低聚物分开施加或施用。与此相一致，本发明的又一方面提供了一种产品，其包含具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物和阳离子微米/纳米颗粒(例如本文所定义的)作为组合制剂，特别是用于分离、同时或依次使用在本文定义的方法中，特别是用于其中将粘液层与具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的至少一种藻酸酯低聚物连同治疗性或诊断性阳离子微米/纳米颗粒接触的上述方法的具体实施方案中，或用于其中具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的至少一种藻酸酯低聚物与治疗性或诊断性微米/纳米颗粒接触，然后使如此形成的微米/纳米颗粒与粘液层接触的实施方案中。该产品可以被视为包含藻酸酯低聚物和阳离子微米/纳米颗粒的药物产品或组合产品，或试剂盒。
术语“接触粘液层”涵盖直接或间接地将实体(例如藻酸酯低聚物和/或微米/纳米颗粒)递送至粘液层的任何方式，以及因此涵盖将实体施加或施用至粘液层，或将粘液层暴露于实体，例如直接将实体施加于粘液层的任何方式。特别地，使粘液层与实体接触(将实体施用至粘液层)的步骤可包括将所述实体施用于受试者，并且特别是施用于需要用治疗性和/或诊断性微米/纳米颗粒进行这种治疗的受试者。因此，将理解，包括医学和非医学方法，例如包括体外和离体方法以及体内方法。因此，明确地包括在本发明范围内是这样的方法，其不在人或非人动物身体内或身体上或相关于在人或非人动物身体内或身体上的粘液层进行，但在其他实施方案中，受试者可以是任何人类或非人动物受试者，例如任何哺乳动物受试者，但是通常将是人受试者或患者。在这些情况下，接触步骤将通过将实体施用于受试者来实现，例如在下述组合物中。
“接触在一起”是指阳离子微米/纳米颗粒和藻酸酯低聚物组合使用以实现(增强的)阳离子微米/纳米颗粒的易位/递送。尤其是指有效量的藻酸酯低聚物与有效量的阳离子微米/纳米颗粒在相同或基本相同的时间或之前施用。在其他实施方案中，将有效量的低聚物与阳离子微米/纳米颗粒分开且在其后施用。技术人员将能够容易地设计剂量方案以使藻酸酯低聚物对阳离子微米/纳米颗粒的易位/递送的作用最大化。技术人员还将能够根据他所处的特定情况选择两种活性剂的最佳组合。有效量可以是足以给阳离子微米/纳米颗粒赋予负表面电荷的量，例如本文所定义的阴离子微米/纳米颗粒的表面电荷，例如可以在体外用动态光散射法或仪器(例如Malvern Nano ZS Zetasizer)在水中测量。
“一起使用”并不意味着相应的试剂存在于相同的制剂或组合物中，因此，即使在相同或基本相同的时间使用或施用，藻酸酯低聚物和微米/纳米颗粒也不必存在于相同的制剂或组合物中，但可以分开施用。因此，“分开”使用/施用包括根据期望的剂量或使用方案在相同或基本相同的时间，或在不同的时间，例如顺序地或以不同的时间间隔的使用/施用。因此，“同时”施用包括在相同组合物或制剂内，或在相同或基本相同时间施用的单独的组合物/制剂内的藻酸酯低聚物和微米/纳米颗粒的施用。在某些实施方案中，藻酸酯低聚物可以由阳离子微米/纳米颗粒携带，例如作为涂层或外层或壳。
阳离子微米/纳米颗粒因此可以与藻酸酯低聚物同时或相继施加或施用。如上所述，在一个实施方案中，阳离子微米/纳米颗粒与藻酸酯低聚物同时或基本同时施用，在另一实施方案中，其在藻酸酯低聚物之后或在藻酸酯低聚物之前施用。因此，在其他实施方案中，将低聚物在阳离子微米/纳米颗粒之前或之后分开施用。在“基本上相同的时间”的范围内包括在藻酸酯低聚物之前或之后立即或几乎立即施加或施用阳离子微米/纳米颗粒。术语“几乎立即”可以理解为包括在先前的施加或施用的一小时内，优选在30分钟之内施加或施用。然而，可以在藻酸酯低聚物之后至少1小时、至少3小时或至少6小时或更长时间施加或施用阳离子微米/纳米颗粒。在这些实施方案中，阳离子微米/纳米颗粒可以在有或没有进一步施加藻酸酯低聚物的情况下施加或使施用。藻酸酯低聚物可以在阳离子微米/纳米颗粒之前或与其一起以多次应用施加或施用，包括如上所述，在阳离子微米/纳米颗粒之前立即或几乎立即施加或施用。在其他实施方案中，阳离子微米/纳米颗粒可方便地在藻酸酯低聚物之前例如至少1小时、至少3小时、至少6小时施加或施用。在这些实施方案中，藻酸酯低聚物可以在有或没有进一步施加阳离子微米/纳米颗粒的情况下被施加或施用。可以在藻酸酯低聚物之前或与藻酸酯低聚物一起以多次施加方式施加或施用阳离子微米/纳米颗粒。
本发明方法中的包括使微米/纳米颗粒与藻酸酯低聚物接触的步骤包括将藻酸酯低聚物直接或间接地递送至微米/纳米颗粒的任何方式，因此包括将藻酸酯低聚物施加至微米/纳米颗粒，或将微米/纳米颗粒暴露于藻酸酯低聚物，例如将藻酸酯低聚物直接施加于微米/纳米颗粒的任何方式。特别地，使微米/纳米颗粒与藻酸酯低聚物接触的步骤可以包括以实现接触的方式将两种实体施用给受试者，并且特别是施用给需要用治疗性和/或诊断性微米/纳米颗粒进行这种治疗的受试者。在其他实施方案中，接触是在体外进行的，例如在将经处理的微米/纳米颗粒施用于受试者或直接施用于粘液层之前。接触步骤导致微米/纳米颗粒带有藻酸酯低聚物。该物理关系的确切性质不受限制，可以是任何形式的非共价或共价物理相互作用，通常为非共价(例如离子、氢键和/或静电键)，其导致藻酸酯低聚物持续存在于微米/纳米颗粒的表面上或处。这可以以可以被认为是涂层或外层或壳的量，或者可以是稀疏分布。在某些实施方案中，藻酸酯低聚物将通过离子和/或静电相互作用或氢键，离子和/或静电地结合至微米/纳米颗粒。
在这些实施方案中，使微米/纳米颗粒与足以形成携带有效实现(增强的)易位/递送的藻酸酯低聚物量的微米/纳米颗粒的藻酸酯低聚物量接触。有效量可以是足以给微米/纳米颗粒赋予负表面电荷的量，例如本文所定义的阴离子微米/纳米颗粒的表面电荷。
粘膜表面在本文中定义为分泌、具有、携带或在任何程度上涂覆有粘液(即粘液层)的动物体内或外的任何表面。更具体地，粘膜表面是包括上皮细胞的组织衬里，所述上皮细胞通常被布置为分泌、具有、携带或在任何程度上被粘液覆盖的上皮细胞层(上皮)。将认识到，术语“粘性膜”和“粘膜”可以可替代地用于指粘膜表面。该定义被认为扩展到所述表面的人工培养版本或所述表面的模型。因此包括进行组织/器官培养或产生粘液层/涂层的细胞培养物的组织或器官的粘液包被表面。
在某些实施方案中，本发明的方法可以应用于受CFTR功能障碍影响并因此将分泌、具有、携带或在任何程度上涂覆了CF的异常粘液特征(致密、顽固并且在某些情况下至少部分地附着在下面的上皮上的粘液)的粘膜表面。据信，这种粘液对于微米/纳米颗粒易位提出了特殊的问题，并且本发明特别适合于解决这些问题。
粘膜表面可以在呼吸系统中，例如上呼吸道(鼻子、鼻腔通道、咽喉和气管)、鼻旁窦和支气管(第一、第二和第三级)和下呼吸道的细支气管。优选地粘膜表面将在呼吸道内，优选在气管、支气管和细支气管内。
粘膜表面可以在胃肠道中，例如嘴、咽、食道、十二指肠和小肠(空肠和回肠)。上GI道由嘴、咽、食道、胃和十二指肠组成，下GI道由小肠、大肠(盲肠、结肠和直肠)和肛门组成。
粘膜表面可以在胰管和/或胆管中。
粘膜表面可以在女性生殖系统中，例如阴道、子宫颈、子宫、输卵管和卵巢，优选地子宫颈、子宫和输卵管。
粘膜表面可以在男性生殖系统中，例如，睾丸、附睾、输精管、副腺、精囊、前列腺和尿道球腺。
根据本发明，跨粘液层的易位是指微米/纳米颗粒从粘液层的一个面跨过该层的深度到另一面的动作，更具体地从顶面(也称为粘膜表面或粘液/管腔界面)到底面(也称为粘液/上皮细胞界面)。应当认识到，实际上，易位是由沿着浓度梯度的扩散来驱动的，因此可以看作是微米/纳米颗粒或其群体通过粘液层的扩散。
跨粘液层的易位(通过粘液层的扩散)可以用通常在设定的时间段内从粘液层的一个面移动到另一个面的微米/纳米颗粒的绝对量表示(例如，作为该层底面的累积浓度)，或者用通常在设定的时间内从粘液层的一个面移动到另一面的微米/纳米颗粒的群体的比例(易位效率或易位百分比)表示。可以由此计算易位率。
“将目标分子递送至粘膜表面的上皮细胞”是指使目标分子与粘液层下面的上皮细胞，特别是上皮细胞的顶表面紧密靠近。在某些实施方案中，这可涉及在粘液层下面的上皮细胞，特别是上皮细胞的顶表面与目标分子之间的接触。在某些实施方案中，所述接触涉及目标分子与存在于上皮细胞的表面(顶表面)上的所述分子的受体例如特异性受体之间的相互作用。在某些实施方案中，所述递送可涉及上皮细胞例如通过内吞作用(胞吞作用、受体介导的内吞作用、吞噬作用和小窝内吞作用)或膜融合吸收目标分子或包含所述分子的微米/纳米颗粒。
增强的易位性包括对该过程的任何积极影响。可以将其视为易位的微米/纳米颗粒总量的增加或易位的微米/纳米颗粒群体的比例的增加(易位效率)。可以将其视为微米/纳米颗粒易位的速率(速度)的增加。可以将其视为由粘液引起的对易位的抵抗力(例如，阻抗)的降低或粘液对微米/纳米颗粒的渗透性的增加(例如，扩散系数表示为粘液中的扩散超过在水中的扩散)。可以将其视为还原性易位/扩散回到粘液层的顶面。实施例描述了许多评估这些特性的技术。
目标分子的增强递送包括对该过程的任何积极作用。这可见为递送的分子总量的增加或施加到递送到上皮细胞的粘液层上的分子数量的比例的增加(递送效率)。可见目标分子的递送速率(速度)的增加。可见由粘液引起的递送阻力(阻抗)的降低或粘液对带有分子的微米/纳米颗粒的渗透性增加(例如，扩散系数表示为粘液中的扩散超过水中的扩散)。可见携带分子的微米/纳米颗粒返回到粘液层顶面的减少。实施例描述了许多评估这些特性的技术。
监测微米/纳米颗粒跨粘液层的易位以及将目标分子递送至粘液层下面的上皮细胞的技术已得到完善建立，并在文献中得到了广泛描述。例如，方便的技术是transwell粘液渗透测定法，其使用在transwell中形成的粘液层作为代表粘膜表面的粘液层的模型，例如在实施例中所述。类似地，粘液分泌细胞(例如16HBE41o-细胞(永生化的人支气管上皮细胞))的单层或具有粘膜表面的组织切片可以用作模型表面。从这样的测定中获得的信息将被认为是体内情况下所发生的代表。更直接地，例如，可以使用微米/纳米颗粒和/或其携带的目标分子在体内监测易位/递送，所述微米/纳米颗粒和/或其携带的目标分子用荧光、放射性物质、放射性造影或MRI造影剂以及适当的显微镜检查或其他成像技术进行了标记。在其他方法中，可以通过跟踪由微米/纳米颗粒携带的核酸的表达产物和/或对靶细胞的影响来间接监测易位/递送。在其他实施方案中，可以通过跟踪目标药物分子的药物/生理作用或来自目标诊断分子的信号来间接监测易位/递送。
如实施例中所示，具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物能够降低阳离子微米/纳米颗粒和由阳离子微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒的细胞毒性。因此，在某些实施方案中，根据本发明的“增强的微米/纳米颗粒的易位”或“目标分子的增强的递送”可以被认为是或者也可以是，与在不存在具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物的情况下使用等效的微米/纳米颗粒进行时比较，微米/纳米颗粒的易位或分子的递送具有降低的或更低的细胞毒性。在这些实施方案中，相关的细胞毒性是与微米/纳米颗粒接触的粘液层或其区域紧接下方的细胞毒性。
根据本发明，微米颗粒可以被认为是具有在微米范围内的粒径的任何颗粒，即，从约1μm到约500μm，例如从约1μm至约400μm、300μm、200μm、100μm、50μm、40μm、30μm、20μm、10μm或5μm，或从约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、100μm、200μm、300μm或400μm至约500μm。囊泡的粒径可以为约5μm至约100μm，例如约5μm至约50μm、40μm、30μm、20μm或10μm，或约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm至约100μm。囊泡的粒径可以为约10μm至约200μm，例如约10μm至约100μm、50μm、40μm、30μm或20μm，或约20μm、30μm、40μm、50μm或100μm至约200μm。明确公开了具有可以由任何上述值形成的端点的任何范围。
纳米颗粒可以被认为是具有纳米范围内的粒径的任何颗粒，即，从约1nm至约1000nm，例如约1nm至约900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm或50nm，或从约50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm或900nm至约1000nm。囊泡的粒度可以为约30nm至约400nm，例如约30nm至约350nm、300nm、250nm、200nm、150nm、100nm或50nm，或约50nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm或350nm至约400nm。囊泡可以具有约100nm至约400nm，例如约100nm至约350nm、300nm、250nm、200nm或150nm，或约150nm、200nm、250nm、300nm或350nm至约400nm。囊泡的粒径可以为约1nm至约50nm，例如约1nm至约40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm或5nm，或约5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm或35nm至约40nm。明确公开了具有可以由任何上述值形成的端点的任何范围。
在纳米颗粒的上下文中，术语“粒度”是指使用动态光散射方法(例如，准弹性光散射方法)测量的颗粒尺寸。例如，可以使用动态光散射仪器(例如，Malvern InstrumentsLtd.制造的Zetasizer Nano ZS型号和Otsuka Electronics Co.，Ltd.制造的ELS-8000)测量粒度。该仪器测量颗粒的布朗运动，并基于已建立的动态光散射方法论确定粒度。在微米颗粒的情况中，术语“粒度”是指使用激光衍射光谱法测量的颗粒尺寸。可以使用商业仪器，包括Malvern Instruments Ltd.制造的Mastersizer 3000仪器。
在考虑微米/纳米颗粒群的情况下，该群可以具有上述值或其范围的众数粒度(直径)。
根据本发明，阳离子微米/纳米颗粒是在生理pH，即约pH 6至约pH 8，例如约pH6.5至约pH 7.8，或约pH 6.8至约pH 7.5或约pH 7.0至约pH 7.3或约pH 7.2下具有净正表面电荷，以及生理渗透压的微米/纳米颗粒。
根据本发明，阴离子微米/纳米颗粒是在生理pH，即约pH 6至约pH 8，例如约pH6.5至约pH 7.8，或约pH 6.8至约pH 7.5或约pH 7.0至约pH 7.3或约pH 7.2下具有净负表面电荷，以及生理渗透压的微米/纳米颗粒。
微米/纳米颗粒的表面电荷可以其ζ电位表示。ζ电位可以通过分析动态光散射来计算，因此例如可以使用上述动态光散射仪器来进行这样的计算。因此，阳离子微米/纳米颗粒在生理渗透压和pH下将具有正的ζ电位，例如至少约10mV，例如至少约20mV，25mV，30mV，35mV，40mV，45mV，50mV，55mV，60mV，65mV，70mV，75mV，80mV，85mV，90mV或95mV的正ζ电位。在其他实施方案中，阳离子微米/纳米颗粒的ζ电位可小于20mV，25mV，30mV，35mV，40mV，45mV，50mV，55mV，60mV，65mV，70mV，75mV，80mV，85mV，90mV或95mV。明确公开了具有可以由任何上述值形成的端点的任何范围。因此，阴离子微米/纳米颗粒在生理渗透压和pH下将具有负的ζ电位，例如至少约(即比其更负)-10mV的负ζ电位，例如至少约-20mV，-25mV，-30mV，-35mV，-40mV，-45mV，-50mV，-55mV，-60mV，-65mV，-70mV，-75mV，-80mV，-85mV，-90mV或-95mV。在某些实施方案中，阴离子微米/纳米颗粒的负ζ电位可以不大于(即比其更不负)约-20mV，-25mV，-30mV，-35mV，-40mV，-45mV，-50mV，-55mV，-60mV，-65mV，-70mV，-75mV，-80mV，-85mV，-90mV或-95mV。明确公开了具有可以由任何上述值形成的端点的任何范围。
微米/纳米颗粒可以具有与表面具有不同电荷的内部，例如，阳离子微米/纳米颗粒可能具有带负电荷的内部或核(例如主要包含带负电荷的组分)。因此，在一些实施方案中，用于本发明的阳离子微米/纳米颗粒可以是涂覆有阳离子层(例如，主要包含带电组分的层)的中性或阴离子核。
微米/纳米颗粒可以是囊泡(例如脂质体(脂质复合物(lipoplex))，聚合物小体，类脂质体或其杂合物(例如脂质聚复合物(lipopolyplex)))，胶束，病毒，病毒样颗粒，树枝状聚合物，金属/金属性颗粒(例如纳米笼、纳米壳、纳米星)，碳纳米管，二氧化硅颗粒，聚合物颗粒。
微米/纳米颗粒可以是实心的或空心的，即包含至少一个内部的，通常为液体填充的体积(空隙)。在某些布置中，这些体积完全被层状相包围。中空的微米/纳米颗粒的实例是囊泡，胶束，病毒，病毒样颗粒，树枝状聚合物，碳纳米管，金属/金属性纳米笼和金属/金属性纳米壳。
术语“囊泡”在本文中以其最广泛的含义使用，即，两亲囊泡形成化合物的层状相的分子排列完全包围水性内部相并将水性内部相与水性外部相分离。层状相是由两亲化合物形成的层，通常为双层，所述层具有亲水性外表面和在所述外表面之间的至少一个疏水区域。囊泡可具有单个层状相(单层)、多个同心层状相(多层)或多个非同心层状相(多囊泡)。
在这种情况下，术语“由两亲性囊泡形成化合物形成”意在传达一种或多种两亲性化合物以有效形成功能性层状相的量存在于囊泡中。因此，不排除在层状相内存在其他化合物，例如藻酸酯低聚物，在这种情况下，它们本身可以被认为是囊泡形成化合物。在某些实施方案中，一种或多种两亲性囊泡形成化合物将是层状相的主要组分，但是也可能存在其中所述化合物可以在没有为其主要组分的情况下影响囊泡的功能性层状相的实施方案。然而，在某些实施方案中，层状相将实质上由例如基本上由所述一种或多种两亲性囊泡形成化合物组成。用数字表示，囊泡的层状相的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(w/w)可以是一种或多种两亲性囊泡形成化合物。在某些实施方案中，囊泡的其余组分(例如小于50％、40％、30％、20％、10％或5％w/w)是具有至少70％M残基的藻酸酯低聚物，但是其他组分也可以存在，如下所述。
在囊泡中，层状相通常包封水相并将该相与水性外部相分离，这意味着层状相起着膜的作用，该膜抑制或阻止某些分子(例如亲水性分子)从内部相扩散到外部相，反之亦然。层状相因此可以被描述为部分(例如，选择性地)可渗透膜。
囊泡可以是脂质体，在这种情况下，层状相是由至少一种两亲脂质形成的脂质双层。囊泡的其他形式包括但不限于聚合物小体(基于两亲性嵌段共聚物的层状相)和类脂质体(基于非离子表面活性剂的层状相)以及脂质体、聚合物小体和类脂质体的杂合形式。脂质体是本发明中使用的囊泡的优选形式。
用于制备脂质体的两亲脂质可以是由亲水性部分和疏水性部分(通常是亲水性头部和疏水性尾部)组成的任何脂质，其可以在水溶液中自发组装成双层。这可以包括来自阳离子脂质、两性离子脂质、中性脂质或阴离子脂质的代表。阳离子脂质的使用可以提供或至少有助于制造根据本发明的微米/纳米颗粒阳离子所需的正电荷。在其他实施方案中，非两亲脂质体形成组分可以提供或至少有助于制造根据本发明的微米/纳米颗粒阳离子所需的正电荷。在某些实施方案中，用于本发明的脂质体由阳离子脂质与非阳离子脂质例如中性脂质和任选地其他脂质体形成组分组合形成。
有用的两亲脂质的亲水部分可包含极性或带电荷的基团，例如碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团。疏水部分可包含非极性基团，其包括但不限于长链饱和及不饱和脂族烃基团和被一个或多个芳族、环脂族或杂环基团取代的基团。两亲脂质化合物的实例包括但不限于磷脂、氨基脂质、糖脂和鞘脂。
阳离子脂质在生理条件(例如pH)下含有带正电的官能团。阳离子脂质包括但不限于N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)，N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)，2,3-二油酰氧基三甲基铵丙烷(DOTAP)，2,3-二(油氧基)丙基三甲基铵(DOTMA)，N-[1-(2,3,-二-十四烷氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)，N-[[1-(2,3,二油氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(DORIE)，3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Choi)，二甲基-二-十八烷基铵(DDAB)，二-十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)和N,N-二甲基-2,3-二油氧基)丙胺(DODMA)。
在某些实施方案中，用于本发明的脂质体的脂质可以包括阴离子或中性(包括两性离子和极性)脂质，例如阴离子或中性磷脂。在选定的pH下，中性脂质以不带电或中性的两性离子形式存在。在生理pH下，此类脂质包括例如二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷和二酰基甘油。合适的两性离子脂质包括但不限于，二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)。阴离子脂质是在生理pH下带负电荷的脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油，心磷脂，二酰基磷脂酰丝氨酸，二酰基磷脂酰酸，N-十二烷基-酰基磷脂酰乙醇胺，N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺，N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺，赖氨酰基磷脂酰甘油，棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)，以及与中性脂质相连的其他阴离子改性基团。
