KR20200136430A - 점액 층을 가로지르는 마이크로/나노입자의 전위를 향상시키기 위한 알지네이트 올리고머의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 점액 층을 가로질러 운반되는 마이크로/나노입자 및 분자 또는 관심 분자를 전위시키는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 점액 층을 가로질러 양이온성 마이크로/나노입자를 전위시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머를 점액 층과 접촉시키는 단계; 또는 (b)(i) 상기 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및 (b)(ii) 점액 층을 단계 (b)(i)에서 제조된 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 점액 층을 가로질러 관심 분자를 전위시키는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자를 점액 층과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나는 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머이며, 상기 관심 분자를 추가로 포함하고, 선택적으로, 여기서 관심 분자는 하나 이상의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분과 공유결합된다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에서 알지네이트 올리고머 및 본 발명의 마이크로/나노입자의 용도에 관한 것이다.

Description

점액 층을 가로지르는 마이크로/나노입자의 전위를 향상시키기 위한 알지네이트 올리고머의 용도
본 발명은 점액 층을 가로지르는 마이크로/나노입자의 전위를 향상시키기 위한, 특히 마이크로/나노입자 형태로 제공되거나 마이크로/나노입자에 의해 점막의 상피 세포 층으로 운반될 때 치료적으로 또는 진단적으로 유용한 분자의 전달을 향상시켜 분자의 국소 전달 및/또는 전신 흡수를 향상시키기 위한 알지네이트 올리고머의 용도에 관한 것이다. 생체 외 및 시험관 내 맥락에서, 점액 층을 생성하는 배양된 세포 또는 점막을 보유하는 조직으로의 마이크로/나노입자의 전달이 향상될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 점액 층, 특히 비정상 점도의 점액 층, 예컨대 낭포성 섬유 막투과 수용체 기능부전을 가진 대상의 점액을 가로지르는 양이온성 성분으로부터 형성된 양이온성 마이크로/나노입자 또는 자가-조립 마이크로/나노입자의 전위를 향상시키기 위한, 특정 부류의 알지네이트 올리고머, 즉, 만누로네이트 풍부 알지네이트 올리고머를 제공한다. 본 발명은, 핵산, 예컨대 치료적 핵산, 또는 특히 CFTR 기능부전을 가진 대상에서 점액 층 아래에 있는 세포에 대해 제한된 생체이용률을 갖는 활성제의 전달에 특히 유용하다.
현대 정밀 의약품의 효능은 종종 이들의 표적에 도달하는 능력에 의해 제한된다. 호흡기, 내장 및 비뇨관의 점막 표면은 혈관과 넓은 표면적으로 인해 약물 전달을 위한 매력적인 표적 부위이다. 그러나, 뮤신, 박테리아 및 숙주-유래 다당류, 박테리아 및 세포 외 DNA를 포함하는 구성성분의 전하 및 복합 중합체 "메시"인 이러한 표면의 점액 장벽은 호흡기 또는 경구 투여 또는 점막 표면에 직접 전달되는 약물의 생체 이용률, 흡착 및 후속 효능을 결정하는 주요 장애물 중 하나를 나타낸다. 더욱이, 다수의 만성 호흡기 및 위장병, 예컨대 낭포성 섬유에서, 고점도의 점액의 생성이 이의 제거를 방해하고 감염과 염증을 연장시킨다. 비정상적인 점액 화합물은 이러한 환자에서 이러한 점액 장벽을 통해 치료제를 전달하는데 어려움을 겪는다.
항생제를 포함하여 다수의 약물, 특히 낭포성 섬유증(cystic fibrosis, CF)의 치료에 통상적으로 사용되는 약물이 흡입 전달용으로 개발되고 있다. CF에 대한 질환 조절 치료제(Disease modifying therapeutics)도 또한 경구 투여용으로 제형화되었다. 그러나, 물에 대한 불용성은 이러한 약물의 생체이용률에 중요한 문제를 제기한다.
예컨대, 낮은 수용해도, 불안정성 또는 비-특이적 독성으로 인해 전달하기 어려운 치료제 또는 진단제의 전반적인 생체이용률을 개선하기 위한 한 가지 유망한 접근 방식은 이러한 약물을 마이크로입자 또는 나노입자에 혼입시키거나 형성하는 것이다. 이러한 입자는 소포(예컨대, 리포좀, 폴리머좀 및 니오좀), 중합체 입자, 금속 입자, 미셀, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 덴드리머, 탄소 나노튜브 및 이러한 개체의 하이브리드 버전을 포함한다. 미립자 전달 시스템이 또한 활성제로서의 핵산을 기반으로 한 치료 또는 진단 접근법, 예컨대, 유전자 치료, 유전자 편집, RNA 간섭 치료, 시험관 내 전사된 mRNA 치료, 안티센스 치료 및 분자 프로브로서 핵산의 사용의 통상적인 특징이며, 그 이유는 분자를 표적 세포로 효과적으로 전달하는 것과 관련된 문제 때문이다.
그러나, 대부분의 입자-기반 약물 전달 시스템은 점액 층에 갇혀 빠르게 제거된다. 따라서 미립자 전달 시스템의 효능은 매우 제한적이며 본 분야에서 오랫 동안 지속되고 있는 과제이다.
현재까지, 연구자들은 경-점막 약물/입자 전달(예컨대, 점막점착제 및 점막 침투 입자)을 개선하기 위해 수많은 기술의 사용을 시도해 왔다. 그러나, 현재 비특이적 결합, 점액 제거 및 독성의 문제로 인해 만성 호흡기 질환에 사용하도록 허용된 것은 없다. 따라서, 인간 질병의 치료 및 진단에서 약물 및 소분자의 경-점막 전달을 촉진할 수 있는 새로운 전달 전략을 개발해야 하는 시급한 미충족 요구가 있다.
알지네이트는 다수의 용도, 즉, 임상적 용도(예컨대, 상처 드레싱에서, 약물 캐리어로서 및 속쓰림 방지 제제에서) 및 비임상적 용도(예컨대, 식품 제제에서) 둘 모두를 갖는 것으로 밝혀진 천연 다당류이다. 알지네이트는 (1-4) 연결된 β-D-만누론산(M) 및/또는 그 C-5 에피머인 α-L-굴루론산(G)의 선형 중합체이다. 알지네이트의 1차 구조는 매우 다양할 수 있다. M 및 G 잔기는 인접한 M 또는 G 잔기의 동종중합체 블록으로서, 교대하는 M 및 G 잔기의 블록으로서 구성될 수 있고 단일 M 또는 G 잔기가 이들 블록 구조물 사이에 간격을 두고 발견될 수 있다. 알지네이트 분자는 이들 구조물 중 일부 또는 모두를 구성할 수 있으며 그러한 구조물은 중합체 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않을 수 있다. 극단적으로는, 굴루론산의 동종중합체(폴리굴루로네이트) 또는 만누론산의 동종중합체(폴리만누로네이트)로 존재한다.
알지네이트는 해양 갈색 조류(예를 들어 두르빌레아(Durvillea), 레소니아(Lessonia) 및 라미나리아(Laminaria)의 특정 종) 및 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii)와 같은 박테리아로부터 단리된다. 다른 슈도모나스들도(예, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 및 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina)) 알지네이트를 생산하는 유전적 능력을 보유하고 있지만, 야생형인 경우에는 알지네이트를 검출가능한 수준으로 생산하지 않는다. 이를 돌연변이시켜, 비-생산성 슈도모나스가 알지네이트를 안정적으로 대량 생산하게 유도할 수 있다.
알지네이트는 폴리만누로네이트로서 합성되며, G 잔기들은 중합체의 M 잔기에 대한 에피머라제(특히 C-5 에피머라제들)의 작용에 의해 만들어진다. 조류에서 추출된 알지네이트는, 조류에서 알지네이트 생합성에 관여하는 효소들이 G 주변에 다른 G를 우선적으로 도입하여, M 잔기들을 G-블록 가닥으로 변환시키기 때문에, G 잔기들이 대개 G 블록으로 조직화되어 있다. 이러한 생합성 체계에 대한 이해를 통해, 특이적인 1차 구조를 가진 알지네이트를 제조할 수 있게 되었다(WO 94/09124, Gimmestad, M et al, Journal of Bacteriology, 2003, Vol 185(12) 3515-3523 및 WO 2004/011628).
알지네이트는 전형적으로 매우 큰 고분자량의 중합체로서, 천연 공급원으로부터 분리되고 있다(예, 평균 분자량 300,000 내지 500,000 달톤 범위). 그러나, 이러한 큰 알지네이트 중합체들이, 예컨대 화학적 또는 효소적 가수분해에 의해 분해 또는 절단되어, 저분자량의 알지네이트 구조체가 되는 것으로 알려져 있다. 평균 분자량이 약 35,000 달톤인 알지네이트가 약학적으로 사용되고 있지만, 공업적으로 사용되는 알지네이트는 전형적으로 100,000 내지 300,000 달톤 범위의 평균 분자량을 가진다(이들 알지네이트는 여전히 큰 중합체로 간주됨).
WO2007/039754, WO2008/125828 및 WO2010/109180은 점액의 점도 및 점액을 통한 중합체성 생물학적/거대분자 약물 및 음이온성 나노입자의 확산에 대한 올리고굴루로네이트(높은 비율의 G 잔기를 가진 알지네이트 올리고머)의 특정 효과를 기술한다. WO2010/109176은 또한 올리고굴루로네이트가 양이온성 리포좀 나노입자를 운반하는 핵산의 형질감염 특성에 미치는 효과를 기술한다. WO2015/128495는 CFTR 기능부전이 있는 환자, 예컨대 낭포성 섬유 환자에서 점액의 특성을 정상화하는 알지네이트 올리고머를 함유하는 특정 알지네이트 G 잔기의 능력을 기술한다.
놀랍게도, 굴루로네이트가 풍부한 알지네이트 올리고머가 아니라, 만누노레이트가 풍부한 알지네이트 올리고머가 점액 층을 가로질러 음이온성 마이크로/나노입자가 아닌 양이온성 마이크로/나노입자의 전위를 향상시킨다는 것이 밝혀졌다. 이러한 알지네이트 올리고머는 또한 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분과 함께 자가-조립 마이크로/나노입자에 혼입될 수 있으며, 이러한 마이크로/나노입자는 이러한 알지네이트 올리고머의 부재 하에 형성된 동등한 마이크로/나노입자와 비교하여 향상된 효율로 점액 층을 가로질러 전위될 것으로 예상된다. 또한, 굴루로네이트가 풍부한 알지네이트 올리고머가 아닌, 만누로네이트가 풍부한 올리고머는 양이온성 마이크로/나노입자 및 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분을 포함하는 마이크로/나노입자와 관련된 세포독성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
이론에 얽매이지 않고, 이는 만누로네이트 풍부 알지네이트 올리고머가 이러한 특정 특성을 가지고 있지만, 굴루로네이트 풍부 알지네이트 올리고머는 이들의 음전하 및 이들의 유연한 구조로 인해 그렇지 않은 것으로 여겨진다.
점액의 다양한 성분은 물질이 전체적으로 음전하를 띄는 것과 같다. 기도 점액 분비물인 MUC5AC 및 MUC5B는 점탄성 겔에서 우세한 뮤신이다. 이러한 뮤신은 대부분의 트레오닌과 세린에서 글리코실화된 프롤린, 트레오닌, 세린(PTS 도메인)이 풍부한 긴 직렬 반복으로 구성된다. 이러한 글리칸의 대부분은 음으로 하전된 카복실 또는 설페이트 기에서 종결되어, PTS 도메인에 높은 음전하를 부여한다. 이러한 음전하는 양이온성 미립자의 정전기 접착제 포획을 촉진한다. 만성 기도 염증이 있는 대상에서, 예컨대, CF에서 볼 수 있듯이, 뮤신 과분비가 발생한다. 이는 뮤신 함량을 증가시켜 CF 점액에서 더 높은 음전하와 점탄성을 부여한다. 뮤신 함량이 증가하면 CF 점액 메시 기공 크기도 감소한다. 염색체 DNA 및 F-액틴 미세섬유를 포함하는 다른 생체 거대분자는 만성 기도 염증을 가진 대상의 기도 점액 분비물에서 우세하며, 이러한 증가된 DNA 수준은 또한 CF 점액에 더 높은 음전하를 부여하고 점액 메시 기공 크기를 감소시킨다. 이렇게 음전하가 증가하고 메시 기공 크기가 감소하면 이러한 대상에서 양이온성 미립자, 예컨대 마이크로/나노입자의 접착성 포획이 더욱 두드러진다.
알지네이트 올리고머는 음으로 하전된 분자이며, 점액 및/또는 양이온성 마이크로/나노입자에 적용되거나 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분과 함께 혼입될 때 입자에 양전하를 감소시키거나 심지어 음전하를 감소시켜 점액의 전체 음전하로 인해 발생하는 방해 효과를 감소시키거나 무효화하는 것으로 여겨진다. 그러나, 굴루로네이트 풍부 알지네이트 올리고머가 아닌 만누로네이트 풍부 알지네이트 올리고머는 각 유형의 올리고머의 상대적인 유연성으로 인해 양이온성 마이크로/나노입자의 전위를 향상시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 굴루코네이트 잔기는 이웃한 굴루코네이트 잔기에 이축으로 결합하고 이는 글리코시드 결합 및 뻣뻣하고 연장된 유로네이트 쇄에 대한 회전을 방해한다. 다른 한편으로, 만누로네이트 잔기는 이웃한 만누로네이트 잔기를 수평방향으로(diequatorially) 결합하는데, 이는 덜 방해된 배열이며, 이는 훨씬 더 유연한 쇄를 발생시킨다. 만누로네이트 풍부 알지네이트 올리고머의 유연성은 이러한 분자가 점액의 뮤신 메시 기공을 통과할 때 마이크로/나노입자에 대해 물리적 장애가 적다는 것을 의미하는 반면, 뻣뻣하고 유연하지 않은 굴루로네이트 올리고머는 점액 성분의 복잡한 네트워크에 잡힐 가능성이 더 높다는 것을 의미한다.
양이온성 마이크로/나노입자 및 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분을 포함하는 마이크로/나노입자는 우수한 세포 형질감염 효율성 및 음이온성 약물(예컨대 핵산)의 우수한 패키징 효율성을 포함하여 음이온성 마이크로/나노입자에 비해 특정 이점이 있기 때문에 이러한 발견은 특히 주목할 만하지만, 특정 응용 분야에서 심각한 전달 장애에 직면하고 세포독성 효과가 있는 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명은 점액의 장벽 효과를 완화하고, 특정 구현예에서, 이러한 입자의 세포독성 효과를 감소시킴으로써 점액 층 아래의 전달 부위와 관련하여 매우 유리한 특정 유형의 마이크로/나노입자의 사용을 용이하게 한다.
따라서 제1양태에서, 본 발명은 점액 층을 가로지르는 양이온성 마이크로/나노입자를 전위시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 점액 층을 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계; 또는
(b)(i) 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
(b)(ii) 상기 점액 층을 상기 단계 (b)(i)에서 제조된 상기 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계.
본 발명은 또한 점액 층을 가로지르는 양이온성 마이크로/나노입자의 전위를 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 점액 층을 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계; 또는
(b)(i) 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
(b)(ii) 상기 점액 층을 상기 단계 (b)(i)에서 제조된 상기 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계.
본 발명은 관심 분자를 점막 표면의 상피 세포로 전달하는 방법을 추가로 제공하는 것으로 간주될 수 있으며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 관심 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 점막 표면의 점액 층을 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계, 또는
(b)(i) 상기 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
(b)(ii) 상기 점막 표면의 점액 층을 상기 단계 (b)(i)에서 제조된 상기 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계.
본 발명은 또한 양이온성 마이크로/나노입자에 의해 점막 표면의 상피 세포에 관심 분자의 전달을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 관심 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 점막 표면의 점액 층을 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계, 또는
(b)(i) 상기 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
(b)(ii) 상기 점막 표면의 점액 층을 상기 단계 (b)(i)에서 제조된 상기 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계.
이러한 양태에서, 마이크로/나노입자는, 예컨대 관심 분자를 운반할 수 있거나, 상기 분자는 이들의 마이크로/나노입자 형태로 제공될 수 있다. 보다 구체적으로, 관심 분자는 마이크로/나노입자의 또 다른 성분, 예컨대 자가-조립 성분에 공유적으로 결합될 수 있거나 마이크로/나노입자의 다른 성분과 별개일 수 있다. 관심 분자는 마이크로/나노입자의 임의의 부분에 또는 그 위에, 예컨대 표면 상에, 내부 공극에 또는 입자 내부 또는 하나 이상의 입자 층 상에, 또는 이들의 조합에 운반될 수 있다. 따라서, 분자는 층상(층) 내부에 존재할 수 있고, 층상을 가로지르고/지르거나 층상의 외부 면과 연합(예컨대 결합)될 수 있거나 층상에 의해 캡슐화될 수 있다, 즉, 분자는 중공 마이크로/나노입자의 내부 상에서 자유롭고/자유롭거나 마이크로/나노입자의 층상의 내부 면과 연합(예컨대 결합)되어 발견되지만, 층상의 내부에서 발견되지 않고, 층상을 가로지르거나 층상의 외부 면과 연합(예컨대 결합)된다. 즉, 이러한 구현예에서, 본질적으로 관심 분자의 어떤 부분도 외부 상에 노출되지 않는다. 이러한 배열은 관심 분자가 독성일 수 있고, 표적을 벗어난 위치에서 해로운 영향을 미칠 수 있으며, 해로운 면역 반응을 유도할 수 있거나, 수용성이 낮은 구현예에서 특히 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 점액 층을 가로지르는 관심 분자를 전위시키는 방법을 제공하며 상기 방법은 점액 층을
(i) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성되는 것으로서, 여기서 적어도 하나는 양이온성 마이크로/나노입자 형성제이고 적어도 하나는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머이고,
(ii) 상기 관심 분자를 추가로 포함하는 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 선택적으로, 여기서 관심 분자는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합된다.
본 발명은 또한 관심 분자를 점막 표면의 상피 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 점막 표면의 점액 층을
(i) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성되는 것으로서, 여기서 적어도 하나는 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머이고,
(ii) 상기 관심 분자를 추가로 포함하는 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 선택적으로, 여기서 관심 분자는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합된다.
본 발명은 또한 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자를 제공하며, 여기서
(i) 적어도 하나의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머이고,
(ii) 상기 마이크로/나노입자가 관심 분자를 추가로 포함하며, 선택적으로 여기서 관심 분자는 하나 이상의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분에 공유결합된다.
관심 분자는 당업자가 특정 사전 결정된 유용성을 갖는 분자이다. 예컨대, 직접 또는 간접적으로 표적 부위 또는 다른 곳에서 기능을 수행하기 위해 또는 효과를 발휘하기 위해 당업자가 표적 부위로 전달되기를 원하는 분자, 또는 표적 부위 또는 표적 부위 또는 다른 곳에서 발생하는 공정에 대해 직접 또는 간접적으로 정보를 제공할 수 있는 분자이다. 따라서, 이러한 분자의 동일성은 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자가 사용되는 특정 맥락에서 당업자의 목적에 의해서만 본질적으로 제한된다. 특정 구체적인 구현예에서, 분자는 치료적 및/또는 진단적 이용의 분자, 예컨대 치료적(약물) 또는 진단제일 수 있으며, 이러한 구현예에서, 마이크로/나노입자는 적절하게 치료적/진단적 마이크로/나노입자로 간주될 수 있다. 용어 관심 분자는 분자 배열로 확장될 수 있다.
본 발명에 따른 관심 분자는 본원에서 정의된 바와 같이 본 발명에서 사용되는 만누로네이트 풍부 알지네이트 올리고머, 예컨대 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 또는 본원에서 정의된 임의의 다른 알지네이트 올리고머가 아님을 즉시 인지할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 관심 분자는 본원에서 정의된 바와 같은 본 발명에서 사용되는 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이 아니다. 다른 구현예에서, 관심 분자는 문제의 마이크로/나노입자의 필수 구조 성분, 예컨대 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분이 아니다.
이러한 양태에서, 관심 분자는 마이크로/나노입자의 자가-조립 성분에 공유결합될 수 있거나, (연합되지 않거나 결합되지 않은, 또는 적어도 단지 일시적으로만 연합되거나 결합된) 마이크로/나노입자의 자가-조립 성분과 구별될 수 있다. 관심 분자는 마이크로/나노입자에 또는 이의 임의의 부분에, 예컨대 표면에, 내부 공극 또는 입자의 하나 이상의 층에, 또는 이들의 조합에 운반될 수 있다. 이와 관련하여 상기 논의는 본 섹션에 준용된다.
자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 단독으로 및/또는 다른 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물과 함께, 예컨대 자발적으로 적절한 물리적 및/또는 화학적 조건 하에서 마이크로/나노입자로 배열될 수 있는 화합물이다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 마이크로/나노소포 및/또는 마이크로/나노미셀로 배열될 수 있는 양친매성 화합물, 예컨대 하기 보다 상세하게 기술되는 양친매성 자가-조립 마이크로/나노입자인 것들일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 바이러스 또는 바이러스-유사 입자의 구조적 성분, 예컨대 하기 보다 상세하게 논의되는 것들일 수 있다. 특정 구현예에서, 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분과 알지네이트 올리고머는 공유결합된다.
상기 마이크로/나노입자, 특히 치료적 또는 진단적 분자인 관심 분자를 포함하는 것들은 치료에서 사용하기 위해 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 대상의 점액 층을 가로지르는 치료적 또는 진단적 양이온성 마이크로/나노입자를 전위시키는 방법에서 사용하기 위한 알지네이트 올리고머를 제공하며, 여기서 상기 알지네이트 올리고머는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가지며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 점액 층을 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계; 또는
(b)(i) 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
(b)(ii) 상기 점액 층을 상기 단계 (b)(i)에서 제조된 상기 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계.
본 발명은 추가로 대상의 점막 표면의 상피 세포에 치료적 또는 진단적 관심 분자를 전달하기 위한 방법에서 사용하기 위한 알지네이트 올리고머를 제공하며, 여기서 상기 알지네이트 올리고머는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가지며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 치료적 또는 진단적 관심 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 점막 표면의 점액 층을 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계; 또는
(b)(i) 상기 치료적 또는 진단적 관심 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
(b)(ii) 상기 점막 표면의 점액 층을 상기 단계 (b)(i)에서 제조된 상기 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계.
본 발명은 또한, 대상의 점액 층을 가로지르는 치료적 또는 진단적 관심 분자를 전위시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 알지네이트 올리고머를 제공하며, 여기서 상기 알지네이트 올리고머는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가지며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자를 제조하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 상기 알지네이트 올리고머이고, 상기 마이크로/나노입자는 치료적 또는 진단적 관심 분자를 추가로 포함하고, 선택적으로 여기서 치료적 또는 진단적 분자는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합되는 단계 및
(b) 상기 점액 층을 상기 단계 (a)에서 제조된 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계.
본 발명은 또한 대상의 점막 표면의 상피 세포에 치료적 또는 진단적 관심 분자를 전달하기 위한 방법에서 사용하기 위한 알지네이트 올리고머를 제공하며, 여기서 상기 알지네이트 올리고머는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가지며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자를 제조하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 상기 알지네이트 올리고머이고, 상기 마이크로/나노입자는 상기 치료적 또는 진단적 관심 분자를 추가로 포함하고, 선택적으로 여기서 치료적 또는 진단적 분자는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합되는 단계 및
(b) 상기 점막 표면의 점액 층을 상기 단계 (a)에서 제조된 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계.
이러한 양태에서, 상기 전위 또는 상기 전달은 향상된 것으로 간주될 수 있다.
특정 구현예에서, 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물로 형성된 마이크로/나노입자를 포함하는 본 발명의 방법 및 용도는 예컨대 하기 보다 상세하게 기술되는 바와 같이 마이크로/나노입자가 제조되는 추가 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 전술된 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머의 용도를 제공한다. 특정 구현예에서, 약제는 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자 또는 본원에 기술된 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물로 형성된 마이크로/나노입자일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은, 치료적 또는 진단적 양이온성 마이크로/나노입자의 용도를 제공한다. 특정 구현예에서, 약제는 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자 또는 본원에 기술된 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물로 형성된 마이크로/나노입자일 수 있다.
치료적 또는 진단적 양이온성 마이크로/나노입자와 함께 알지네이트 올리고머가 점액 층과 접촉되는 특정 구현예에서, 또는 알지네이트 올리고머가 이렇게 형성된 마이크로/나노입자와 점액 층과 접촉되기 전에 치료적 또는 진단적 마이크로/나노입자와 접촉되는 구현예에서, 약제는 추가로 치료적 또는 진단적 양이온성 마이크로/나노입자를 포함할 수 있다.
약제는 알지네이트 올리고머 및 양이온성 마이크로/나노입자를 포함하는 단일 조성물 또는 제형의 형태일 수 있거나, 각각 알지네이트 올리고머 또는 양이온성 마이크로/나노입자를 각각 함유하는 별도의 조성물 또는 제형이 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 방법의 구현예에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 적어도 70% 만누로네이트 잔기 및 치료적 또는 진단적 양이온성 마이크로/나노입자를 가진 알지네이트 올리고머의 용도를 제공하며, 여기서 점액 층은 치료적 또는 진단적 양이온성 마이크로/나노입자와 함께 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉되거나, 일 구현예에서, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머는 이렇게 형성된 마이크로/나노입자가 점액 층과 접촉되기 전에 치료적 또는 진단적 마이크로/나노입자와 접촉된다.
전술한 바와 같이, 마이크로/나노입자는 알지네이트 올리고머와 별도로 적용되거나 투여될 수 있다. 이와 일치하여, 본 발명의 또 다른 양태는 특히 본원에 정의된 방법에서, 특히 점액 층이 치료적 또는 진단적 양이온성 마이크로/나노입자와 함께 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉되는 상기 방법의 구현예, 또는 이와 같이 형성된 마이크로/나노입자가 점액 층과 접촉되기 전에 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머가 치료적 또는 진단적 마이크로/나노입자와 접촉되는 구현예에서, 개별, 동시 또는 순차적으로 용도를 위한, 병용된 제제로서 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머 및 양이온성 마이크로/나노입자 (예컨대 본원에서 정의된 바와 같음)를 함유하는 제품을 제공한다. 제품은 알지네이트 올리고머 및 양이온성 마이크로/나노입자를 포함하는 약학 제품 또는 병용 제품, 또는 키트로 볼 수 있다.
용어 "점액 층 접촉"은 직접적이든 간접적이든 개체(예컨대 알지네이트 올리고머 및/또는 마이크로/나노입자)를 점액 층에 전달하는 임의의 수단을 포함하며, 따라서, 개체를 점액 층에 투여하거나 점액 층을 개체에 노출시키는 것, 예컨대 개체를 점액 층에 직접적으로 적용하는 임의의 수단이 포함된다. 특히, 점액 층을 개체와 접촉시키는 단계(개체를 점액 층에 투여하는 단계)는 개체, 특히 치료적 및/또는 진단적 마이크로/나노입자의 이러한 치료를 필요로 하는 대상에 개체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 의학적 방법 및 비-의학적 방법 둘 모두가 포함된다는 것이 이해될 것이며, 예컨대 시험관 내 및 생체 외 방법과 생체 내 방법이 포함된다. 따라서, 인간 및 비-인간 동물 신체에서 또는 그 상에서, 또는 관련하여, 인간 또는 비-인간 동물 신체 내 또는 그 상의 점액 층에서 수행되지 않는 방법이 본 발명의 범위 내에 명시적으로 포함되지만, 다른 구현예에서, 대상은 임의의 인간 또는 비-인간 동물 대상, 예컨대 임의의 포유류 대상이지만 전형적으로 인간 대상 또는 환자가 될 수 있다. 이러한 맥락에서, 접촉 단계는 예컨대 하기 조성물에서 개체를 대상에 투여함으로써 달성될 수 있다.
"함께 접촉"은 양이온성 마이크로/나노입자 및 알지네이트 올리고머가 양이온성 마이크로/나노입자의 (향상된) 전위/전달을 달성하기 위해 병용하여 사용됨을 의미한다. 이는 특히 유효량의 알지네이트 올리고머가 유효량의 양이온성 마이크로/나노입자를 투여하는 것과 동일하거나 실질적으로 동시에 또는 투여되기 전에 투여됨을 의미한다. 다른 구현예에서, 유효량의 올리고머는 양이온성 마이크로/나노입자와 개별적으로 그 후에 투여된다. 당업자는 양이온성 마이크로/나노입자의 전위/전달에 대한 알지네이트 올리고머의 효과를 최대화하기 위한 투여 요법을 쉽게 설계할 수 있을 것이다. 그는 또한 그가 작업하고 있는 특정 상황에 따라 두 활성제의 최적 조합을 선택할 수 있다. 유효량은 양이온성 마이크로/나노입자의 음의 표면 전하를 부여하기에 충분한 양일 수 있으며, 예컨대 본원에 정의된 음이온성 마이크로/나노입자의 표면 전하는, 예컨대 동적 광산란 방법 또는 기기(예컨대 Malvern Nano ZS Zetasizer)를 사용하여 물에서 시험관 내에서 측정할 수 있다.
"함께 사용"은 각각의 제제가 동일한 제형 또는 조성물에 존재한다는 것을 의미하지 않으며, 따라서 동시에 또는 실질적으로 동시에 사용 또는 투여되더라도, 알지네이트 올리고머 및 마이크로/나노입자는 동일한 조성물 또는 제형으로 존재할 필요는 없지만, 별도로 투여될 수 있다. 따라서 "별도의" 사용/투여는 동시에 또는 실질적으로 동시에, 또는 상이한 시간에, 예컨대 순차적으로, 또는 목적하는 투약 또는 사용 요법에 따라 상이한 시간 간격으로 사용/투여를 포함한다. "동시"투여는 따라서 동일한 조성물 또는 제형 내에서, 또는 동시에 또는 실질적으로 동시에 투여되는 개별적인 조성물/제형 내에서 알지네이트 올리고머 및 마이크로/나노입자의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 알지네이트 올리고머는 예컨대 코팅 또는 외부 층 또는 쉘로서, 양이온성 마이크로/나노입자에 의해 운반될 수 있다.
양이온성 마이크로/나노입자는 따라서 알지네이트 올리고머와 동시에 또는 순차적으로 적용 또는 투여될 수 있다. 전술한 바와 같이, 일 구현예에서, 양이온성 마이크로/나노입자는 알지네이트 올리고머와 동시에 또는 실질적으로 동시에 투여되고, 또 다른 구현예에서 이는 알지네이트 올리고머 후에 또는 알지네이트 올리고머 이전에 투여된다. 따라서, 다른 구현예에서, 올리고머는 양이온성 마이크로/나노입자 전후에 개별적으로 투여된다. "실질적으로 동일한 시간"의 범위 내에는 양이온성 마이크로/나노입자의 적용 또는 투여가 알지네이트 올리고머의 직전 또는 거의 직전 또는 직후인 것을 포함한다. 용어 "거의 즉시"는 이전의 적용 또는 투여의 1 시간 이내, 바람직하게는 30 분 이내의 적용 또는 투여를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 그러나, 양이온성 마이크로/나노입자는 알지네이트 올리고머 투여 후 적어도 1 시간, 적어도 3 시간, 또는 적어도 6 시간 이상에 적용 또는 투여될 수 있다. 이러한 구현예에서, 양이온성 마이크로/나노입자는 알지네이트 올리고머의 추가 적용과 함께 또는 추가 적용 없이 적용 또는 투여될 수 있다. 알지네이트 올리고머는 양이온성 마이크로 나노입자 이전에 또는 이와 함께 다수의 적용으로 적용 또는 투여될 수 있으며, 이는 전술된 바와 같이, 양이온성 마이크로/나노입자 직전 또는 거의 바로 직전에 적용 또는 투여된다. 다른 구현예에서, 양이온성 마이크로/나노입자는 알지네이트 올리고머 전에, 예컨대 알지네이트 올리고머 전에 적어도 1 시간, 적어도 3 시간, 적어도 6 시간에 편리하게 적용 또는 투여될 수 있다. 이러한 구현예에서, 알지네이트 올리고머는 양이온성 마이크로/나노입자의 추가 적용과 함께 또는 추가 적용 없이 적용 또는 투여될 수 있다. 양이온성 마이크로/나노입자는 알지네이트 올리고머 이전에 또는 이와 함께 다수의 적용으로 적용 또는 투여될 수 있다.
마이크로/나노입자를 알지네이트 올리고머와 접촉하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법 내의 단계는 알지네이트 올리고머를 마이크로/나노입자에 직접적으로 또는 간접적으로 전달하는 임의의 수단을 포함하며, 따라서 알지네이트 올리고머를 마이크로/나노입자에 적용하는 수단, 또는 마이크로/나노입자를 알지네이트 올리고머에 노출시키는 단계, 예컨대 알지네이트 올리고머를 마이크로/나노입자에 직접적으로 적용하는 단계가 포함된다. 특히, 마이크로/나노입자를 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계는 둘 모두의 개체를 대상, 특히 치료적 및/또는 진단적 마이크로/나노입자로 이러한 치료를 필요로 하는 대상에 접촉을 유발하는 방식으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 접촉은 예컨대 처리된 마이크로/나노입자를 대상에 투여하기 전에 또는 점액 층에 직접적으로 투여하기 전에 시험관 내에서 수행된다. 접촉 단계는 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 생성한다. 이러한 물리적 관계의 정확한 특성은 제한되지 않으며 일반적으로 비-공유(예컨대 이온, 수소 및/또는 정전기 결합)의 비-공유 또는 공유 물리 상호작용의 임의의 형태일 수 있으며, 이는 알지네이트 올리고머가 마이크로/나노입자의 표면 상에 또는 표면에서 지속되도록 한다. 이는 코팅 또는 외부 층 또는 쉘로 간주될 수 있는 양일 수 있거나 더 희박한 분포일 수 있다. 특정 구현예에서, 알지네이트 올리고머는 이온적으로 및/또는 정전기적으로, 즉 이온 및/또는 정전기적 상호작용을 통해, 또는 수소 결합을 통해 마이크로/나노입자와 결합할 것이다.
이러한 구현예에서, 마이크로/나노입자는 (향상된) 전위/전달을 달성하기 위해 효과적인 알지네이트 올리고머의 양을 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하기에 충분한 알지네이트 올리고머의 양과 접촉된다. 유효량은 마이크로/나노입자의 음의 표면 전하, 예컨대 본원에 기술된 바와 같이 음이온성 마이크로/나노입자의 표면 전하를 부여하기에 충분한 양일 수 있다.
본원에서 점막 표면은 점액(즉 점액 층)을 분비하거나 보유하거나 운반하거나 어느 정도까지 코팅된, 동물의 신체의 내부 또는 외부의 임의의 표면으로서 정의된다. 보다 구체적으로, 점막 표면은 상피 세포를 포함하는 조직 라이닝이며, 전형적으로 점액을 분비하거나, 보유하거나, 운반하거나 어느 정도까지 코팅된 상피 세포 층(상피)으로 배열된다. 용어 "점막(mucous membrane)" 및 "점막(mucosa)"은 대안적으로 점막 표면을 지칭하기 위해 사용될 수 있음이 인식될 것이다. 이러한 정의는 상기 표면의 인공적으로 배양된 버전 또는 상기 표면의 모델로 확장되는 것으로 간주된다. 따라서, 점액 층/코팅을 생성하는 조직/기관 배양 또는 세포 배양을 겪는 조직 또는 기관의 점액 코팅된 표면이 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 CFTR 기능부전에 의해 영향을 받은 점막 표면에 적용될 수 있고, 따라서 CF의 비정상적인 점액 특성(밀도가 높고, 다루기 힘든 점액이며, 일부 경우에는 기저 상피에 적어도 부분적으로 부착된 점액)을 분비하거나, 보유하거나, 운반하거나 어느 정도까지 코팅할 것이다. 이러한 점액은 마이크로/나노입자 전위에 대해 특별한 문제를 야기하는 것으로 여겨지며 본 발명은 이러한 문제를 해결하는 데 특히 적합하다.
점막 표면은 호흡계, 예컨대 상기도(코, 비강, 인두 후두 및 기관), 부비동 및 기관지(1차, 2차 및 3차) 및 하기도 세기관지에 있을 수 있다. 바람직하게는 점막 표면은 호흡기, 바람직하게는 기관, 기관지 및 세기관지에 있을 것이다.
점막 표면은 위장관, 예컨대 입, 인두, 식도, 십이지장 및 소장 (공장 및 회장)에 있을 수 있다. 상부 위장관은 입, 인두, 식도, 위, 및 십이지장으로 구성되며, 하부 위장관은 소장, 대장 (맹장, 결장 및 직장) 및 항문으로 구성된다.
점막 표면은 췌장 및/또는 담관에 있을 수 있다.
점막 표면은 여성 생식계, 예컨대 질, 자궁 경부, 자궁, 나팔관 및 난소, 바람직하게는 자궁 경부, 자궁 및 나팔관에 있을 수 있다.
점막 표면은 남성 생식계, 예컨대 고환, 부고환, 정관, 부속샘, 정낭, 전립선 및 쿠퍼선에 있을 수 있다.
본 발명에 따르면, 점액 층을 가로지르는 전위는 점액 층의 한 면에서 층의 깊이를 가로 질러 다른 면으로 이동하는, 보다 구체적으로 정점 면(또는 점막 표면 또는 점액/내강 경계면)에서 기저면(점액/상피 세포 경계면이라고도 함)으로 이동하는 마이크로/나노입자의 작용을 지칭한다. 실제로, 전위는 농도 구배를 따른 확산에 의해 유도되며, 점액 층을 통한 마이크로/나노입자, 또는 이의 집단의 확산으로 볼 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
점액 층을 가로지르는 전위(점액 층을 통한 확산)는 통상적으로 설정 일정 기간(예컨대 층의 기저 면에서의 누적 농도)에서 점액 층의 한 면에서 다른 면으로 이동하는 마이크로/나노입자의 절대량의 관점으로 표현될 수 있거나, 통상적으로 설정 시간 (전위 효율 또는 퍼센트 전위)에서 점액 층의 한 면에서 다른 면으로 이동하는 마이크로/나노입자의 집단 비율의 관점으로 표현될 수 있다. 이로부터 전위 비율이 계산될 수 있다.
"관심 분자를 점막 표면의 상피 세포로 전달하는 것"은 관심 분자를 점액 층 아래 있는 상피 세포, 특히 상피 세포의 정점 표면에 근접하게 하는 행위를 의미한다. 특정 구현예에서, 이는 점액 층 아래 있는 상피 세포, 특히 상피 세포의 정점 표면과 관심 분자 사이의 접촉을 달성하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 접촉은 관심 분자와 수용체, 예컨대 상피 세포의 표면(정점 표면)에 존재하는 상기 분자에 대한 특정 수용체 사이의 상호작용을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 전달은 예컨대 엔도시토시스(피노시토시스, 수용체 매개 엔도시토시스, 파고시토시스 및 카베올라 엔도시토시스)에 의해 또는 막 융합에 의해 상피 세포에 의한 관심 분자 또는 상기 분자를 포함하는 마이크로/나노입자의 흡수를 포함할 수 있다.
향상된 전위는 이러한 과정에 대한 긍정적인 영향을 포함한다. 이는 전위된 마이크로/나노입자의 총 량의 증가 또는 전위된 마이크로/나노입자의 집단 비율의 증가(전위 효율)로 볼 수 있다. 마이크로/나노입자가 전위하는 속도(속도, velocity)의 증가로 볼 수 있다. 이는 점액에 의한 전위 저항 감소(예컨대 임피던스) 또는 마이크로/나노입자에 대한 점액 투과성의 증가(예컨대 물에서의 확산에 대한 점액의 확산으로 표현되는 확산 계수)로 볼 수 있다. 이는 점액 층의 정점 면으로의 전위/확산 감소에서 볼 수 있다. 실시예는 이러한 특성을 평가하기 위한 여러 기술을 기술한다.
관심 분자의 향상된 전달은 이 과정에 대한 임의의 긍정적인 영향을 포함한다. 이는 전달되는 분자의 총 양의 증가 또는 상피 세포로 전달되는 점액 층에 적용되는 분자의 양의 비율(전달 효율)의 증가로 볼 수 있다. 이는 관심 분자가 전달되는 속도(속도, velocity)의 증가로 볼 수 있다. 이는 점액에 의한 전달 저항 감소(임피던스) 또는 분자를 운반하는 마이크로/나노입자에 대한 점액의 투과성 증가(예컨대, 물에서의 확산에 대한 점액 확산으로 표현되는 확산 계수)로 볼 수 있다. 이는 분자를 점액 층의 정점 면으로 운반하는 마이크로/나노입자의 복귀 감소에서 볼 수 있다. 실시예는 이러한 특성을 평가하기 위한 여러 기술을 기술한다.
점액 층을 가로지르는 마이크로/나노입자의 전위와 점액 층 아래에 있는 상피 세포로의 관심 분자의 전달을 모니터링하는 기술은 잘 확립되어 있으며 문헌에 널리 설명되어 있다. 예컨대, 편리한 기술은 트랜스웰 점액 침투 분석으로, 이는 예컨대 실시예에 기술된 바와 같이 트랜스웰에 형성된 점액 층을 점막 표면의 점액 층을 나타내는 모델로 사용한다. 유사하게, 점액 분비 세포의 단층(예컨대 16HBE41o-세포(불멸화된 인간 기관지 상피 세포)), 또는 점막 표면을 갖는 조직 절편이 모델 표면으로서 사용될 수 있다. 이러한 분석으로부터 얻은 정보는 생체 내 상황에서 발생할 수 있는 일을 대표하는 것으로 간주된다. 보다 직접적으로, 전위/전달은 예컨대 적절한 현미경 또는 다른 영상화 기술과 함께, 형광, 방사성, 방사성 조영제 또는 MRI 조영제로 표지된 마이크로/나노입자 및/또는 이에 의해 운반되는 관심 분자를 사용하여 생체 내에서 모니터링될 수 있다. 다른 접근법에서, 전위/전달은 마이크로/나노입자에 의해 운반되는 핵산의 표적 세포의 발현 생성물 및/또는 효과를 추적함으로서 간접적으로 모니터링 될 수 있다. 다른 구현예에서, 전위/전달은 약제학적 관심 분자의 약제학적/생리학적 효과 또는 진단적 관심 분자의 신호를 추적함으로써 간접적으로 모니터링될 수 있다.
실시예에 나타난 바와 같이, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머는 양이온성 마이크로/나노입자 및 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자의 세포독성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 "마이크로/나노입자의 향상된 전위" 또는 "관심 분자의 향상된 전달"은 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머의 부재 하에 동등한 마이크로/나노입자로 수행할 때와 비교하여 감소된, 또는 더 적은 세포독성과 함께 전위 또는 마이크로/나노입자 또는 분자 전달인 것으로 간주될 수 있거나 그러한 것일 수 있다. 이러한 구현예에서, 관련 세포독성은 마이크로/나노입자와 접촉된 점액 층 바로 아래 또는 이들의 영역의 세포의 독성이다.
본 발명에 따르면, 마이크로입자는 마이크로미터 범위, 즉, 약 1 μm 내지 약 500 μm, 예컨대 약 1 μm 내지 약 400 μm, 300 μm, 200 μm, 100 μm, 50 μm, 40 μm, 30 μm, 20 μm, 10 μm, 또는 5 μm, 또는 약 1 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 또는 400 μm, 내지 약 500 μm의 입자 크기를 가진 임의의 입자로 간주될 수 있다. 소낭은 약 5 μm 내지 약 100 μm, 예컨대 약 5 μm 내지 약 50 μm, 40 μm, 30 μm, 20 μm, 또는 10 μm 또는 약 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm 내지 약 100 μm의 입자 크기일 수 있다. 소낭은 약 10 μm 내지 약 200 μm, 예컨대 약 10 μm 내지 약 100 μm, 50 μm, 40 μm, 30 μm, 또는 20 μm, 또는 약 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm or 100 μm 내지 약 200 μm의 입자 크기일 수 있다. 임의의 상기 값으로부터 형성될 수 있는 종점을 가진 임의의 범위가 명시적으로 개시된다.