阴离子和中性脂质在本文中可以称为非阳离子脂质。此类脂质可含有磷。在本发明中使用的脂质体中使用的非阳离子脂质的实例包括卵磷脂，溶血卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)，棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)，鸡蛋磷脂酰胆碱(EPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)，二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)，二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)，棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油POPG)，16-0-单甲基PE，16-0-二甲基PE，18-1-反式PE，棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)，1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，脑磷脂，心磷脂，磷脂酸，脑苷，二鲸蜡醇磷酸酯和胆固醇。
在其他实施方案中，两亲脂质可以选自磷脂酰胆碱，例如1,2-二油酰基-磷脂酰胆碱，1,2-二棕榈酰基-磷脂酰胆碱，1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱，1,2-二硬脂酰基-磷脂酰胆碱，1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱，1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰胆碱，1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱；磷脂酰乙醇胺，例如1,2-二油酰基-磷脂酰乙醇胺，1,2-二棕榈酰酰基磷脂酰乙醇胺，1,2-二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺，1,2-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺，1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺，1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺，1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺和N-琥珀酰基-油酰基-磷脂酰乙醇胺；磷脂酰丝氨酸，例如1,2-二油酰基-磷脂酰丝氨酸，1,2-二棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸，1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰丝氨酸，1,2-二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸，1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸，1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸，1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸；磷脂酰甘油，例如1,2-二油酰基-磷脂酰甘油，1,2-二棕榈酰基-磷脂酰甘油，1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰甘油，1,2-二硬脂酰-磷脂酰甘油，1-油酰基-2-棕榈酰-磷脂酰甘油，1-油酰-2-硬脂酰基磷脂酰甘油，1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油；聚乙二醇化脂质；聚乙二醇化磷脂，例如磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]，磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]，磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-3000]，磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000]；聚乙二醇化神经酰胺，例如N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)1000]}，N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)2000]}，N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)3000]}，N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)5000]}；溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰甘油，溶血磷脂酰丝氨酸，神经酰胺；鞘脂；糖脂，例如神经节苷脂GM1；糖脂；硫脂；磷脂酸，例如二棕榈酰-甘油磷脂酸；棕榈脂肪酸；硬脂脂肪酸；花生四烯脂肪酸；月桂脂肪酸；肉豆蔻脂肪酸；十二烯脂肪酸；植物性脂肪酸；肉豆蔻烯脂肪酸；棕榈烯脂肪酸；岩芹酸脂肪酸；油酸脂肪酸；异月桂酸脂肪酸；异肉豆蔻酸脂肪酸；异硬脂酸脂肪酸；固醇和固醇衍生物，例如胆固醇，胆固醇半琥珀酸酯，胆固醇硫酸酯和胆固醇-(4-三甲基铵)-丁酸酯，麦角固醇，羊毛甾醇；聚氧乙烯脂肪酸酯和聚氧乙烯脂肪酸醇；聚氧乙烯脂肪酸醇醚；聚氧乙烯化的脱水山梨糖醇脂肪酸酯，甘油聚乙二醇氧硬脂酸酯；甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯；乙氧基化大豆固醇；乙氧基化蓖麻油；聚氧乙烯聚氧丙烯脂肪酸聚合物；聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯；二油酰基-sn-甘油；二棕榈酰基-琥珀酰甘油；1,3-二棕榈酰基-2-琥珀酰甘油；1-烷基-2-酰基-磷脂酰胆碱，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱；1-烷基-2-酰基-磷脂酰乙醇胺，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺；1-烷基-2-酰基-磷脂酰丝氨酸，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸；1-烷基-2-酰基-磷脂酰甘油，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油；1-烷基-2-烷基-磷脂酰胆碱，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰胆碱；1-烷基-2-烷基-磷脂酰乙醇胺，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰乙醇胺；1-烷基-2-烷基-磷脂酰丝氨酸，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰丝氨酸；1-烷基-2-烷基-磷脂酰甘油，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰甘油；N-琥珀酰基-二十八烷基胺；棕榈酰同型半胱氨酸；月桂基三甲基溴化铵；十六烷基三甲基溴化铵；肉豆蔻基三甲基溴化铵；
DOTMA；DOTAP；1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基铵)-丁酰基-sn-甘油(DOTB)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-2000)；DSPE-PEG2000-TATE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]-TATE)；和1-十四烷酰基-2-十八碳酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MSPC)。
可以使用的其他脂质可以选自WO2017/153779、WO2005/117985和WO03/094974中公开的那些。
在某些实施方案中，脂质可以选自2,3-二(油氧基)丙基三甲基铵(DOTMA)、DHDTMA、DOSEP3、GL67和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在特定实施例中，层状相可以例如以重量比(1：1)包含DOPE和DOTMA，或者例如以(1：1)重量比包含DOPE和DHDTMA，或者例如以重量比(1：1)包含DOPE和DOSEP3。
用于制备聚合物小体的两亲嵌段共聚物可以是由亲水性聚合物和疏水性聚合物组成的任何共聚物，其可以自发组装成至少单层，通常是双层，在水溶液中其具有亲水性外表面和在所述层之间的至少一个疏水区域。在一个优选的实施方案中，两亲性嵌段共聚物是具有一个亲水性聚合物区域和一个疏水性聚合物区域的二嵌段共聚物。在另一个优选的实施方案中，该共聚物是三嵌段共聚物，其在第一亲水性聚合物区域和第二亲水性聚合物区域之间具有疏水性聚合物区域。在含有这种三嵌段共聚物的聚合物小体中，一种三嵌段共聚物替代了两种二嵌段共聚物并跨越了层状相，从而形成了具有亲水性外表面和在所述外表面之间的疏水区域的单层。可以类似地使用包含大量重复的亲水和疏水区域的嵌段聚合物，从而形成多层层状相。
在一个优选的实施方案中，该嵌段共聚物是无毒的。在一个优选的实施方案中，嵌段共聚物是可生物降解的。在一个优选的实施方案中，嵌段共聚物具有支持聚合物小体形成的亲水级分(fEO)。例如，共聚物可以具有等于或大于50％、40％、30％、20％、10％或5％的fEO。亲水区域可以包含聚乙二醇，聚环氧乙烷，聚(异氰基-L-丙氨酸-L-丙氨酸)，聚丙烯酸，聚(甲基噁唑啉)，聚(4-乙烯基吡啶)，聚-L-谷氨酸，聚(Ne-2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰基-L-赖氨酸，聚(γ-苄基L-谷氨酸)或右旋糖酐。聚乙二醇可以是甲氧基聚(乙炔二醇)5000。疏水区域可以包含聚丙交酯，聚(乳酸)，聚(乙基乙烯)，聚丁二烯，聚己内酯，聚丙硫醚，聚苯乙烯，聚-L-亮氨酸，聚酯，聚(环氧丁烷)，聚(异丁烯)，聚苯乙烯-b-聚(异氰基丙氨酸(2-噻吩-3-基乙基)酰胺，聚(2-硝基苯丙氨酸)，聚(γ-甲基-L-己内酯)或聚(碳酸三亚甲基酯)或透明质酸。可以至少部分地通过包含阳离子嵌段共聚物，例如聚(甲基丙烯酸[二甲基氨基]乙酯)，使聚合物小体成为阳离子型。在其他实施方案中，非两亲聚合物小体形成组分可以提供或至少有助于制造根据本发明的微米/纳米颗粒阳离子所需的正电荷。对于手性分子的聚合物，该聚合物可以包含D-形式、L-形式或D-和L-形式的混合物。例如，聚(乳酸)可以是聚(D)-(L)-乳酸。聚(D)-(L)-乳酸可具有的D和L立体异构体相对百分比为10％/90％、20％/80％、30％/70％、40％/60％、50％/50％、60％/40％、70％/30％、80％/20％或90％/10％。
用于制备类脂质体的两亲性非离子表面活性剂可以是由亲水性部分和疏水性部分组成的可以在水溶液中自发组装成双层的任何非离子性表面活性剂。也可以使用非离子表面活性剂和胆固醇或三酰基甘油的混合物。作为非离子表面活性剂，聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物等可以单独使用或组合使用。非离子表面活性剂的具体实例可包括吐温61、吐温80和司盘80、Pluronic F-88(F88)。胆固醇的具体实例可以包括胆固醇、α-胆固醇、β-胆固醇、胆甾烷、去甾醇(5,24-胆固醇二烯-3β-醇)、胆酸钠和胆钙化固醇。可以至少部分地通过包含阳离子脂质例如2,3-二(十四烷氧基)丙-1-胺或二十二烷基二甲基溴化铵，使类脂质体变成阳离子型。在其他实施方案中，非两亲类脂质体形成组分可以提供或至少有助于制造根据本发明的微米/纳米颗粒阳离子所需的正电荷。
囊泡还可包含官能化的囊泡形成化合物。官能化的囊泡形成化合物的代表性的非限制性实例包括唾液酸衍生物，葡糖醛酸衍生物；谷氨酸衍生物；聚甘油衍生物；聚乙二醇衍生物(包括甲氧基聚乙二醇缩合物等)，例如N-[羰基-甲氧基聚乙二醇2000]-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-750]-1,2-二硬脂酰基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺，N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(MPEG2000-二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺)，N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，DSPE-PEG-2000和DSPE-PEG2000-TATE。
可以用受体亲和分子将任何上述囊泡形成化合物衍生化，以帮助将囊泡靶向选择的靶位点。这样的亲和分子包括受体特异性多肽、核酸和碳水化合物，例如抗体、抗体片段、肽生长因子、DNA和RNA。所述受体可以是多肽(例如整联蛋白、钙粘蛋白、选择蛋白、ICAM-1)、核酸或碳水化合物。大批受体-配体对是本领域技术人员已知的，并且可以在没有不适当负担的情况下进行鉴定，并且这些对中的任何一个都可以提供选择用于本发明的受体亲和分子的基础。实例包括在WO96/15811、WO98/54347、WO01/92543、WO02/072616、WO2004108938和WO2007/138324中描述的肽配体。受体配体衍生的脂质体形成化合物可包括WO2007/138324中描述的那些。在某些实施方案中，受体亲和分子不是目标分子，不是藻酸酯低聚物，或者本身(即，当未与另一化学实体偶联时)不是自组装的微米/纳米颗粒形成剂。
制备本发明中使用的囊泡的技术是众所周知的，并且完善建立并且因此是完全常规的。该技术的讨论可见于Huang Z,et al.,2014,Progress involving new techniquesfor liposome preparation,Asian Journal of Pharmaceutical Sciences,Vol 9(4):176-82；Torchilin VP.,2012,Multifunctional nanocarriers,Advanced Drug DeliveryReviews,Vol 64(SUPPL.):302-15；Vemuri S,et al,1995,Preparation andcharacterization of liposomes as therapeutic delivery systems:a review,Pharmaceutica Acta Helvetiae,Vol 70(2):95-111；Carugo,D.,et al,2016,Liposomeproduction by microfluidics:potential and limiting factors,ScientificReports,6:25876；
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广义上讲，可以使用分批技术制备囊泡微米/纳米颗粒，所述分批技术在宏观环境中产生异质性囊泡群体，或使用微流体方法，其中在受限的微环境中形成囊泡，从而可产生更均质的囊泡群体，这是由于可以对形成囊泡的微环境的物理参数施加更大的控制。
这些分批方法可细分为基于最初干燥的囊泡形成化合物的预组织膜的溶胀(即再水化方法)，然后对分散的双层进行机械操作的那些方法，并且那些方法涉及使用(i)囊泡形成化合物可溶于其中的助溶剂，(ii)其他非双层形成的“双亲体(coamphiphile)”，或(iii)影响囊泡形成化合物超分子聚集的特定离子种类。
微流体方法在文献中有广泛描述，并且包括被称为电形成和水合、挤出、脉冲喷射、双重乳液模板化、冰滴水化、瞬态膜喷射、液滴乳液转移、流体动力夹紧(pinch-off)和流体动力聚焦的那些方法。根据本发明，可以有利地使用微流体的流体动力聚焦。
因此，根据本发明，可以通过本文所述的用于形成囊状微米/纳米颗粒的任何方法，特别是分批生产方法或微流体生产方法(电形成和水合、挤出、脉冲喷射、双重乳液模板化、冰滴水化、瞬态膜喷射、液滴乳液转移、流体动力夹紧和流体动力聚焦)，制备由两亲性自组装微米/纳米颗粒形成化合物形成的微米/纳米颗粒。
因此，在某些实施方案中，本发明的涉及由两亲性自组装微米/纳米颗粒形成化合物形成的微米/纳米颗粒的方法可以包括另外的步骤，其中例如通过本文所述的用于形成囊状微米/纳米颗粒的任何方法，特别是分批生产方法或微流体生产方法，制备微米/纳米颗粒。
用于本发明的微米/纳米颗粒可以是胶束。胶束是两亲化合物的球形自组装超分子组装体，其中亲水区域作为外壳接触周围的水相，而疏水区域隔离在胶束中心，形成连续的疏水核。任何上述两亲化合物都可以形成胶束，例如通过在高于所用化合物或其组合的临界胶束浓度的水溶液中提供所述化合物。如上文针对囊泡微米/纳米颗粒所述，在胶束和/或官能化的两亲化合物中存在其他组分可以用于胶束微米/纳米颗粒的情况中。胶束可以至少部分地通过包含阳离子两亲性化合物而变成阳离子型，例如如上所述。在其他实施方案中，非两亲胶束形成组分可以提供或至少有助于制造根据本发明的微米/纳米颗粒阳离子所需的正电荷。
用于本发明的微米/纳米颗粒可以是病毒，特别是携带核酸载体或异源肽(野生型病毒中不存在的肽)的病毒。这样的病毒可以方便地用于将包含治疗性或诊断性核酸的治疗性或诊断性肽或载体递送至目标粘膜表面例如呼吸道、GI道和生殖道的表面的上皮细胞。更一般地，病毒本身可以是抗病毒疫苗的活性成分，和/或可以递送病毒携带的或由病毒携带的核酸载体表达的异源肽抗原。根据本发明使用的病毒例如病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒、痘病毒、α病毒和疱疹病毒及其杂合物。在其他实施方案中，病毒可以是溶瘤病毒，即优先感染并杀死癌细胞的病毒。溶瘤病毒可以例如选自腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、塞姆利基森林病毒、牛痘、塞内卡病毒、马拉巴病毒和肠病毒的溶瘤形式。
病毒样颗粒是非致病性的微米/纳米颗粒，当结构病毒蛋白在合适的宿主细胞中表达时，它们通过自组装形成。自组装过程中不会将病毒核酸包装到颗粒中。此类颗粒可以充当疫苗抗原和/或可以被设计成通过共价连接结构病毒蛋白的此类分子或通过在目标分子的存在下进行自组装而携带本发明的目标分子。病毒样颗粒可由逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、痘病毒、α病毒、疱疹病毒和肝炎病毒的结构蛋白形成。
碳纳米管是具有纳米或微米范围的圆柱形结构的碳的同素异形体。圆柱结构可以是单层(单壁纳米管)或多层(多壁纳米管)。这些结构可以以文献中充分描述的多种方式制备，例如化学气相沉积、电弧放电、高压一氧化碳歧化和激光烧蚀。碳纳米管可以通过表面官能化或通过在微米/纳米颗粒中或之上包含阳离子成分而变成阳离子型。
树枝状聚合物是具有纳米级尺寸的高度分支的星形大分子。树枝状聚合物由三个组分限定：中心核、内部树枝状结构(分支)和具有官能表面基团的外表面。通过改变这些组分的组合，具有不同形状和大小的树枝状聚合物带有屏蔽内核和特定表面特性(例如正表面电荷)。通过逐步化学方法合成树枝状聚合物，以产生具有窄分子量分布、均匀大小和形状以及多个(多价)表面基团的分子的不同世代(G0、G1、G2、...)。根据本发明使用的树枝状聚合物可包括聚酰胺基胺(PAMAM)树枝状聚合物、聚丙烯亚胺树枝状聚合物、硫代磷酰基树枝状聚合物、环三磷腈树枝状聚合物和2,2-双(羟甲基)丙酸(bis-MPA)树枝状聚合物。树枝状聚合物可以至少部分地通过使用阳离子结构组分和/或通过使用阳离子官能表面基团和/或在微米/纳米颗粒中或之上包含其他阳离子组分而变成阳离子型。
固体微米/纳米颗粒的实例包括聚合物微米/纳米颗粒、二氧化硅微米/纳米颗粒和金属微米/纳米颗粒。
聚合物微米/纳米颗粒可以由任何合适的聚合物形成(包括通过自组装(polyplexes)、一层一层组装或通过凝胶化，例如水凝胶化)，例如聚苯乙烯、聚乳酸、聚丙烯酰胺、三聚氰胺、聚(D-L-丙交酯)、聚-D-L-乙交酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)PLA、聚己内酯、壳聚糖、明胶、白蛋白、葡聚糖、琼脂糖、聚-L-谷氨酸、聚L-赖氨酸。可以至少部分地通过包含阳离子聚合物，例如聚L-赖氨酸，和/或通过表面官能化或在微米/纳米颗粒中或之上包含其他阳离子成分，使聚合物微米/纳米颗粒成为阳离子型。
金属和金属性微米/纳米颗粒可由以下金属及其同位素形成：金(例如198Au、199Au)，银(例如107Ag和109Ag)，铂(例如195mPt)，铁(例如59Fe)，铜(例如61Cu、64Cu和67Cu)，钆(例如149Gd、151Gd)，铟(例如111ln)，锝(例如99mTc)，镓(例如67Ga、68Ga)，铼(例如188Re、186Re)，镥(例如177Lu)，锕(例如225Ac)，钇(例如90Y)，锑(例如119Sb)，锡(例如117Sn、113Sn)，镝(例如159Dy)，钴(例如56Co、60Co)，钌(例如97Ru、103Ru、106Ru)，钯(例如103Pd)，镉(例如115Cd)，碲(例如118Te、123Te)，钡(例如131Ba、140Ba)，铽(例如160Tb)，镧(例如140La)，镭(例如223Ra、224Ra)，锶(例如89Sr)，钐(例如153Sm)镱(例如169Yb)，铊(例如201TI)，铯(例如137Cs)，铱(例如192Ir)和铷(例如82Rb)。金属可以以任何现有的金属氧化态出现。这些氧化态包括一价阳离子、二价阳离子、三价阳离子、四价阳离子、五价阳离子、六价阳离子和七价阳离子。颗粒的功能化，例如用基于铵的物质(精氨酸、聚乙烯亚胺等)或基于磷鎓的物质(膦酰基烷基硫代硫酸盐、膦酰基烷基硫代乙酸盐)的官能化可提供阳离子表面电荷。金属/金属性微米/纳米颗粒可以是微米/纳米球、微米/纳米星、微米/纳米笼或微米/纳米壳。
二氧化硅微米/纳米颗粒可以是中孔二氧化硅。
在某些实施方案中，本发明中使用的微米/纳米颗粒可进一步包含为或携带受体亲和分子以帮助将微米/纳米颗粒靶向至所选靶位点的组分。这样的亲和分子包括受体特异性多肽、核酸和碳水化合物，例如抗体、抗体片段、肽生长因子、DNA和RNA。所述受体可以是多肽(例如整联蛋白、钙粘蛋白、选择蛋白、ICAM-1)、核酸或碳水化合物。大批受体-配体对是本领域技术人员已知的，并且可以在没有不适当负担的情况下进行鉴定，并且这些对中的任何一个都可以提供选择用于本发明的受体亲和分子的基础。实例包括在WO96/15811、WO98/54347、WO01/92543、WO02/072616、WO2004108938和
WO2007/138324中描述的肽配体。受体亲和分子可以包括在WO2007/138324中在受体亲和分子衍生的脂质体形成化合物的背景下描述的那些。在某些实施方案中，受体亲和分子不是目标分子，不是藻酸酯低聚物，或者本身(即，当未与另一化学实体偶联时)不是自组装的微米/纳米颗粒形成剂。
如上所述，在某些实施方案中，用于本发明的微米/纳米颗粒携带目标分子，特别是要被递送至粘膜表面的上皮细胞的分子。这样的分子可以包括治疗活性剂(药物/药)，诊断或成像剂或用于工程化细胞或细胞产生的产物的性质的试剂(例如，酶、辅因子、前体物质、底物)。治疗剂尤其可以是小分子药物、生物治疗剂或放射性药物(例如放射性核素或放射性免疫治疗剂)。生物治疗剂包括但不限于抗体、肽激素、细胞因子、肽生长因子，肽抗原和核酸(例如用于基因治疗、基因编辑、RNA干扰疗法(例如siRNA或miRNA)、反义疗法和体外转录mRNA(IVT-mRNA)疗法的核酸)。诊断剂可以包括放射诊断剂(例如诊断性放射性核素)、造影剂或用作分子探针的核酸或蛋白质(例如寡核苷酸和抗体)。细胞工程剂可包括核酸酶(例如Cas9、Cpf1)、蛋白酶、脂肪酶和辅因子。
治疗活性剂可以是CFTR调节剂，抗生素，抗真菌剂，抗病毒剂，细胞毒性化学治疗剂，血管生成抑制剂，抗癌单克隆抗体，放射免疫治疗剂，免疫刺激剂，免疫抑制剂，皮质类固醇，非类固醇抗炎药(NSAID)，支气管扩张药，口服降糖药或放射性药物。
CFTR调节剂是可以至少部分解决CFTR功能障碍的小分子。CFTR调制剂可分为CFTR增强剂、CFTR校正剂和通透剂(read-through agent)。
CFTR增强剂是这样的CFTR调节剂，其增加存在于上皮细胞表面的CFTR离子通道的活性(例如，通过增加通道的打开概率(门打开时间和/或门控概率)或电导率)。这可以采取以下形式：在有缺陷的CFTR中从降低的水平增加离子通道活性，或在尺寸减小的正常CFTR群体中将离子通道活性增加到高于正常水平。
CFTR校正剂是这样的CFTR调节剂，其增加递送或保留在上皮细胞表面的CFTR蛋白的量。考虑到CFTR加工中的各种缺陷会导致上皮细胞表面CFTR量减少，因此这些分子可以多种方式实现此效果。例如，某些CFTR校正剂可以充当分子伴侣(chaperone)，促进CFTR的适当倍数和翻译后修饰，保护CFTR免于过早降解，促进CFTR的细胞内靶向并逆转CFTR在细胞膜上的加速更新。这可以采取以下形式：增加已递送或保留在上皮细胞表面的正常CFTR蛋白的量至反映健康细胞的水平，或增加递送或保留在上皮细胞表面的部分缺陷CFTR蛋白的量，例如，至高于健康细胞中野生型CFTR所见的水平。
通透剂是这样的CFTR调节剂，其引起细胞的翻译机制通过CFTR mRNA转录物中的任何过早终止密码子，从而增加所产生的基本上全长且优选功能CFTR的数量。
在某些实施方案中，CFTR调节剂选自以下文献公开的那些：WO2006/002421、WO2007/056341、WO2007134279、WO2009038683、WO2009064959、WO2009073757、WO2009076141、WO2009076142、WO2010019239、WO2010037066、WO2010048526、WO2010053471、WO2010054138、WO2010138484、WO2011019413、WO2011050325、WO2011072241、WO2011127241、WO2011127290、WO2011133751、WO2011133951、WO2011133953、WO2011133956、WO2011146901、Pedemonte,N.,et al.,J ClinInvest.2005；115(9):2564-2571、Van Goor,F.et al.,Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol 2006,290:L1117–L1130、和Pedemonte,N.,et al.,Molecular Pharmacology,2005vol.67no.5 1797-1807，将它们的内容通过引用并入本文。
特别要提到的是在以下中的增强剂：苯甘氨酸，磺酰胺(如Pedemonteet al.,Molecular Pharmacology,2005报道)，吡唑(例如[如Van Goor,F.et al,Am J PhysiolLung Cell Mol Physiol 2006报道的[4-甲基-2-(5-苯基-1H-吡唑-3-基)苯酚]，黄酮(例如异黄酮和苯并黄酮，尤其是染料木黄酮和芹菜素)，黄嘌呤(例如异丁基甲基黄胺(IBMX)、8-环戊基-1,3-二丙基黄嘌呤(CPX)、1-异丁基黄嘌呤(XC-33))，苯并噻吩(例如四氢苯并噻吩)，苯并咪唑酮(例如NS004、5-三氟甲基-1-(5-氯-2-羟基苯基)1,3-二氢-2H-苯并咪唑-二唑-2-酮；NS1619、1,3-二氢-1-[2-羟基-5-(三氟甲基)苯基]-5-(三氟甲基)-2H-苯并咪唑-2-酮)，辣椒素，荧光素(例如荧光桃红B)，菲咯啉，苯并喹啉，二氢吡啶(例如1,4-二氢吡啶，特别是非洛地平)，异喹啉和苯并[c]喹啉鎓(例如MPB-27(6-羟基-7-氯苯并[c]喹啉鎓)，MPB-07(6-羟基-10-氯苯并[c]喹啉鎓)，MPB-91(5-丁基-10-氯-6-羟基苯并[c]喹啉鎓氯化物)，MPB-104(5-丁基-7-氯-6-羟基苯并[c]喹啉鎓氯化物)，如Norez et al,J.Pharmacology and Experimental Therapeutics,2008,325,89-99报道的)类。本发明中使用的其他调节剂和相应的分子结构如图10所示。
CFTR校正剂包括4-苯基丁酸酯(4-PBA)，1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸二酰胺，异喹啉中的化合物，环烷基羧酰氨基-吡啶苯甲酸和苯并[c]喹啉鎓类(例如，MPB-07、MPB-80(10-氟-6-羟基苯并[c]喹啉鎓氯化物(MPB-91和MPB 104)以及其他各种结构类别的化合物，如Pedemonte et al.J.Clin.Invest.(2005)和Van Goor,F.et al.Am J Physiol LungCell Mol Physiol(2006)报道并在图3中显示的(氨基苯并噻唑(例如2-氨基苯并噻唑)，氨基芳基噻唑(例如2-氨基-4-芳基噻唑)，喹唑啉酮(例如喹唑啉基氨基嘧啶酮)(特别是2-喹唑啉基-4-氨基嘧啶酮)，双氨基甲基噻唑，N-苯基氨基喹啉(例如(N-苯基氨基)喹诺酮))。
代表性的CFTR调节剂包括N-(2,4-二叔丁基-5-羟苯基)-1,4-二氢-4-氧喹啉-3-羧酰胺(ivacaftor；VX-770)，[4-甲基-2-(5-苯基-1H-吡唑-3-y)苯酚](VRT-532)，VRT-422，4-环己氧基-2-{1-[4-(4-甲氧基-苯磺酰基)-哌嗪-1-基]-乙基}-喹唑啉(VRT-325)(均在Van Goor,F.et al.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol(2006)和图3中)，3-[6-[[1-(2,2-二氟-1,3-苯并二噁唑-5-基)环丙烷羰基]氨基]-3-甲基吡啶-2-基]苯甲酸(lumacaftor；VX-809)，VX-661(tezacaftor；1-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧杂环戊烷-5-基)-N-[1-[(2R)-2,3-二羟丙基]-6-氟-2-(2-羟基-1,1-二甲基乙基)-1H-吲哚-5-基]-环丙烷甲酰胺)，N6022(3-[1-(4-氨基甲酰基-2-甲基苯基)-5-(4-咪唑-1-基苯基)吡咯-2-基]丙酸)，ataluren，1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸二酰胺，4-苯基丁酸酯(4-PBA)，染料木黄酮，芹菜素，MPB-07，MPB-27，MPB-91，MPB-104，非洛地平，NS004，荧光桃红B，IBMX，CPX，XC-33，辣椒素和庆大霉素，优选ivacaftor，lumacaftor，VX-661，和ataluren，最优选ivacaftor和lumacaftor。
在上述CFTR调节剂中，以下被认为是增强剂：VX-770，VTR-532，染料木黄酮，芹菜素，MPB-07，MPB-27，MPB-91，MPB-104，非洛地平，NS004，荧光桃红B，IBMX，CPX，XC-33，辣椒素和染料木黄酮。在上述CFTR调制剂中，以下被视为校正剂：VRT-422，VRT-325，VX-809，VX-661，N6022，1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸二酰胺，4-苯基丁酸酯(4-PBA)，MPB-07，MPB 80，MPB-91和MPB-104。在上述CFTR调节剂中，以下被认为是通透剂：ataluren和庆大霉素。
抗生素可以选自氨基糖苷类(例如阿米卡星，庆大霉素，卡那霉素，新霉素，奈替米星，链霉素，妥布霉素)；β-内酰胺类(例如羧甲基苯丙胺类(例如洛拉卡培夫)；第一代头孢菌素(例如头孢羟氨苄，头孢唑林，头孢氨苄)；第二代头孢菌素(例如头孢克洛，头孢曼多尔，头孢氨苄，头孢西丁，头孢吡嗪，头孢呋肟)；第三代头孢菌素(头孢克肟，头孢地尼，头孢托仑，头孢哌酮，头孢噻肟，头孢泊肟，头孢他啶，头孢替丁，头孢唑肟，头孢曲松)；第四代头孢菌素(例如头孢吡肟)；单杆菌(例如氨曲南)；大环内酯类(例如阿奇霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，竹桃霉素)；单环内酰胺类(例如氨曲南)；青霉素类(例如阿莫西林，氨苄青霉素，羧苄青霉素，克洛西林，双氯西林，萘夫西林，奥沙西林，青霉素G，青霉素V，哌拉西林，替卡西林)；多肽抗生素类(例如杆菌肽，黏菌素，多粘菌素B)；喹诺酮类(例如环丙沙星，依诺沙星，加替沙星，左氧氟沙星，洛美沙星，莫西沙星，诺氟沙星，氧氟沙星，曲伐沙星)；磺酰胺类(例如马芬尼，磺胺醋酰，磺胺甲基咪唑，柳氮磺吡啶，磺胺异噁唑，甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑)；四环素类(例如去甲环素，强力霉素，米诺环素，土霉素，四环素)；甘氨酰环素(如替加环素)；碳青霉烯类(例如亚胺培南，美罗培南，厄他培南，多利培南，帕尼培南/倍他米隆，比阿培南，PZ-601)；其他抗生素包括氯霉素；克林霉素，乙胺丁醇；磷霉素；异烟肼；利奈唑胺；甲硝唑；呋喃妥因；吡嗪酰胺；奎奴普丁/达福普汀；利福平；壮观霉素；和万古霉素。
更优选地，抗生素选自阿米卡星，庆大霉素，卡那霉素，新霉素，奈替米星，链霉素，妥布霉素，头孢克肟，头孢地尼，头孢托仑，头孢哌酮，头孢噻肟，头孢泊肟，头孢他啶，头孢替丁，头孢唑肟，头孢曲松，头孢吡肟，氨曲南，头孢噻肟，阿莫西林，氨苄青霉素，羧苄青霉素，克洛西林，双氯西林，萘夫西林，奥沙西林，青霉素G，青霉素V，哌拉西林，替卡西林，环丙沙星，依诺沙星，加替沙星，左氧氟沙星，洛美沙星，莫西沙星，诺氟沙星，氧氟沙星，曲伐沙星，阿奇霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，罗红霉素，泰利霉素，碳霉素A，乔沙霉素，吉他霉素，Midecamicine，竹桃霉素，螺旋霉素，troleandromycin，泰乐霉素，亚胺培南，美罗培南，厄他培南，多利培南，帕尼培南/倍他米隆，比阿培南，PZ-601，杆菌肽，粘菌素，多粘菌素B，去甲金霉素，多西环素，米诺环素，土霉素和四环素。
更优选地，抗生素选自氨曲南，环丙沙星，庆大霉素，妥布霉素，阿莫西林，粘菌素，头孢他啶，阿奇霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，罗红霉素，螺旋霉素，土霉素，亚胺培南。
在特别优选的实施方案中，抗生素选自氨曲南，环丙沙星，庆大霉素，妥布霉素，阿莫西林，粘菌素和头孢他啶。
代表性的抗真菌剂包括但不限于多烯类(例如那他霉素，龟裂杀菌素，菲律宾菌素，制霉菌素，两性霉素B，candicin；咪唑类(例如咪康唑，酮康唑，克霉唑，益康唑，联苯并唑，丁康唑，芬替康唑，异康唑，氧康唑，舒康唑，噻康唑)；三唑类(例如氟康唑，伊曲康唑，伊沙康唑，拉伏康唑，泊沙康唑，伏立康唑，叔康唑)；烯丙胺类(例如特比萘芬，阿莫罗芬，萘替芬，丁那芬)；以及棘白菌素类(例如阿尼芬净，卡泊芬净，米卡芬净)。
代表性的抗病毒药包括但不限于阿巴卡韦，阿昔洛韦，阿德福韦，金刚烷胺，安普那韦，阿比多尔，阿扎那韦，阿曲帕拉，博西普韦，西多福韦，康美韦，达那那韦，地拉夫定，去羟肌苷，二十二烷醇，依多西定，依非韦伦，恩曲他滨，恩夫韦肽，恩替卡韦，泛昔洛韦，福米韦生(fomivirsen)，福沙那韦，磷甲酸(foscarnet)，膦乙酸(fosfonet)，更昔洛韦，伊巴他滨，imunovir，碘苷(idoxuridine)，咪喹莫特，英地那韦，肌苷，III型干扰素，II型干扰素，I型干扰素，拉米夫定，洛匹那韦，洛韦胺，maravidavix，吗啉胍，奈非那韦，尼维拉平，nexavir，奥司他韦，喷昔洛韦，帕拉米韦，pleconaril，鬼臼毒素，拉尔格韦，利巴韦林，金刚乙胺，利托那韦，沙奎那韦，司他夫定，替诺福韦，替诺福韦二吡呋酯，替普那韦，三氟哩啶，trizivir，托孟他定，特鲁瓦达，万乃洛韦，缬更昔洛韦，vicriviroc，阿糖腺苷，viramidine，扎西他滨，扎那米韦和齐多夫定。
代表性的免疫刺激剂包括但不限于细胞因子，例如TNF、IL-1、IL-6、IL-8。
代表性的NSAID包括但不限于水杨酸盐类(例如阿司匹林(乙酰水杨酸)，胆碱三水杨酸镁，二氟尼柳，双水杨酯，丙酸衍生物(例如布洛芬，地昔布洛芬，右酮洛芬，芬诺洛芬，氟比洛芬，酮洛芬，洛索洛芬，萘普生，奥沙普秦)，乙酸衍生物(例如醋氯芬酸，双氯芬酸，依托度酸，吲哚美辛，酮咯酸，萘丁美酮，托美汀，舒林酸)，烯醇酸衍生物(例如屈恶昔康，异昔康，氯诺昔康，美洛昔康，吡罗昔康，替诺昔康酸)，氨茴酸衍生物(例如氟芬那酸，甲氯芬那酸，甲芬那酸，托芬那酸)和选择性COX-2抑制剂(昔布类；例如塞莱昔布，依他昔布，氯美昔布，帕瑞昔布，罗非昔布，伐地昔布)。丙酸衍生物(例如布洛芬，地昔布洛芬，右旋酮洛芬，芬诺洛芬，氟比洛芬，酮洛芬，洛索洛芬，萘普生，奥沙普嗪)是优选的，布洛芬是最优选的。
合适的支气管扩张药的代表性实例包括但不限于β2激动剂(例如短效β2激动剂(例如比丁特罗，肾上腺素，沙丁胺醇，左旋沙丁胺醇，克仑特罗，特布他林，丙卡特罗，间间羟异丙肾上腺素，非诺特罗，比索特罗甲磺酸盐，利托那林，异丙肾上腺素)；长效β2激动剂(如沙美特罗，福莫特罗，班布特罗，克仑特罗)和超长效β2激动剂(如茚达特罗)，抗胆碱药(如异丙托溴铵，阿托托铵，噻托溴铵)和茶碱。
合适的皮质类固醇的代表性实例包括但不限于泼尼松，氟尼松，曲安西龙，氟替卡松，布地奈德，莫米松，倍氯米松，氨磺尼德，布地奈德，地松奈德，氟西可尼德，氟轻松，氟尼松酮，氢化可的松，可的松，替可的松，泼尼松龙，甲基泼尼松龙，泼尼松，倍他米松，地塞米松，氟可酮，阿氯米松，泼尼卡酯，氯倍他松，氯倍他索和氟泼尼丁。
合适的口服抗糖尿病药的代表性实例包括但不限于磺酰脲类(例如卡布丁酰胺，乙酰己酰胺，氯丙酰胺，甲苯磺丁酰胺，格列吡嗪，格列齐特，格列本脲，格列波脲，格列酮，格列索肽，糖吡咯胺，格列美脲)，双胍类(例如，二甲双胍，苯乙双胍，丁双胍，氯胍(proguanil))，噻唑烷二酮类(例如罗格列酮，吡格列酮，曲格列酮)，α-葡萄糖苷酶抑制剂类(例如阿卡波糖，米格列醇，伏格列波糖)，美格列奈类(例如那格列奈，瑞格列奈，米格列奈)和lycosurics(例如达格列浄，ganagliflozin，伊格列净，托格列净(tofogliflozin)，恩格列净，依碳酸舍格列净，依碳酸瑞格列净)。
合适的细胞毒性化学治疗剂的代表性实例包括但不限于博来霉素，卡培他滨，卡铂，顺铂，环磷酰胺，达卡巴嗪，多西他赛，阿霉素，聚乙二醇化脂质体阿霉素，表柔比星，艾瑞布林，依托泊苷，氟尿嘧啶，吉西他滨，伊沙匹隆，甲氨蝶呤，氮芥，奥沙利铂，紫杉醇，丙卡巴肼，泼尼松龙，蛋白结合型紫杉醇，长春瑞滨，长春碱和长春新碱。
合适的血管生成抑制剂的代表性实例包括但不限于贝伐单抗，依维莫司，来那度胺，雷莫西单抗，索拉非尼，舒尼替尼和沙利度胺。
合适的抗癌单克隆抗体的代表性实例包括但不限于阿仑单抗，贝伐单抗，西妥昔单抗，奥法木单抗(ofatumumab)，帕尼单抗，利妥昔单抗和曲妥珠单抗，以及限制点抑制剂依匹莫单抗，尼古拉单抗，派姆单抗，阿妥珠单抗，阿维单抗，德瓦鲁单抗和cemiplimab。
合适的放射免疫治疗剂的代表性实例包括但不限于依贝妥单抗和托西妥单抗。
治疗性放射性核素的代表性例子包括但不限于铟(例如111ln)，锝(例如99mTc)，镓(例如67Ga、68Ga)，铼(例如188Re、186Re)，镥(例如177Lu)，锕(例如225Ac)，钇(例如90Y)，锑(例如119Sb)，锡(例如117Sn、113Sn)，镝(例如159Dy)，钴(例如56Co、60Co)，铁(例如59Fe)，铜(例如61Cu、64Cu和67Cu)，钌(例如97Ru、103Ru、106Ru)，钯(例如103Pd)，镉(例如115Cd)，碲(例如118Te、123Te)，钡(例如131Ba、140Ba)，镓(例如149Gd、151Gd)，铽(例如160Tb)，金(例如198Au、199Au)，镧(例如140La)，镭(例如223Ra、224Ra)，锶(例如89Sr)，钐(例如153Sm)，镱(例如169Yb)，铊(例如201TI)，铯(例如137Cs)，铱(例如192Ir)和铷(例如82Rb)。
诊断放射性核素的代表性示例包括但不限于铟(例如111ln)，锝(例如99mTc)，镓(例如67Ga、68Ga)，铷(例如82Rb)和铊(例如201TI)。
上述放射性核素可以金属的任何现有氧化态出现。这些氧化态包括一价阳离子、二价阳离子、三价阳离子、四价阳离子、五价阳离子、六价阳离子和七价阳离子。
合适的免疫抑制剂的代表性实例包括但不限于环孢素，雷帕霉素，他克莫司，放线菌素，丝裂霉素c，博来霉素，光辉霉素，硫唑嘌呤，氢化可的松，可的松，泼尼松，泼尼松龙，甲基强的松龙，贝沙米松，倍他米松，氟羟氢化泼尼松，倍氯米松，醋酸氟氢可的松，醋酸脱氧皮质酮和醛固酮。
在某些实施方案中，治疗性核酸可以包含编码在受试者中功能失调的蛋白质的功能形式的基因，例如CFTR基因。在其他实施方案中，核酸可以是IVT-mRNA分子，或编码或为siRNA分子、miRNA分子或反义RNA分子，其靶向功能异常的基因或过表达的基因，例如癌基因。在其他实施方式中，核酸可以编码或为CRISPR系统例如CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas13和/或CRISPR-Cpf1的一些或全部组分(例如核酶、sgRNA、crRNA、tracrRNA或DNA修复模板)。作为诊断剂，核酸可以与指示疾病或病症或其进展的核酸生物标志物的核苷酸序列互补。在其他情况下，例如体外细胞或组织培养，此类核酸可用于工程化细胞或细胞产生的产物的性质。
如上所述，藻酸酯通常以平均分子量至少为35,000道尔顿的聚合物存在，即约175至约190个单体残基，尽管通常更高，并且根据本发明的藻酸酯低聚物可以定义为通过以下方法获得的材料：藻酸酯聚合物(通常是天然存在的藻酸酯)的分馏(即尺寸减小)。藻酸酯低聚物可被认为是平均分子量小于35,000道尔顿(即小于约190或小于约175个单体残基)的藻酸酯，特别是平均分子量小于30,000道尔顿(例如，小于约175或小于约150个单体残基)，更特别是平均分子量小于25,000或20,000道尔顿(即小于约135或125个单体残基或小于约110或100个单体残基)的藻酸酯。
另一方面，低聚物通常包含2个或更多个单元或残基，并且根据本发明使用的藻酸酯低聚物将典型地包含2至100个单体残基，更典型地3、4、5或6至100个，并且可以包含2、3、4、5或6至75个，2、3、4、5或6至50个，2、3、4、5或6至40个，2、3、4、5或6至35个，或2、3、4、5或6至30个残基。因此，根据本发明使用的藻酸酯低聚物通常将具有平均分子量350、
550、700、900或1000至20,000道尔顿，350、550、700、900或1000至15,000道尔顿，350、550、700、900或1000至10,000道尔顿，350、550、700、900或1000至8000道尔顿，350、550、700、900或1000至7000道尔顿，或350、550、700、900或1000至6,000道尔顿。
替代地，藻酸酯低聚物可以具有的聚合度(DP)，或数均聚合度(DPn)，为2至100，优选地2至75，优选地2至50，更优选地2至40、2至35、2至30、2至28、2至25、2至22、2至20、2至18、2至17、2至15或2至12。
其他代表性范围(无论是残基数、DP还是DPn)包括3、4、5、6、7、8、9、10或11中的任何一个至50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13或12中的任何一个。
其他代表性范围(无论是残基数、DP还是DPn)包括8、9、10、11、12、13、14或15中的任何一个至50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17或16中的任何一个。
其他代表性范围(无论残基数、DP或DPn)包括11、12、13、14、15、16、17或18中的任何一个至50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19中的任何一个。