나노입자는 나노미터 범위, 즉, 약 1 nm 내지 약 1,000 nm, 예컨대 약 1 nm 내지 약 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 100 nm 또는 50 nm, 또는 약 50 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm 또는 900 nm 내지 약 1,000 nm인 입자 크기를 갖는 임의의 입자로 간주될 수 있다. 소낭은 약 30 nm 내지 약 400 nm, 예컨대 약 30 nm 내지 약 350 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 또는 50 nm, 또는 약 50 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm 또는 350 nm 내지 약 400 nm의 입자 크기일 수 있다. 소낭은 약 100 nm 내지 약 400 nm, 예컨대 약 100 nm 내지 약 350 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 또는 150 nm, 또는 약 150 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 또는 350 nm 내지 약 400 nm의 입자 크기일 수 있다. 소낭은 약 1 nm 내지 약 50 nm, 예컨대 약 1 nm 내지 약 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm, 15 nm, 10 nm, 또는 5 nm, 또는 약 5 nm, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm 또는 35 nm 내지 약 40 nm의 입자 크기일 수 있다. 임의의 상기 값으로부터 형성될 수 있는 종점을 가진 임의의 범위가 명시적으로 개시된다.
나노입자 맥락에서, 용어 "입자 크기"는 동적 광 산란 방법(예컨대, 준-탄성 광 산란 방법)을 사용하여 측정된 입자 크기를 지칭한다. 예컨대, 입자 크기는 동적 광 산란 장치(예컨대 Malvern Instruments Ltd에서 제조된 Zetasizer Nano ZS 모델 및 Otsuka Electronics Co., Ltd.에서 제조된 ELS-8000)를 사용하여 측정될 수 있다. 장치는 입자의 브라운 운동을 측정하고 입자 크기는 확립된 동적 광 산란 방법 이론을 기초로 결정된다. 마이크로입자 맥락에서, 용어 "입자 크기"는 레이저 회절 분광법을 사용하여 측정된 입자 크기를 지칭한다. 상업적인 기기를 이용할 수 있으며 Malvern Instruments Ltd.에서 제조된 Mastersizer 3000 기기를 포함한다.
마이크로/나노입자의 집단이 고려되는 맥락에서, 집단은 상기 언급된 값 또는 이들의 범위의 모드 입자 크기(직경)을 가질 수 있다.
본 발명에 따르면, 양이온성 마이크로/나노입자는 생리학적 pH, 즉 약 pH 6 내지 약 pH 8, 예컨대 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.8, 또는 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.5 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.2, 및 생리학적 삼투압에서 순 양의 표면 전하를 갖는 마이크로/나노입자이다.
본 발명에 따르면, 음이온성 마이크로/나노입자는 생리학적 pH, 즉 약 pH 6 내지 약 pH 8, 예컨대 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.8, 또는 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.5 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.2, 및 생리학적 삼투압에서 순 음의 표면 전하를 갖는 마이크로/나노입자이다.
마이크로/나노입자의 표면 전하는 이의 제타 전위의 관점에서 표현될 수 있다. 제타 전위는 동적 광 산란을 분석하여 계산될 수 있으므로 이러한 계산은, 예컨대 전술된 동적 광 산란 기기를 사용하여 수행될 수 있다. 양이온성 마이크로/나노입자는 따라서 생리학적 삼투압 및 pH에서 양의 제타 전위를 가지며, 예컨대 적어도 약 10 mV, 예컨대 적어도 약 20 mV, 25 mV, 30 mV, 35 mV, 40 mV, 45 mV, 50 mV, 55 mV, 60 mV, 65mV, 70 mV, 75 mV, 80 mV, 85 mV, 90 mV 또는 95 mV의 양의 제타 전위를 갖는다. 다른 구현예에서, 양이온성 마이크로/나노입자는 20 mV, 25 mV, 30 mV, 35 mV, 40 mV, 45 mV, 50 mV, 55 mV, 60 mV, 65mV, 70 mV, 75 mV, 80 mV, 85 mV, 90 mV 또는 95 mV 미만의 제타 전위를 가질 수 있다. 임의의 상기 값으로부터 형성될 수 있는 종점을 가진 임의의 범위가 명시적으로 개시된다. 음이온성 마이크로/나노입자는 따라서 생리학적 삼투압 및 pH에서 음의 제타 전위를 가지며, 예컨대 적어도 약 -10 mV(즉 이보다 보다 더 큰 음의), 예컨대 적어도 약 -20 mV, -25 mV, -30 mV, -35 mV, -40 mV, -45 mV, -50 mV, -55 mV, -60 mV, -65mV, -70 mV, -75 mV, -80 mV, -85 mV, -90 mV 또는 -95 mV의 음의 제타 전위를 갖는다. 특정 구현예에서, 음이온성 마이크로/나노입자는 약 -20 mV, -25 mV, -30 mV, -35 mV, -40 mV, -45 mV, -50 mV, -55 mV, -60 mV, -65mV, -70 mV, -75 mV, -80 mV, -85 mV, -90 mV 또는 -95 mV 이하(즉, 이보다 더 적은 음의) 음의 제타 전위를 가질 수 있다. 임의의 상기 값으로부터 형성될 수 있는 종점을 가진 임의의 범위가 명시적으로 개시된다.
마이크로/나노입자는 표면에 다른 전하를 갖는 내부를 가질 수 있으며, 예컨대 양이온성 마이크로/나노입자는 음으로 하전된 내부 또는 코어를 가질 수 있다(예컨대 주로 음으로 하전된 성분을 함유함). 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 용도의 양이온성 마이크로/나노입자는 양이온성 층(예컨대 주로 하전된 성분을 함유하는 층)으로 코팅된 중성 또는 음이온성 코어일 수 있다.
마이크로/나노입자는 소낭(예컨대 리포좀(리포플렉스), 폴리머좀, 노이좀, 또는 이들의 하이브리드(예컨대 리포폴리플렉스)), 미셀, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 덴드리머, 금속/금속 입자(예컨대 나노케이지, 나노쉘, 나노스타), 탄소 나노튜브, 실리카 입자, 중합체 입자일 수 있다.
마이크로/나노입자는 고체 또는 중공일 수 있으며, 즉, 적어도 하나의 내부, 일반적으로 액체로 채워진 체적(공극)을 포함한다. 일부 배열에서 이러한 체적은 층상으로 둘러싸여 있다. 중공 마이크로/나노입자의 예는 소낭, 미셀, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 덴드리머, 탄소 나노튜브, 금속/금속 나노케이지 및 금속/금속 나노쉘이다.
용어 "소낭"은 본원에서 가장 넓은 의미, 즉 외부 수성 상으로부터 수성 내부 상을 완전히 둘러싸서 분리하는 양친매성 소포 형성 화합물의 층상 분자 배열로 사용된다. 층상은 층, 양친매성 화합물로 형성된, 전형적으로 이중 층이며, 상기 층은 친수성 외부 표면 및 상기 외부 층 사이의 적어도 하나의 소수성 영역을 갖는다. 소낭은 단일 층상(단층), 다중 동심 층상(다층) 또는 다중 비-동심 층상(다소포)을 가질 수 있다.
이러한 맥락에서 용어 "양친매성 소낭 형성 화합물로 형성됨"은 하나 이상의 양친매성 화합물이 기능성 층상을 형성하기에 효과적인 양으로 소낭에 존재함을 전달하는 것으로 의도된다. 따라서, 다른 화합물의 존재, 예컨대 층상 내의 알지네이트 올리고머는 배제되지 않으며 이러한 맥락에서 그 자체가 소낭 형성 화합물로 간주될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 양친매성 소낭 형성 화합물은 층상의 우세한 성분일 것이지만, 상기 화합물이 이의 우세한 성분이 되지 않고 소낭의 기능성 층상에 영향을 미칠 수 있는 구현예도 있을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 특정 구현예에서, 층상은 상기 하나 이상의 양친매성 소낭 형성 화합물로 실질적으로, 예컨대 본질적으로 구성될 것이다. 소낭의 층상의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% (w/w)로 수치적으로 표현되는 것은 하나 이상의 양친매성 소낭 화합물일 수 있다. 특정 구현예에서, 소낭의 나머지 성분(예컨대 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% w/w 미만)은 적어도 70% M 잔기를 가진 알지네이트 올리고머이지만, 다른 성분도 또한 하기 논의된 바와 같이 존재할 수 있다.
소낭에서, 층상은 전형적으로 수성 상을 둘러싸고 상기 상을 외부 수성 상으로부터 분리하며, 이는 층상이 특정의 확산, 친수성, 내부 상으로부터 외부 상으로 및 그 반대로 예를 들어, 친수성 분자를 억제하거나 방지하는 막으로서 작용함을 의미한다. 층상은 따라서 부분적으로(예컨대 선택적으로) 투과성 막으로서 기술될 수 있다.
소낭은 리포좀일 수 있으며, 이 경우 층상은 적어도 하나의 양친매성 지질로부터 형성된 지질 이중층이다. 다른 형태의 소낭은 비제한적으로 폴리머좀(양친매성 블록 공중합체 기반 층상) 및 니오좀(비-이온성 계면활성제 기반 층상) 및 리포좀, 폴리머좀 및 니오좀의 하이브리드 형태를 포함한다. 리포좀은 본 발명에서 사용되는 바람직한 형태의 소낭이다.
리포좀의 제조에서 사용되는 양친매성 지질은 수용액에서 자발적으로 이중층으로 조립될 수 있는 친수성 부분 및 소수성 부분(전형적으로 친수성 헤드 및 소수성 테일)으로 구성된 임의의 지질일 수 있다. 이는 양이온성 지질, 쯔비터이온성 지질, 중성 지질 또는 음이온성 지질의 대표적인 것을 포함할 수 있다. 양이온성 지질의 사용은 본 발명에 따라 마이크로/나노입자를 양이온성으로 만드는데 필요한 양전하를 제공하거나 적어도 기여할 수 있다. 다른 구현예에서, 비-양친매성 리포좀 형성 성분은 본 발명에 따라 마이크로/나노입자를 양이온성으로 만드는데 필요한 양전하를 제공하거나 적어도 기여할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 리포좀은 비-양이온성 지질, 예컨대 중성 지질, 및 선택적으로 다른 리포좀 형성 성분과 조합하여 양이온성 지질로부터 형성된다.
유용한 양친매성 지질의 친수성 부분은 극성 또는 하전된 기 예컨대 탄수화물, 포스페이트, 카복실릭, 설페이토, 아미노, 설피드릴, 니트로, 히드록시 및 다른 유사 기를 포함할 수 있다. 소수성 부분은 비제한적으로 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기 및 하나 이상의 방향족, 사이클로-지방족 또는 헤테로사이클릭 기로 치환된 기를 포함하는 비극성 기를 포함할 수 있다. 양친매성 지질 화합물의 예는 비제한적으로 인지질, 아미노지질, 글리코지질 및 스핑고지질을 포함한다.
양이온성 지질은 생리학적 조건, 예컨대 pH에서 양으로 하전된 작용기를 함유한다. 양이온성 지질은 비제한적으로 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), 2,3-디올레오일옥시 트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), 2,3-디-(올레일옥시)프로필 트리메틸 암모늄(DOTMA), N-[1-(2,3,-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE), N-[1-(2,3,디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시 에틸암모늄 브로마이드(DORIE), 3β-[Ν-(Ν',Ν'-디메틸아미노에탄) 카바모일]콜레스테롤(DC-Choi), 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB), 디옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS) 및 N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민(DODMA)을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 리포좀의 지질은 음이온성 또는 중성(쯔비터이온성 및 극성) 지질, 예컨대 음이온성 또는 중성 인지질을 포함할 수 있다. 중성 지질은 선택되는 pH에서 비하전 또는 중성 쯔비터이온으로 존재한다. 생리학적 pH에서, 이러한 지질은, 예컨대 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로시데스 및 디아실 글리세롤을 포함한다. 이러한 쯔비터이온성 지질은, 제한 없이 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 및 디올레오일포스파티딜세린(DOPS)을 포함한다. 음이온성 지질은 생리학적 pH에서 음으로 하전된 지질이다. 이러한 지질은, 제한 없이 포스파티딜글리세롤, 카디올리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데-카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N- 글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 결합된 음이온성 변형 기를 포함한다.
음이온성 및 중성 지질은 본원에서 비-양이온성 지질로 지칭될 수 있다. 이러한 지질은 인을 함유할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 리포좀에서 사용되는 비-양이온성 지질의 예는 레시틴, 리소레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티디 1-에탄올아민(DSPE), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 에그포스파티딜콜린(EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 16-0-모노메틸 PE, 16-0- 디메틸 PE, 18-1- 트랜스 PE, 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 1-스테아로일-2-올레오일포스파티디에탄올아민(SOPE), 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 세팔린, 카디올리핀, 포스파티드산, 세레브로시데스, 디세틸포스페이트, 및 콜레스테롤을 포함한다.
다른 구현예에서, 양친매성 지질은 포스파티딜콜린, 예컨대 1,2-디올레오일-포스파티딜콜린, 1,2-디팔미토일-포스파티딜콜린, 1,2-디미리스토일-포스파티딜콜린, 1,2-디스테아로일-포스파티딜콜린, 1-올레오일-2-팔미토일-포스파티딜콜린, 1-올레오일-2-스테아로일-포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜콜린 및 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜콜린; 포스파티딜에탄올아민, 예컨대 1,2-디올레오일-포스파티딜에탄올아민, 1,2- 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 1,2-디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 1,2- 디스테아로일포스파티딜에탄올아민, 1-올레오일-2-팔미토일-포스파티딜에탄올아민, 1-올레오일-2-스테아로일-포스파티딜에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민 및 N-숙시닐-디올레오일-포스파티딜에탄올아민; 포스파티딜세린, 예컨대 1,2-디올레오일-포스파티딜세린, 1,2-디팔미토일-포스파티딜세린, 1,2-디미리스토일- 포스파티딜세린, 1,2-디스테아로일-포스파티딜세린, 1-올레오일-2-팔미토일- 포스파티딜세린, 1-올레오일-2-스테아로일-포스파티딜세린, 1-팔미토일-2-올레오일- 포스파티딜세린 및 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜세린; 포스파티딜글리세롤, 예컨대1,2-디올레오일-포스파티딜글리세롤, 1,2-디팔미토일-포스파티딜글리세롤, 1,2- 디미리스토일-포스파티딜글리세롤, 1,2-디스테아로일-포스파티딜글리세롤, 1-올레오일-2-팔미토일-포스파티딜글리세롤, 1-올레오일-2-스테아로일-포스파티딜글리세롤, 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜글리세롤 및 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜글리세롤; 페길화된 지질; 페길화된 인지질, 예컨대 포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-1000], 포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000], 포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-3000], 포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000]; 페길화된 세라미드, 예컨대 N-옥타노일- 스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)1000]}, N-옥타노일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]}, N-옥타노일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)3000]}, N-옥타노일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)5000]}; 리소-포스파티딜콜린, 리소-포스파티딜에탄올아민, 리소-포스파티딜글리세롤, 리소-포스파티딜세린, 세라미드; 스핑고지질; 글리코지질, 예컨대 강글리오시드 GM1; 글루코지질; 설파티드; 포스파티드산, 예컨대 디-팔미토일-글리세로포스파티드산; 팔미트 지방산; 스테아르 지방산; 아라키돈 지방산; 라우르 지방산; 미리스트 지방산; 라우로레일 지방산; 피세테르 지방산; 미리스톨레일 지방산; 팔미톨레 지방산; 페트로셀린 지방산; 올레이 지방산; 이소라우르 지방산; 이소미리스트 지방산; 이소스테아르 지방산; 스테롤 및 스테롤 유도체 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 콜레스테롤 설페이트, 및 콜레스테릴-(4-트리메틸아미노)- 부타노에이트, 에르고스테롤, 라노스테롤; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스터 및 폴리옥시에틸렌 지방산 알코올; 폴리옥시에틸렌 지방산 알코올 에터; 폴리옥시에틸화 솔비탄 지방산 에스터, 글리세롤 폴리에틸렌 글리콜 옥시-스테아레이트; 글리세롤 폴리에틸렌 글리콜 리시놀리에이트; 에톡실화 대두 스테롤; 에톡실화 캐스터유; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 지방산 중합체; 폴리옥시에틸렌 지방산 스테아레이트; 디-올레오일-sn-글리세롤; 디팔미토일-숙시닐글리세롤; 1,3-디팔미토일-2-숙시닐글리세롤; 1-알킬-2아실-포스파티딜콜린, 예컨대 1-헥사데실-2-팔미토일-포스파티딜콜린; 1-알킬-2아실-포스파티딜에탄올아민 예컨대 1-헥사데실-2-팔미토일-포스파티딜에탄올아민; 1-알킬-2아실-포스파티딜세린, 예컨대 1- 헥사데실-2-팔미토일-포스파티딜세린; 1-알킬-2아실-포스파티딜글리세롤, 예컨대 1-헥사데실-2-팔미토일-포스파티딜글리세롤; 1-알킬-2-알킬-포스파티딜콜린, 예컨대 1 -헥사데실-2-헥사데실-포스파티딜콜린; 1 -알킬-2-알킬- 포스파티딜에탄올아민, 예컨대 1-헥사데실-2-헥사데실- 포스파티딜에탄올아민; 1-알킬-2-알킬-포스파티딜세린, 예컨대 1-헥사데실-2- 헥사데실-포스파티딜세린; 1-알킬-2-알킬-포스파티딜글리세롤, 예컨대 1- 헥사데실-2-헥사데실-포스파티딜글리세롤; N-숙시닐-디옥타데실아민; 팔미토일호모시스테인; 라우릴트리메틸암모늄 브로마이드; 세틸트리메틸-암모늄 브로마이드; 미리스틸트리메틸암모늄 브로마이드; DOTMA; DOTAP; 1,2-디올레오일-c-(4'-트리메틸암모늄)-부타노일-sn-글리세롤(DOTB); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000]; 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시 (폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DSPE-PEG-2000); DSPE-PEG2000-TATE (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시 (폴리에틸렌 글리콜)-2000]-TATE); 및 1-테트라데카노일-2-옥타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC)으로부터 선택될 수 있다.
사용될 수 있는 다른 지질은 WO2017/153779, WO2005/117985 및 WO03/094974에 개시된 것들로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 지질은 2,3-디-(올레일옥시)프로필 트리메틸 암모늄(DOTMA), DHDTMA, DOSEP3, GL67 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 층상은 예컨대 (1:1)의 중량비인 DOPE 및 DOTMA, 또는 예컨대 (1:1)의 중량비인 DOPE 및 DHDTMA, 또는 예컨대 (1:1)의 중량비인 DOPE 및 DOSEP3을 포함할 수 있다.
폴리머좀의 제조에서 사용되는 양친매성 블록 공중합체는 친수성 중합체 및 수용액에서 상기 외부 표면 사이에 적어도 하나의 소수성 영역을 갖는, 적어도 단일 층으로, 전형적으로 이중층으로 자발적으로 조립될 수 있는 소수성 중합체로 구성된 임의의 공중합체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 양친매성 블록 공중합체는 하나의 친수성 중합체 영역 및 하나의 소수성 중합체 영역을 갖는 디블록 공중합체이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 공중합체는 제1 친수성 중합체 영역 사이에 소수성 중합체 영역, 및 제2 친수성 중합체를 갖는 트리블록 공중합체이다. 이러한 트리블록 공중합체를 함유하는 폴리머좀에서, 하나의 트리블록 공중합체는 2 개의 디블록 공중합체를 대체하고 층상에 걸쳐서 확장되어 친수성 외부 표면과 상기 외부 표면 사이에 소수성 영역을 갖는 단일 층을 형성한다. 더 많은 수의 반복 친수성 및 소수성 영역을 포함하는 블록 공중합체가 유사하게 사용될 수 있으므로 다층 층상을 형성할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 블록 공중합체는 비-독성이다. 바람직한 구현예에서, 블록 공중합체는 생분해성이다. 바람직한 구현예에서, 블록 공중합체는 폴리머좀 형성을 지원하는 친수성 분획(f EO )을 갖는다. 예컨대, 공중합체는 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 이상의 f EO 를 가질 수 있다. 친수성 영역은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리(이소시아노-L-알라닌-L-알라닌), 폴리아크릴산, 폴리(메틸옥사졸린), 폴리(4-비닐 피리딘), 폴리-L-글루탐산, 폴리(N e -2-(2-(2-메톡시에톡실)에톡시)아세틸-L-리신, 폴리(γ-벤질 L-글루타메이트), 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)5000일 수 있다. 소수성 영역은 폴리락타이드, 폴리(락트산), 폴리(에틸에틸렌), 폴리부타디엔, 폴리카프로락톤, 폴리프로필렌 설파이드, 폴리스티렌, 폴리-L-류신, 폴리에스터, 폴리(부틸렌 옥시드), 폴리(이소부틸렌), 폴리스티렌-b-폴리(이소시아노알라닌(2-티오펜-3-일에틸)아미드, 폴리(2-니트로페닐알라닌), 폴리(γ-메틸-L-카프로락톤), 또는 폴리(트리메틸렌 카보네이트) 또는 히알루로난을 함유할 수 있다. 폴리머좀은 양이온성 블록 공중합체, 예컨대 폴리([디메틸아미노] 에틸 메타크릴레이트)의 포함에 의해 적어도 부분적으로 양이온성이 될 수 있다. 다른 구현예에서, 비-양친매성 폴리머좀 형성 성분은 본 발명에 따른 마이크로/나노입자 양이온성을 제조하는데 요구되는 양전하를 제공할 수 있거나 적어도 기여할 수 있다. 키랄 분자의 중합체의 경우, 중합체는 D-형, L-형, 또는 D- 및 L-형의 혼합물을 함유할 수 있다. 예컨대, 폴리(락트산)은 폴리(D)-(L)-락트산일 수 있다. 폴리(D)-(L)-락트산은 10%/90%, 20%/80%, 30%/70%, 40%/60%, 50%/50%, 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 또는 90%/10%의 D 및 L 입체이성질체의 상대 백분율을 가질 수 있다.