用于本发明的藻酸酯低聚物优选为3至35聚体，更优选3至28聚体，特别是4至25聚体，例如5至20聚体，特别是6至22聚体，尤其是8至20聚体，特别是10至15聚体，例如分子量为350至6400道尔顿，或350至6000道尔顿，优选是550至5500道尔顿，优选是750至5000道尔顿，尤其是750至4500道尔顿或2000至3000道尔顿或900至3500道尔顿。如上所述，其他代表性的藻酸酯低聚物包括具有5、6、7、8、9、10、11、12或13至50、45、40、35、28、25、22或20个残基的低聚物。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有3-28、4-25、6-22、8-20或10-15，或5-18或7-15或8-12，尤其是10的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有3-24、4-23、5-22、6-21、7-20、8-19、9-18、10-17、11-16、12-15或13-14(例如13或14)的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有4-25、5-24、6-23、7-22、8-21、9-20、10-19、11-18、12-17、13-16、14-15(例如14或15)的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有5-26、6-25、7-24、8-23、9-22、10-21、11-20、12-19、13-18、14-17或15-16(例如15或16)的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有4-50、4-40、4-35、4-30、4-28、4-26、4-22、4-20、4-18、4-16或4-14的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有5-50、5-40、5-25、5-22、5-20、5-18、5-23、5-20、5-18、5-16或5-14的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有6-50、6-40、6-35、6-30、6-28、6-26、6-24、6-20、6-19、6-18、6-16或6-14的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可具有8-50、8-40、8-35、8-30、8-28、8-25、8-22、8-20、8-18、8-16或8-14的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有9-50、9-40、9-35、9-30、9-28、9-25、9-22、9-20、9-18、9-16或9-14的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有10-50、10-40、10-35、10-30、10-28、10-25、10-22、10-20、10-18、10-16或10-14的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有11-50、11-40、11-35、11-30、11-28、11-25、11-22、11-20、11-18、11-16或11-14的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有12-50、12-40、12-35、12-30、12-28、12-25、12-22、12-20、12-18、12-16或12-14的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有13-50、13-40、13-35、13-30、13-28、13-25、13-22、13-20、13-18、13-16或13-14的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有14-50、14-40、14-35、14-30、14-28、14-25、14-22、14-20、14-18、14-16或14-15的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有15-50、15-40、15-35、15-30、15-28、15-25、15-22、15-20、15-18或15-16的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
本发明的藻酸酯低聚物可以具有18-50、18-40、18-35、18-30、18-28、18-25、18-22或18-20的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)。
藻酸酯低聚物优选为线性低聚物。
它可以是单一化合物或可以是化合物的混合物，例如具有聚合度范围的混合物。优选地，本发明的藻酸酯低聚物实质上不含，优选基本上不含聚合度在本文公开的范围之外的藻酸酯低聚物。这可以用本发明的藻酸酯低聚物的分子量分布来表示，例如，根据本发明所使用的具有在相关范围之外的DP的每摩尔藻酸酯低聚物的百分比。分子量分布优选使得不大于10％，优选不大于9、8、7、6、5、4、3、2或1％摩尔具有比DPn的相关上限大3、2或1的DP。同样地，优选的是不大于10％，优选不大于9、8、7、6、5、4、3、2或1％摩尔具有比DPn的相关下限小3、2或1数字的DP。
如上所述，藻酸酯低聚物将包含(或包括)古洛糖醛酸酯或古洛糖醛酸(G)和/或甘露糖醛酸酯或甘露糖醛酸(M)残基或单元。根据本发明的藻酸酯低聚物将优选仅由或基本上仅由糖醛酸酯/糖醛酸残基组成(即基本上由其组成)，更特别地仅由或基本上仅由G和/或M残基组成。可选地，在用于本发明的藻酸酯低聚物中，至少80％，更特别地至少85、90、95或99％的单体残基可以是糖醛酸酯/糖醛酸残基，或更特别地G和/或M残基。换句话说，优选地，藻酸酯低聚物将不包含其他残基或单元(例如，其他糖残基，或更特别地，其他糖醛酸/糖醛酸酯残基)。
如上所述，藻酸酯低聚物中的单体残基可以相同或不同，并且并非全部都需要带有带电荷的基团，尽管优选大多数(例如至少60％，优选至少80％，更优选至少90％)是这样。优选的是大部分，例如至少80％，更优选至少90％的带电基团具有相同的极性。在藻酸酯低聚物中，羟基与带电基团的比例优选为至少2∶1，更优选至少3∶1。
根据本发明，藻酸酯低聚物的至少70％的单体残基是M残基(即，甘露糖醛酸酯或甘露糖醛酸)。换句话说，藻酸酯低聚物将包含至少或替代地大于70％的甘露糖醛酸酯(或甘露糖醛酸)残基。因此，具体的实施方案包括具有(例如含有)70至100％M(甘露糖醛酸酯)残基的藻酸酯低聚物。进一步的具体实施方案还包括含有71至85％M残基或85至100％M残基的低聚物。因此，根据本发明的该实施方案使用的代表性藻酸酯低聚物将包含超过70％的M残基(即，藻酸酯低聚物的超过70％的单体残基将是M残基)。
在其他实施方案中，至少或75％、80％、85％、90％、95％或99％的单体残基是甘露糖醛酸酯。在一个实施方案中，藻酸酯低聚物可以是低聚甘露糖醛酸酯(即M或100％M的均低聚物)。
在另一个实施方案中，本发明的上述藻酸酯具有一级结构，其中大部分M残基在所谓的M-嵌段中。在该实施方案中，优选至少50％，更优选至少70或75％，最优选至少80、85、90或95％的M残基在M-嵌段中。M嵌段是至少两个M残基的连续序列，优选至少3个连续M残基，更优选至少4或5个连续M残基，最优选至少7个连续M残基。
特别地，至少80％，例如至少85％或90％的M残基与另一个M残基1-4连接。更特别地，藻酸酯的至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％的M个残基1-4连接至另一个M残基。
其他优选的低聚物是这样的藻酸酯低聚物，其中低聚物中至少70％的单体残基是1-4连接至另一个M-残基的M残基，或更优选该低聚物的至少75％，最优选至少80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的单体残基是与另一个M残基1-4连接的M残基。两个M残基的这种1-4连接可以可替代地表示为与相邻的甘露糖醛单元结合的甘露糖醛单元。
在另一个实施方案中，本发明的藻酸酯低聚物包含交替的M和G残基的序列。至少三个，优选至少四个，交替的M和G残基的序列代表MG嵌段。换句话说，本发明的藻酸酯低聚物包含MG嵌段。更具体地表达，MG嵌段是由G和M残基组成的至少三个连续残基的序列，并且其中该连续序列中的每个非末端(内部)G残基均与M残基1-4和4-1连接，以及连续序列中的每个非末端(内部)M残基均与G残基1-4和4-1连接。优选地，MG嵌段为至少5或6个连续残基，更优选为至少7或8个连续残基。
在另一个实施方案中，藻酸酯低聚物中的任何G残基主要存在于MG嵌段中。在该实施方案中，优选地，MG嵌段中存在藻酸酯低聚物中的古洛糖醛酸酯单体的至少50％，更优选至少70或75％，最优选至少80、85、90或95％。在另一个实施方案中，藻酸酯低聚物被布置为使得低聚物中至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，例如100％的G残基布置在MG嵌段中。
在某些实施方案中，本发明的低聚物的末端糖醛酸残基不具有双键，特别是位于C4和C5原子之间的双键。此类低聚物可被描述为具有饱和的末端糖醛酸残基。技术人员将能够制备具有饱和的末端糖醛酸残基的低聚物而不会造成不适当的负担。这可以通过使用产生这种低聚物的生产技术，或通过转化(饱和)由产生具有不饱和末端糖醛酸残基的低聚物的方法生产的低聚物来实现。
藻酸酯低聚物通常带电荷，因此藻酸酯低聚物的抗衡离子可以是任何生理上可耐受的离子，尤其是那些通常用于带电药物的离子，例如钠、钾、铵、氯、甲磺酸根、葡甲胺等。也可以使用促进藻酸酯胶凝的离子，例如第2族金属离子。
尽管藻酸酯低聚物可以是由适当数量的古洛糖醛酸盐和甘露糖醛酸酯残基聚合而产生的合成材料，但本发明中使用的藻酸酯低聚物可方便地从天然来源，例如上述那些，即天然藻酸酯源材料获得、生产或衍生。
可以使用常规的多糖裂解技术，例如酶消化和酸水解，将多糖裂解为寡糖以产生可用于本发明的藻酸酯低聚物。在一个有利的实施方案中，将酸水解用于制备本发明的藻酸酯低聚物。在其他实施方案中，酶消化与另外的加工步骤一起使用以使低聚物中的末端糖醛酸饱和。
然后可以使用离子交换树脂通过色谱法或通过分级沉淀或增溶或过滤将低聚物与多糖分解产物分离。通过引用明确地整体并入本文的US6,121,441和WO2008/125828描述了适合于制备用于本发明的藻酸酯低聚物的方法。进一步的信息和讨论可以在例如“Handbooks of Hydrocolloids”,Ed.Phillips and Williams,CRC,Boca Raton,Florida,USA,2000中找到，该教科书明确地通过引用整体并入本文。
藻酸酯低聚物也可以被化学修饰，包括但不限于修饰以添加带电基团(例如羧化或羧甲基化的聚糖)和藻酸酯低聚物被修饰以改变柔韧性(例如通过高碘酸盐氧化)。
适用于本发明的藻酸酯低聚物(例如低聚古洛糖醛酸)可以方便地通过以下产生：将海藻酸从但不限于海带和淡黑巨海藻中酸水解，在中性pH下溶解，添加无机酸降低pH至3.4以沉淀藻酸酯低聚物(低聚古洛糖醛酸)，用弱酸洗涤，在中性pH下重悬并冷冻干燥。
用于产生本发明的藻酸酯低聚物的藻酸酯也可以从合适的细菌来源例如铜绿假单胞菌或棕色固氮菌直接获得。
已经克隆并表征了荧光假单胞菌和棕色固氮菌中藻酸酯生物合成中涉及的分子装置(WO 94/09124；
Figure BDA0002684241160000461
H.,et al,Metabolic Engineering,1999,Vol 1,262-269；WO 2004/011628；Gimmestad,M.,et al(见上)；Remminghorst和Rehm,BiotechnologyLetters,2006,Vol 28,1701-1712；Gimmestad,M.et al,Journal of Bacteriology,2006,Vol 188(15),5551-5560并且通过操纵这些系统，可以容易地获得定制的一级结构的藻酸酯。
藻酸酯(例如藻类来源材料)的G含量可以通过差向异构化而增加，例如用来自棕色固氮菌的甘露糖醛酸C-5差向异构酶或其他差向异构酶。因此，例如在体外差向异构化可以用从假单胞菌或固氮菌分离的差向异构酶进行，例如来自荧光假单胞菌和棕色固氮菌的AlgG或来自棕色固氮菌的ALGE酶(AlgE1至AlgE7)。还特别地考虑了使用具有产生藻酸酯，特别是藻类的能力的来自其他生物的差向异构酶。
Figure BDA0002684241160000462
et al(见上)以及Strugalaet al(Gums and Stabilisers for the Food Industry,2004,12,The Royal Society ofChemistry,84-94)详细描述了低G藻酸酯用棕色固氮菌AlgE差向异构酶的体外差向异构化。
为了获得含有G-嵌段的藻酸酯或藻酸酯低聚物，用一种或多种除AlgE4以外的棕色固氮菌AlgE4差向异构酶进行差向异构化是优选的，因为这些酶能够产生G嵌段结构。另一方面，AlgE4差向异构酶可用于产生具有交替延伸的M/G序列或含有单个G残基的一级结构的藻酸酯或藻酸酯低聚物，因为已发现该酶似乎优先差向异构单个M残基以产生与M残基连接的单个G残基而不是产生G嵌段。通过使用这些酶的不同组合可以获得特定的一级结构。
这些酶或来自其他生物的同源物的突变形式在使用时也被特别考虑。WO 94/09124描述了重组或修饰的甘露糖醛聚糖C-5差向异构酶(AlgE酶)，例如由差向异构酶序列编码，其中编码差向异构酶的不同结构域或模块的DNA序列已被改组或缺失和重组。或者，可以使用天然存在的差向异构酶的突变体(AlgG或AlgE)，例如通过AlgG或AlgE基因的定点定向或随机诱变获得的。
一种不同的方法是创建假单胞菌和固氮菌生物体，其在某些或全部其差向异构酶基因中发生突变，方式是使这些突变体产生具有所需结构的藻酸酯，以用于后续的藻酸酯低聚物生产，甚至是具有所需结构和大小(或分子量)的藻酸酯低聚物的生产。具有突变的AlgG基因的许多荧光假单胞菌生物体的产生在WO 2004/011628和Gimmestad,M.,et al,2003(见上)中有详细描述。具有突变的AlgE基因的许多棕色固氮菌生物体的产生在Gimmestad,M.,et al,2006(见上)中公开。
另一种方法是从固氮菌或假单胞菌生物体中删除或灭活内源性差向异构酶基因，然后引入一个或多个外源差向异构酶基因，这些基因可能会突变，也可能不会突变(即可能是野生型或修饰的)，并且其表达可以例如通过使用诱导型或其他“可控制的启动子”来控制。通过选择基因的适当组合，可以产生预定一级结构的藻酸酯。
仍进一步的方法是将假单胞菌和/或固氮菌的一些或全部藻酸酯生物合成机制引入非藻酸酯产生生物(例如大肠杆菌)中，并从这些基因修饰生物诱导藻酸酯的产生。
当使用这些基于培养物的系统时，培养条件会影响藻酸酯或藻酸酯低聚物产物的一级结构。调整培养参数，例如温度、摩尔渗透压浓度、营养水平/来源和大气参数，以操纵特定生物体产生的藻酸酯的一级结构，完全在技术人员的能力范围内。
提及“G残基/G”和“M残基/M”或古洛糖醛酸或甘露糖醛酸，或古洛糖醛酸酯或甘露糖醛酸酯应可互换地理解为指古洛糖醛酸/古洛糖醛酸酯和甘露糖醛酸/甘露糖醛酸酯(特别是α-L-古洛糖醛酸/古洛糖醛酸酯和β-D-甘露糖醛酸/甘露糖醛酸酯)，并进一步包括其衍生物，其中一个或多个可用的侧链或基团已被修饰而没有导致增强阳离子微米/纳米颗粒或由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒跨过粘液层易位的能力(其低于未改性低聚物的粘液层)，其中至少一种自组装微米/纳米颗粒形成组分是阳离子形成微米/纳米颗粒形成组分。常见的糖修饰基团包括乙酰基、硫酸根、氨基、脱氧基、醇基、醛基、酮基、酯基和脱水基。藻酸酯低聚物也可以被化学修饰，以添加带电基团(例如羧化或羧甲基化的聚糖)和以改变柔韧性(例如通过高碘酸盐氧化)。技术人员会意识到可以对寡糖的单糖亚基进行进一步的化学修饰，并且这些化学修饰可以应用于本发明的藻酸酯低聚物。
本发明包括单一藻酸酯低聚物或不同藻酸酯低聚物的混合物(多重性/多数性)的用途。因此，例如，可以使用不同藻酸酯低聚物(例如两种或更多种)的组合。
在更具体的实施方案中，本发明提供了一种用于治疗或预防当施用于粘膜表面时对治疗活性分子有应答或被其预防的疾病或病症或其并发症的方法，所述方法包括
(a)向患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症或其并发症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层施用包含所述治疗活性分子的阳离子微米/纳米颗粒连同具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物；或
(b)(i)使包括所述治疗活性分子的阳离子微米/纳米颗粒与至少一种具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物接触，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)向患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症或其并发症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层施用步骤(b)(i)中形成的所述微米/纳米颗粒。
在本发明的另外的实施方案中，本发明提供了一种用于治疗或预防当施用于粘膜表面时对治疗活性分子有应答或被其预防的疾病或病症或其并发症的方法，所述方法包括使患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症或其并发症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层与微米/纳米颗粒接触，所述微米/纳米颗粒
(i)由自组装的微米/纳米颗粒形成组分形成，其中至少一种是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，至少一种是具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物，和
(ii)还包含所述治疗活性分子，任选地其中所述治疗活性分子与一种或多种所述自组装的微米/纳米颗粒形成组分共价结合。
本发明进一步提供了藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％的甘露糖醛酸酯残基，其用于一种用于治疗或预防当施用于粘膜表面时对治疗活性分子有应答或被其预防的疾病或病症或其并发症的方法中，所述方法包括
(a)向患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症或其并发症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层施用包含所述治疗活性分子的阳离子微米/纳米颗粒连同具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物；或
(b)(i)使包括所述治疗活性分子的阳离子微米/纳米颗粒与至少一种具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物接触，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)向患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症或其并发症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层施用步骤(b)(i)中形成的所述微米/纳米颗粒。
本发明进一步提供了藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％的甘露糖醛酸酯残基，其用于一种用于治疗或预防当施用于粘膜表面时对治疗活性分子有应答或被其预防的疾病或病症或其并发症的方法中，所述方法包括
(a)制备由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒，其中至少一种自组装微米/纳米颗粒形成组分是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，并且至少一种是所述藻酸酯低聚物，所述微米/纳米颗粒进一步包含治疗活性分子，任选地其中治疗活性分子共价结合至一种或多种所述自组装微米/纳米颗粒形成组分，和
(b)向患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症或其并发症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层施用步骤(a)中制备的微米/纳米颗粒。
本发明还提供了藻酸酯低聚物在制造用于上述方法的药物中的用途，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基。在某些实施方案中，药物可以是带有藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒或由本文所述的自组装微米/纳米颗粒形成化合物形成的微米/纳米颗粒。
本发明还进一步提供了包含治疗活性分子的阳离子微米/纳米颗粒在制备用于上述方法的药物中的用途。在某些实施方案中，药物可以是带有藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒或由本文所述的自组装微米/纳米颗粒形成化合物形成的微米/纳米颗粒。
上述特征涉及藻酸酯低聚物(其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％的甘露糖醛酸酯残基)和/或治疗性阳离子微米/纳米颗粒在制造药物中的用途，所述药物在以上本发明的更一般的实施方案的上下文中提出的本发明方法中使用，尤其是涉及组合产品的那些方法，上述特征经适当修改后应用于紧接上文所述的本发明的更具体的实施方案，并且因此在必要时适当修改后可以在此应用该部分中所述的特征和原理的所有组合。
治疗活性分子可以被称为药物或药，并且可以例如是本文所述的任何感兴趣的治疗分子。
如本文所用，术语“病症”包括受试者可能经历的任何有害的生理病症，无论是由于遗传缺陷或突变引起的，还是以任何其他方式引起的，包括例如由于环境和/或暴露于病原体引起的获得性病症。
该疾病或病症可以是例如呼吸系统疾病或病症、感染、过度增殖或赘生性疾病、自身免疫疾病或炎性肠病。
呼吸系统疾病或病症可以是阻塞性呼吸系统疾病，更具体地，可以特征在于由于呼吸道感染引起的慢性炎症状态、气道重塑和/或恶化的呼吸系统病症。此类疾病可包括COPD(及其亚型慢性支气管炎和肺气肿)、支气管扩张、特发性肺纤维化、原发性纤毛运动障碍、肺炎、哮喘和慢性鼻窦炎。此类疾病还可包括由CFTR功能障碍引起或与之相关的疾病，例如囊性纤维化、非复合CFTR基因突变杂合性、呼吸道粘液清除异常和/或由于慢性颗粒吸入引起的呼吸困难和/或慢性炎性呼吸系统疾病，例如COPD(及其亚型慢性支气管炎和肺气肿)、支气管扩张、哮喘和/或慢性鼻窦炎。此类疾病还可包括吸烟者和其他长期吸入颗粒刺激物例如烟颗粒(烟草、木材等)、污染、灰尘(石棉、棉花、煤、石头、动物粪便等)和孢子的受试者中的粘液淤积和呼吸困难。在其他实施方案中，该病症可以是上述病症的与粘液有关的并发症。
COPD，也称为慢性阻塞性肺疾病(COLD)和慢性阻塞性气道疾病(COAD)，是慢性阻塞性肺疾病的统称，其特征是气道慢性炎症而无扩张，长期气流不畅和痰液产生增加。普遍认为慢性支气管炎(支气管粘膜发炎)和肺气肿(肺组织特别是肺泡破裂)是COPD的亚型。通常将COPD诊断为施用支气管扩张药不能改善的慢性肺功能不佳，和慢性生产性咳嗽。胸部成像(例如，MRI和高分辨率计算机断层扫描(HRCT))还可显示COPD的生理特征，并排除其他呼吸道疾病。
在COPD中观察到的痰液产生增加以及与CF粘液相似的特征意味着，在CF中观察到的呼吸道并发症(如下所述)在COPD患者中常见，尤其是与气道感染有关的并发症。
支气管扩张是一种疾病，其特征是炎症反应导致支气管慢性肿胀和随后破裂，可通过服用支气管扩张药改善的慢性肺功能不佳，和慢性生产性咳嗽。诊断通常基于肺功能测试和胸部成像，例如MRI和高分辨率计算机断层扫描(HRCT)，以显示该疾病支气管增大的特征。
在支气管扩张中观察到的痰液产生增加以及与CF粘液相似的特征意味着，在CF中观察到的呼吸道并发症(如上所述)在支气管扩张患者中常见，尤其是与气道感染有关的并发症。
特发性肺纤维化的特征是肺功能的进行性和不可逆转的下降。并发症包括心力衰竭、肺动脉高压、肺炎和肺栓塞。与特发性肺纤维化相关的慢性炎症过程和气道组织重塑意味着，在特发性肺纤维化患者中可见到如下所述在CF中观察到的呼吸系统并发症。
慢性鼻窦炎是长期的、超过三个月的鼻旁窦炎症。引起炎症的原因可能是感染、过敏(通常对包括灰尘、污染、花粉、孢子和微生物在内的微米颗粒过敏)或自身免疫反应。炎症导致粘液产生增加、鼻窦引流受损和继发性细菌感染，这些进一步加剧了炎症反应。慢性鼻窦炎患者的鼻窦粘液具有与CF粘液相似的特征意味着，如上所述在CF中观察到的呼吸(尤其是鼻旁窦)并发症在慢性鼻窦炎患者中很常见。通常通过鼻内窥镜检查可确诊为慢性鼻窦炎。
慢性鼻窦炎患者的鼻窦粘液具有与CF粘液相似的特征并且这意味着，如下所述在CF中观察到的呼吸(尤其是鼻旁窦)并发症在慢性鼻窦炎患者中很常见，尤其是与气道感染有关的并发症。
哮喘是一种慢性气道疾病，表现为由于气道(主要是细支气管)周围平滑肌紧缩造成的短暂支气管收缩而引起的气流阻塞急性发作。这种恶化通常是由于暴露于外部刺激而引发的。支气管炎症还导致组织肿胀和水肿，从而引起进一步的阻塞。明显的支气管收缩和气道阻塞事件是由于疤痕和炎症以及粘液腺过度发达而引起的气道增厚和重塑的慢性症状。
长期与哮喘相关的气道的慢性炎症过程和组织重塑，包括增加的痰液生成，意味着在哮喘患者中可见到如下所述在CF中观察到的呼吸系统并发症，特别是与气道感染相关的并发症。
囊性纤维化是一种人类疾病，其特征在于来自肺、胰腺和肝的粘液和/或外分泌分泌物具有异常的物理特性，通常具有增高的粘度，并且在粘液的情况下，其粘附于粘膜表面上皮。这些潜在因素表现为呼吸困难，呼吸道感染(慢性和急性，例如支气管或肺部)，呼吸道炎症(例如支气管炎症(如果因感染而被称为支气管炎)或肺部炎症/肺炎(如果由于感染而称为肺炎))，肺动脉高压，心力衰竭，呼吸衰竭，肺重塑，鼻窦感染，鼻窦炎(急性、亚急性和慢性)，面部疼痛，头痛，鼻腔引流异常，粪便增厚，便秘，肠梗阻，营养吸收不良，胰腺炎症，胰腺炎，糖尿病，胆结石，肝硬化和不育症，等等。还可以看到对抗生素的反应减弱，尤其是在肺部。异常的粘液和外分泌分泌物是由CFTR中的突变引起的，这些突变影响该蛋白将氯离子和碳酸氢根离子转运通过上皮膜从而调节其他离子(如钠)的平衡的能力。已经鉴定出许多这样的CFTR突变，其中一些导致比其他突变更显著的CF表型。因此，受试者在以下情况下被认为患有CF：如果受试者患有上述病症中的一种或多种，优选地为2、3、4、5、6或多种或全部，异常粘液(例如致密、难治的粘液，在某些情况下，其在至少一个粘膜表面可能附着在上皮上)，痰液或其他分泌物和/或外分泌分泌物分泌过多以及他/她的每个CFTR基因都发生突变。
方便地，可以通过“汗液测试”诊断CF。这是本领域技术人员熟悉的常规测试。简而言之，将毛果芸香碱放置在皮肤上并被电流诱导吸收。收集响应毛果芸香碱在治疗部位释放的汗液(例如吸收到滤纸片上)，然后分析其盐含量。患有CF的人的盐浓度将比正常人高一又二分之一到两倍。更具体地说，对于6个月及以下的婴儿，氯化物水平等于或小于29mmol/L意味着CF的可能性很小；30–59mmol/L的水平意味着CF是可能的；且水平大于或等于60mmol/L意味着CF很可能。对于大于6个月大的人，氯化物水平等于或小于39mmol/L意味着CF的可能性很小；40–59mmol/L的水平意味着CF是可能的；且水平大于或等于60mmol/L意味着CF很可能。
根据本发明，将对其应用本发明的治疗的婴儿受试者(6个月或更小)的汗液氯化物水平将大于25mmol/L，优选大于29mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L或60mmol/L，所有其他患者的汗液氯化物水平将大于35mmol/L，优选地大于39mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L或60mmol/L。
CFTR功能障碍已被认为是CF以外其他疾病的潜在因素。这种功能障碍可以通过一个突变的CFTR等位基因的遗传而遗传，或可以通过例如长期吸入颗粒物(尤其是烟草和木烟)和呼吸道的慢性炎症(例如在COPD及其亚型CB和肺气肿、支气管扩张和慢性鼻窦炎中))获得。
非复合CFTR基因突变杂合性是一种临床状况，其中受试者有一个CFTR等位基因不携带影响从其表达的蛋白质的细胞内加工和/或细胞表面离子通道活性的突变，而一个等位基因确实具有对由其表达的蛋白质的细胞内加工和/或细胞表面离子通道活性有害的突变。这样的受试者在任何时候都清楚地看到CF的多种并发症中没有表现出上面定义的明显CF，但是杂合受试者至少有时会出现轻度形式的异常粘液，这是CF的特征，并因此可能伴有轻度形式的CF或其中一种并发症，但严重程度不足以提示明确诊断CF。具体而言，已观察到具有CFTR杂合性的受试者患有复发性“特发性”胰腺炎、先天性双侧输精管缺失、慢性鼻窦炎和特发性支气管扩张，但此类患者可能出现本文所述的任何CF并发症。
CF汗液测试可用于识别怀疑具有非复合CFTR基因突变杂合性的患者，因为此类患者的汗液氯化物水平介于“极不可能”和“可能”之间。对于婴儿患者(6个月或以下)，汗液氯化物水平可大于25mmol/L，优选大于29mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L，但小于60mmol/L，所有其他患者的汗液氯化物水平将大于35mmol/L，优选地大于39mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L，但小于60mmol/L。然后对可疑患者进行基因检测即可确诊。
如文献所述(例如De Boeck,K.,et al,Journal or Cystic Fibrosis,2011,Vol10(Suppl 2),S53-S66)，CFTR功能障碍也可通过对直肠活检或体内鼻电势差(NPD)进行肠电流测量(ICM)直接评估。将测试受试者的结果与正常受试者对照的结果进行比较，提供CFTR功能障碍的指征。如在实施例中更具体描述的，将直肠活检组织依次暴露于离子通道调节剂吲哚美辛、阿米洛利、福司可林/IBMX、染料木黄酮、卡巴胆碱和组胺可在ICM期间隔离CFTR活性。
还已经认识到，吸入颗粒刺激物，例如烟尘(烟草、木材等)，污染，灰尘(石棉、棉花、煤、石头、动物粪便等)和孢子，可导致CFTR离子通道功能缺陷(因此导致CFTR功能障碍)，这是通过抑制CFTR离子的转运活性和/或通过促进CFTR从上皮细胞表面的内在化。在长时间的暴露下，这可导致形成CF特征性的粘液，从而导致没有表现出慢性炎症性呼吸障碍明显症状的受试者出现异常的粘液清除和/或呼吸困难。在这些受试者中看到的异常的粘液清除(或粘液淤积)是指如上所述在CF中观察到的呼吸系统并发症在此类受试者(例如吸烟者)中是常见的，特别是与气道感染和炎症相关的并发症。
本发明的方法和医学用途也可以被认为是治疗与具有上述病况的患者中CFTR功能障碍有关或由其引起的上述病况的并发症(特别是与粘液相关的并发症)的方法或医学用途，其包括预防、减少或延迟该病况进一步并发症的发展或发作，或降低患有CFTR功能障碍的患者发展或获得该病况的进一步并发症的风险。具体而言，这适用于以上提到或讨论的任何病况，例如CF、非复合CFTR基因突变杂合性、呼吸道粘液清除异常和/或由于慢性颗粒吸入引起的呼吸困难和/或慢性炎性呼吸系统疾病，例如COPD、CB、支气管扩张、哮喘和/或慢性鼻窦炎。
此类并发症可能是以下各节所述的任何并发症。为方便起见，在下面，通过提及CFTR功能障碍相关的病况来表示这类病况，但是在上下文允许的情况下，可以将这些术语解释为与上面列出的病况(例如上面列出的CF、非复合CFTR基因突变杂合性等)中的任一种相关的病况(或并发症)。因此，此类病况(并发症)可以是与CFTR功能障碍相关的呼吸道疾病(例如，呼吸道感染、呼吸道炎症、呼吸困难、呼吸衰竭和肺重塑)，与CFTR功能障碍相关的心血管疾病(例如，肺动脉高压和心力衰竭)；与CFTR功能障碍相关的鼻旁窦疾病(例如鼻旁窦感染、鼻窦炎面部疼痛、头痛、鼻腔引流异常、鼻息肉)；CFTR功能障碍相关的GI疾病(例如便秘、肠梗阻(例如新生儿受试者的胎粪肠梗阻和老年患者的肠套叠和DIOS)、营养吸收不良)；与CFTR功能障碍相关的胰腺疾病(例如，胰管阻塞、营养吸收不良、胰腺炎症、胰腺炎(急性和慢性)、糖尿病)；与CFTR功能障碍相关的肝病(例如胆管阻塞、胆结石、肝硬化)；和与CFTR功能障碍相关的不育。
因此，本发明在预防上也是有用的，因为通过用藻酸酯低聚物和CFTR调节剂在受试者中对抗CFTR功能障碍并恢复更正常的粘液表型，可以避免(即减少或预防)CFTR功能障碍相关病症的发展，例如感染和/或炎症(最值得注意的是在呼吸道、GI道、胰腺和/或肝脏中)。
更一般地，本发明可以被认为是治疗上述CFTR功能障碍相关病症的方法或医学用途。与CFTR功能障碍相关的肺部、GI、胰腺和肝部疾病(例如上述疾病)的治疗是优选的。
在治疗或预防上述呼吸系统疾病或病症或其并发症时，治疗活性剂可以是CFTR调节剂，抗生素，抗真菌剂，抗病毒剂，免疫刺激剂，皮质类固醇，非甾体抗炎药物(NSAID)，支气管扩张药或口服抗糖尿病药(例如上述公开的任一种药物)，肽激素，细胞因子，肽生长因子，肽抗原或用于此类疾病或病症的遗传介质的基因治疗、基因编辑、RNA干扰疗法(例如siRNA或miRNA)、反义疗法或体外转录mRNA(IVT-mRNA)疗法的核酸。特别地，核酸可以编码功能性CFTR蛋白。
该疾病或病症可以是感染，例如细菌、真菌或病毒感染，尤其是呼吸系统的感染，例如下呼吸道(例如支气管或肺中)的感染。该感染可以是慢性感染。此类感染通常可由金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、鸟分枝杆菌复合物、结核分枝杆菌(肺结核的病原体)和烟曲霉引起，尽管感染/炎症可能是由任何传染原引起的，例如细菌、真菌、病毒和寄生虫。除了已经提到的那些以外，呼吸道中发现的常见传染物包括但不限于衣原体肺炎、百日咳博德特氏菌、支原体肺炎、卡他莫拉菌、军团菌肺炎、链球菌肺炎、鹦鹉热衣原体、Coxiella burnetti、鼻病毒、冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒、间质肺病毒、副流感病毒、荚膜组织胞浆菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子虫、球孢子菌、刚地弓形虫、粪类圆线虫、似蚓蛔线虫和疟原虫。
在进一步的实施方案中，感染可以在上呼吸道例如鼻子、鼻腔通道、咽、喉和气管中。因此，该疾病或病症可以是鼻炎、鼻咽炎、鼻咽炎、咽炎、会厌炎、声门上炎、喉炎、喉气管炎、气管炎或扁桃体炎。这些病症有时统称为上呼吸道感染，并且可能是由上述任何一种传染原引起。
在某些实施方案中，感染是在患有CFTR功能障碍的受试者中。
在治疗或预防上述感染时，治疗活性剂可以是CFTR调节剂，抗生素，抗真菌剂，抗病毒剂，免疫刺激剂，皮质类固醇，非甾体抗炎药物(NSAID)，或支气管扩张药(例如上述公开的任一种药物)，肽激素，细胞因子，肽生长因子，肽抗原或用于此类感染的遗传介质的基因治疗、基因编辑、RNA干扰疗法(例如siRNA或miRNA)、反义疗法或体外转录mRNA(IVT-mRNA)疗法的核酸。特别地，核酸可以编码功能性CFTR蛋白。
过度增殖性或赘生性疾病或病症可以是由任何恶性、恶性前或非恶性(良性)赘生实体引起的任何疾病或病症。因此，该术语尤其包括癌症、肿瘤、恶性肿瘤、肉瘤、癌、生殖瘤、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤、乳头状瘤和腺瘤。在这些各种实施方案中，过度增殖性或赘生性疾病或病症可以选自结直肠癌(也称为结肠癌、直肠癌或肠癌)，前列腺癌，肾脏(肾)癌(例如，威尔姆氏肿瘤)，胰腺癌，睾丸癌，皮肤癌(例如黑素瘤和非黑素瘤(例如基底细胞癌、鳞状细胞癌))，乳腺癌，卵巢癌，胃部(胃)癌，肠癌(例如十二指肠癌、回肠癌、空肠癌、小肠癌)，肝脏癌(肝癌)，肺部癌(肺癌)，食道癌，口腔癌，咽喉癌，脑癌(例如成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤)，肾上腺癌(例如肾上腺皮质癌)，甲状腺癌(例如间变性甲状腺癌)，子宫癌(例如子宫癌肉瘤)，血液癌(也称为血液学上的恶性肿瘤(例如造血和淋巴癌恶性肿瘤，例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)，包括其转移性形式，以及这些解剖部位的非恶性瘤或肿瘤(例如结直肠息肉、汗囊肿、血管瘤、骨瘤、软骨瘤、脂肪瘤、纤维瘤、淋巴管瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、神经节神经瘤、乳头状瘤、腺瘤)。
在治疗或预防上述过度增生或赘生性疾病或病症或其并发症时，治疗活性剂可以是细胞毒性化学治疗剂，血管生成抑制剂，抗癌单克隆抗体，放射免疫治疗剂，免疫刺激剂，免疫抑制剂，皮质类固醇或放射性药物(例如上述公开的任一种药物)，肽激素，细胞因子，肽生长因子，肽抗原或用于此类感染的遗传介质的基因治疗、基因编辑、RNA干扰疗法(例如siRNA或miRNA)、反义疗法或体外转录mRNA(IVT-mRNA)疗法的核酸，例如癌基因、血管生成因子的抑癌基因。
自身免疫性疾病可能是Addison疾病，溶血性自身免疫性贫血，抗肾小球基底膜疾病，抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎，抗磷脂综合征，关节炎，青少年，类风湿关节炎，Felty综合征，类风湿性血管炎，Sjogren综合征，Still综合征，抗-n-甲基-d-天门冬氨酸受体脑炎，Lambert-Eaton重症肌无力综合征，重症肌无力，多发性放射神经病，Guillain-Barre综合症，僵人综合症，葡萄膜脑病综合症，中枢神经系统血管炎，自身免疫性垂体炎，自身免疫性淋巴增生综合征，疱疹样皮炎，1型糖尿病，肾小球肾炎，格雷夫斯病，自身免疫性肝炎，线性IgA大疱性皮病，系统性红斑狼疮，交感性眼炎，自身免疫性多发性内分泌病，特发性血小板减少性紫癜，自身免疫性甲状腺炎，显微镜下结肠炎(胶原性结肠炎和淋巴细胞性结肠炎)，改道性结肠炎或
Figure BDA0002684241160000581
病。
在治疗或预防上述自身免疫疾病或病症或其并发症时，治疗活性剂可以是免疫抑制剂，皮质类固醇，非甾体抗炎药物(NSAID)，或口服抗糖尿病药(例如上述公开的任一种药物)，细胞因子，生长因子，肽激素或用于此类疾病或病症的遗传介质的基因治疗、基因编辑、RNA干扰疗法(例如siRNA或miRNA)、反义疗法或体外转录mRNA(IVT-mRNA)疗法的核酸。
炎症性肠病可以是溃疡性结肠炎，克罗恩氏病，显微镜性结肠炎(胶原性结肠炎和淋巴细胞性结肠炎)，改道性结肠炎或
Figure BDA0002684241160000591
病。
在治疗或预防上述炎性肠疾病时，治疗活性剂可以是抗生素、免疫刺激剂、免疫抑制剂，皮质类固醇，非甾体抗炎药物(NSAID)(例如上述公开的任一种药物)，细胞因子，生长因子，肽激素或用于此类疾病或病症的遗传介质的基因治疗、基因编辑、RNA干扰疗法(例如siRNA或miRNA)、反义疗法或体外转录mRNA(IVT-mRNA)疗法的核酸。
当与根据本发明的受试者的疾病或医学状况的治疗有关一般使用时，“治疗”在本文中广泛使用，以包括任何治疗作用，即与疾病或状况有关的任何有益作用。因此，不仅包括根除或消除疾病或病症，或治愈受试者，而且包括改善受试者的疾病或病症。因此，例如包括疾病或病症的任何症状或体征的改善，或疾病/病症的任何临床认可的指示的改善。因此，治疗包括治愈和姑息治疗，例如先前存在或诊断出的疾病/状况的治愈和姑息治疗，即反应性治疗。
如本文通常所用，“预防”是指任何预防性或防止性作用。因此，它包括延迟、限制、减少或预防疾病或病症或疾病/病症或其一种或多种症状或适应症的发作，例如相对于预防性治疗之前的疾病或病症或症状或适应症。因此，预防明确包括疾病或病状、症状或其体征的发生或发展的绝对预防，以及疾病或病状、症状或其体征的发作或发展的任何延迟，或疾病或病状、症状或体征的发展或进展的减轻或限制。
在由CF和非复合CFTR基因突变杂合性及其并发症引起或与其相关的疾病和病症的更具体的情况下，因为这些疾病是遗传性疾病，在每个受试者中其特征在于在接受本发明的治疗时受试者表现出的独特的与CF和非复合CFTR基因突变杂合性相关的疾病和病症的集合，因此术语“CF的治疗”和“非复合CFTR基因突变杂合性的治疗”可以被认为是对受试者的任何或所有疾病和病症或其并发症的治疗，或对其子集的治疗。
因此，尽管本发明提供的某些治疗不能解决CF或非复合CFTR基因突变杂合性的的潜在遗传缺陷的纠正，但它们确实涉及对由缺陷引起的体内影响的治疗，例如减轻其影响，例如由异常粘液引起的影响，并因此包括治疗相关疾病或病症，以及也改善疾病或病症的临床影响或受试者的整体健康。
在这种情况下，CF或非复合CFTR基因突变杂合性的“治愈”将相当于完全缓解受试者在接收本发明的治疗时所表现出的各种与CF或非复合CFTR基因突变杂合性相关的疾病和病症；但是，该疾病的遗传基础(CFTR突变)仍然存在。但是，在这些情况下的“治疗”不要求这种“治愈”，并且如上所述，它包括改善CF或非复合CFTR基因突变杂合性对身体的任何影响。因此，包括的是例如改善与CF或非复合CFTR基因突变杂合性相关的疾病或病症的任何症状或体征，或改善受试者中任何临床公认的与CF或非复合CFTR基因突变杂合性相关的疾病或状况的指示(例如，肺部粘膜纤毛清除率增加、便秘的发生率降低、营养物质吸收的改善以及药物和营养或消化酶补充剂的生物利用度增加，在特定的实施方案中可以将这些看作是肺部感染对抗生素的反应性增强和消化健康改善)。在这些情况下，可能是预先存在的与CF或非复合CFTR基因突变杂合性相关的疾病或病症没有完全根除或新的与CF-或非复合CFTR基因突变杂合性相关的疾病或病症的发作没有完全停止，但治疗足以将这些过程抑制到靶标CF或非复合CFTR基因突变杂合性相关的疾病或病症被完全解决，或至少在某种程度上被解决的程度，优选为受试者可接受的程度。因此，治疗包括治愈性和姑息性治疗，例如既往或诊断过的CF-或非复合CFTR基因突变杂合性相关的疾病或病症的治愈性和姑息性治疗，即反应性治疗。
在CF和非复合CFTR基因突变杂合性的情况中的“预防”因此涉及防止由于潜在的遗传缺陷或由于异常粘液而在体内产生的影响。在这些情况下，因为这些疾病是遗传性疾病，在每个受试者中其特征在于在接受本发明的治疗时受试者表现出的独特的与CF或非复合CFTR基因突变杂合性相关的疾病和病症的集合，术语“预防与CF或非复合CFTR基因突变杂合性或CF-或非复合CFTR基因突变杂合性相关的疾病或病症”可被视为预防受试者尚未获得或受试者先前已获得但在接受所要求的治疗之前已经克服的任何与CF或非复合CFTR基因突变杂合性相关的病症或病状或其并发症。
预防工作明确包括由上述限定的CFTR离子通道功能障碍引起或与之相关的病症的影响或其症状或指征的发生或发展的绝对预防，以及由上述限定的CFTR功能障碍引起或与之相关的病症的影响或其症状或指征的发作或发展的任何延迟，或由上述限定的CFTR功能障碍引起或与之相关的病症或其症状或指征的发展或进展的减轻或限制。预防性治疗也可以被认为是降低患者获得或发展由CFTR功能障碍引起或与之相关的疾病(如上文所定义)或其症状或适应症的风险的治疗。
在其他实施方案中，所述治疗在遗传(核酸)水平上起作用，因此可能能够解决对CF或非复合CFTR基因突变杂合性的潜在遗传缺陷的校正。在这些情况下，“治疗”和“预防”可以根据其更一般的用法进行解释，如上所述。
可以类似地解释具有遗传原因的其他疾病和病症的治疗或预防，例如肿瘤性疾病。
在更具体的实施方案中，本发明提供了一种用于诊断、预后或监测疾病或病状的方法，当将其施用于粘膜表面时，其特征可以由诊断有效指示剂分子来确定，所述方法包括
(a)向患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症或其并发症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层施用包含所述诊断有效指示剂分子的阳离子微米/纳米颗粒连同具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物；或
(b)(i)使包括所述诊断有效指示剂分子的阳离子微米/纳米颗粒与至少一种具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物接触，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)向患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层施用步骤(b)(i)中形成的所述微米/纳米颗粒，和
(c)直接或间接地从所述诊断有效指示剂分子检测指示疾病或病症的特征的信号，
其中所述信号的性质指示受试者是否患有所述疾病或病症、受试者中疾病或病症的状态、受试者具有发展所述疾病或病症的风险或受试者中所述疾病或病症进展的风险。
在还另外的实施方案中，本发明提供了一种用于诊断、预后或监测疾病或病症的方法，当将其施用于粘膜表面时，其特征可以由诊断有效指示剂分子确定，所述方法包括使患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层与微米/纳米颗粒接触，所述微米/纳米颗粒
(i)由自组装的微米/纳米颗粒形成组分形成，其中至少一种是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，至少一种是具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物，和