니오좀의 제조에서 사용되는 양친매성 비-이온성 게면활성제는 수용액에서 이중 층으로 자발적으로 조립될 수 있는 친수성 부분 및 소수성 부분으로 구성된 임의의 비-이온성 계면활성제일 수 있다. 비-이온성 계면활성제 및 콜레스테롤 또는 트리아실글리세롤의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 비-이온성 계면활성제로서, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스터, 솔비탄 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 공중합체 등이 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 비-이온성 계면활성제의 구체적인 예는 Tween-61, Tween-80, 및 Span 80, Pluronic F-88(F88)을 포함할 수 있다. 콜레스테롤의 구체적인 예는 콜레스테롤, α-콜레스타놀, β-콜레스타놀, 콜레스탄, 데스모스테롤 (5,24-콜레스타디엔-3β-올), 소듐 콜레이트, 및 콜레칼시페롤을 포함할 수 있다. 니오좀은 양이온성 지질, 예컨대 2,3-디(테트라데실옥시)프로판-1-아민 또는 디도데실디메틸암모늄 브로마이드의 혼합에 의해 적어도 부분적으로 양이온성이 될 수 있다. 다른 구현예에서, 비-양친매성 니오좀 형성 성분은 본 발명에 따른 마이크로/나노입자 양이온성을 제조하는데 요구되는 양전하를 제공할 수 있거나, 적어도 기여할 수 있다.
소낭은 또한 기능화된 소낭 형성 화합물을 함유할 수 있다. 기능화된 소낭 형성 화합물의 대표적인, 비-제한적인 예는 시알산 유도체, 글루쿠론산 유도체; 글루타민산 유도체; 폴리글리세린 유도체; 폴리에틸렌 글리콜 유도체(메톡시폴리에틸렌 글리콜 농축물 등 포함), 예컨대 N-[카보닐-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-2000]-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, N-[카보닐-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-5000]-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, N-[카보닐-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-750]-1,2-디스테아로일-sn 글리세로-3-포스포에탄올아민, N-[카보닐-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-2000]-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (MPEG 2000-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민), N-[카보닐-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-5000]-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, DSPE-PEG-2000 및 DSPE-PEG2000-TATE를 포함한다.
임의의 상기 소낭 형성 화합물은 수용체 친화성 분자로 유도체화되어 선택된 표적 부위로 소낭의 표적화를 보조할 수 있다. 이러한 친화성 분자는 수용체 특이적 폴리펩티드, 핵산 및 탄수화물, 예컨대 항체, 항체 단편, 펩티드 성장 인자, DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 수용체는 폴리펩티드(예컨대 인테그린, 카데린, 셀렉틴, ICAM-1), 핵산 또는 탄수화물일 수 있다. 다수의 수용체-리간드 쌍이 당업자에게 공지되어 있으며, 과도한 부담 없이 확인될 수 있으며 임의의 이러한 쌍은 본 발명에서 사용하기 위한 수용체 친화성 분자의 선택의 기초를 제공할 수 있다. 예는 WO96/15811, WO98/54347, WO01/92543, WO02/072616, WO2004108938, 및 WO2007/138324에 기술된 펩티드 리간드를 포함한다. 수용체 리간드 유도체화된 리포좀 형성 화합물은 WO2007/138324에 기술된 것들을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 수용체 친화성 분자는 관심 분자가 아니고, 알지네이트 올리고머가 아니거나 자체로(즉, 또 다른 화학 개체에 결합되지 않은 경우) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성제가 아니다.
본 발명에서 사용되는 소낭을 제조하기 위한 기술이 잘 알려져 있고 잘 확립되어 있으며 따라서 완전히 일상적이다. 본 기술에 대한 논의는 Huang Z, et al., 2014, Progress involving new techniques for liposome preparation, Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 9(4):176-82; Torchilin VP., 2012, Multifunctional nanocarriers, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol 64(SUPPL.):302-15; Vemuri S, et al, 1995, Preparation and characterization of liposomes as therapeutic delivery systems: 리뷰논문, Pharmaceutica Acta Helvetiae, Vol 70(2):95-111; Carugo, D., et al, 2016, Liposome production by microfluidics: potential and limiting factors, Scientific Reports, 6:25876; Erdogan S, et al, 2006, Thrombus localization by using streptokinase containing vesicular systems, Drug Delivery, Vol 13(4):303-9; 및 Meng F, et al, 2011, Polymersomes spanning from nano- to microscales: Advanced vehicles for controlled drug delivery and robust vesicles for virus and cell mimicking, Journal of Physical Chemistry Letters, Vol 2(13):1533-9에서 확인할 수 있으며 이들 내용은 참조로써 본원에 포함되어 있다.
넓은 관점에서 소낭 마이크로/나노입자는 거시적인 환경 내에서 불균질한 소낭 집단을 발생시키는 배치 기술을 사용하거나 한정된 미세환경에서 소낭 형성이 일어나므로 소낭이 형성되는 미세 환경의 물리적 파라미터에 대해 더 큰 제어가 가해질 수 있기 때문에 더 균질한 집단을 생성할 수 있는 미세 유체 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
벌크 방법은 소낭 형성 화합물의 초기 건조된 사전 조직화 필름의 팽윤(즉, 재수화 방법)에 기초한 방법, 및 이어서 분산된 이중 층의 기계적 조작 및 다음의 사용을 포함하는 방법으로 하위-분류될 수 있다: (i) 소낭 형성 화합물이 가용성인 공용매, (ii) 추가의 비-이중 층 형성 "공양친매", 또는 (iii) 소낭 형성 화합물의 초분자 응집에 영향을 미치는 특정 이온 종.
미세유체 방법은 문헌에 널리 설명되어 있으며, 전기형성 및 수화, 압출, 펄스 제트, 이중 에멀젼 템플레이팅, 얼음 액적 수화, 일시적인 막 방출, 액적 에멀젼 전달, 유체역학적 핀치-오프 및 유체역학적 포커싱이라 지칭되는 방법들을 포함한다. 미세유체 유체역학적 포커싱이 본 발명에 따라 유리하게 사용될 수 잇다.
따라서, 본 발명에 따라, 양친매성 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물로 형성된 마이크로/나노입자는 소낭 마이크로/나노입자의 형성에 대해 본원에 기술된 임의의 방법, 특히 벌크 생산 방법 또는 미세유체 생산 방법(예컨대 전기형성 및 수화, 압출, 펄스 제트, 이중 에멀젼 템플레이팅, 얼음 액적 수화, 일시적인 막 방출, 액적 에멀젼 전달, 유체역학 핀치-오프 및 유체역학 포커싱)에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 양친매성 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물로 형성된 마이크로/나노입자를 포함하는 본 발명의 방법은 예컨대 소낭 마이크로/나노입자의 형성에 대해 본원에 기술된 임의의 방법, 특히 벌크 생성 방법 및 미세유체 생성 방법에 의해 마이크로/나노입자가 제조되는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 마이크로/나노입자는 미셀일 수 있다. 미셀은 양친매성 화합물의 구형 자가-조립 초분자 조립체로서, 여기서 친수성 영역은 외부 쉘로서 주변 수성 상과 접촉하고 소수성 영역은 미셀 중심에서 격리되어 연속적인 소수성 코어를 형성한다. 임의의 상기 언급된 양친매성 화합물은 예컨대 사용되는 화합물 또는 이들의 조합에 대해 임계 미셀 농도 이상의 수용액에 상기 화합물을 제공함으로써 미셀로 형성될 수 있다. 소낭 마이크로/나노입자에 대해 전술한 바와 같은 미셀 및/또는 기능화된 양친매성 화합물 내의 다른 성분의 존재는 미셀 마이크로/나노입자의 맥락에서 사용될 수 있다. 미셀은 예컨대 전술된 바와 같이 양이온성 양친매성 화합물의 포함에 의해 적어도 부분적으로 양이온성이 될 수 있다. 다른 구현예에서, 비-양친매성 미셀 형성 성분은 본 발명에 따른 마이크로/나노입자 양이온성을 제조하기 위해 요구되는 양전하를 제공할 수 있거나, 적어도 기여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자는 바이러스, 특히 핵산 벡터 또는 이종 펩티드(야생형 바이러스에 존재하지 않는 펩티드)를 운반하는 바이러스일 수 있다. 이러한 바이러스는 치료적 또는 진단적 핵산을 포함하는 치료적 또는 진단적 펩티드 또는 벡터를 표적 점막 표면의 상피 세포, 예컨대 호흡기, 위장관 및 생식관의 표면으로 전달하는데 편리하게 사용될 수 있다. 보다 일반적으로, 바이러스 자체는 바이러스에 대한 백신의 활성 성분일 수 있고/있거나, 바이러스에 의해 운반되거나 바이러스에 의해 운반되는 핵산 벡터로부터 발현된 이종 펩티드 항원을 전달할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 바이러스, 예컨대 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 수두 바이러스, 알파바이러스, 및 헤르페스 바이러스 및 이들의 하이브리드를 포함한다. 다른 구현예에서, 바이러스는 종양 용해성 바이러스, 즉 암세포를 우선적으로 감염시키고 사멸시키는 바이러스일 수 있다. 종양 용해성 바이러스는 예컨대 종양 용해 형태의 아데노바이러스, 레오바이러스, 홍역 바이러스, 헤르페스 단순 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 폴리오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 우두 바이러스, 세네카 바이러스, 마라바 바이러스 및 엔테로바이러스로부터 선택될 수 있다.
바이러스 유사 입자는 구조적 바이러스 단백질이 적절한 숙주 세포에서 발현될 때 자가-조립에 의해 형성된 비-병원성 마이크로/나노입자이다. 바이러스 핵산은 자가-조립 동안 입자 내로 패키징되지 않는다. 이러한 입자는 백신 항원으로서 작용할 수 있고/있거나 구조적 바이러스 단백질의 분자를 공유적으로 연결함으로서 또는 관심 분자의 존재 하에 자가-조립이 일어나도록 함으로써 본 발명에 따른 관심 분자를 운반하도록 조작될 수 있다. 바이러스 유사 입자는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 수두 바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스 및 간염 바이러스의 구조적 단백질로부터 형성될 수 있다.
탄소 나노튜브는 나노미터 또는 마이크로미터 범위의 원통형 구조를 가진 탄소 동소체이다. 원통형 구조는 단일 층(단일 벽 나노튜브) 또는 다중 층(다중-벽 나노튜브)일 수 있다. 이러한 구조는 문헌에 잘 기술된 다양한 방식, 예컨대 화학 기상 증착, 아크 방전, 고압 일산화탄소 불균형, 및 레이저 제거로 제조될 수 있다. 탄소 나노튜브는 표면 기능화에 의해 또는 마이크로/나노입자 내부 또는 위에 양이온성 성분의 포함에 의해 양이온성이 될 수 있다.
덴드리머는 나노미터-크기의 고도로 분지된 별 모양의 거대분자이다. 덴드리머는 중앙 코어, 내부 덴드리머 구조(가지), 기능성 표면 기가 있는 외부 표면의 세 가지 성분으로 정의된다. 차폐된 내부 코어 및 특정 표면 특성, 예컨대 양의 표면 전하를 가진 상이한 모양과 크기의 이러한 덴드리머 성분의 조합을 변화시켜. 덴드리머는 단계적 화학적 방법에 의해 합성되어 좁은 분자량 분포, 균일한 크기 및 모양, 및 다중(다가) 표면 기를 갖는 분자의 뚜렷한 세대(G0, G1, G2, ...)를 제공한다. 본 발명에 따라 사용되는 덴드리머는 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머, 폴리프로필렌이민 덴드리머, 티오포스포릴 덴드리머, 사이클로트리포스파젠 덴드리머, 및 2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산 (비스-MPA) 덴드리머를 포함할 수 있다. 덴드리머는 양이온성 구조적 성분의 사용에 의해 및/또는 양이온성 기능화 표면 기의 사용에 의해 및/또는 마이크로/나노입자 내부 또는 위에 다른 양이온성 성분의 포함에 의해 적어도 부분적으로 양이온성이 될 수 있다.
고체 마이크로/나노입자의 예는 중합체 마이크로/나노입자, 실리카 마이크로/나노입자 및 금속 마이크로/나노입자를 포함한다.
중합체 마이크로/나노입자는 임의의 적합한 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리락트산, 폴리아크릴아미드, 멜라민, 폴리(D-L-락티드), 폴리-D-L-글리콜리드, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리(락티드-co-글리콜리드) PLA, 폴리카프로락톤, 키토산, 젤라틴, 알부민, 덱스트란, 아가로스, 폴리-L-글루탐산, 폴리 L-리신으로/로부터 형성될 수 있다(자가-조립체(폴리플렉스), 층별 조립체 또는 겔화에 의해, 예컨대 히드로겔화에 의한 것 포함). 중합체 마이크로/나노입자는 양이온성 중합체, 예컨대 폴리 L-리신의 포함에 의해, 및/또는 표면 기능화 또는 마이크로/나노입자 내부 또는 위에 다른 양이온성 성분의 포함에 의해 적어도 부분적으로 양이온성이 될 수 있다.
금속 및 금속 마이크로/나노입자는 다음의 금속 및 이들의 동위원소로/로부터 형성될 수 있다: 금(예컨대 198Au, 199Au), 은(예컨대 107Ag 및 109Ag), 백금(예컨대 195mPt), 철(예컨대 59Fe), 구리(예컨대 61Cu, 64Cu, 및 67Cu), 가돌리늄(예컨대 149Gd, 151Gd), 인듐(예컨대 111ln), 테크네튬(예컨대 99mTc), 갈륨(예컨대 67Ga, 68Ga), 레늄(예컨대 188Re,186Re), 루테튬(예컨대 177Lu), 악티늄(예컨대 225Ac), 이트륨(예컨대 90Y), 안티모니(예컨대 119Sb), 주석(예컨대 117Sn, 113Sn), 디스프로슘(예컨대 159Dy), 코발트(예컨대 56Co, 60Co), 루테늄(예컨대 97Ru, 103Ru,106Ru), 팔라듐(예컨대 103Pd), 카드뮴(예컨대 115Cd), 텔루륨(예컨대 118Te, 123Te), 바륨(예컨대 131Ba, 140Ba), 테르븀(예컨대 160Tb), 란타늄(예컨대 140La), 라듐(예컨대 223Ra, 224Ra), 스트론튬(예컨대 89Sr), 사마륨(예컨대 153Sm), 이테르븀(예컨대 169Yb), 탈륨 (예컨대 201TI), 세슘(예컨대 137Cs), 이리듐(예컨대 192Ir) 및 루비듐(예컨대 82Rb). 금속은 금속에 대한 기존 산화 상태로 나타날 수 있다. 이러한 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다. 예컨대 암모늄-기반 종(아르기닌, 폴리에틸렌 이민, 등) 또는 포스포늄-기반 종(포스포니오알킬티오설페이트, 포스포니오알킬티오아세테이트)로의 입자의 기능화는 양이온성 표면 전하를 제공할 수 있다. 금속/금속 마이크로/나노입자는 마이크로/나노스피어, 마이크로/나노스타, 마이크로/나노케이지 또는 마이크로/나노쉘일 수 있다.
실리카 마이크로/나노입자는 메조기공 실리카일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자는 선택된 표적 부위에 마이크로/나노입자의 표적화를 보조하기 위한 수용체 친화성 분자이거나 이를 운반하는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 친화성 분자는 수용체 특이적 폴리펩티드, 핵산 및 탄수화물, 예컨대 항체, 항체 단편, 펩티드 성장 인자, DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 수용체는 폴리펩티드(예컨대 인테그린, 카데린, 셀렉틴, ICAM-1), 핵산 또는 탄수화물일 수 있다. 다수의 수용체-리간드 쌍이 당업자에게 공지되어 있으며, 과도한 부담 없이 확인될 수 있으며 임의의 이러한 쌍은 본 발명에서 사용하기 위한 수용체 친화성 분자의 선택의 기초를 제공할 수 있다. 예는 WO96/15811, WO98/54347, WO01/92543, WO02/072616, WO2004108938, 및 WO2007/138324에 기술된 펩티드 리간드를 포함한다. 수용체 친화성 분자는 WO2007/138324에서 수용체 친화성 분자 유도체화된 리포좀 형성 화합물의 맥락에서 기술된 것들을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 수용체 친화성 분자는 관심 분자가 아니고, 알지네이트 올리고머가 아니거나 자체로(즉, 또 다른 화학 개체에 결합되지 않은 경우) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성제가 아니다.
전술된 바와 같이, 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자는 관심 분자, 특히 점막 표면의 상피 세포에 전달될 분자를 운반한다. 이러한 분자는 치료적 활성제(약제/약물), 진단제 또는 영상화제 또는 세포 또는 세포가 생산하는 산물(예컨대 효소, 보조인자, 전구체 물질, 기질)의 특성을 조작하기 위한 제제를 포함할 수 있다. 치료제는 특히 소분자 약제, 생물학적 치료제 또는 방사성 약제(예컨대 방사성 핵종 또는 방사성 면역 치료제)일 수 있다. 생물학적 치료제는 비제한적으로 항체, 펩티드 호르몬, 사이토카인, 펩티드 성장 인자, 펩티드 항원 및 핵산(예컨대 유전자 치료, 유전자 편집, RNA 간섭 치료(예컨대 siRNA 또는 miRNA), 안티센스 치료 및 시험관 내 전사된 mRNA(IVT-mRNA) 치료용 핵산)을 포함한다. 진단제는 방사성핵종(예컨대 진단 방사성 핵종), 조영제 또는 분자 프로브로서 사용하기 위한 핵산 또는 단백질(예컨대 올리고뉴클레오티드 및 항체)을 포함할 수 있다. 세포 공학제는 뉴클레아제(예컨대 Cas9, Cpf1), 프로테아제, 리파제, 및 보조인자를 포함할 수 있다.
치료 활성제는 CFTR 조절제, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 세포독성 화학요법제, 신생혈관 억제제, 항암 단일클론 항체, 방사선면역치료제, 면역자극제, 면역억제제, 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 항-염증제(NSAID), 기관지 확장제, 경구용 당뇨병 치료제, 또는 방사성 의약품일 수 있다.
CFTR 조절제는 CFTR 기능부전을 적어도 부분적으로 감소시키는 소분자이다. CFTR 조절제는 CFTR 강화제, CFTR 교정제 및 리드-스루(read-through) 제제로 분류될 수 있다.
CFTR 강화제는 상피 세포 표면 상에 존재하는 CFTR 이온 채널의 활성을 증가시키는 CFTR 조절제이다(예컨대 개방 확률(게이트 개방 시간 및/또는 게이팅 확률) 또는 채널의 컨덕턴스 증가에 의해). 이는 결함이 있는 CFTR의 감소된 수준에서 이온 채널 활성을 증가시키거나 축소된 크기의 정상 CFTR 집단에서 정상 수준보다 위로 이온 채널 활성을 증가시키는 형태를 취할 수 있다.
CFTR 교정제는 상피 세포 표면에서 전달되거나 유지된 CFTR 단백질의 양을 증가시키는 CFTR 조절제이다. 이러한 분자는 상피 세포 표면에서 CFTR의 양을 감소시킬 수 있는 CFTR 처리의 다양한 결함을 고려하여 다양한 방식으로 이러한 효과를 달성할 수 있다. 예컨대, 특정 CFTR 교정제는 CFTR의 적절한 폴딩 및 CFTR의 번역 후 수정을 촉진하고 CFTR을 조기 분해로부터 보호하고, CFTR의 세포 내 표적화를 촉진하고, 세포 막에서 CFTR의 가속화된 전환을 역전시키는 샤페론 역할을 할 수 있다. 이는 건강한 세포를 반영하는 수준으로 상피 세포 표면에 전달되거나 유지되는 정상 CFTR 단백질의 양을 증가시키거나, 예컨대 건강한 세포에서 야생형 CFTR보다 더 높은 수준으로, 상피 세포 표면에 전달되거나 유지된 부분적으로 결함이 있는 CFTR 단백질의 양을 증가시키는 형태를 취할 수 있다.
리드-스루 제제는 세포의 번역 기전이 CFTR mRNA 전사체에서 임의의 미성숙한 종료 코돈을 피하게 함으로써 생산된 실질적으로 전장 및 바람직하게는 기능적 CFTR의 양을 증가시키는 CFTR 조절제이다.
특정 구현예에서, CFTR 조절제는 WO2006/002421, WO2007/056341 WO2007134279, WO2009038683, WO2009064959, WO2009073757, WO2009076141, WO2009076142, WO2010019239, WO2010037066, WO2010048526, WO2010053471, WO2010054138, WO2010138484, WO2011019413, WO2011050325, WO2011072241, WO2011127241, WO2011127290, WO2011133751, WO2011133951, WO2011133953, WO2011133956, WO2011146901, Pedemonte, N., et al., J Clin Invest. 2005;115(9):2564-2571, Van Goor, F. et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006, 290: L1117-L1130, 및 Pedemonte, N., et al., Molecular Pharmacology, 2005 vol. 67 no. 5 1797-1807에 개시된 것들로부터 선택되며, 이의 내용은 참조로써 본원에 포함된다.
페닐글리신, 설폰아미드(Pedemonte et al., Molecular Pharmacology, 2005에 의해 보고됨), 피라졸(예컨대 [4-메틸-2-(5-페닐-1H-피라졸-3-y)페놀], Van Goor, F. et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006에 의해 보고됨), 플라본(예컨대 이소플라본 및 벤조플라본, 특히 제니스테인 및 에피제닌), 잔틴(예컨대 이소부틸메틸사민(IBMX), 8-사이클로펜틸-1,3-디프로필잔틴(CPX), 1-이소부틸잔틴(XC-33)), 벤조티오펜(예컨대 테트라히드로벤조티오펜), 벤즈이미다졸론(예컨대 NS004, 5-트리플루오로메틸-1-(5-클로로-2-히드록시페닐)1,3-디히드로-2H-벤즈이미-다졸-2-온; NS1619, 1,3-디히드로-1-[2-히드록시-5-(트리플루오로메틸)페닐]-5-(트리플루오로메틸)-2H-벤즈이미다졸-2-온), 캡사이신, 플루오레스세인(예컨대 플록신 B), 페난트롤린, 벤조퀴놀린, 디히드로피리딘(예컨대 1,4- 디히드로피리딘, 특히 펠로디핀), 이소퀴놀린, 및 벤조[c]퀴놀리지늄(예컨대 MPB-27 (6-히드록시-7-클로로벤조[c]퀴놀리지늄), MPB-07 (6-히드록시-10-클로로벤조[c]퀴놀리지늄), MPB-91 (5-부틸-10-클로로-6-히드록시벤조[c]퀴놀리지늄 클로라이드), MPB-104 (5-부틸-7-클로로-6-히드록시벤조[c]퀴놀리지늄 클로라이드), Norez et al, J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2008, 325, 89-99)에 보고됨) 부류의 강화제를 특별히 언급할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 추가 조절제 및 상응하는 분자 구조가 도 10에 도시되어 있다.