(ii)进一步包括所述诊断有效指示剂，任选地其中所述诊断有效指示剂共价结合至一种或多种自组装微米/纳米颗粒形成组分，和
(iii)直接或间接地从所述诊断有效指示剂分子检测指示疾病或病症的特征的信号，
其中所述信号的性质指示受试者是否患有所述疾病或病症、受试者中疾病或病症的状态、受试者具有发展所述疾病或病症的风险或受试者中所述疾病或病症进展的风险。
本发明进一步提供了藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％的甘露糖醛酸酯残基，其在用于诊断、预后或监测疾病或病状的方法中使用，当施用于粘膜表面时其特征可以由诊断有效指示剂分子确定，所述方法包括
(a)向患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症或其并发症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层施用包含所述诊断有效指示剂分子的阳离子微米/纳米颗粒连同具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物；或
(b)(i)使包括所述诊断有效指示剂分子的阳离子微米/纳米颗粒与至少一种具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物接触，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)向患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层施用步骤(b)(i)中形成的所述微米/纳米颗粒，和
(c)直接或间接地从所述诊断有效指示剂分子检测指示疾病或病症的特征的信号，
其中所述信号的性质指示受试者是否患有所述疾病或病症、受试者中疾病或病症的状态、受试者具有发展所述疾病或病症的风险或受试者中所述疾病或病症进展的风险。
本发明进一步提供了藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％的甘露糖醛酸酯残基，其在用于诊断、预后或监测疾病或病状的方法中使用，当施用于粘膜表面时其特征可以由诊断有效指示剂分子指示，所述方法包括
(a)制备由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒，其中至少一种自组装微米/纳米颗粒形成组分是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，并且至少一种是所述藻酸酯低聚物，所述微米/纳米颗粒进一步包含诊断有效指示剂，任选地其中诊断有效指示剂共价结合至一种或多种所述自组装微米/纳米颗粒形成组分，和
(b)向患有、怀疑患有或处于所述疾病或病症的风险的受试者的粘膜表面的粘液层施用步骤(a)中制备的微米/纳米颗粒，和
(c)直接或间接地从所述诊断有效指示剂分子检测指示疾病或病症的特征的信号，
其中所述信号的性质指示受试者是否患有所述疾病或病症、受试者中疾病或病症的状态、受试者具有发展所述疾病或病症的风险或受试者中所述疾病或病症进展的风险。
本发明还提供了藻酸酯低聚物在制造用于上述方法的药物中的用途，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基。在某些实施方案中，药物可以是带有藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒或由本文所述的自组装微米/纳米颗粒形成化合物形成的微米/纳米颗粒。
本发明还进一步提供了包含诊断有效指示剂分子的阳离子微米/纳米颗粒在制备用于上述方法的药物中的用途。在某些实施方案中，药物可以是带有藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒或由本文所述的自组装微米/纳米颗粒形成化合物形成的微米/纳米颗粒。
上述特征涉及藻酸酯低聚物(其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％的甘露糖醛酸酯残基)和/或诊断性阳离子微米/纳米颗粒在制造药物中的用途，所述药物在以上本发明的更一般的实施方案的上下文中提出的本发明方法中使用，尤其是涉及组合产品的那些方法，上述特征经适当修改后应用于紧接上文所述的本发明的更具体的实施方案，并且因此在必要时适当修改后可以在此应用该部分中所述的特征和原理的所有组合。
根据本发明检测到的信号的特性可以是其不存在、存在、信号的相对或绝对强度或信号随时间的变化。
在这些实施方案中，该方法可以包括进一步的步骤，其中诊断出受试者患有所述疾病或病症、确定受试者中疾病或病症的状态、确定受试者患有该疾病或病症的风险、确定受试者中疾病或状况进展的风险，或确定受试者中疾病或状况的预后。
诊断有效分子(诊断剂)可以包括放射诊断剂、造影剂或用作分子探针的核酸或蛋白质(例如寡核苷酸和抗体)。
如实施例中所示，具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物能够降低阳离子微米/纳米颗粒和由阳离子微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒的细胞毒性。因此，在某些实施方案中，与在不存在具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物的情况下用等效的微米/纳米颗粒进行的方法或用途相比，本文所述的方法和用途可与减少的或更少的细胞毒性相关联。在这些实施方案中，相关的细胞毒性是与微米/纳米颗粒接触的粘液层或其区域紧接下方的细胞毒性。
受试者可以是任何人类或非人类动物受试者，但是更特别地可以是人类或非人类脊椎动物，例如选自哺乳动物、鸟类、两栖动物、鱼类和爬行动物的非人类动物。非人类动物可以是牲畜或家畜或具有商业价值的动物，包括实验动物或动物园或游戏公园中的动物。因此，代表性的非人类动物包括狗、猫、马、猪、绵羊、山羊、牛、鸡、火鸡、珍珠鸡、鸭和鹅。因此，涵盖了本发明的兽医用途。受试者可以被视为患者。在某些实施方案中，受试者是患有CFTR离子通道功能障碍的人类患者，更具体地讲，是与CFTR功能障碍相关的病理表型，例如异常的粘液和粘液清除。在特定的实施方案中，受试者将是患有CF的人类患者。术语“带有CF的受试者”、“患有CF的受试者”、“具有CF的受试者”和“CF受试者”被认为是等同的，并且在本文中可互换使用。受试者可以是任何年龄，例如可以是新生儿、婴儿、儿童、少年、青少年或成人。换句话说，受试者至少5岁，例如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18岁。在某些实施方案中，受试者具有公认的CFTR功能障碍表型，其包括根据本发明待治疗的病症的症状(例如，包括慢性感染、慢性炎症和/或气道重塑的症状)。“公认的”是指在受试者中已观察表型至少2年，例如至少3、4、5、6、7、8、9或10年。
本发明中使用的微米/纳米颗粒可以以任何方便的形式或通过任何便利的方式施用于受试者，以将有效量的微米/纳米颗粒递送至待治疗的粘膜表面。这可以通过肠内(例如口服、经颊、舌下、直肠)或局部途径或通过吸入(包括经鼻吸入)。施用可以实现全身性分布或局部性分布，这意味着向目标部位或位置进行递送，但是基本上不在患者体内的其他位置。技术人员将能够选择适合于任何特定目标部位或位置的合适的施用方式。如上所述，在某些实施方案中，可以通过受体亲和分子将根据本发明使用的微米/纳米颗粒靶向靶位点。
本发明中使用的藻酸酯低聚物可以以任何方便的形式或通过任何便利的方式施用于受试者，以将有效量的藻酸酯低聚物递送至待治疗的粘膜表面。这可以通过肠胃外(例如静脉内、脊髓内、肌内、皮下)，肠内(例如口服、经颊、舌下、直肠)或局部途径或通过吸入(包括经鼻吸入)。施用可以实现全身性分布或局部性分布，这意味着向目标部位或位置进行递送，但是基本上不在患者体内的其他位置。技术人员将能够选择适合于任何特定目标部位或位置的合适的施用方式。为了方便，优选全身施用，特别是通过肠胃外施用来实现。
技术人员将能够根据本领域已知的且在文献中广泛描述的任何常规方法，将本发明中使用的微米/纳米颗粒和藻酸酯低聚物配制成适于这些施用和身体分布途径的药物组合物。
更具体地，可以将本发明中使用的微米/纳米颗粒和藻酸酯低聚物任选地与其他活性剂一起与一种或多种常规载体、稀释剂和/或赋形剂一起掺入以制备常规的盖伦制剂，例如片剂、丸剂、颗粒剂(例如游离形式或封闭在胶囊中)、粉剂(例如可吸入粉剂)、锭剂、香囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(固体或液体介质)、喷雾剂(例如鼻喷雾剂)、用于喷雾器的组合物、软膏、乳膏、药膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、子宫托、无菌注射液、无菌包装粉末等。肠溶衣固体或液体组合物，例如肠溶衣片剂和肠溶衣颗粒剂(其可以在肠溶衣胶囊或非肠溶衣胶囊中提供，即其中溶衣可以是或可以不是肠溶衣)；无菌注射组合物特别值得注意。
合适的载体、赋形剂或稀释剂的实例为乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、惰性海藻酸聚合物、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、水、水/乙醇、水/二醇、水/聚乙烯、高渗盐水、二醇、丙二醇、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油或脂肪物质，如硬脂肪或其合适的混合物。值得注意的赋形剂和稀释剂是甘露醇和高渗盐水(盐水)。
所述组合物可另外包含润滑剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂等。
肠胃外给药形式，例如适于静脉内递送的溶液，应该是无菌的并且没有生理上不可接受的试剂，并且应该具有低渗透压以最小化给药时的刺激或其他不良影响，并因此溶液应该优选是等渗的或稍高渗的，例如高渗盐水(盐水)。合适的媒介物包括通常用于施用肠胃外溶液的水性媒介物，例如无菌注射用水，氯化钠注射剂，林格氏注射剂，右旋糖注射剂，右旋糖和氯化钠注射剂，乳酸林格氏注射剂和其他溶液，例如在Remington'sPharmaceutical Sciences,15th ed.,Easton:Mack Publishing Co.,pp.1405-1412和1461-1487(1975)以及The National Formulary XIV,14th ed.Washington:AmericanPharmaceutical Association(1975))中所述的，其通过引用整体明确地并入本文。溶液可以包含常规用于肠胃外溶液的防腐剂、抗微生物剂、缓冲剂和抗氧化剂，与本发明中使用的微米/纳米颗粒和藻酸酯低聚物相容并且不干扰产品的生产、储存或使用的赋形剂和其他添加剂。
包含本发明中使用的微米/纳米颗粒和/或藻酸酯低聚物的简单无菌液体组合物可能是特别方便的。
用于本发明的微米/纳米颗粒和/或藻酸酯低聚物的固体或液体制剂可以具有肠溶衣，该肠溶衣防止在胃和/或上GI道的其他部分中降解，但允许在下GI道例如小肠中的降解。此类溶衣通常由包括脂肪酸、蜡、虫胶、塑料和植物纤维的聚合物制备。其具体实例包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯(羟丙甲基乙酸琥珀酸酯)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸乙酸酯(PVAP)、乙酸纤维素偏苯三酸酯和藻酸钠聚合物。肠溶衣片剂和肠溶衣颗粒剂(其可以在肠溶衣胶囊或非肠溶衣胶囊中提供)特别值得注意。肠溶衣颗粒剂可以根据WO 1989008448和Al-Khedairy,E.B.H,2006,IraqiJ.Pharm.Sci.,Vol.15(1)49，第15卷(1)49的教导制备，其内容通过引用并入本文，但是本领域技术人员将意识到可以使用的其他替代技术。
对于局部施用，可以将本发明中使用的微米/纳米颗粒和/或藻酸酯低聚物掺入乳膏、药膏、凝胶、软膏等中。设想合适的其他局部系统是原位药物递送系统，例如其中原位形成固体、半固体、无定形或液晶凝胶基质并且可以包含在本发明中使用的微米/纳米颗粒和/或藻酸酯低聚物的凝胶。可以方便地设计这样的基质以控制微米/纳米颗粒和/或藻酸酯低聚物从基质的释放，例如可以在选定的时间段内延迟和/或维持释放。这样的系统仅在与粘膜表面接触时才形成凝胶。通常，凝胶是粘膜粘附的。
在本发明的组合物中用于本发明的微米/纳米颗粒和/或藻酸酯低聚物的相对含量可以根据所需的剂量和遵循的剂量方案而变化，但是将足以在靶治疗位或部位达到有效量，这要考虑变量，例如要治疗的受试者的身体大小、受试者特定疾病的性质以及靶治疗区域的位置和身份。本领域技术人员将知道，如果遵循或增加多剂量给药方案以最小化施用或应用的次数，则可以减少本发明在组合物中使用的微米/纳米颗粒和/或藻酸酯低聚物的量。
用于通过注射(例如通过静脉内、脊髓内、肌肉内或皮下注射)递送本发明中使用的藻酸酯低聚物的代表性水溶液将是无菌的，并且可以含有0.1至10％，例如0.1至5％、0.1至2％、0.1至1％、0.1至0.8％、0.1至0.5％、0.1至0.2％、0.2至10％、0.2至5％、0.2至2％、0.2至1％、0.2至0.8％、0.2至0.5％、0.5到10％、0.5到5％、0.5到2％、0.5到1％、0.5到0.8％、0.8到10％、0.8到5％、0.8到2％、0.8到1％、1到10％、1至5％、1至2％、2至10％、2％至5％或5％至10％w/v的藻酸酯低聚物，其余部分由水和药学上可接受的赋形剂和/或其他活性剂(如果使用)组成。
用于向呼吸道施用本发明中使用的微米/纳米颗粒的代表性可吸入溶液通常将是无菌的，并且可以含有0.1至10％，例如0.1至5％、0.1至2％、0.1至1％、0.1至0.8％、0.1至0.5％、0.1至0.2％、0.2至10％、0.2至5％、0.2至2％、0.2至1％、0.2至0.8％、0.2至0.5％、0.5到10％、0.5到5％、0.5到2％、0.5到1％、0.5到0.8％、0.8到10％、0.8到5％、0.8到2％、0.8到1％、1到10％、1至5％、1至2％、2至10％、2％至5％或5％至10％w/v的微米/纳米颗粒，其余部分由药学上可接受的赋形剂例如水和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的藻酸酯低聚物)组成。
用于向呼吸道施用本发明中使用的藻酸酯低聚物的代表性可吸入溶液通常将是无菌的，并且可以含有0.1至10％，例如0.1至5％、0.1至2％、0.1至1％、0.1至0.8％、0.1至0.5％、0.1至0.2％、0.2至10％、0.2至5％、0.2至2％、0.2至1％、0.2至0.8％、0.2至0.5％、0.5到10％、0.5到5％、0.5到2％、0.5到1％、0.5到0.8％、0.8到10％、0.8到5％、0.8到2％、0.8到1％、1到10％、1至5％、1至2％、2至10％、2％至5％或5％至10％w/v的藻酸酯低聚物，其余部分由药学上可接受的赋形剂例如水和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的微米/纳米颗粒)组成。
为了将本发明中使用的微米/纳米颗粒施用于鼻子或鼻旁鼻窦，可以使用无菌水性液体制剂；例如通过鼻喷雾装置施用，例如无推进剂或推进剂辅助的鼻喷雾装置。代表性制剂可以含有0.1至10％，例如0.1至5％、0.1至2％、0.1至1％、0.1至0.8％、0.1至0.5％、0.1至0.2％、0.2至10％、0.2至5％、0.2至2％、0.2至1％、0.2至0.8％、0.2至0.5％、0.5到10％、0.5到5％、0.5到2％、0.5到1％、0.5到0.8％、0.8到10％、0.8到5％、0.8到2％、0.8到1％、1到10％、1至5％、1至2％、2至10％、2％至5％或5％至10％w/v的微米/纳米颗粒，其余部分由药学上可接受的赋形剂例如水和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的藻酸酯低聚物)组成。
为了将本发明中使用的藻酸酯低聚物施用于鼻子或鼻旁鼻窦，可以使用无菌水性液体制剂；例如通过鼻喷雾装置施用，例如无推进剂或推进剂辅助的鼻喷雾装置。代表性制剂可以含有0.1至10％，例如0.1至5％、0.1至2％、0.1至1％、0.1至0.8％、0.1至0.5％、0.1至0.2％、0.2至10％、0.2至5％、0.2至2％、0.2至1％、0.2至0.8％、0.2至0.5％、0.5到10％、0.5到5％、0.5到2％、0.5到1％、0.5到0.8％、0.8到10％、0.8到5％、0.8到2％、0.8到1％、1到10％、1至5％、1至2％、2至10％、2％至5％或5％至10％w/v的藻酸酯低聚物，其余部分由药学上可接受的赋形剂例如水和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的微米/纳米颗粒)组成。
用于将本发明的藻酸酯低聚物施用至下呼吸道的代表性可吸入粉末可包含至多90％，例如至多85％、80％、75％或70％，例如50至90％、55至90％、60至90％、65至90％、70至90％、75至90％、80至90％、85至90％、50至85％、55至85％、60至85％、65至85％、70至85％、75至85％、80至85％、50至80％、55至80％、60至80％、65至80％、70至80％、75至80％、50至70％、55至70％、60至70％或65至70％w/v或w/w的低聚物，其余部分由药学上可接受的赋形剂和/或其他活性剂(如果使用)(例如用于本发明的微米/纳米颗粒)组成。
用于将本发明中使用的微米/纳米颗粒施用至下呼吸道的代表性可吸入粉末可包含至多90％，例如至多85％、80％、75％或70％，例如50至90％、55至90％、60至90％、65至90％、70至90％、75至90％、80至90％、85至90％、50至85％、55至85％、60至85％、65至85％、70至85％、75至85％、80至85％、50至80％、55至80％、60至80％、65至80％、70至80％、75至80％、50至70％、55至70％、60至70％或65至70％w/v或w/w的微米/纳米颗粒，其余部分由药学上可接受的赋形剂和/或其他活性剂(如果使用)(例如用于本发明的藻酸酯低聚物)组成。
用于将本发明中使用的藻酸酯低聚物施用至下GI道的代表性片剂可包含至多99％、至多95％、90％、85％或80％，例如50至95％、55至95％、60至95％、65至95％、70至95％、75至95％、80至95％、85至95％、90至95％、50至90％、50至90％、55至90％、60至90％、65至90％、70至90％、75至90％、80至90％、85至90％、50至90％、55至85％、60至80％或65至75％w/v或w/w的低聚物，其余部分由药学上可接受的赋形剂和/或其他活性剂(如果使用)(例如用于本发明的微米/纳米颗粒)组成。
肠溶衣片剂也在施用本发明中使用的藻酸酯低聚物至下GI道中是有效的。代表性的肠溶衣片剂可包含至多95％，例如至多90％、85％或80％，例如55至90％、60至90％、65至90％、70至90％、75至90％、80至90％、85至90％、55至85％、60至85％、65至85％、70至85％、75至85％、80至85％、50至80％、55至80％、60至80％、65至80％、70至80％或75至80％w/v或w/w的低聚物，其余部分由药学上可接受的赋形剂——包括肠溶衣(例如包含脂肪酸的聚合物，蜡，虫胶，塑料和植物纤维)——和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的微米/纳米颗粒)组成。
肠溶衣片剂也在施用本发明中使用的微米/纳米颗粒至下GI道中是有效的。代表性的肠溶衣片剂可包含至多95％，例如至多90％、85％或80％，例如55至90％、60至90％、65至90％、70至90％、75至90％、80至90％、85至90％、55至85％、60至85％、65至85％、70至85％、75至85％、80至85％、50至80％、55至80％、60至80％、65至80％、70至80％或75至80％w/v或w/w的微米/纳米颗粒，其余部分由药学上可接受的赋形剂——包括肠溶衣(例如包含脂肪酸的聚合物，蜡，虫胶，塑料和植物纤维)——和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的藻酸酯低聚物)组成。
肠溶衣颗粒也在施用本发明中使用的藻酸酯低聚物至下GI道中是有效的。这样的颗粒可以提供在胶囊中，该胶囊本身可以或可以不设有肠溶衣。代表性的肠溶衣颗粒可包含至多95％，例如至多90％、85％或80％，例如55至90％、60至90％、65至90％、70至90％、75至90％、80至90％、85至90％、55至85％、60至85％、65至85％、70至85％、75至85％、80至85％、50至80％、55至80％、60至80％、65至80％、70至80％或75至80％w/v或w/w的低聚物，其余部分由药学上可接受的赋形剂——包括肠溶衣(例如包含脂肪酸的聚合物，蜡，虫胶，塑料和植物纤维)——和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的微米/纳米颗粒)组成。
肠溶衣颗粒在施用本发明中使用的微米/纳米颗粒至下GI道中是有效的。这样的颗粒可以提供在胶囊中，该胶囊本身可以或可以不设有肠溶衣。代表性的肠溶衣颗粒可包含至多95％，例如至多90％、85％或80％，例如55至90％、60至90％、65至90％、70至90％、75至90％、80至90％、85至90％、55至85％、60至85％、65至85％、70至85％、75至85％、80至85％、50至80％、55至80％、60至80％、65至80％、70至80％或75至80％w/v或w/w的微米/纳米颗粒，其余部分由药学上可接受的赋形剂——包括肠溶衣(例如包含脂肪酸的聚合物，蜡，虫胶，塑料和植物纤维)——和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的藻酸酯低聚物)组成。
子宫托可用于将本发明中使用的藻酸酯低聚物和/或微米/纳米颗粒施用于女性生殖道的下部。代表性制剂可包含1至25％、1至20％，例如1至15％、1至10％、1至9％、1至8％、1至7％、1至6％、5至25％、5至20％、5至15％、5至10％、5至9％、5至8％、5至7％、5至6％、8至25％、8至20％、8至15％、8至10％、9至25％、9至20％或9至15％w/v或w/w的低聚物，其余部分由药学上可接受的赋形剂——包括固体赋形剂(例如石蜡等)——和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的微米/纳米颗粒)组成。另一代表性制剂可包含1至25％、1至20％，例如1至15％、1至10％、1至9％、1至8％、1至7％、1至6％、5至25％、5至20％、5至15％、5至10％、5至9％、5至8％、5至7％、5至6％、8至25％、8至20％、8至15％、8至10％、9至25％、9至20％或9至15％w/v或w/w的微米/纳米颗粒，其余部分由药学上可接受的赋形剂——包括固体赋形剂(例如石蜡等)——和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的藻酸酯低聚物)组成。