CFTR 교정제는 4-페닐부티레이트(4-PBA), 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카복실산 디아미드, 이소퀴놀린의 화합물, 사이클로알킬카복사미도-피리딘 벤조산 및 벤조[c]퀴놀리지늄 부류(예컨대 MPB-07, MPB-80 (10-플루오로-6-히드록시벤조[c]퀴놀리지늄 클로라이드) MPB-91 및 MPB 104) 및 Pedemonte et al. J.Clin. Invest. (2005) 및 Van Goor, F. et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2006)에 의해 보고되고 도 3에 도시된 바와 같은 다양한 다른 구조적 부류의 화합물(아미노벤조티아졸 (예컨대 2- 아미노벤조티아졸), 아미노아릴티아졸(예컨대 2-아미노-4-아릴티아졸), 퀴나졸리논 (예컨대 퀴나졸리닐아미노피리미돈(특히 2-퀴나졸리닐-4-아미노피리미디논), 비스아미노메틸바이티아졸, N-페닐아미노퀴놀린(예컨대 (N-페닐아미노)퀴놀론))을 포함한다.
대표적인 CFTR 조절제는 N-(2,4-디-tert-부틸-5-히드록시페닐)-1,4-디히드로-4-옥소퀴놀린-3-카복사미드(이바캡토; VX-770), [4-메틸-2-(5-페닐-1H-피라졸-3-y)페놀] (VRT-532), VRT-422, 4-사이클로헥실옥시-2-{1-[4-(4-메톡시-벤젠설포닐)-피페라진-1-일]-에틸}-퀴나졸린 (VRT-325) (Van Goor, F. et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2006) 및 도 3의 둘 모두), 3-[6-[[1-(2,2-디플루오로-1,3-벤조디옥솔-5-일)사이클로프로판카보닐]아미노]-3-메틸피리딘-2-일]벤조산 (루마캡토; VX-809), VX-661 (테자캡토; 1-(2,2-디플루오로-1,3-벤조디옥솔-5-일)-N-[1-[(2R)-2,3-디히드록시프로필]-6-플루오로-2-(2-히드록시-1,1-디메틸에틸)-1H-인돌-5-일]-사이클로프로판카복사미드), N6022 (3-[1-(4-카바모일-2-메틸페닐)-5-(4-이미다졸-1-일페닐)피롤-2-일]프로파논산), 아탈루렌, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카복실산 디아미드, 4-페닐부티레이트(4-PBA), 제니스테인, 에피제닌, MPB-07, MPB-27, MPB-91, MPB-104, 펠로디핀, NS004, 플록신 B, IBMX, CPX, XC-33, 캡사이신 및 젠타마이신, 바람직하게는 이바캡토, 루마캡토, VX-661, 및 아탈루렌 및 가장 바람직하게는 이바캡토 및 루마캡토를 포함한다.
상기 언급된 CFTR 조절제 중에서, 다음은 강화제로 간주된다: VX-770, VTR-532, 제니스테인, 에피제닌, MPB-07, MPB-27, MPB-91, MPB-104, 펠로디핀, NS004, 플록신 B, IBMX, CPX, XC-33, 캡사이신 및 제니스테인. 상기 언급된 CFTR 조절제 중에서, 다음은 교정제로 간주된다: VRT-422, VRT-325, VX-809, VX-661, N6022, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카복실산 디아미드, 4-페닐부티레이트 (4-PBA), MPB-07, MPB 80, MPB-91 및 MPB-104. 상기 언급된 CFTR 조절제 중에서, 다음은 제제를 통해 판독되는 것으로 간주된다: 아탈루렌 및 젠타마이신.
항생제는 아미노글리코사이드(예 아미카신(amikacin), 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin), 네틸마이신(netilmicin), 스트렙토마이신(streptomycin), 토브라마이신(tobramycin)); β-락탐 (예, 카바세펨(carbacephem) (예, 로라카르베프(loracarbef)); 1세대 세팔로스포린(예, 세파드록실(cefadroxil), 세파졸린(cefazolin), 세팔렉신(cephalexin)); 2세대 세팔로스포린 (예, 세팍클로르(cefaclor), 세파만돌(cefamandole), 세팔렉신(cephalexin), 세폭시틴(cefoxitin), 세프프로질(cefprozil), 세푸록심(cefuroxime)); 3세대 세팔로스포린(예, 세픽심(cefixime), 세프디니르(cefdinir), 세프디토렌(cefditoren), 세포페라존(cefoperazone), 세포탁심(cefotaxime), 세프포독심(cefpodoxime), 세프타지딤(ceftazidime), 세프티부텐(ceftibuten), 세프티족심(ceftizoxime), 세프트리아손(ceftriaxone)); 4세대 세팔로스포린(예, 세페핌(cefepime)); 모노박탐(예, 아즈트레오남(aztreonam)); 매크롤라이드(예, 아지트로마이신(azithromycin), 클라리트로마이신(clarithromycin), 디리트로마이신(dirithromycin), 에리트로마이신(erythromycin), 트롤린도마이신(troleandomycin)); 모노박탐(monobactam) (예, 아즈트레오남(aztreonam)); 페니실린 (예, 아목시실린(amoxicillin), 암피실린(ampicillin), 카베니실린(carbenicillin), 클록사실린(cloxacillin), 디클록사실린(dicloxacillin), 나프실린(nafcillin), 옥사실린(oxacillin), 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린(piperacillin), 티카르실린(ticarcillin)); 폴리펩타이드 항생제(예, 박시트락신(bacitracin), 콜리스틴(colistin), 폴리믹신 B(polymyxin B)); 퀴놀론(quinolone) (예, 시프로플록사신(ciprofloxacin), 에녹사신(enoxacin), 가티플록사신(gatifloxacin), 레보플록사신(levofloxacin), 로메플록사신(lomefloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 노르플록사신(norfloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 트로바플록사신(trovafloxacin)); 설폰아미드(예, 마페니드(mafenide), 설파세타미드(sulfacetamide), 설파메티졸(sulfamethizole), 설파살라진(sulfasalazine), 설피속사졸(sulfisoxazole), 트리메토프림(trimethoprim), 설파메톡사졸(sulfamethoxazole)); 테트라사이클린 (예, 데메클로사이클린(demeclocycline), 독시사이클린(doxycycline), 미노사이클린(minocycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline), 테트라사이클린(tetracycline)); 글리사일사이클린(glycylcycline) (예, 티게사이클린(tigecycline)); 카바페넴(carbapenem) (예, 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 에르타페넴(ertapenem), 도리페넴(doripenem), 파니페넴(panipenem)/베타미프론(betamipron), 비아페넴(biapenem), PZ-601)으로부터 선택될 수 있으며; 그외 항생제로는 클로람페니콜(chloramphenicol); 클린다마이신(clindamycin), 에탐부톨(ethambutol); 포스포마이신(fosfomycin); 이소니아지드(isoniazid); 리네졸리드(linezolid); 메트로니다졸(metronidazole); 니트로푸란토인(nitrofurantoin); 피라진아미드(pyrazinamide); 퀴누프리스틴(quinupristin)/달포프리스틴(dalfopristin); 리팜핀(rifampin); 스펙티노마이신(spectinomycin); 및 반코마이신(vancomycin)으로부터 선택될 수 있다.
보다 바람직하게는 항생제는 아미카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 세픽심, 세프디니르, 세프디토렌, 세포페라존, 세포탁심, 세프포독심, 세프타지딤, 세프티부텐, 세프티족심, 세프트리아손, 세페핌, 아즈트레오남, 아목실린, 암피실린, 카베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 티카르실린, 시프로플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 텔리트로마이신, 카보마이신 A, 조사마이신, 키타사마이신, 미데카마이신, 올레안도마이신, 스피라마이신, 트롤레안도마이신, 틸로신, 이미페넴, 메로페넴, 에르타페넴, 도리페넴, 파니페넴/베타미프론, 비아페넴, PZ-601, 박시트라신, 콜리스틴, 폴리믹신 B, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린 및 테트라사이클린으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 항생제는 아즈트레오남, 시프로플록사신, 젠타마이신, 토브라마이신, 아목시실린, 콜리스틴, 세프타지딤, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 스피라마이신, 옥시테트라사이클린 및 이미페넴으로부터 선택된다.
특히 바람직한 구현예에서, 항생제는 아즈트레오남, 시프로플록사신, 젠타마이신, 토브라마이신, 아목시실린, 콜리스틴 및 세프타지딤으로부터 선택된다.
대표적인 항진균제로는, 비제한적으로, 폴리엔(예, 나타마이신(natamycin), 리목시딘(rimocidin), 필리핀(filipin), 니스타틴(nystatin), 암포테리신 B(amphotericin B), 칸디신(candicin)); 이미다졸(예, 미코나졸(miconazole), 케토코나졸(ketoconazole), 클로트리마졸(clotrimazole), 에코나졸(econazole), 비포나졸(bifonazole), 부토코나졸(butoconazole), 펜티코나졸(fenticonazole), 이소코나졸(isoconazole), 옥시코나졸(oxiconazole), 세르타코나졸(sertaconazole), 술코나졸(sulconazole), 티오코나졸(tioconazole)); 트리아졸(예, 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 이사부코나졸(isavuconazole), 라부코나졸(ravuconazole), 포사코나졸(posaconazole), 보리코나졸(voriconazole), 테르코나졸(terconazole)); 알릴아민(예, 테르비나핀(terbinafine), 아모롤핀(amorolfine), 나프티핀(naftifine), 부테나핀(butenafine)); 및 에키노칸딘(echinocandin)(예, 아니둘라푼긴(anidulafungin), 카스포푼긴(caspofungin), 미카푼긴(micafungin))을 포함한다.
대표적인 항바이러스제로는, 비제한적으로, 어바카비르(abacavir), 어사이클로비르(acyclovir), 아데포비르(adefovir), 아만타딘(amantadine), 암프레나비르(amprenavir), 아르비돌(arbidol), 아타자나비르(atazanavir), 어트리플라(atripla), 보세프레비르(boceprevir), 시도포비르(cidofovir), 콤비비르(combivir), 다루나비르(darunavir), 델라비르딘(delavirdine), 디다노신(didanosine), 도코사놀(docosanol), 에독수딘(edoxudine), 에파비렌즈(efavirenz), 엠트리시타빈(emtricitabine), 엔푸비르티드(enfuvirtide), 엔테카비르(entecavir), 팜시클로비르(famciclovir), 포미비르센(fomivirsen), 포삼프레나비르(fosamprenavir), 포스카르넷(foscarnet), 포스포넷(fosfonet), 간시클로비르(ganciclovir), 이박시타빈(ibacitabine), 이뮤노비르(imunovir), 이독수리딘(idoxuridine), 이미퀴모드(imiquimod), 인디나비르(indinavir), 이노신(inosine), 인터페론 III형, 인터페론 II형, 인터페론 I형, 라미부딘(lamivudine), 로피나비르(lopinavir), 로비리드(loviride), 마라비록(maraviroc), 모록시딘(moroxydine), 넬피나비르(nelfinavir), 네비라핀(nevirapine), 넥사비르(nexavir), 오셀타미비르(oseltamivir), 펜시클로비르(penciclovir), 퍼라미비르(peramivir), 플레코나릴(pleconaril), 포도필로톡신(podophyllotoxin), 랄테그라비르(raltegravir), 리바비린(ribavirin), 리만타딘(rimantadine), 리토나비르(ritonavir), 사퀴나비르(saquinavir), 스타부딘(stavudine), 테노포비르(tenofovir), 테노포비르(tenofovir) 디소프로실(disoproxil), 티프라나비르(tipranavir), 트리플루리딘(trifluridine), 트리지비르(trizivir), 트로만타딘(tromantadine), 트루바다(truvada), 발라시클로비르(valaciclovir), 발간시클로비르(valganciclovir), 비크리비록(vicriviroc), 비다라빈(vidarabine), 비라미딘(viramidine), 잘시타빈(zalcitabine), 자나미비르(zanamivir) 및 지도부딘(zidovudine)을 포함한다.
대표적인 면역자극제로는, 비제한적으로, 사이토카인, 예컨대 TNF, IL-1, IL-6, IL-8을 포함한다.
대표적인 NSAID로는, 비제한적으로, 살리실레이트(예, 아스피린 (아세틸살리실산), 콜린 마그네슘 트리살리실레이트, 디플루니살 (diflunisal), 살살레이트(salsalate), 프로피온산 유도체(예, 이부프로펜(ibuprofen), 덱시부프로펜(dexibuprofen), 덱스케토프로펜(dexketoprofen), 페노프로펜(fenoprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 케토프로펜(ketoprofen), 록소프로펜(loxoprofen), 나프록센(naproxen), 옥사프로진(oxaprozin)), 아세트산 유도체(예, 아세클로페낙(aceclofenac), 디클로페낙(diclofenac), 에토돌락(etodolac), 인도메타신(indomethacin), 케토롤락(ketorolac), 나부메톤(nabumetone), 톨메틴(tolmetin), 설린닥(sulindac)), 에놀산 유도체(예, 드록시캄(droxicam), 이속시캄(isoxicam), 로르녹시캄(lornoxicam), 멜록시캄(meloxicam), 피록시캄(piroxicam), 테녹시캄(tenoxicam)), 안트라닐산 유도체(예, 플루페남산, 메클로페남산(meclofenamic acid), 메페남산(mefenamic acid), 톨페남산) 및 선택적인 COX-2 저해제(Coxibs; 예컨대 셀레콕십(celecoxib), 에토리콕십(etoricoxib), 루미라콕십(lumiracoxib), 파레콕십(parecoxib), 로페콕십(rofecoxib), 발데콕십(valdecoxib)) 등을 포함한다. 프로피온산 유도체(예, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 덱스케토프로펜, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 록소프로펜, 나프록센, 옥사프로진)이 바람직하며, 이부프로펜이 가장 바람직하다.
적합한 기관지 확장제에 대한 대표적인 예로는, 비제한적으로, β2 작용제(예, 단기-작용성 β2 작용제(예, 피르부테롤(pirbuterol), 에피네프린(epinephrine), 살부타몰(salbutamol), 레보살부타몰(levosalbutamol), 클렌부테롤(clenbuterol), 테르부탈린(terbutaline), 프로카테롤(procaterol), 메타프로테레놀(metaproterenol), 페노테롤(fenoterol), 비톨레롤(bitolterol) 메실레이트, 리토드린(ritodrine), 이소프레날린(isoprenaline)); 장기-작용성 β2 작용제(예, 살메테롤 (salmeterol), 포르모테롤(formoterol), 밤부테롤(bambuterol), 클렌부테롤(clenbuterol)); 및 초 장기-작용성 β2 작용제(예, 인다카테롤(indacaterol)), 항-콜린제(예, 이프라트로피움 (ipratropium), 옥시트로피움(oxitropium), 티오트로피움(tiotropium)) 및 테오필린을 포함한다.
적합한 코르티코스테로이드에 대한 대표적인 예로는, 비제한적으로, 프레드니손(prednisone), 플루니솔리드(flunisolide), 트리암시놀론(triamcinolone), 플루티카손(fluticasone), 부데소니드(budesonide), 모메타손(mometasone), 베클로메타손(beclomethasone), 암시노니드(amcinonide), 부데소니드(budesonide), 데소니드(desonide), 플루오시노니드(fluocinonide), 플루오시놀론(fluocinolone), 할시노니드(halcinonide), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 코르티손(cortisone), 티소코르톨(tixocortol), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론, 프레드니손(prednisone), 베타메타손(betamethasone), 덱사메타손, 플루오코르톨론(fluocortolone), 아클로메타손(aclometasone), 프레드니카르베이트(prednicarbate), 클로베타손(clobetasone), 클로베타솔(clobetasol) 및 플루프레드니덴(fluprednidene)을 포함한다.
적합한 경구 항-당뇨병제에 대한 대표적인 예로는, 비제한적으로, 설포닐우레아(예, 카르부타미드(carbutamide), 아세토헥사미드(acetohexamide), 클로르프로파미드(chlorpropamide), 톨부타미드(tolbutamide), 글리피지드(glipizide), 글리클라지드(gliclazide), 글리벤클라미드(glibenclamide), 글리보르누리드(glibornuride), 글리퀴돈(gliquidone), 글리속세피드(glisoxepide), 글리클로피라미드(glyclopyramide), 글리메피리드(glimepiride)), 비구아니드(biguanide) (예, 메트포르민(metformin), 펜포르민(phenformin), 부포르민(buformin), 프로구아닐(proguanil)), 티아졸리딘다이온(thiazolidinedione)) (예, 로시글리타존(rosiglitazone), 피오글리타존(pioglitazone), 트로글리타존(troglitazone)), 알파-글루코시다제 저해제(예, 아카르보스(acarbose), 미글리톨(miglitol), 보글리보스(voglibose)), 메글리티니드(meglitinide) (예, 나테글리니드(nateglinide), 레파글리니드(repaglinide), 미티글리니드(mitiglinide)), 및 글리코수릭스(glycosurics) (예, 다파글리플로진(dapagliflozin), 가나글리플로진(ganagliflozin), 이프라글리플로진(ipragliflozin), 토포글리플로진(tofogliflozin), 엠파글리플로진(empagliflozin), 세르글리플로진 에타보네이트(sergliflozin etabonate), 레모글리플로진 에타보네이트(remogliflozin etabonate))를 포함한다.
적합한 세포독성 화학치료제의 대표적인 예는, 비제한적으로, 블레오마이신, 카페시타빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 다카바진, 도세탁셀, 독소루비신, 페길화된 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 에리불린, 에토포시드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 익사베필론, 메토트렉세이트, 메클로레사민, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 프로카바진, 프레드니솔론, 단백질-결합 파클리탁셀, 비노렐빈, 빈블라스틴 및 빈크리스틴을 포함한다.
적합한 혈관신생 억제제의 대표적인 예는, 비제한적으로, 베바시주맙, 에베롤리무스, 레날리도미드, 라무시루맙 소라페닙, 수니티닙 및 탈리도마이드를 포함한다.
적합한 항암 단클론 항체의 대표적인 예는, 비제한적으로, 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 및 트라스트주맙 및 체크포인트 억제제 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 및 세미플리맙을 포함한다.
적합한 방사성면역치료제의 대표적인 예는, 비제한적으로, 이브리투모맙 및 토시투모맙을 포함한다.
치료적 방사성 핵종의 대표적인 예는, 비제한적으로, 인듐(예컨대 111ln), 테크네튬(예컨대 99mTc), 갈륨(예컨대 67Ga, 68Ga), 레늄(예컨대 188Re,186Re), 루테튬(예컨대 177Lu), 악티늄(예컨대 225Ac), 이트륨(예컨대 90Y), 안티모니(예컨대 119Sb), 주석(예컨대 117Sn, 113Sn), 디스프로슘(예컨대 159Dy), 코발트(예컨대 56Co, 60Co), 철(예컨대 59Fe), 구리(예컨대 61Cu, 64Cu, 및 67Cu), 루테늄(예컨대 97Ru, 103Ru,106Ru), 팔라듐(예컨대 103Pd), 카드뮴(예컨대 115Cd), 텔루륨(예컨대 118Te, 123Te), 바륨(예컨대 131Ba, 140Ba), 가돌리늄(예컨대 149Gd, 151Gd), 테르븀(예컨대 160Tb), 금(예컨대 198Au, 199Au), 란타늄(예컨대 140La), 라듐(예컨대 223Ra, 224Ra), 스트론튬(예컨대 89Sr), 사마륨(예컨대 153Sm), 이테르븀(예컨대 169Yb), 탈륨(예컨대 201TI), 세슘(예컨대 137Cs), 이리듐(예컨대 192Ir) 및 루비듐(예컨대 82Rb)을 포함한다.
진단적 방사성 핵종의 대표적인 예는, 비제한적으로, 인듐(예컨대 111ln), 테크네튬(예컨대 99mTc), 갈륨(예컨대 67Ga, 68Ga), 루비듐(예컨대 82Rb) 및 탈륨(예컨대 201TI)을 포함한다.
상기 언급된 방사성 핵종은 금속의 경우 임의의 존재하는 산화 상태로 나타날 수 있다. 이러한 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
적합한 면역억제제의 대표적인 예는, 비제한적으로 사이클로스포린, 라파마이신, 타크로리무스, 닥티노마이신, 미토마이신 c, 블레오마이신, 미트라마이신, 아자티오프린, 히드로코티손, 코티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 벡사메타손, 베타메타손, 트리암시놀론, 베클로메타손, 플루드로코티손 아세테이트, 디옥시코티코스테론 아세테이트 및 알도스테론을 포함한다.
특정 구현예에서, 치료적 핵산은 대상에서 기능부전인 단백질의 기능적인 버전을 코딩하는 유전자, 예컨대 CFTR 유전자를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산은 IVT-mRNA 분자일 수 있거나, 기능부전 유전자 또는 과발현되는 유전자, 예컨대 종양 유전자를 표적으로 하는, siRNA 분자, miRNA 분자, 또는 안티센스 RNA 분자를 코딩할 수 있거나 그일 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산은 CRISPR 시스템의 성분(예를 들어 뉴클레아제, sgRNA, crRNA, tracrRNA 또는 DNA 복구 주형)의 일부 또는 전부, 예컨대 CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas13, 및 CRISPR-Cpf1을 코딩할 수 있거나 그일 수 있다. 진단제로서, 핵산은 질환 또는 병태 또는 이들의 진행을 나타내는 핵산 바이오마커의 뉴클레오티드 서열에 상보적일 수 있다. 다른 맥락에서, 예컨대 시험관 내 세포 또는 조직 배양에서, 이러한 핵산은 세포 또는 세포가 생산하는 산물의 특성을 조작하는데 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 알지네이트는, 전형적으로, 훨씬 크지만, 전형적으로 평균 분자량 35,000 달톤 이상의 폴리머, 즉, 약 175 내지 약 190 개의 단량체 잔기로 된 폴리머로서 형성되며, 본 발명에 따른 알지네이트 올리고머는 알지네이트 폴리머의 단편화(fractionation) (즉, 크기 감소)에 의해 수득되는 물질, 통상적으로 천연 알지네이트로서 정의될 수 있다. 알지네이트 올리고머는 평균 분자량 35,000 달톤 미만(즉, 단량체 잔기 약 190 개 미만, 또는 약 175 개 미만)인 것으로 간주될 수 있으며, 특히 평균 분자량 30,000 달톤 미만(즉, 단량체 잔기 약 175 개 미만 또는 약 150 개 미만), 보다 구체적으로 평균 분자량 25,000 또는 20,000 달톤 미만(즉, 단량체 잔기 약 135 또는 125 개 미만, 또는 단량체 잔기 약 110 개 또는 100 개 미만)의 알지네이트인 것으로 간주될 수 있다.
다른 관점에서, 올리고머는 일반적으로 2 개 이상의 유닛 또는 잔기를 포함하며, 본 발명에 따라 사용하기 위한 알지네이트 올리고머는 전형적으로 단량체 잔기 2 내지 100 개, 보다 전형적으로 3, 4, 5 또는 6 내지 100 개를 포함할 것이며, 2, 3, 4, 5 또는 6 내지 75, 2, 3, 4, 5 또는 6 내지 50, 2, 3, 4, 5 또는 6 내지 40, 2, 3, 4, 5 또는 6 내지 35 또는 2, 3, 4, 5 또는 6 내지 30 개의 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 알지네이트 올리고머는 전형적으로 350, 550, 700, 900 또는 1,000 내지 20,000 달톤, 350, 550, 700, 900 또는 1,000 내지 15,000 달톤, 350, 550, 700, 900 또는 1,000 내지 10,000 달톤, 350, 550, 700, 900 또는 1,000 내지 8,000 달톤, 350, 550, 700, 900 또는 1,000 내지 7,000 달톤, 또는 350, 550, 700, 900 또는 1,000 내지 6,000 달톤의 평균 분자량을 가질 것이다.
다른 구현예에서, 알지네이트 올리고머는 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn) 2 내지 100, 바람직하게는 2 내지 75, 바람직하게는 2 내지 50, 더 바람직하게는 2 내지 40, 2 내지 35, 2 내지 30, 2 내지 28, 2 내지 25, 2 내지 22, 2 내지 20, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 15 또는 2 내지 12를 가질 수 있다.
다른 예시적인 범위(잔기의 수, DP 또는 DPn)는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나 내지 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13 또는 12 중 어느 하나이다.
다른 예시적인 범위(잔기의 수, DP 또는 DPn)는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 중 어느 하나 내지 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 또는 16 중 어느 하나를 포함한다.
다른 예시적인 범위(잔기의 수, DP 또는 DPn)는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 어느 하나 내지 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 또는 19 중 어느 하나를 포함한다.
본 발명에 사용되는 알지네이트 올리고머는 바람직하게는 3- 내지 35-mer, 더 바람직하게는 3- 내지 28-mer, 특히 4- 내지 25-mer, 예컨대 5- 내지 20-mer, 특히 6- 내지 22-mer, 특히 8- 내지 20-mer, 특히 10- 또는 15-mer이고, 예컨대 350 내지 6,400 달톤 또는 350 내지 6,000 달톤, 바람직하게는 550 내지 5,500 달톤, 바람직하게는 750 내지 5,000 달톤, 특히 750 내지 4,500 달톤 또는 2,000 내지 3,000 달톤 또는 900 내지 3,500 달톤 범위의 분자량을 가진다. 그외 예시적인 알지네이트 올리고머는, 전술한 바와 같이, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 내지 50, 45, 40, 35, 28, 25, 22 또는 20 개의 잔기를 가진 올리고머를 포함한다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 3-28, 4-25, 6-22, 8-20 또는 10-15, 또는 5-18 또는 7-15 또는 8-12, 특히 10의 중합도(DP), 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 3-24, 4-23, 5-22, 6-21, 7-20, 8-19, 9-18, 10-17, 11-16, 12-15 또는 13-14 (예, 13 또는 14)의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 4-25, 5-24, 6-23, 7-22, 8-21, 9-20, 10-19, 11-18, 12-17, 13-16, 14-15 (예, 14 또는 15)의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 5-26, 6-25, 7-24, 8-23, 9-22, 10-21, 11-20, 12-19, 13-18, 14-17 또는 15-16 (예, 15 또는 16)의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 4-50, 4-40, 4-35, 4-30, 4-28, 4-26, 4-22, 4-20, 4-18, 4-16 또는 4-14의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 5-50, 5-40, 5-25, 5-22, 5-20, 5-18, 5-23, 5-20, 5-18, 5-16 또는 5-14의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 6-50, 6-40, 6-35, 6-30, 6-28, 6-26, 6-24, 6-20, 6-19, 6-18, 6-16 또는 6-14의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 8-50, 8-40, 8-35, 8-30, 8-28, 8-25, 8-22, 8-20, 8-18, 8-16 또는 8-14의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 9-50, 9-40, 9-35, 9-30, 9-28, 9-25, 9-22, 9-20, 9-18, 9-16 또는 9-14의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 10-50, 10-40, 10-35, 10-30, 10-28, 10-25, 10-22, 10-20, 10-18, 10-16 또는 10-14의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 11-50, 11-40, 11-35, 11-30, 11-28, 11-25, 11-22, 11-20, 11-18, 11-16 또는 11-14의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 12-50, 12-40, 12-35, 12-30, 12-28, 12-25, 12-22, 12-20, 12-18, 12-16 또는 12-14의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 13-50, 13-40, 13-35, 13-30, 13-28, 13-25, 13-22, 13-20, 13-18, 13-16 또는 13-14의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 14-50, 14-40, 14-35, 14-30, 14-28, 14-25, 14-22, 14-20, 14-18, 14-16 또는 14-15의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 15-50, 15-40, 15-35, 15-30, 15-28, 15-25, 15-22, 15-20, 15-18 또는 15-16의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머는 18-50, 18-40, 18-35, 18-30, 18-28, 18-25, 18-22 또는 18-20의 중합도(DP) 또는 수 평균 중합도(DPn)를 가질 수 있다.
알지네이트 올리고머는 바람직하게는 선형 올리고머이다.
이는 단일 화합물일 수 있거나 예컨대 중합도의 범위의 화합물의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 알지네이트 올리고머는 본원에 개시된 범위를 벗어난 중합도를 가진 알지네이트 올리고머가 실질적으로 없는, 바람직하게는 본질적으로 없다. 이는, 본 발명의 알지네이트 올리고머의 분자량 분포 수준에서 표시되며, 예를 들어, 해당 범위 이외의 DP를 가지는 것을 본 발명에 따라 사용되는 알지네이트 올리고머에 대한 각 몰 %로 표현할 수 있다. 분자량 분포는, 바람직하게는, 10% 이하, 바람직하게는 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 몰 이하가 DPn의 관련 상한 보다 3, 2 또는 1 높은 DP를 가지는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 10% 이하, 바람직하게는 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 몰 이하가 DPn의 관련 하한 보다 3, 2 또는 1 낮은 DP를 가지는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, 알지네이트 올리고머는 굴루코네이트 또는 굴루콘산(G) 및/또는 만누로네이트 또는 만누론산 (M) 잔기 또는 유닛을 함유(또는 포함)할 것이다. 본 발명에 따른 알지네이트 올리고머는 바람직하게는 단독으로, 또는 실질적으로 단독으로(즉 본질적으로 구성된) 우로네이트/우론산 잔기, 보다 특히 단독으로 또는 실질적으로 단독으로 G 및/또는 M 잔기로 구성될 것이다. 대안적인 표현으로서, 본 발명에서 알지네이트 올리고머 용도에서, 적어도 80%, 보다 특히 적어도 85, 90, 95 또는 99%의 단량체 잔기는 우로네이트/우론산 잔기, 또는 보다 특히 G 및/또는 M 잔기일 수 있다. 즉, 바람직하게는, 알지네이트 올리고머는 다른 잔기 또는 유닛(예컨대 다른 사카라이드 잔기, 또는 보다 특히 다른 우론산/우로네이트 잔기)를 포함하지 않을 것이다.
전술한 바와 같이, 알지네이트 올리고머 중의 단량체 잔기는 동일하거나 상이할 수 있으며, 대부분(예컨대 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 80% 보다 바람직하게는 적어도 90%)이 바람직하지만 모두 전기적으로 하전된 기를 가질 필요는 없다. 실질적으로 대부분, 예컨대 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%의 하전된 기가 동일한 극성을 갖는 것이 바람직하다. 알지네이트 올리고머에서, 히드록실 기 대 하전된 기의 비는 바람직하게는 적어도 2:1, 보다 특히 적어도 3:1이다.
본 발명에 따라 알지네이트 올리고머의 적어도 70% 단량체 잔기는 M 잔기(즉, 만누로네이트 또는 만누론산)이다. 즉, 알지네이트 올리고머는 적어도 또는 다르게는 70% 초과의 만누로네이트(또는 만누론산) 잔기를 함유할 것이다. 따라서 구체적인 구현예는 70 내지 100% M(만누로네이트) 잔기를 가진(예컨대 함유하는) 알지네이트 올리고머를 포함한다. 추가의 구체적인 구현예는 또한 71 내지 85% M 잔기 또는 85 내지 100% M 잔기를 함유하는 올리고머를 포함한다. 따라서, 본 발명의 이러한 구현예에 따른 용도를 위한 대표적인 알지네이트 올리고머는 70% 초과의 M 잔기를 함유할 것이다 (즉 알지네이트 올리고머의 70% 초과의 단량체 잔기가 M 잔기일 것이다).
다른 구현예에서, 적어도 또는 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%의 단량체 잔기는 만누로네이트이다. 일 구현예에서, 알지네이트 올리고머는 올리고만누로네이트(즉 M의 호모올리고머, 또는 100% M)일 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 전술된 알지네이트는 M 잔기의 대부분이 소위 M-블록에 있는 1차 구조를 갖는다. 이러한 구현예에서, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70 또는 75%, 가장 바람직하게는 적어도 80, 85, 90 또는 95%의 M 잔기는 M-블록에 있다. M 블록은 적어도 2 개의 M 잔기의 연속 서열, 바람직하게는 적어도 3 연속 M 잔기, 보다 바람직하게는 적어도 4 또는 5 연속 M 잔기, 가장 바람직하게는 적어도 7 연속 M 잔기이다.
특히, 적어도 80%, 예컨대 적어도 85% 또는 90%의 M 잔기는 또 다른 M 잔기와 1-4로 연결된다. 보다 특히, 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99%의 알지네이트의 M 잔기는 또 다른 M 잔기와 1-4로 연결된다.
다른 바람직한 올리고머는 올리고머 중의 적어도 70%의 단량체 잔기가 또 다른 M-잔기와 1-4 연결된 M 잔기이거나, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 적어도 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 올리고머의 단량체 잔기는 또 다른 M 잔기와 1-4 연결된 M-잔기인 알지네이트 올리고머이다. 2 개의 M 잔기의 이러한 1-4 연결은 인접한 만누론 유닛에 결합된 만누론 유닛으로서 대안적으로 표현될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 알지네이트 올리고머는 M 잔기와 G 잔기가 교대로 있는 서열을 포함한다. M 잔기와 G 잔기가 교대로 3번 이상, 바람직하게는 4번 이상 있는 서열이 MG 블록이다. 즉, 본 발명의 알지네이트 올리고머는 MG 블록을 포함한다. 보다 구체적으로 나타내면, MG 블록은 G 잔기와 M 잔기로 구성된 3 개 이상의 연속 잔기로 이루어진 서열이며, 연속 서열에서 각 비-말단(내부) G 잔기는 M 잔기에 1-4 및 4-1로 연결되며, 연속 서열에서 각 비-말단(내부) M 잔기는 G 잔기에 1-4 및 4-1로 연결된다. 바람직하게는, MG 블록은 적어도 5 또는 6 개의 연속 잔기, 더 바람직하게는 적어도 7 또는 8 개의 연속 잔기이다.
추가적인 구현예에서, 알지네이트 올리고머에서 임의의 G 잔기가 주로 MG 블록에서 발견된다. 이러한 구현예에서, MG 블록 알지네이트 올리고머에서, 굴루로네이트 단량체들 중 바람직하게는 50% 이상, 더 바람직하게는 70% 이상 또는 75% 이상, 가장 바람직하게는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 MG 블록에 존재한다. 다른 구현예에서, 알지네이트 올리고머는, 올리고머에서 G 잔기의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 예컨대 100%가 MG 블록으로 정렬되도록, 정렬된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 올리고머의 말단 우론산 잔기는 이중 결합, 특히 C4와 C5 원자 사이에 이중 결합을 갖지 않는다. 이러한 올리고머는 포화된 말단 우론산 잔기를 갖는 것으로 설명될 수 있다. 당업자는, 과도한 부담없이도 포화된 말단 우론산 잔기를 가진 올리고머를 제조할 수 있을 것이다. 이는, 이러한 올리고머를 만드는 제조 기법을 사용함으로써 또는 불포화된 말단 우론산 잔기를 가진 올리고머 제조 공정에 의해 제조된 (포화) 올리고머를 변환함으로써, 만들 수 있다.
알지네이트 올리고머는 전형적으로 전하를 띌 것이며, 그래서 알지네이트 올리고머에 대한 반대 이온은 생리적으로 허용가능한 임의의 이온, 하전된 약물 물질에 특히 통상적으로 사용되는 이온, 예컨대 소듐, 포타슘, 암모늄, 클로라이드, 메실레이트, 메글루민 등일 수 있다. 알지네이트의 젤화를 촉진하는 이온, 예컨대 2족 금속 이온을 사용할 수 있다.
알지네이트 올리고머는 적정 수의 굴루로네이트 및 만누로네이트 잔기들의 중합으로 만들어진 합성 물질일 수 있지만, 본 발명에 사용되는 알지네이트 올리고머는 전술한 바와 같이, 즉, 천연 알지네이트 소스 물질 등의 천연 소스로부터 편리하게 수득, 제조 또는 유래할 수 있다.
본 발명에 따라 이용가능한 알지네이트 올리고머를 제조하기 위한 다당류의 올리고당으로의 절단은, 효소적 절단 및 산 가수분해 등의 일반적인 다당류 분해 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서는, 본 발명의 알지네이트 올리고머 제조에 산 가수분해를 이용한다. 다른 구현예에서, 효소적 절단은 올리고머에서 말단 우론산을 포화시키기 위한 추가적인 처리 단계(들)과 함께 사용한다.
그런 후, 올리고머를 이온 교환 수지를 이용하거나 또는 분별 침전(fractionated precipitation) 또는 가용화 또는 여과에 의해 크로마토그래피를 통해 다당류 분해 산물들로부터 분리할 수 있다. US 6,121,441 및 WO 2008/125828에, 본 발명에 사용하기 위한 알지네이트 올리고머의 제조에 적합한 공정이 기술되어 있으며, 그 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다. 추가적인 정보와 논의는 예컨대 "Handbooks of Hydrocolloids", Ed. Phillips and Williams, CRC, Boca Raton, Florida, USA, 2000에서 확인할 수 있으며, 그 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
또한, 알지네이트 올리고머는, 비제한적인 예로서, 하전된 기(예, 카르복시화되거나 카르복시메틸화된 글리칸)를 부가하기 위한 변형 등으로 화학적으로 변형할 수 있으며, 알지네이트 올리고머는 (예, 과요오드 산화에 의해) 유연성을 변형시키기 위해 변형할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 적합한 알지네이트 올리고머(예, 올리고굴루론산)는, 비제한적인 예로서, 라미나리아 하이퍼보라(Laminaria hyperbora) 및 레소니아 니그레센스(Lessonia nigrescens)로부터 유래된 알긴산의 산 가수분해, 중성 pH에서 용해, 미네랄산을 첨가하여 pH를 3.4로 낮춤으로써 알지네이트 올리고머(올리고굴루론산)의 석출, 약산으로 세정, 중성 pH에서 재현탁 및 동결 건조에 의해 쉽게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 알지네이트 올리고머를 제조하기 위한 알지네이트는 적합한 박테리아 소스, 예컨대 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 아조토박터 비네란디이(Azotobacter vinelandii)로부터 직접 수득할 수 있다.
슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)와 아조토박터 비네란디이에서 알지네이트 생합성에 관여하는 분자 장치들이 클로닝 및 특징화되었고 (WO 94/09124; Ertesvag, H., et al, Metabolic Engineering, 1999, Vol 1, 262-269; WO 2004/011628; Gimmestad, M., et al (supra); Remminghorst and Rehm, Biotechnology Letters, 2006, Vol 28, 1701-1712; Gimmestad, M. et al, Journal of Bacteriology, 2006, Vol 188(15), 5551-5560), 맞춤형 1차 구조를 가진 알지네이트는 이러한 시스템을 조작함으로써 쉽게 수득할 수 있다.
알지네이트(예, 조류 소스 물질)의 G 함량은, 예컨대 아조토박터 비네란디이의 만누로난 C-5 에피머라제 또는 그외 에피머라제 효소를 이용한 에피머화에 의해 높일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 시험관내 에피머화는 슈도모나스 또는 아조토박터 유래의 분리된 에피머라제, 예컨대 슈도모나스 플루오레센스 또는 아조토박터 비네란디이의 AlgG 또는 아조토박터 비네란디이의 AlgE 효소들(AlgE1 내지 AlgE7)을 이용하여 수행할 수 있다. 알지네이트 생산력을 지닌 다른 유기체, 특히 조류 유래의 에피머라제의 사용도 명확하게 고려된다. 아조토박터 비네란디이 AlgE 에피머라제를 이용한 G 함량이 낮은 알지네이트의 시험관내 에피머화는 Ertesvag et al (supra) 및 Strugala et al (Gums and Stabilisers for the Food Industry, 2004, 12, The Royal Society of Chemistry, 84 - 94)에 상세하게 기술되어 있다.
G-블록 함유성 알지네이트 또는 알지네이트 올리고머를 수득하기 위해, AlgE4이외의 하나 이상의 아조토박터 비네란디이 AlgE 에피머라제를 이용한 에피머화는, G 블록 구조를 만들 수 있어, 바람직하다. 한편, AlgE4 에피머라제는, G 블록을 만들기 보다는, M 잔기에 연결된 단일 G 잔기를 만들도록 각각의 M 잔기를 우선적으로 에피머화하는 것으로 보이므로, 이를 이용하여, M/G 서열이 교대로 있는 가닥 또는 단일한 G 잔기들을 함유하는 1차 구조를 가진 알지네이트 또는 알지네이트 올리고머를 만들 수 있다. 각각의 1차 구조들은 이들 효소의 여러가지 조합을 이용하여 수득할 수 있다.
이들 효소의 돌연변이된 버전이나 다른 유기체로부터 유래된 상동체도 사용가능할 것으로 특히 고려된다. WO 94/09124에는 예로 에피머라제의 여러가지 도메인이나 모듈을 코딩하는 DNA 서열이 섞이거나, 제거되었거나 또는 조합된 에피머라제 서열에 의해 코딩되는, 재조합 또는 변형된 만누로난 C-5 에피머라제 효소(AIgE 효소)가 개시되어 있다. 대안적으로, 천연 에피머라제 효소(AIgG 또는 AIgE)의 돌연변이, 예컨대 AIgG 또는 AIgE 유전자의 부위 특이적인 또는 랜덤 돌연변이 유발에 의해 수득되는 돌연변이도 사용할 수 있다.
다른 방법은, 돌연변이가 후속적인 알지네이트 올리고머 제조에 필수적인 구조의 알지네이트를 생산하거나, 또는 심지어 필수 구조 및 크기(또는 분자량)의 알지네이트 올리고머를 생산하도록, 에피머라제 유전자의 일부나 또는 전체를 돌연변이시킨 슈도모나스 및 아조토박터 유기체를 만드는 것이다. AIgG 돌연변이 유전자를 가진 여러가지 슈도모나스 플루오레센스 유기체를 제조하는 것은 WO 2004/011628와 Gimmestad, M., et al, 2003 (supra)에 상세하게 기술되어 있다. AIgE 유전자가 돌연변이된 다수의 아조토박터 비네란디이 유기체의 제조 방법은 Gimmestad, M., et al, 2006 (supra)에 기술되어 있다.
다른 방법은, 아조토박터나 슈도모나스 유기체로부터 내인성 에피머라제 유전자를 제거 또는 불활성화시킨 다음, 돌연변이되거나 또는 되지 않을 수 있으며(즉, 야생형이거나 변형된 형태일 수 있음), 예컨대 유도성 또는 다른 "조절가능한 프로모터"에 의해 발현을 조절할 수 있는, 하나 이상의 외인성 에피머라제 유전자를 도입하는 방법이다. 유전자들의 적합한 조합을 선택함으로써, 미리 결정된 1차 구조를 가진 알지네이트를 제조할 수 있다.
또다른 방법은, 슈도모나스 및/또는 아조토박터의 알지네이트 생합성 장치를 일부 또는 전부 알지네이트 비-생산 유기체(예, E. coli)에 도입하여, 유전자 변형된 이 유기체로부터 알지네이트의 생산을 유도하는 방법이 있을 수 있다.
이러한 배양-기반의 시스템을 이용하는 경우, 알지네이트 또는 알지네이트 올리고머의 1차 구조는 배양 조건에 영향을 받을 수 있다. 특정 유기체에 의해 생산되는 알지네이트의 1차 구조를 조작하기 위해, 온도, 삼투성, 영양 수준/소스 및 대기 파라미터 등의 배양 파라미터들을 조절하는 것은 당업자의 능력내에서 충분할 것이다.
"G 잔기/G" 및 "M 잔기/M" 또는 굴루론산 또는 만누론산, 또는 굴루로네이트 또는 만누로네이트는, 굴루론산/굴루로네이트 및 만누론산/만누로네이트(특히, α-L-굴루론산/굴루로네이트 및 β-D-만누론산/만누로네이트)와 같이 상호 호환적으로 사용되며, 추가적으로, 양이온성 마이크로/나노입자 또는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자의 전위를 향상시키는 능력 없이 하나 이상의 이용가능한 측쇄 또는 기가 변형된 그것의 유도체를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 비변형 올리고머보다 실질적으로 낮은 점액 층을 가로지르는 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이다. 일반적인 당 변형 기로는 아세틸, 설페이트, 아미노, 데옥시, 알코올, 알데하이드, 케톤, 에스테르 및 언하이드로 기가 있다. 또한, 알지네이트 올리고머는 화학적으로 변형하여, 하전된 기(예, 카르복시화된 또는 카르복시메틸화된 글리칸)를 첨가하고, 유연성(예, 페리오데이트 산화에 의해)을 변형할 수 있다. 당업자는 올리고당의 단당류 서브유닛에 행해질 수 있는 또 다른 화학적 변형을 숙지하고 있을 것이며, 이를 본 발명의 알지네이트 올리고머에 적용할 수 있을 것이다.