用于将本发明中使用的藻酸酯低聚物直接递送至肝脏、胰腺或生殖系统的粘膜表面的代表性水溶液将是无菌的，并且可以含有6至25％，例如6至20％、6至15％、6至10％、8至25％、8至20％、8至15％、9至25％、9至20％、9至15％、10至15％、10至20％、10至25％、15至20％或15至25％w/v的低聚物，其余部分由水和药学上可接受的赋形剂和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的微米/纳米颗粒)组成。
用于将本发明中使用的微米/纳米颗粒直接递送至肝脏、胰腺或生殖系统的粘膜表面的代表性水溶液将是无菌的，并且可以含有6至25％，例如6至20％、6至15％、6至10％、8至25％、8至20％、8至15％、9至25％、9至20％、9至15％、10至15％、10至20％、10至25％、15至20％或15至25％w/v的微米/纳米颗粒，其余部分由水和药学上可接受的赋形剂和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的藻酸酯低聚物)组成。
直肠栓剂可用于将本发明中使用的微米/纳米颗粒施用于GI道的下部。代表性制剂可以含有0.1至10％，例如0.1至5％、0.1至2％、0.1至1％、0.1至0.8％、0.1至0.5％、0.1至0.2％、0.2至10％、0.2至5％、0.2至2％、0.2至1％、0.2至0.8％、0.2至0.5％、0.5到10％、0.5到5％、0.5到2％、0.5到1％、0.5到0.8％、0.8到10％、0.8到5％、0.8到2％、0.8到1％、1到10％、1至5％、1至2％、2至10％、2％至5％或5％至10％w/v的微米/纳米颗粒，其余部分由药学上可接受的赋形剂(包括固体赋形剂)和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的藻酸酯低聚物)组成。
直肠栓剂可用于将本发明中使用的藻酸酯低聚物施用于GI道的下部。代表性制剂可以含有0.1至10％，例如0.1至5％、0.1至2％、0.1至1％、0.1至0.8％、0.1至0.5％、0.1至0.2％、0.2至10％、0.2至5％、0.2至2％、0.2至1％、0.2至0.8％、0.2至0.5％、0.5到10％、0.5到5％、0.5到2％、0.5到1％、0.5到0.8％、0.8到10％、0.8到5％、0.8到2％、0.8到1％、1到10％、1至5％、1至2％、2至10％、2％至5％或5％至10％w/v的藻酸酯低聚物，其余部分由药学上可接受的赋形剂(包括固体赋形剂)和/或其他活性剂(如果使用)(例如本发明中使用的微米/纳米颗粒)组成。
将参考以下非限制性实例进一步描述本发明，其中
图1显示实施例1和2的transwell粘液RTN渗透测定的示意图。
图2显示CF粘液中阴离子(正方形)和阳离子(菱形)RTN随时间(分钟)的易位％。误差棒代表标准偏差。
图3显示正常粘液中阴离子(正方形)和阳离子(菱形)RTN随时间(分钟)的易位％。误差棒代表标准偏差。
图4显示阳离子RTN制剂通过CF(菱形)和正常粘液(NM；正方形)的累积浓度(ng/cm2)和％易位的比较。误差棒代表标准偏差。
图5显示阴离子RTN制剂通过CF(菱形)和正常(正方形)粘液的累积浓度(ng/cm2)和％易位的比较。误差棒代表标准偏差。
图6显示使用OligoG(正方形)或OligoM(三角形)处理或不进行处理(菱形)下，CF粘液中阳离子RTN随时间(分钟)的平均累积浓度(ng/cm2)和％易位的比较。用OligoG或OligoM处理粘液，平衡后，加入RTN。误差棒代表标准偏差。
图7显示使用OligoG(正方形)或OligoM(三角形)处理或不进行处理(菱形)下，正常粘液中阳离子RTN随时间(分钟)的平均累积浓度(ng/cm2)和％易位的比较。用OligoG或OligoM处理粘液，平衡后，加入RTN。误差棒代表标准偏差。
图8显示使用OligoG(正方形)或OligoM(三角形)处理或不进行处理(菱形)下，CF粘液中阴离子RTN随时间(分钟)的平均累积浓度(ng/cm2)和％易位的比较。用OligoG或OligoM处理粘液，平衡后，加入RTN。误差棒代表标准偏差。
图9显示使用OligoG(正方形)或OligoM(三角形)处理或不进行处理(菱形)下，正常粘液中阴离子RTN随时间(分钟)的平均累积浓度(ng/cm2)和％易位的比较。用OligoG或OligoM处理粘液，平衡后，加入RTN。误差棒代表标准偏差。
图10显示阳离子RTN在易位之前(A)和易位穿过CF粘液(B)和用OligoM处理的CF粘液后的TEM照片。
图11显示用或不用OligoG和OligoM或单独使用OligoG和OligoM的阳离子和阴离子RTN转染后16HBE细胞存活的百分比。在100％的存活率处还显示了未经处理的细胞。进行了t检验，其显著性截断值为p<0.05，并且以虚线显示了与未处理对照显著不同的条件。误差棒代表标准偏差。
图12显示了各种CFTR调节剂的化学结构。
实施例
实施例1–阳离子和阴离子纳米颗粒跨正常和囊性纤维化粘液的易位以及藻酸酯 低聚物的作用
材料和方法
材料
受体靶向的纳米复合物(RTN)制剂包括脂质体DOTMA/DOPE或DOPG/DOPE(AvantiPolar Lipids,Inc.,Alabaster,AL,USA)、肽Y(中国上海ChinaPeptides)和Cy-3沉默子GAPDH siRNA(Thermo Fisher Scientific,Northumberland,UK)。
用于体外转染的RTN在OPTIMEM(Life Technology,Paisley,UK)中制备，其余的则在不含DNAse/RNAse的水中(Thermo Fisher Scientific,Northumberland,UK)制备。所有RTN均在室温下孵育，而含有荧光标记的siRNA(Cy-3)的THOSE则置于黑暗中。
通过在快速搅拌下将肽Y溶液添加到DOTMA/DOPE溶液中，最后加入Cy-3siRNA，并孵育30分钟，以1：4：1(脂质体：肽：siRNA)重量比制备阳离子siRNA RTN。通过将siRNA在快速搅拌下加入肽中并孵育30分钟，以20：2.7：1(脂质体：肽：siRNA)的重量比制备阴离子siRNA RTN。然后加入DOPG/DOPE并再温育30分钟。
表1和2显示了贮液浓度(μg/μl)以及肽Y和DOTMA/DOPE稀释因子的实例以及混合制成三种RTN的最终量。
表1：稀释因子和混合以制成最终RTN制剂的组分量。
Figure BDA0002684241160000771
表2：用于RTN制剂的脂质和肽组分的详细化学名称和结构
Figure BDA0002684241160000772
藻酸酯低聚物-由挪威AlgiPharma AS提供OligoG(藻酸酯低聚物，DP 5至20，平均分子量3200Da，90-95％G残基)和OligoM(藻酸酯低聚物，12聚体，100％M)。
Transwell粘液RTN渗透测定
Transwell粘液RTN渗透测定在带有transwell(6.5毫米，3.0μm孔聚酯膜插入物，Corning,UK)的24孔板中进行，一式2份或3份，置于有盖有水的容器中，并保持在37℃培养箱中(图8)。使用Trizma-Base(Sigma Aldrich，Dorset,UK)在50mM和pH 7.4下制备Tris缓冲液。在每个孔中添加600μl的Tris缓冲液，并将transwell置于顶部。在顶部添加1μl的CF或非CF(正常)粘液(瑞士日内瓦Epithelix Sarl)，并分散在每个transwell中。在某些情况下，还添加2μl的5mg/ml的OligoG或OligoM(挪威AlgiPharma AS)，并与粘液混合。将板温育30分钟以平衡粘液。制备140ng/μl的siRNA RTN，并在每个孔上添加3μl。还包括带有3μl的140ng/μl siRNA的Tris缓冲液的阳性对照和纯Tris缓冲液的阴性对照。在5、10、15、30、45、60和120分钟后，收集200μl的Tris缓冲液，然后移液到96孔板(Nunc MicroWell,96-Well,Optical-Bottom,Coverglass Base,Thermo-Fisher Scientific)中。每次收集后，在孔中更换200μl的Tris缓冲液。在FLUOstar OPTIMA酶标仪(BMG，Labtech)中测量SiRNA荧光(激发波长560±10nm，发射波长590±10nm)。
确定RTN大小和电荷
将RTN制剂用无DNAse/RNAse的水以1μg/mL siRNA浓度稀释至1mL，并使用MalvernNano ZS Zetasizer(英国Malvern)测定其大小和电荷(ζ电位)，每个样品进行10次测量，自动采样，1.330折射率，78.5介电常数，0.8871cP粘度和25℃温度，使用制造商的DTS程序(v5.03)处理。
累积浓度和百分比移位计算
首先，需要计算RTN通过粘液的易位百分比。从荧光计获得通过粘液进行RTN测定的原始荧光数据。从其各自的样品数据和阳性对照(Tris缓冲液中的siRNA)中减去阴性对照值(Tris缓冲液)。通过将5分钟数据添加到10分钟数据，将10分钟数据添加到15分钟数据等等，计算累积数据。还计算阳性对照的总和。通过将累积数据乘以100，然后将其除以阳性对照的总和，可以计算出RTN通过粘液的易位百分比。
为了计算累积浓度，首先将渗透百分比数据除以100。现在，将这些数据乘以420-其是阳离子RTN内siRNA的浓度(以ng为单位)(每个孔中加入的140ng/μl siRNA x 3μl＝420ng/孔)。对于阴离子制剂，数据需要乘以358.4ng/孔，这是不同的。最后，将这些数据除以0.33，该值是测定中使用的transwell的表面积，单位为cm2。
通过两次样本T检验确定显著性，p值的显著性临界值为p<0.05。
RTN通过粘液的扩散
RTN通过粘液的扩散使用菲克第二定律进行计算。
Figure BDA0002684241160000791
(菲克第二定律)
dM/dt是每ng/s/cm2的通量(F)(由绘制的RTN累积浓度的线性趋势线方程确定，以计算稳态下的传输速率)，D是以cm2s-1为单位的扩散系数，C是粘液上SiRNA的浓度，单位为ng/cm3，h是transwell上粘液的厚度，单位为cm。
为了找到通量，绘制了累积浓度数据点的散点XY图，并选择了曲线图达到平稳之前的点。在添加显示其方程式和R2值的线性趋势线之前，绘制的图需要尽可能的直线。为了获得最佳的理论通量值，R2值必须尽可能接近1。
在本实施例中，通量为9.86ng/cm2/min。
为了将通量应用于菲克方程，需要以秒为单位计算。为此，将通量除以60。
通量＝9.86/60＝0.16ng/cm2/s
h＝单位为cm的势垒(transwell)厚度＝0.0035cm
C0＝RTN内SiRNA的浓度，以ng/cm3计，对于阳离子RTN，＝140000ng/cm3，对于阴离子RTN，＝119800ng/cm3
求解D将得到RTN通过粘液的扩散(Dm)，单位为cm2s-1。
RTN通过水的扩散
RTN通过水的扩散采用式II(斯托克定律)进行计算；
Figure BDA0002684241160000801
(斯托克定律)
D是以cm2s-1为单位的扩散系数，K是玻尔兹曼常数，T是开尔文温度，η是以gs-1nm-1为单位的粘度，r是RTN的半径。
玻尔兹曼常数＝1.38E-02nm2gs-2k-1
温度＝310开尔文
Pi＝3.1416
粘度＝6.92E-10gs-1nm-1
半径＝RTN的测量大小(单位为nm(直径))除以2。
求解D将得到RTN通过水的扩散(Dw)，单位为nm2s-1。
需要通过将Dw乘以10-8将该值转换为以cm2s-1为单位。
透射电子显微镜(TEM)
为了进行电子显微镜检查，将如上所述制备的RTN涂在涂有Formvar/碳载体膜(Agar Scientific)的300目铜栅格上。在准备之前，将栅格在Emitech K350G系统(EmitechLtd.)中以30mA(负极性)“辉光放电”15s。几秒钟后，通过用滤纸吸干来干燥栅格。然后将样品(纳米颗粒)用1％乙酸铀酰进行2-3s负染色，然后用滤纸吸干并风干。用Philips CM120BioTwin透射电子显微镜进行成像，并在120kV的加速电压下运行。使用AMT 5MP数字TEM相机(Deben UK Limited，Bury St.Edmunds，Suffolk)捕获图像。
MTS细胞活力测定
测试了siRNA RTN和OligoG或OligoM的细胞活力。以100ng/孔的RTN siRNA制剂，15μl的5mg/ml OligoG和OligoM以及15μl的OligoG或OligoM与不同的siRNA RTN制剂组合，都用OPTIMEM配制至150μl。将它们加入96孔板(Greiner Bio-One，微孔板，PS，平底，透明)中的16HBE细胞中，放置4小时。用PBS洗涤细胞，并更换150μl新鲜培养基。24小时后，将培养基移出，并添加100μl含20μlMTS分析试剂(Promega)的新鲜培养基。孵育四小时后，使用FLUOstar OPTIMA微孔板读数器在490nm(BMG，Labtech)处测量吸光度。
结果
阳离子和阴离子RTN易位跨越囊性纤维化粘液
制备含Cy3标签的siRNA的阳离子和阴离子RTN，并测量其大小和电荷。在表3中报告了它们的平均值，并且在CF粘液上进行的所有穿透孔粘液渗透测定中均保持相同。
表3：用于CF粘液测定的RTN制剂的大小和电荷测量。
大小 电荷
阳离子型 158.7 46.6
阴离子型 169.8 -38.48
将这些RTN添加到transwells的粘液层的顶部(图1)，以模拟气道上皮的粘液屏障-允许通过膜易位并沉积到缓冲液(Tris缓冲液)中。在5、10、15、30、45、60和120分钟的特定时间点收集带有易位RTN的缓冲液样品。测量RTN荧光并将其与siRNA阳性对照进行比较，以确定特定时间点后的累积RTN易位。然后计算RTN的易位百分比(％)和累积浓度，针对不同RTN制剂中的siRNA浓度差异进行归一化。还计算了来自所有进行的实验的平均％易位和累积浓度。相比于其各自的100％siRNA阳性对照，％易位可显示RTN穿透至收集缓冲液的程度，并且可以确定RTN是否可穿过粘液移动。最后，通过分别对纳米颗粒通过粘液和水的扩散应用菲克和斯托克定律，确定并比较了RTN的扩散速率(表12)。
图2显示阴离子RTN比阳离子RTN具有更高的％易位。
跨正常粘液的阳离子和阴离子RTN移位
与CF粘液的实验相似，进行了使用来自健康供体的粘液(称为“正常粘液”)的实验。表4中描述了所用制剂的平均大小和电荷值，并且在对正常粘液进行的所有transwell粘液渗透测定中均保持相同。
表4：用于正常粘液测定的RTN制剂的大小和电荷测量。
大小 电荷
阳离子型 121.3 48.1
阴离子型 160.5 -40.9
RTN制剂具有约140±50nm的可接受大小，该大小是CF粘液的预定孔径，并用于transwell粘液渗透测定，这次以正常粘液作为transwell膜上的屏障。收集样品并测定其来自Cy3-siRNA的荧光。然后计算RTN的易位百分比(％)和累积浓度，针对不同RTN制剂中的siRNA浓度差异进行归一化。还计算了来自所有进行的实验的平均％易位和累积浓度。通过分别对纳米颗粒通过粘液和水的扩散应用菲克和斯托克定律，确定并比较了RTN的扩散速率(表12)。
阴离子RTN比阳离子RTN具有更高的易位百分比。对％易位的T检验表明，阳离子RTN与阴离子RTN明显不同(表5)。
表5：RTN制剂在正常粘液中随时间的％易位的组合的T检验p值。斜体表示显著性，截断值为p<0.05。
Figure BDA0002684241160000831
阳离子和阴离子RTN跨CF和正常粘液易位的比较
比较不同RTN制剂在CF或正常粘液中的易位将确定CF粘液是否确实减慢了RTN的速度，以及这种累积的程度
图4和5显示，与正常粘液相比，当将两种RTN制剂应用于CF粘液时，其RTN累积浓度和％易位降低。在阳离子和阴离子制剂中，CF粘液中的累积浓度分别降低了30％和20％。T-检验确定阳离子和阴离子RTN在CF和正常粘液上的易位速率显著不同(表6)。
表6：比较不同时间点阳离子和阴离子RTN的CF和正常粘液累积浓度的T检验。斜体表示显著性，截断值为p<0.05。
Figure BDA0002684241160000841
OligoG和OligoM对RTN跨粘液层易位的影响
确定了RTN通过粘液易位的趋势后，OligoG和OligoM被用于确定它们是否可以增强RTN易位效率并增加其累积浓度。OligoG和OligoM使用与上述用于阳离子和阴离子RTN制剂相同的transwell粘液渗透测定法进行测试。
阳离子RTN
图6显示了OligoG和OligoM对跨CF粘液层的阳离子RTN易位的影响。未经处理的阳离子RTN的易位效率最低，而OligoG和OligoM均可增加阳离子RTN制剂的累积浓度和％易位。与OligoG相比，OligoM显示出显著更高的RTN最终浓度，这一观察得到了T检验(表7)和ANOVA的支持。
表7：未经处理或经低聚物处理的CF粘液中阳离子RTN累积浓度的T检验值。将CF粘液中的阳离子RTN(无)与用OligoG或OligoM处理的CF粘液中的阳离子RTN进行比较。将OligoG处理的CF粘液中的阳离子RTN与OligoM处理的CF粘液中的阳离子RTN进行比较。斜体表示显著性，截断值为p<0.05。
Figure BDA0002684241160000842
Figure BDA0002684241160000851
在所有时间点上，通过OligoG和OligoM处理的CF粘液移位的阳离子RTN的累积浓度与未处理的CF粘液中的累积浓度显著不同。同样，与OligoG相比，OligoM在阳离子RTN易位方面具有明显更好的效果，尤其是在45分钟的收集时间点之后，并且％易位甚至超过了100％的名义渗透率。在最后120分钟的时间点上的ANOVA多重比较测试相似地显示，与未处理的粘液相比，两种Oligos均具有显著不同的RTN累积浓度效应，并且与OligoG相比，OligoM对RTN的穿透效率和速率具有显著增强的作用。
当使用正常粘液进行此测定时，可以检测到与CF粘液相似的趋势(图7)。如在CF粘液中所见，与OligoG或未经处理的正常粘液相比，OligoM最大程度地提高了RTN易位效率。如在CF粘液中所观察到的，OligoG仍显示对未处理的正常粘液具有更高的累积浓度，但不及也超过100％易位的OligoM的浓度高。这些观察的显著性通过下面所见的T检验突出示出(表8)。
表8：未经处理或经低聚物处理的正常粘液中阳离子RTN累积浓度的T检验值。将正常粘液中的阳离子RTN(无)与用OligoG或OligoM处理的正常粘液中的阳离子RTN进行比较。将用OligoG处理的正常粘液中的阳离子RTN与用OligoM处理的正常粘液中的阳离子RTN进行比较。斜体表示显著性，截断值为p<0.05。
Figure BDA0002684241160000852
在30分钟的时间点之后，OligoM对增加阳离子RTN的累积浓度具有显著作用，但仅在30分钟和45分钟的时间点，OligoG的情况是如此。与OligoG在45分钟后的时间点相比，OligoM显示出RTN的易位速率显著提高，并且RTN累积浓度急剧增加。相反，用OligoG进行粘液处理似乎显示出与未处理粘液相同的易位性，尽管累积RTN浓度始终较高。ANOVA检验还可以在最终时间点验证t检验结果。
阴离子RTN
图8显示了OligoG和OligoM对跨CF粘液层的阴离子RTN易位的影响。与未处理的CF粘液相比，两种低聚物都显示出更高的累积浓度和％易位的趋势，但发现这些差异并不明显(表9)并通过ANOVA检验确认(未显示)。
表9：未经处理或经低聚物处理的CF粘液中阴离子RTN累积浓度的T检验值。将CF粘液中的阴离子RTN(无)与用OligoG或OligoM处理的CF粘液中的阴离子RTN进行比较。将OligoG处理的CF粘液中的阴离子RTN与OligoM处理的CF粘液中的阴离子RTN进行比较。斜体表示显著性，使用截断值p<0.05。
Figure BDA0002684241160000861
在用OligoG或OligoM处理(或未处理)的正常粘液中进行了相同的实验。结果如图9所示。这里，Oligos的无效性更加明显，因为所有绘制的线都彼此非常接近并且显示出几乎相同的趋势。在120分钟的最终时间点上略有差异，表明用OligoG处理的粘液的RTN累积浓度略低，而未处理的粘液的RTN浓度略高。但是，所有条件在统计上都不显著，已通过t检验(表10)和ANOVA值(未显示)进行了验证。
表10：未经处理或经低聚物处理的正常粘液中阴离子RTN累积浓度的T检验值。将正常粘液中的阴离子RTN(无)与用OligoG或OligoM处理的正常粘液中的阴离子RTN进行比较。将用OligoG处理的正常粘液中的阴离子RTN与用OligoM处理的正常粘液中的阴离子RTN进行比较。斜体表示显著性，截断值为p<0.05。
Figure BDA0002684241160000871
OligoG和OligoM对RTN大小和电荷的影响
在确定使用OligoG和OligoM进行的粘液处理在RTN制剂(主要是阳离子RTN)的易位中显示出显著差异后，尝试发现这是否是由于改变RTN电荷而引起的。制备阴离子和阳离子RTN制剂并将其分成三个相等的eppendorfs。用OligoG或OligoM将其中的两个样品处理2分钟。测量了它们的大小和电荷(表11)。
表11：未经处理或用OligoG或OligoM处理的阳离子和阴离子RTN的尺寸和电荷测量值。
Figure BDA0002684241160000881
表11显示两种低聚物都改变了阳离子和阴离子RTN的电荷，使其更负。这对于阳离子RTN最为明显，它们的电荷完全从正变为负，几乎达到与未处理阴离子RTN相似的电荷水平。同样明显的是，尤其是在阳离子制剂中，它们的大小在每次测量后都减小。首先测量未经处理的样品，然后测量经OligoG和OligoM处理的样品，每次测量持续约20分钟。尽管OligoM似乎与OligoG产生的电荷差异稍小，但这些值彼此之间并无显著差异。
RTN在CF和正常粘液中的倍数阻抗
使用菲克和斯托克定律，计算用或不用OligoG或OligoM处理过的CF和正常粘液中RTN的扩散系数及其倍数阻抗(fold impedance)(表12)。这些计算考虑了纳米复合物的大小，并且可以确定这些RTN在粘液中的倍数阻抗(与它们在水中的扩散相比)，其用作最佳无障碍扩散性的对照。
表12：用或不用OligoG或OligoM处理的阳离子和阴离子RTN在CF和正常粘液(NM)中的扩散速率(Dm)。Dw代表RTN在水中的扩散。与水相比，倍数阻抗代表RTN通过粘液的阻滞作用。
Figure BDA0002684241160000891
Figure BDA0002684241160000901
在CF和正常粘液中，与未经处理的粘液相比，用OligoM处理后，阳离子RTN的倍数阻抗显著降低(分别为2.6和1.7倍)。与OligoG相比，OligoM在降低CF粘液的粘液阻抗方面具有1.8倍的差异，而在正常粘液中具有1.7倍的差异。在阴离子RTN的情况，低聚物对提高或降低易位效率没有明显影响。
从transwell回收的RTN的透射电子显微镜(TEM)
如图10所示，在存在或不存在OligoM的情况下，跨CF粘液层易位后，从下transwell室回收的阳离子RTN与易位之前的其形式相比，在结构上是完整的并且基本不变。
OligoG、OligoM和RTN的细胞毒性
进行MTS测定以确定RTN和/或OligoG或OligoM单独或一起对16HBE细胞细胞(永生化的人支气管上皮细胞)是否产生毒性。将16HBE细胞以60-70％的融合度接种在96孔板上，然后孵育过夜。以100ng/孔施加RTN制剂。在转染时，将低聚物与RTN或单独与OPTIMEM混合。4小时后，将测试培养基移出并用新鲜培养基和MTS溶液替换，持续另外4小时。然后，读取其吸光度并将其与未转染的对照进行比较，以计算每种测试条件下细胞的存活百分比。结果在图11中示出。
可以看出，与单独的OligoM相比，单独的OligoG对细胞更具毒性。而且，阴离子RTN比阳离子RTN毒性小。阳离子和阴离子RTN制剂之间的T检验表明，与阴离子RTN相比，阳离子RTN具有明显更高的毒性(p值0.0276；p值的截断值显著性为p<0.05)。在RTN与OligoG组合使用中观察到最高和最显著的毒性。另一方面，OligoM使阳离子RTN的毒性低于单独的阳离子RTN，并且对阴离子RTN毒性没有影响。
讨论
可以从这项研究中得出以下结论：
1.CF粘液比正常粘液抑制RTN的易位更多。
2.在正常和CF粘液中阴离子RTN比阳离子RTN更有效地易位。
3.与OligoG相比，Oligo M增强阳离子RTN通过正常和CF粘液的易位。
4.OligoM对阴离子RTN的易位没有明显影响。
5.与OligoM一起使用时，阳离子RTN在本文测试的所有系统中均具有最高的扩散速率。
6.与在存在或不存在OligoM的情况下通过CF粘液易位之前其形式相比，阳离子RTN在结构式保持完整，并且基本不变。
7.OligoM提供阳离子RTN对16HBE细胞更小的细胞毒性。
实施例2-聚乙二醇化对阳离子纳米复合物通过正常和CF人气道粘液的易位的影 响
方法：
阳离子纳米复合物制剂
由DOTMA/DOPE脂质体(0.5μg/μL)与0％、5％或10％PEG(每个PEG为2.5μg/μL)、肽Y(2μg/μL)和Cy3标记的siRNA(0.5μg/μL)制成的阳离子纳米复合物分别以1：4：1的重量比配制。例如，将脂质体(1μg)和肽Y(4μg)添加到无核酸酶的水(1μL)中。然后在快速混合下将Cy3标记的siRNA(1μg)添加到混合物中。将该纳米复合物在室温下避光孵育30-40分钟，以形成复合物。
阳离子纳米复合物的表征
使用Zetasizer Nano ZS测量每种纳米复合物的大小和ζ电位。将纳米复合物(对于含0％PEG的阳离子为10μL，对于含5％或10％PEG的阳离子为16.7μL)在MilliQ水(使溶液达到940μL所需的体积)中稀释。将920μL每个稀释的纳米复合物样品转移到比色杯中，并放入Zetasizer Nano ZS中以测量其大小，然后测量ζ电位。
Transwell测定
如实施例1中所述
结果
分别配制了DOTMA/DOPE与0％、5％或10％PEG、肽Y和Cy3标记的siRNA重量比为1：4：1制成的阳离子纳米复合物。Cy3标记的siRNA可通过测量荧光定量通过正常和CF人粘液进行的纳米复合物易位。量化和绘制易位纳米复合物的累积渗透和浓度。还测量了每种纳米复合物的大小和ζ电位。这样做是为了分别使用菲克定律和斯托克斯定律计算易位纳米复合物在粘液和水中的扩散速率。综上所述，这些数据允许研究PEG化对通过正常和CF粘液进行阳离子纳米复合物易位的影响。
表13.含0、5％和10％PEG的阳离子纳米复合物的表征
Figure BDA0002684241160000931
表14.具有0、5％和10％PEG的易位纳米复合物在粘液(Dm)和水(Dw)中的扩散速率。
Figure BDA0002684241160000932
分别使用菲克定律和斯托克斯定律计算了具有0％、5％和10％PEG的易位阳离子纳米复合物的扩散速率(不包括第3.2节中所述的那些)。
表14表明，与正常粘液相比，阳离子纳米复合物在CF粘液中的扩散通常更受阻。与水相比，具有0％、5％和10％PEG的阳离子纳米复合物在正常粘液中的扩散速度分别慢6.54、8和10.7倍。这表明聚乙二醇化稍微阻碍了阳离子纳米复合物通过正常粘液的易位。与水相比，含0、5％和10％PEG的阳离子纳米复合物在CF粘液中的扩散速度分别慢46.5、40.3和43.1倍。这表明，与OligoM处理不同，聚乙二醇化作用仅微幅改善了阳离子纳米复合物通过CF粘液的易位。

Claims (39)

1.一种将阳离子微米/纳米颗粒跨粘液层易位的方法，所述方法包括
(a)使所述粘液层与至少一种藻酸酯低聚物连同所述阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基；或
(b)(i)使所述阳离子微米/纳米颗粒与具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物接触，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)使所述粘液层与步骤(b)(i)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
2.一种用于将目标分子递送至粘膜表面的上皮细胞的方法，所述方法包括
(a)使所述粘膜表面的粘液层与至少一种藻酸酯低聚物连同包括所述目标分子的阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基；或
(b)(i)使包括所述分子的阳离子微米/纳米颗粒与至少一种藻酸酯低聚物接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)使所述粘膜表面的粘液层与步骤(b)(i)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述微米/纳米颗粒携带所述目标分子，或者以其微米/纳米颗粒的形式提供所述分子。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述目标分子共价结合至所述微米/纳米颗粒的另一组分，或者可以不同于所述微米/纳米颗粒的其他组分。
5.一种使目标分子跨粘液层易位的方法，所述方法包括使所述粘液层与微米/纳米颗粒接触，所述微米/纳米颗粒
(i)由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成，其中至少一种是阳离子微米/纳米颗粒形成剂，至少一种是具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物，和
(ii)还包含所述目标分子，任选地其中所述目标分子与一种或多种所述自组装微米/纳米颗粒形成组分共价结合。
6.一种用于将目标分子递送至粘膜表面的上皮细胞的方法，所述方法包括使所述粘膜表面的粘液层与微米/纳米颗粒接触，所述微米/纳米颗粒
(i)由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成，其中至少一种是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，至少一种是具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物，和
(ii)还包含所述目标分子，任选地其中所述目标分子与一种或多种所述自组装微米/纳米颗粒形成组分共价结合。
7.一种由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒，其中
(i)至少一种自组装微米/纳米颗粒形成组分是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，并且至少一种是具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物，和
(ii)所述微米/纳米颗粒还包含目标分子，任选地其中所述目标分子与一种或多种所述自组装微米/纳米颗粒形成组分共价结合。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法或微米/纳米颗粒，其中所述微米/纳米颗粒包括两亲性自组装微米/纳米颗粒形成组分和/或病毒或病毒样粒子的结构组分。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法或微米/纳米颗粒，其中所述阳离子微米/纳米颗粒形成组分为阳离子两亲性自组装微米/纳米颗粒形成组分和/或病毒或病毒样粒子的阳离子结构组分。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法或微米/纳米颗粒，其中所述分子是具有治疗和/或诊断用途的分子。
11.一种藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，其用于将治疗性或诊断性阳离子微米/纳米颗粒跨粘液层易位的方法中，所述方法包括
(a)使所述粘液层与至少一种藻酸酯低聚物连同所述阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基；或
(b)(i)使所述阳离子微米/纳米颗粒与具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物接触，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)使所述粘液层与步骤(b)(i)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
12.一种藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，其用于将治疗性或诊断性目标分子递送至受试者粘膜表面的上皮细胞的方法中，所述方法包括
(a)使所述粘膜表面的粘液层与至少一种藻酸酯低聚物连同包括所述治疗性或诊断性目标分子的阳离子微米/纳米颗粒接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基；或
(b)(i)使包括所述治疗性或诊断性目标分子的阳离子微米/纳米颗粒与至少一种藻酸酯低聚物接触，所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，从而形成携带所述藻酸酯低聚物的微米/纳米颗粒，和
(b)(ii)使所述粘膜表面的粘液层与步骤(b)(i)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
13.一种藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，其用于跨受试者的粘液层易位治疗性或诊断性目标分子的方法中，所述方法包括
(a)制备由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒，其中至少一种自组装微米/纳米颗粒形成组分是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，并且至少一种是所述藻酸酯低聚物，所述微米/纳米颗粒进一步包含所述治疗性或诊断性目标分子，任选地其中所述治疗性或诊断性分子共价结合至一种或多种所述自组装微米/纳米颗粒形成组分，和
(b)使所述粘液层与步骤(a)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
14.一种藻酸酯低聚物，其中所述藻酸酯低聚物具有至少70％甘露糖醛酸酯残基，其用于将治疗性或诊断性目标分子递送至受试者粘膜表面的上皮细胞的方法中，所述方法包括
(a)制备由自组装微米/纳米颗粒形成组分形成的微米/纳米颗粒，其中至少一种自组装微米/纳米颗粒形成组分是阳离子微米/纳米颗粒形成组分，并且至少一种是所述藻酸酯低聚物，所述微米/纳米颗粒进一步包含所述治疗性或诊断性目标分子，任选地其中所述治疗性或诊断性分子共价结合至一种或多种所述自组装微米/纳米颗粒形成组分，和
(b)使所述粘膜表面的粘液层与步骤(a)中制备的所述微米/纳米颗粒接触。
15.一种产品，其包含具有至少70％甘露糖醛酸酯残基的藻酸酯低聚物和阳离子微米/纳米颗粒作为组合制剂，用于在权利要求1至4中任一项所定义的方法中单独、同时或依次使用。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述粘液层是粘膜表面的粘液层
(i)所述粘液层受CFTR功能障碍的影响，
(ii)所述粘液层是呼吸系统例如鼻子、鼻腔、咽喉、气管、鼻旁窦、支气管或细支气管的粘液层，
(iii)所述粘液层是胃肠道例如口、咽、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠或肛门的粘液层，
(iv)所述粘液层是胰管和/或胆管的粘液层，
(v)所述粘液层是女性生殖系统例如阴道、子宫颈、子宫、输卵管或卵巢的粘液层，
(vi)所述粘液层是男性生殖系统例如睾丸、附睾、输精管、副腺、精囊、前列腺和尿道球腺的粘液层。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述微米/纳米颗粒为约1μm至约500μm、约10μm至约200μm或约10μm至约100μm的微米颗粒。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述微米/纳米颗粒是约1nm至约1000nm、约30nm至约400nm、约100nm至约350nm或约1nm至约50nm的纳米颗粒。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述微米/纳米颗粒是囊泡、胶束、病毒、病毒样粒子、树枝状聚合物、金属/金属性颗粒、碳纳米管、二氧化硅颗粒、聚合物颗粒。
20.根据权利要求19所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述囊泡是脂质体、脂质复合物、聚合物小体、类脂质体或其杂合物。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述微米/纳米颗粒是脂质体或脂质复合物，其包含选自以下的阳离子脂质：N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)，N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)，2,3-二油酰氧基三甲基铵丙烷(DOTAP)，2,3-二(油氧基)丙基三甲基铵(DOTMA)，N-[1-(2,3,-二-十四烷氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)，N-[[1-(2,3,二油氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(DORIE)，3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Choi)，二甲基-二-十八烷基铵(DDAB)，二-十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)和N,N-二甲基-2,3-二油氧基)丙胺(DODMA)。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述微米/纳米颗粒由两亲性自组装微米/纳米颗粒形成化合物形成，并且通过用于制备囊泡微米/纳米颗粒的分批生产方法或微流体生产方法制备。
23.根据权利要求1至19中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述微米/纳米颗粒是携带核酸载体或异源肽的病毒或溶瘤病毒。
24.根据权利要求23所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中
(i)所述携带核酸载体或异源肽的病毒是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、痘病毒、α病毒、疱疹病毒或其杂合物，或
(ii)所述溶瘤病毒为腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、塞姆利基森林病毒、牛痘病毒、塞内卡病毒、马拉巴病毒或肠病毒。
25.根据权利要求1至19中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述聚合物微米/纳米颗粒包括聚苯乙烯、聚乳酸、聚丙烯酰胺、三聚氰胺、聚(D-L-丙交酯)、聚-D-L-乙交酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)PLA、聚己内酯、壳聚糖、明胶、白蛋白、葡聚糖、琼脂糖、聚-L-谷氨酸和/或聚L-赖氨酸。
26.根据权利要求1至19中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述金属/金属性颗粒包括金(例如198Au、199Au)，银(例如107Ag和109Ag)，铂(例如195mPt)，铁(例如59Fe)，铜(例如61Cu、64Cu和67Cu)，钆(例如149Gd、151Gd)，铟(例如111ln)，锝(例如99mTc)，镓(例如67Ga、68Ga)，铼(例如188Re、186Re)，镥(例如177Lu)，锕(例如225Ac)，钇(例如90Y)，锑(例如119Sb)，锡(例如117Sn、113Sn)，镝(例如159Dy)，钴(例如56Co、60Co)，钌(例如97Ru、103Ru、106Ru)，钯(例如103Pd)，镉(例如115Cd)，碲(例如118Te、123Te)，钡(例如131Ba、140Ba)，铽(例如160Tb)，镧(例如140La)，镭(例如223Ra、224Ra)，锶(例如89Sr)，钐(例如153Sm)镱(例如169Yb)，铊(例如201TI)，铯(例如137Cs)，铱(例如192Ir)和铷(例如82Rb)。
27.根据权利要求26所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述金属/金属性颗粒为微米/纳米球、微米/纳米星、微米/纳米笼或微米/纳米壳。
28.根据权利要求1至19中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述二氧化硅微米/纳米颗粒包括中孔二氧化硅。
29.根据权利要求2至28中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述目标分子是治疗活性剂、诊断剂、成像剂、用于工程化细胞或细胞产生的产物的性质的试剂。
30.根据权利要求29所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述治疗活性剂是小分子药物、生物治疗剂或放射性药物。
31.根据权利要求30所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述生物治疗剂是抗体、肽激素、细胞因子、肽生长因子、肽抗原或核酸。
32.根据权利要求31所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述治疗活性剂是CFTR调节剂、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、细胞毒性化学治疗剂、血管生成抑制剂、抗癌单克隆抗体、放射免疫治疗剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、皮质类固醇、非类固醇抗炎药(NSAID)、支气管扩张药、口服降糖药或放射性药物。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述治疗活性剂是用于基因治疗、基因编辑、RNA干扰治疗(例如siRNA或miRNA)、反义治疗以及体外转录mRNA治疗的核酸。
34.根据权利要求29所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述诊断剂是放射诊断剂、造影剂或用作分子探针的核酸或蛋白质。
35.根据权利要求29所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述细胞工程化剂是核酸酶(例如Cas9、Cpf1)、蛋白酶、脂肪酶、辅因子、前体化合物或底物。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述藻酸酯低聚物的平均分子量小于35,000道尔顿，优选小于30,000、25,000或20,000道尔顿。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述藻酸酯低聚物的聚合度(DP)或数均聚合度(DPn)为
(i)2至100、2至75、2至50、2至40、2至35、2至30、2至28、2至25、2至22、2至20、2至18、2至17、2至15或2至12，
(ii)4至100、4至75、4至50、4至35、4至30、4至25、4至22、4至20、4至18、4至16或4至14，
(iii)6至50、6至35、6至30、6至25、6至22、6至20、6至18、6至16或6至14，或
(iv)8至50、8至35、8至30、8至25、10至25、10至22、10至20、10至18或10至15。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中所述藻酸酯低聚物具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％或大约100％的M残基。
39.根据权利要求1至38中任一项的方法、微米/纳米颗粒、藻酸酯低聚物或产品，其中至少80％的M残基布置在M-嵌段中。
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