본 발명은 단일 알지네이트 올리고머 또는 여러가지 알지네이트 올리고머들의 혼합물(다중성/복합성(multiplicity/plurality))의 사용을 포괄한다. 즉, 예를 들어, 여러가지(예, 2 개 이상) 알지네이트 올리고머의 조합물이 사용될 수 있다.
보다 구체적인 구현예에서, 본 발명은 점막 표면에 투여될 때 치료 활성 분자에 대해 반응하거나 이에 의해 예방되는 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 갖는 알지네이트 올리고머와 함께 상기 치료 활성 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를, 상기 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 갖는 것으로 의심되거나 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층에 투여하는 단계; 또는
(b)(i) 상기 치료 활성 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 갖는 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
(b)(ii) 단계 (b)(i)에서 형성된 마이크로/나노입자를 상기 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 갖는 것으로 의심되거나 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층에 투여하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 점막 표면에 투여하였을 때 치료 활성 분자에 대해 반응하거나 이에 의해 예방되는 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 갖는 것으로 의심되거나 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층을
(i) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성되는 것으로서, 여기서 적어도 하나는 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 갖는 알지네이트 올리고머이고,
(ii) 상기 치료 활성 분자를 추가로 포함하는 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 선택적으로, 여기서 치료 활성 분자는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합된다.
본 발명은 또한 점막 표면에 투여하였을 때 치료 활성 분자에 대해 반응하거나 이에 의해 예방되는 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 갖는 알지네이트 올리고머를 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 갖는 알지네이트 올리고머와 함께 상기 치료 활성 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를, 상기 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 갖는 것으로 의심되거나 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층에 투여하는 단계; 또는
(b)(i) 상기 치료 활성 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 갖는 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
(b)(ii) 단계 (b)(i)에서 형성된 마이크로/나노입자를 상기 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 갖는 것으로 의심되거나 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층에 투여하는 단계.
본 발명은 또한 점막 표면에 투여하였을 때 치료 활성 분자에 대해 반응하거나 이에 의해 예방되는 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 갖는 알지네이트 올리고머를 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자를 제조하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 상기 알지네이트 올리고머이고, 상기 마이크로/나노입자는 치료 활성 분자를 추가로 포함하고, 선택적으로 여기서 치료 활성 분자는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합되는 단계 및
(b) 상기 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 갖는 것으로 의심되거나 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층에 단계 (a)에서 제조된 마이크로/나노입자를 투여하는 단계.
본 발명은 또한 전술된 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머의 용도를 제공한다. 특정 구현예에서, 약제는 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자 또는 본원에 기술된 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물로 형성된 마이크로/나노입자일 수 있다.
본 발명은 또한 전술된 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 치료 활성 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자의 용도를 제공한다. 특정 구현예에서, 약제는 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자 또는 본원에 기술된 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물로 형성된 마이크로/나노입자일 수 있다.
상기 발명의 보다 일반적인 구현예의 맥락에서 제시된 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 갖는 알지네이트 올리고머, 및/또는 치료적 양이온성 마이크로/나노입자의 용도에 관한 상기 기술된 특징, 특히 병용된 제품에 관한 것들은 바로 위에 기술된 본 발명의 보다 구체적인 구현예에 준용되며, 따라서 필요한 경우 그 섹션에서 기술된 특징 및 원리의 모든 조합은 적절한 적응과 함께 본원에서 적용될 수 있다.
치료 활성 분자는 약제 또는 약물로 지칭될 수 있거나, 예컨대 본원에 기술된 임의의 관심 치료 분자일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "병태"는 유전적 결함 또는 돌연변이로 인해, 또는 후천적 병태를 포함하여 임의의 다른 방식으로, 예컨대 환경 및/또는 병원체 노출로 인해 발생하는지 여부에 관계 없이 대상이 경험할 수 있는 임의의 해로운 생리학적 장애를 포함한다.
질환 또는 병태는, 예컨대 호흡기 질환 또는 병태, 감염, 과다증식 또는 신생물성 질환, 자가면역 질환 또는 염증성 장 질환일 수 있다.
호흡기 질환 또는 병태는 폐쇄성 호흡기 질환일 수 있으며, 보다 특히, 호흡기 병태는 만성 염증 상태, 기도 리모델링 및/또는 호흡기 감염으로 인한 악화를 특징으로 하는 것일 수 있다. 이러한 장애는 COPD(및 이의 하위 유형인 만성 기관지염 및 폐기종), 기관지 확장증, 특발성 폐섬유증, 원발성 섬모 운동 이상증, 폐렴, 천식, 및 만성 부비동염을 포함할 수 있다. 이러한 장애는 또한 CFTR 기능부전으로부터 발생하거나 이와 관련된 병태, 예컨대 낭포성 섬유증, non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성, 호흡기의 비정상적인 점액 제거 및/또는 만성 미립자 흡입으로 인한 호흡 곤란, 및/또는 만성 염증성 호흡기 장애, 예컨대 COPD(및 이의 하위 유형인 만성기관지염 및 폐기종), 기관지 확장증, 천식 및/또는 만성 부비동염을 포함할 수 있다. 이러한 장애는 또한 담배 흡연자 및 미립자 자극제, 예컨대 연기 입자(담배, 나무 등), 오염, 먼지 (석면, 면화, 석탄, 돌, 동물 배설물 등) 및 포자의 만성 흡입에 노출된 다른 대상의 점액 정체 및 호흡 곤란을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 병태는 상기 열거된 병태의 점액-관련 합병증일 수 있다.
만성 폐색성 폐 질환(COLD) 및 만성 폐색성 기도 질환(COAD)으로도 공지된 COPD는 기도가 이완되지 않는 만성 염증, 만성적인 공기 흐름 불량 및 객담 과다 생성을 특징으로 하는 만성 폐색성 폐 질환을 지칭하는 총괄적인 용어이다. 일반적으로 만성 기관지염(기관지의 점막 염증) 및 폐기종(폐 조직의 파열, 특히 폐포의 파열)의 병태들이 COPD의 하위 유형으로 인식된다. COPD는 통상적으로 기관지 확장제의 투여에 의해 개선되지 않는 만성적인 폐 기능 불량 및 만성적인 젖은 기침을 수반하는 만성적으로 불량한 폐 기능으로서 진단된다. 예컨대, MRI 및 고해상 컴퓨터 토모그라피(HRCT)를 이용한 흉부 촬영으로 COPD의 특징적인 생리학적 증상을 또한 확인할 수 있으며, 다른 호흡 병태들을 제외시킬 수 있다.
COPD에서 관찰되는 객담 생성 증가 및 CF 점액과 유사한 특징은, 전술한 CF에서 관찰되는 호흡기 합병증들이 COPD 환자들에서 공통적이며, 특히 이들 합병증이 기도의 감염과 관련있음을 의미한다.
기관지 확장증은 염증 반응의 결과로서 기관지의 만성적인 비대 및 후속적인 파열, 기관지확장제 투여에 의해 개선될 수 있는 만성적인 폐 기능 불량 및 만성적인 젖은 기침이 특징적인 질환이다. 질환의 비대된 기관지 특징을 확인하기 위해, 진단은 일반적으로 폐 기능 검사와 예를 들어 MRI 및 고해상 컴퓨터 토모그라피(HRCT)를 이용한 흉부 촬영술을 토대로 한다.
기관지 확장증에서 관찰되는 객담 생성 증가 및 CF 점액과 유사한 특징은, 전술한 CF에서 관찰되는 호흡기 합병증들이 기관지 확장증 환자들에서 공통적이며, 특히 이들 합병증이 기도의 감염과 관련있음을 의미한다.
특발성 폐섬유증은 폐 기능의 점진적이고 비가역적인 감소를 특징으로 한다. 합병증으로는 심부전, 폐 고혈압, 폐렴 및 폐색전증을 포함한다. 특발성 폐섬유증과 관련된 기도의 만성 염증 과정 및 조직 리모델링은 아래 논의된 바와 같이 CF에서 관찰되는 호흡기 합병증이 특발성 폐섬유증을 가진 대상에서 나타날 수 있음을 의미한다.
만성 부비동염은 3달 이상의 장기간 동안 부비동에 염증이 있는 질환이다. 이 염증의 원인은 감염, 알레르기(통상적으로, 먼지, 오염물질, 꽃가루, 포자 및 미생물 등의 미립자에 대한 알레르기) 또는 자가면역 반응일 수 있다. 염증은 점액 생성 증가 및 부비강 분비 이상과 2차 박테리아 감염으로 이어지며, 이는 염증 반응을 더욱 악화시킨다. 즉, 만성 부비동염 환자의 부비강 점액이 CF 점액과 유사한 특징을 가지고 있는데, 이는 전술한 바와 같이 CF에서 관찰되는 호흡기, 특히 부비동 합병증들이 만성 부비동염 환자에서 공통적이라는 것을 의미한다. 만성 부비동염에 대한 진단은 일반적으로 코 내시경을 통해 검증한다.
만성 부비동염 환자의 부비강 점액이 CF 점액과 유사한 특징을 가지고 있는데, 이는 하기와 같이 CF에서 관찰되는 호흡기, 특히 부비동 합병증들이 만성 부비동염 환자에서 공통적이라는 것을 의미하며, 특히 기도 감염과 관련된 합병증임을 의미한다.
천식은 기도, 주로 세기관지를 둘러싼 평활근의 타이트닝(tightening)으로 인한 일시적인 기관지 수축으로 인해 급작스러운 공기 흐름 폐쇄 현상으로서 나타나는, 만성 기도 질환이다. 이러한 악화는 종종 외부 자극에 의해 노출되어 유발된다. 기관지 염증은 또한 조직 팽창과 부종을 유도하여, 추가적인 폐쇄를 야기한다. 기관지 수축 및 기도 폐쇄 현상의 명백한 발생은 흉터 발생 및 염증으로 인한 기도 비후화 및 리모델링, 그리고 과도하게 발달된 점액 분비선과 같은 만성적인 증상들의 근원이 된다.
객담 생성 증가 등의, 장기간의 천식으로 인한 기도의 만성적인 염증 과정과 조직 리모델링은, 하기 CF에서 관찰되는 호흡기 합병증들이 천식 환자들에서도 나타날 수 있으며, 특히 합병증이 기도의 감염과 관련있다는 것을 의미한다.
낭포성 섬유증은, 비정상적인 물성, 전형적으로 증가된 점성을 가지되, 점액의 경우 점막 표면의 상피에 대한 부착성을 가진, 폐, 췌장 및 간 유래 점액 및/또는 외분비 분비물이 특징적인 인간 질환이다. 이들 기저 요인은 다른 병태들 중에서도 특히 호흡 곤란, 호흡기 감염(만성 및 급성, 예를 들어 폐 또는 기관지의 감염), 호흡기 염증(예, 기관지 염증(감염이 원인인 경우에는 기관지염이라 함) 또는 폐 염증/폐렴(감염이 원인인 경우에는 폐렴이라 함)), 폐 고혈압, 심부전, 호흡 부전, 폐 리모델링, 부비동 감염, 부비동염(급성, 아급성 및 만성), 안면 통증, 두통, 비정상적인 비강 배액, 딱딱한 변, 변비, 장 폐색, 영양소 흡수 장애, 췌장 염증, 췌장염, 당뇨병, 담석, 간경변 및 불임을 유발한다. 특히, 폐에서는 항생제에 대한 반응성 감소도 나타난다. 비정상적인 점액 및 외분비 분비물은, 상피 막을 통해 클로라이드와 바이카보네이트 이온을 수송하여 나트륨과 같은 다른 이온들의 균형을 조절하는 단백질의 능력에 영향을 미치는, CFTR의 돌연변이에 의해 발생한다. 이러한 CFTR 돌연변이들이 다수 동정되고 있으며, 그 일부는 특히 CF 표현형을 더 강화한다. 따라서, 대상이, 전술한 병태들 중 하나 이상, 바람직하게는, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상 또는 전부, 비정상적인 점액(예컨대 일부의 경우 적어도 하나의 점막 표면에서 상피에 부착될 수 있는 밀도가 높고, 다루기 힘든 점액), 과점성의 객담 또는 기타 분비물 및/또는 외분비 분비물 및 자신의 CFTR 유전자 각각에서의 돌연변이를 가지고 있다면, 그 대상은 CF를 앓는 것으로 간주될 수 있다.
편리하게는, CF는 "발한 검사"로 진단할 수 있다. 이 검사는 당해 기술 분야의 당업자에게 익숙한 일반적인 검사이다. 간략하게는, 필로카르핀을 피부 위에 배치하고, 전기 전류에 의해 흡수를 유도한다. 필로카르핀에 반응하여 처리부위에서 분비되는 땀을 수집(예컨대 필터 페이퍼 한장에 흡수시킴)한 다음 이의 염 함량을 분석한다. CF를 가진 개체는 염 농도가 정상치 보다 1.5 내지 2배 높을 것이다. 보다 구체적으로, 6 개월 이하의 신생아의 경우, 염소 농도 29 mmol/L 이하는 CF 가능성이 매우 낮다는 것을 의미하며; 30 ~ 59 mmol/L은 CF 가능성 있음을 의미하며; 60 mmol/L 이상은 CF 가능성 높음을 의미한다. 6 개월 경과한 개체의 경우, 염소 농도 39 mmol/L 이하는 CF 가능성이 매우 낮다는 것을 의미하며; 40 ~ 59 mmol/L은 CF 가능성 있음을 의미하며; 60 mmol/L 이상은 CF 가능성 높음을 의미한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 치료를 적용할 신생아 대상(6 개월 이하)은 땀내 염소 농도가 25 mmol/L 초과, 바람직하게는 29 mmol/L 초과, 35 mmol/L 초과, 40 mmol/L 초과, 45 mmol/L 초과, 50 mmol/L 초과, 55 mmol/L 초과 또는 60 mmol/L 초과일 것이며, 그외 환자들은 모두 땀내 염소 농도가 35 mmol/L 초과, 바람직하게는 39 mmol/L 초과, 45 mmol/L 초과, 50 mmol/L 초과, 55 mmol/L 초과 또는 60 mmol/L 초과일 것이다.
CFTR 기능부전은 CF 이외의 다른 병태들에서도 기저 요인으로 간주되어 왔다. 이러한 기능부전은 돌연변이 CFTR 대립유전자 중 하나를 통해 유전되거나, 또는 예를 들어 미립자(특히, 담배 연기 및 나무 연기)의 장기간 흡입 및 호흡기의 만성 염증(예, COPD 및 이의 서브타입 CB, 폐기종, 기관지 확장증 및 만성 부비동염)으로 인해 후천적으로 발병할 수 있다.
non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성은, CFTR 대립유전자 하나는 발현되는 단백질의 세포 표면 이온 채널 활성 및/또는 세포내 과정에 영향을 미치는 돌연변이를 가지고 있지 않고, 다른 하나는 발현되는 단백질의 세포 표면 이온 채널 활성 및/또는 세포내 과정에 유해한 돌연변이를 가지고 있는 대상에서의, 임상 병태(clinical condition)를 지칭한다. 이러한 대상은 CF의 다양한 합병증 중 몇몇이 임의의 어느 시점에 명확하게 보이는 한 상기 정의된 바와 같이 명백한 CF를 나타내지는 않지만, 이형접합성 대상은 때때로 CF를 특징인 비정상적인 점액을 적어도 경증으로 가지고 있을 것이며, 따라서 CF로 명확하게 진단될 만큼 충분히 중증인 것은 아니지만 CF 합병증 또는 합병증들을 경증인 형태로 나타낼 수 있다. 구체적으로, CFTR 이형접합성인 대상은 재발성 "특발성" 췌장염, 선천성 양측 정관 부전증, 만성 부비동염 및 특발성 기관지 확장증을 가지고 있는 것으로 관찰되지만, 이들 환자에는 본원에 언급된 임의의 CF 합병증도 존재할 수 있다.
CF 발한 검사를 이용해, non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성으로 의심되는 환자를 동정할 수 있는데, 이들 환자는 땀내 염소 농도가 "가능성 거의 없음" 및 "가능성 있음" 범위에 해당될 것이다. 신생아 환자(6 개월 이하)의 경우, 땀내 염소 농도는 25 mmol/L 초과, 바람직하게는 29 mmol/L 초과, 35 mmol/L 초과, 40 mmol/L 초과, 45 mmol/L 초과, 50 mmol/L 초과, 55 mmol/L 초과이되 60 mmol/L 미만일 수 있으며, 그외 환자들은 모두 땀내 염소 농도가 35 mmol/L 초과, 바람직하게는 39 mmol/L 초과, 45 mmol/L 초과, 50 mmol/L 초과, 55 mmol/L 초과이되 60 mmol/L 미만일 것이다. 이후 의심 환자를 유전자 검사하여 진단을 검증할 수 있다.
CFTR 기능부전은 또한 문헌(예컨대 De Boeck, K., et al, Journal or Cystic Fibrosis, 2011, Vol 10 (Suppl 2), S53-S66)에 기술된 바와 같이, 직장 생검에 대한 장 전류 측정(ICM) 또는 생체 내 비강 전위차(NPD) 측정을 수행하여 직접 평가될 수 있다. 시험 대상의 결과와 정상 대상 대조군의 결과를 비교하면 CFTR 기능부전의 징후를 제공한다. 실시예에서 보다 구체적으로 기술되는 바와 같이, 이온 채널 조절제인 인도메타신, 아밀로리드, 포스콜린/IBMX, 제니스테인, 카바콜 및 히스타민에 대한 전장 생검의 순차적 노출은 ICM 동안 CFTR 활성의 단리를 가능케 한다.
또한, 미립자 자극제, 예컨대 연기 입자(담배, 목재 등), 오염, 먼지(석면, 면화, 석탄, 돌, 동물 배설 등) 및 포자의 흡입은 CFTR 이온 수송 활성의 억제 및/또는 상피 세포 표면으로부터 CFTR의 내재화 촉진을 통해 CFTR 이온 채널 기능에 결함을 야기할 수 있는 것으로 (따라서 CFTR 기능부전을 야기할 수 있는 것으로) 알려져 있다. 장기간에 걸쳐 노출되면 CF의 특징적인 점액이 형성되어 만성 염증성 호흡기 장애의 명백한 증상을 나타내지 않는 대상에서 비정상적인 점액 제거 및/또는 호흡 곤란을 초래할 수 있다. 이러한 대상에서 나타나는 비정상적인 점액 제거(또는 점액 정체)는 전술된 바와 같이 CF에서 관찰된 호흡기 합병증, 특히 기도의 감염 및 염증과 관련된 합병증이 이러한 대상, 예컨대 흡연자에서 흔함을 의미한다.
본 발명의 방법 및 의학적 용도는 또한 전술된 병태를 가진 환자에서 CFTR 기능부전과 관련되거나 이로부터 발생하는 전술된 병태의 합병증(특히 점액-관련 합병증)을 치료하는 방법, 또는 의학적 용도로 간주될 수 있으며, 여기에는 병태의 추가 합병증의 발달 또는 발병을 예방, 감소 또는 지연하거나 CFTR 기능부전을 가진 환자가 병태의 추가 합병증을 발달시키거나 획득할 위험을 감소시키는 것을 포함한다. 특히, 이는 위에 언급하거나 논의된 임의의 병태, 예컨대 CF, non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성, 호흡기의 비정상적인 점액 제거 및/또는 만성 미립자 흡입으로 인한 호흡 곤란, 및/또는 만성 염증성 호흡기 장애, 예컨대 COPD, CB, 폐기종, 기관지 확장증, 천식 및/또는 만성 부비동염에 적용된다.
이러한 합병증은 다음의 섹션에서 언급되는 것들 중 임의의 것일 수 있다. 편의상, 다음의 이러한 병태는 CFTR기능부전-관련 병태를 참조하여 표현되지만, 문맥이 허용되는 경우, 이러한 용어는 상기 목록에 열거된 임의의 병태, 예컨대 상기 열거된 바와 같이 CF, non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성 등과 관련된 병태(또는 합병증)로서 해석될 수 있다. 따라서, 이러한 병태(합병증)은 CFTR 기능부전-관련 호흡기 병태(예컨대 호흡기 감염, 호흡기 염증, 호흡 곤란, 호흡 부전 및 폐 리모델링), CFTR 기능부전-관련 심혈관 병태(예컨대 폐 고혈압 및 심부전); CFTR 기능부전-관련 부비동 병태(예컨대 부비동 감염, 안면 부비동 통증, 두통, 비정상적인 비강 배액, 비강 폴립); CFTR 기능부전-관련 위장관 병태(예컨대 변비, 장 폐색(예컨대 신생아 대상에서의 태변 장폐색 및 노인 환자의 장 중첩 및 DIOS), 영양소 흡수 장애); CFTR 기능부전-관련 췌장 병태(예컨대 췌장관 폐색, 영양소 흡수 장애, 췌장 염증, 췌장염(급성 및 만성), 당뇨병); CFTR 기능부전-관련 간 병태(예컨대 담관 폐색, 담석, 간경변); 및 CFTR 기능부전-관련 불임일 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 CFTR 기능부전을 퇴치하고 알지네이트 올리고머 및 CFTR 조절제를 사용하여 대상에서 보다 정상적인 점액 표현형을 회복함으로써 CFTR 기능부전-관련 병태의 발달, 예컨대 감염 및/또는 염증(특히 호흡기, 위장관, 췌장 및/또는 간에서)을 피할 수 있도록(즉, 감소 또는 예방) 하므로, 예방적으로도 유용하다.
보다 일반적으로, 본 발명은 상기 언급된 CFTR 기능부전-관련 병태를 치료하는 방법, 또는 의학적 용도로 간주될 수 있다. CFTR 기능부전-관련 폐, 위장관, 췌장 및 간 병태(예컨대 상기 명시된 것들)의 치료가 바람직하다.
전술된 호흡기 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증의 치료 또는 예방에서, 치료 활성제는 CFTR 조절제, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역자극제, 코르티코스테로이드, 비-스테로이드계 항염증제(NSAID), 기관지 확장제, 또는 경구 항당뇨병제, 예컨대 위에 개시된 임의의 것들, 펩티드 호르몬, 사이토카인, 펩티드 성장 인자, 펩티드 항원 또는 이러한 질환 또는 병태의 유전적 매개자의 유전자 치료, 유전자 편집, RNA 간섭 치료(예컨대 siRNA 또는 miRNA), 안티센스 요법 또는 시험관 내 전사된 mRNA (IVT-mRNA) 요법에서 사용하기 위한 핵산일 수 있다. 특히, 핵산은 기능적인 CFTR 단백질을 코딩할 수 있다.
질환 또는 병태는 감염, 예컨대 박테리아, 진균 또는 바이러스 감염, 특히 호흡계, 예컨대 하기도(예컨대 기관지 또는 폐) 감염일 수 있다. 감염은 만성 감염일 수 있다. 이러한 감염은 감염/염증이 임의의 감염원, 예컨대 박테리아, 진균, 바이러스 또는 기생충에 의해 유발될 수 있지만, 통상적으로 스타필로코쿠스 아우레우스, 헤모필루스 인플루엔자, 슈도모나스 에루기노사, 마이코박테리움 애비움 복합체, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(폐결핵의 원인균) 및 아스퍼질러스 푸미가투스에 의해 유발될 수 있다. 이미 언급한 것들 외에도, 호흡기에서 발견되는 통상적인 감염원은, 비제한적으로 클라미도필라 폐렴, 보르데텔라 백일해, 마이코플라즈마 폐렴, 모락셀라 카타랄리스, 레지오넬라 뉴모필라, 스트렙토코쿠스 폐렴, 클라미디아 시타시, 콕시엘라 부르네티, 리노바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 아데노바이러스, 메타뉴모바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 히스토플라즈마 캡슐라텀, 크립토코쿠스 네오포만스, 뉴모시스티스 지로베시, 코시디오이데스 이미티스, 톡소플라즈마 곤디, 스트롱길로이데스 스테코랄리스, 아스카리스 룸브리코이데스, 및 플라즈모디움 말라리아를 포함한다.
추가의 구현예에서, 감염은 상기도 예컨대 코, 비강, 인두, 후두 및 기관에 있을 수 있다. 따라서, 질환 또는 병태는 비염, 코인두염(nasopharyngitis), 비인두염(rhinopharyngitis), 인두염, 후두개염, 성문상부염, 후두염, 후두기관염, 기관염 또는 편도염일 수 있다. 이러한 병태는 종종 상부 호흡기 감염으로 집합적으로 지칭되고 전술된 임의의 감염원에 의해 야기될 수 있다.
특정 구현예에서, 감염은 CFTR 기능부전을 가진 대상에서 일 수 있다.
전술된 감염의 치료 또는 예방에서, 치료 활성제는 CFTR 조절제, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역자극제, 코르티코스테로이드, 비-스테로이드계 항염증제(NSAID), 또는, 기관지 확장제, 예컨대 위에 개시된 임의의 것들, 펩티드 호르몬, 사이토카인, 펩티드 성장 인자, 펩티드 항원 또는 이러한 감염의 유전적 매개자의 유전자 치료, 유전자 편집, RNA 간섭 치료(예컨대 siRNA 또는 miRNA), 안티센스 요법 또는 시험관 내 전사된 mRNA (IVT-mRNA) 요법에서 사용하기 위한 핵산일 수 있다. 특히, 핵산은 기능적인 CFTR 단백질을 코딩할 수 있다.
과증식성 또는 신생물성 질환 또는 병태는 임의의 악성, 전-악성 또는 비-악성(양성) 신생물 개체에 의해 유발된 임의의 질환 또는 병태일 수 있다. 따라서, 상기 용어는 특히 암, 종양, 악성종양, 육종, 암종, 생식종, 림프종, 백혈병, 모세포종, 유두종, 및 선종을 포함한다. 이러한 다양한 구현예에서, 과증식성 또는 신생물성 질환 또는 병태는 직장결장암(대장암, 직장암, 또는 장암으로도 공지됨), 전립선암, 콩팥(신장)암 (예컨대 윌름 종양), 췌장암, 고환암, 피부암(예컨대 멜라노마 및 비-멜라노마(예컨대 기저세포암, 편평세포암)), 유방암, 난소암, 위(위장)암, 장암(예컨대 십이지장암, 회장암, 공장암, 소장암), 간(간)암, 폐(폐)암, 식도암, 구강암, 인후암, 뇌암(예컨대 교모세포종, 수모세포종), 부신암(예컨대 부신피질암), 갑상선암(예컨대 역형성 갑상선 암종), 자궁암(예컨대 자궁암 육종), 혈액암(혈액 악성 종양(haematological malignancies)으로도 공지됨)(예컨대 조혈 및 림프암 악성종양, 예컨대 백혈병, 림프종 및 골수종), 이들의 전이 형태 포함, 및 이들의 해부학적 부위의 비-악성 신생물 또는 종양(예컨대 결장직장 용종, 모낭종, 혈관종, 골종, 연골종, 지방종, 섬유종, 림프관종, 평활근종, 횡문근종, 성상세포종, 수막종, 신경절 신경종, 유두종, 선종)으로부터 선택될 수 있다.
전술된 과증식성 또는 신생물성 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증의 치료 또는 예방에서, 치료 활성제는 세포독성 화학요법제, 신생혈관 억제제, 항암 단클론 항체, 방사선면역치료제, 면역자극제, 면역억제제, 코르티코스테로이드, 또는 방사성의약품, 예컨대 전술된 것들 중 임의의 하나, 펩티드 호르몬, 사이토카인, 펩티드 성장 인자, 펩티드 항원 또는 이러한 감염의 유전적 매개자, 예컨대 종양 유전자, 신생혈관생성 인자의 종양 억제 유전자의 유전자 치료, 유전자 편집, RNA 간섭 치료(예컨대 siRNA 또는 miRNA), 안티센스 요법 또는 시험관 내 전사된 mRNA (IVT-mRNA) 요법에서 사용하기 위한 핵산일 수 있다.
자가면역 질환은 에디슨병, 용혈성 자가면역 빈혈, 항-사구체 기저막 질환, 항-호중구 세포질 항체-관련 혈관염, 항인지질 증후군, 관절염, 청소년 류마티스 관절염, 펠티 증후군, 류마티스 혈관염, 쇼그렌 증후군, 스틸병, 항-n-메틸-d-아스파테이트 수용체 뇌염, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 중증 근무력증, 다발성 신경근병증, 갈랭-바레 증후군, 강직-인간 증후군, 포도막수막염 증후군, 중추 신경계 혈관염, 자가면역 뇌하수체염, 자가면역성 림프증식 증후군, 포진성 피부염, 제1형 당뇨병, 사구체신염, 그레이브스병, 자가면역성 간염, 선상 IgA 수포성 피부병, 전신 홍반성 루프스, 교감성 안염, 자가면역성 다발내분비장애, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 자가면역성 갑상선염, 미세장염(교원성 대장염 및 림프구성 대장염), 전환성 대장염 또는 베체트병일 수 있다.
전술된 자가면역 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증의 치료 또는 예방에서, 치료 활성제는 면역억제제, 코르티코스테로이드, 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID) 또는 경구 항당뇨 약물, 예컨대 전술된 것들 중 임의의 하나, 사이토카인, 성장 인자, 펩티드 호르몬, 또는 이러한 질환 또는 병태의 유전적 매개자의 유전자 치료, 유전자 편집, RNA 간섭 치료(예컨대 siRNA 또는 miRNA), 안티센스 요법 또는 시험관 내 전사된 mRNA (IVT-mRNA) 요법에서 사용하기 위한 핵산일 수 있다.
염증성 장 질환은 궤양성 대장염, 크론병, 미세 장염(교원성 대장염 및 림프구성 대장염), 전환성 대장염 또는 베체트병일 수 있다.
전술된 염증성 장 질환의 치료 또는 예방에서, 치료 활성제는 항생제, 면역자극제, 면역억제제, 코르티코스테로이드, 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID), 예컨대 전술된 것들 중 임의의 하나, 사이토카인, 성장 인자, 펩티드 호르몬, 또는 이러한 질환 또는 병태의 유전적 매개자의 유전자 치료, 유전자 편집, RNA 간섭 치료(예컨대 siRNA 또는 miRNA), 안티센스 요법 또는 시험관 내 전사된 mRNA (IVT-mRNA) 요법에서 사용하기 위한 핵산일 수 있다.
본 발명에 따른 대상에서 질환 또는 의학적 병태의 치료와 관련하여 일반적으로 사용되는 "치료"는 본원에서 광의적으로 임의의 치료 효과, 즉, 질환 또는 병태에 대한 임의의 유익한 효과를 포함하는 것으로 사용된다. 따라서, 질환 또는 병태의 근절 또는 제거, 또는 대상의 치유뿐만 아니라, 대상의 질환 또는 병태 개선도 포함한다. 따라서, 예컨대 질환 또는 병태의 임의의 증상 또는 징후의 개선, 또는 질환/병태의 임상적으로 허용되는 지표의 개선이 포함된다. 따라서 치료는 예컨대 이미 존재하거나 진단된 질환/병태의 치유 및 완화 요법 둘 모두, 즉, 반응 치료를 포함한다.
"예방"은 본원에서 일반적으로 임의의 예방 또는 방지 효과를 지칭한다. 따라서 이는 예컨대 예방적 치료 전의 질환 또는 병태 또는 증상 또는 징후와 관련하여 질환 또는 병태, 또는 질환 또는 병태의 발병, 또는 이의 하나 이상의 증상 또는 징후의 지연, 제한, 감소 또는 예방하는 것을 포함한다. 예방은 따라서 질환 또는 병태, 또는 이들의 증상 또는 징후의 발생 또는 발달의 절대적인 예방, 및 질환 또는 병태 또는 증상 또는 징후의 발병 또는 발달의 임의의 지연, 또는 질환 병태 또는 증상 또는 징후의 발달 또는 진행의 감소 또는 제한 둘 모두를 명시적으로 포함한다.
CF 및 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성 및 이들의 합병증으로부터 또는 이들과 관련하여 발생하는 병태 또는 장애의 보다 구체적인 맥락에서, 이러한 질환은 본 발명의 치료를 받는 시기에 대상에서 나타나는 CF- 및 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 및 병태만을 수집함으로써 각각의 대상에서 특정된 유전 질환이기 때문에, 용어 "CF 치료" 및 "non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성 치료"는 대상의 장애 및 병태들 중 임의의 것 또는 전부에 대한 치료, 이들의 합병증, 또는 이의 서브세트의 치료로 간주할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의해 제공되는 특정 치료는 CF 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성의 기저 유전 결함을 교정하는 것은 아니지만, 본 발명은 그러한 결함으로 기인한 체내 영향에 대한 치료, 예컨대 이의 영향의 완화, 예컨대 비정상적인 점액으로 인한 영향의 완화에 관한 것이며, 관련 장애 또는 병태의 치료, 그리고 또한 장애 또는 병태에 대한 임상적인 영향 개선 또는 대상의 전체적인 웰빙 개선에 관한 것이다.
이러한 맥락에서, CF 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성의 "치유(cure)"는, 본 발명의 치료 실시시 대상에서 나타나는 다양한 CF- 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 및 병태들의 완전한 완화에 해당될 것이지만, 질병에 대한 유전적 토대 (CFTR 돌연변이)는 여전히 남아있을 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 맥락에서의 "치료"는 상기한 "치유"를 요구하는 것은 아니며, 전술한 바와 같이 신체에 대한 CF 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성으로 인한 임의의 영향에 대한 개선을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 대상에서 CF- 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 또는 병태의 임의 증상 또는 징후, 또는 CF- 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 또는 병태의 모든 임상적으로 용인되는 징후에 대한 개선(예컨대, 폐의 점막섬모 청소 증가, 변비 발생 감소, 영양 흡수 개선 및 의약품 및 영양소 또는 소화 효소 보충제의 생체이용률 증가, 이는 특정 구현예에서 항생제애 대한 폐 감염의 반응성 증가 및 소화기 건강 개선으로 나타날 수 있음)을 포함한다. 이러한 맥락에서, 이는 기-존재하는 CF- 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 또는 병태의 완전한 소멸, 또는 새로운 CF- 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 또는 병태의 발병의 완전한 중단일 수 있지만, 치료는, 표적 CF- 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 또는 병태가 완전히 해결되는 수준으로 또는 적어도 어느 정도, 바람직하게는 대상에 허용가능한 정도로 이들 과정을 저해하기에 충분한 것일 수 있다. 따라서, 치료는, 예를 들어, 기-존재하거나 또는 진단된 CF- 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 또는 병태에 대한 치유적 치료 및 완화 치료, 즉 반응성 치료(reactionary treatment)를 포함한다.
CF 및 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성의 맥락에서 "예방"은 따라서 기저 유전적 결함의 결과, 또는 비정상적인 점액의 결과로 발생하는 신체의 영향을 예방하는 것에 관한 것이다. 이러한 맥락에서, 이러한 질환은 본 발명의 치료를 받는 시기에 대상에서 나타나는 CF- 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 및 병태만을 수집함으로써 각각의 대상에서 특정된 유전 질환이기 때문에, 용어 "CF 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성 또는 CF- 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 또는 병태의 예방"은 대상이 아직 획득하지 않았거나 대상이 이전에 획득했지만 청구된 치료를 받기 이전에 극복한 임의의 CF- 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성-관련 장애 또는 병태 또는 이들의 합병증의 예방으로 간주될 수 있다.
예방은 상기 정의된 바와 같은 CFTR 이온 채널 기능부전으로부터 또는 이와 관련되어 발생하는 병태의 영향 또는 이의 증상 또는 징후의 발생 또는 발달의 절대적인 예방, 및 상기 정의된 바와 같은 CFTR 기능부전으로부터 또는 이와 관련되어 발생하는 병태의 영향, 또는 이들의 증상 또는 징후의 발병 또는 발달의 임의의 지연, 또는 상기 정의된 바와 같은 CFTR 기능부전으로부터 또는 이와 관련된 병태, 또는 이의 증상 또는 징후의 발달 또는 진행의 감소 또는 제한 둘 모두를 명시적으로 포함한다. 예방적 치료는 또한 상기 정의된 바와 같은 CFTR 기능부전으로부터 또는 이와 관련된 병태, 또는 이의 증상 또는 징후를 환자가 획득 또는 발달할 위험을 감소시키는 치료로서 간주될 수 있다.
다른 구현예에서, 치료는 유전적(핵산) 수준에서 작용하므로 CF 또는 non-compound CFTR 유전자 돌연변이 이형접합성의 기저 유전 결함의 교정을 처리할 수 있다. 이러한 맥락에서, "치료" 및 "예방"은 상기 설명한 바와 같이 이의 보다 일반적인 사용에 따라 해석될 수 있다.
유전적인 원인이 있는 기타 질환 또는 병태, 예컨대 신생물성 질환의 치료 또는 예방이 유사하게 해석될 수 있다.
보다 구체적인 구현예에서, 본 발명은 질환 또는 병태를 진단, 예후 또는 모니터링하는 방법을 제공하며, 그 특징은 점막 표면에 투여될 때 진단적으로 유효한 지표 분자에 의해 결정될 수 있으며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 앓고 있을 것으로 의심되거나 이의 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층에 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머와 함께 상기 진단적으로 유효한 지표 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 투여하는 단계; 또는
(b)(i) 상기 진단적으로 유효한 지표 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
(b)(ii) 단계 (b)(i)에서 형성된 마이크로/나노입자를 상기 질환 또는 병태를 앓고 있는 것으로 의심되거나 이의 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층에 투여하는 단계, 및
(c) 질환 또는 병태의 특성을 나타내는 진단적으로 유효한 지표 분자로부터 직접적으로 또는 간접적으로 신호를 검출하는 단계로서,
여기서 상기 신호 특성은 대상이 상기 질환 또는 병태를 앓고 있는지 여부, 대상에서 질환 또는 병태의 상태, 대상이 질환 또는 병태를 발달시킬 위험, 또는 대상에서 질환 또는 병태 진행 위험을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 질환 또는 병태를 진단, 예후 또는 모니터링하는 방법을 제공하며, 그 특징은 점막 표면에 투여될 때 진단적으로 유효한 지표 분자에 의해 결정될 수 있으며, 상기 방법은 상기 질환 또는 병태를 앓고 있을 것으로 의심되거나 이의 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층을
(i) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성되는 것으로서, 여기서 적어도 하나는 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머이고,
(ii) 상기 진단적으로 유효한 지시제를 추가로 포함하는 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 선택적으로 여기서 진단적으로 유효한 지시제는 하나 이상의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분과 공유결합되어 있는 단계, 및
(iii) 질환 또는 병태의 특징을 나타내는 진단적으로 유효한 지표 분자로부터 직접적으로 또는 간접적으로 신호를 검출하는 단계로서,
여기서 상기 신호 특성은 대상이 상기 질환 또는 병태를 앓고 있는지 여부, 대상에서 질환 또는 병태의 상태, 대상이 질환 또는 병태를 발달시킬 위험, 또는 대상에서 질환 또는 병태 진행 위험을 나타낸다.
본 발명은 또한 질환 또는 병태를 진단, 예후 또는 모니터링하는 방법에 사용하기 위한, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머를 제공하며, 그 특징은 점막 표면에 투여될 때 진단적으로 유효한 지표 분자에 의해 결정될 수 있으며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 질환 또는 병태 또는 이들의 합병증을 앓고 있을 것으로 의심되거나 이의 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층에 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머와 함께 상기 진단적으로 유효한 지표 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 투여하는 단계; 또는
(b)(i) 상기 진단적으로 유효한 지표 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
(b)(ii) 단계 (b)(i)에서 형성된 마이크로/나노입자를 상기 질환 또는 병태를 앓고 있는 것으로 의심되거나 이의 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층에 투여하는 단계, 및
(c) 질환 또는 병태의 특성을 나타내는 진단적으로 유효한 지표 분자로부터 직접적으로 또는 간접적으로 신호를 검출하는 단계로서,
여기서 상기 신호 특성은 대상이 상기 질환 또는 병태를 앓고 있는지 여부, 대상에서 질환 또는 병태의 상태, 대상이 질환 또는 병태를 발달시킬 위험, 또는 대상에서 질환 또는 병태 진행 위험을 나타낸다.
본 발명은 또한 질환 또는 병태를 진단, 예후 또는 모니터링하는 방법에 사용하기 위한, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머를 제공하며, 그 특징은 점막 표면에 투여될 때 진단적으로 유효한 지표 분자에 의해 나타날 수 있으며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자를 제조하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 상기 알지네이트 올리고머이고, 상기 마이크로/나노입자는 진단적으로 유효한 지시제를 추가로 포함하고, 선택적으로 여기서 진단적으로 유효한 지시제는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합되는 단계 및
(b) 상기 질환 또는 병태를 앓고 있을 것으로 의심되거나 이의 위험이 있는 대상의 점막 표면의 점액 층에 단계 (a)에서 제조된 마이크로/나노입자를 투여하는 단계, 및
(c) 질환 또는 병태의 특성을 나타내는 진단적으로 유효한 지표 분자로부터 직접적으로 또는 간접적으로 신호를 검출하는 단계로서,
여기서 상기 신호 특성은 대상이 상기 질환 또는 병태를 앓고 있는지 여부, 대상에서 질환 또는 병태의 상태, 대상이 질환 또는 병태를 발달시킬 위험, 또는 대상에서 질환 또는 병태 진행 위험을 나타낸다.
본 발명은 또한 전술된 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머의 용도를 제공한다. 특정 구현예에서, 약제는 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자 또는 본원에 기술된 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물로 형성된 마이크로/나노입자일 수 있다.
본 발명은 또한 전술된 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 진단적으로 유효한 지표 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자의 용도를 제공한다. 특정 구현예에서, 약제는 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자 또는 본원에 기술된 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물로 형성된 마이크로/나노입자일 수 있다.
상기 발명의 보다 일반적인 구현예의 맥락에서 제시된 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 갖는 알지네이트 올리고머, 및/또는 진단적 양이온성 마이크로/나노입자의 용도에 관한 상기 기술된 특징, 특히 병용된 제품에 관한 것들은 바로 위에 기술된 본 발명의 보다 구체적인 구현예에 준용되며, 따라서 필요한 경우 그 섹션에서 기술된 특징 및 원리의 모든 조합은 적절한 적응과 함께 본원에서 적용될 수 있다.
본 발명에 따라 검출된 신호의 특성은 이의 부재 또는 존재, 신호의 상대적 또는 절대적 강도 또는 시간에 따른 신호의 변화일 수 있다.
이러한 구현예에서, 상기 방법은 대상이 상기 질환 또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단되는 단계, 대상의 질환 또는 병태의 상태가 결정되는 단계, 대상이 질환 또는 병태를 발달시킬 위험을 결정하는 단계, 대상의 질환 또는 병태 진행 위험을 결정하는 단계, 또는 대상의 질환 또는 병태의 예후를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
진단적으로 유효한 분자(진단제)는 방사성핵종, 조영제 또는 분자 프로브로서 사용하기 위한 핵산 또는 단백질(예컨대 올리고뉴클레오티드 및 항체)을 포함할 수 있다.
실시예에 나타난 바와 같이, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머는 양이온성 마이크로/나노입자 및 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자의 세포독성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법 및 용도는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머의 부재 시 동등한 마이크로/나노입자를 사용하여 수행하였을 때의 방법 또는 용도와 비교하여 감소된, 또는 더 적은 세포독성과 관련이 있을 수 있다. 이러한 구현예에서, 관련 세포독성은 마이크로/나노입자와 접촉된 점액 층 바로 아래 또는 이들의 영역의 세포의 독성이다.
대상은 임의의 인간 또는 비-인간 동물 대상일 수 있지만, 보다 특히 인간 또는 비-인간 척추동물, 예컨대 포유류, 조류, 양서류, 어류 및 파충류로부터 선택된 비-인간 동물일 수 있다. 비-인간 동물은 실험 동물 또는 동물원 또는 게임 공원의 동물을 포함하여, 가축 또는 사육 동물 또는 상업적 가치가 있는 동물일 수 있다. 따라서 대표적인 비-인간 동물은 개, 고양이, 말, 돼지, 양, 염소, 소, 닭, 칠면조, 뿔닭, 오리 및 거위를 포함한다. 따라서 본 발명의 수의학적 용도가 포함된다. 대상은 환자로 볼 수 있다. 특정 구현예에서, 대상은 CFTR 이온 채널 기능부전, 보다 구체적으로 병리학적 표현형, 예컨대 CFTR 기능부전과 관련된 비정상적인 점액 및 점액 제거를 가진 인간 환자이다. 특정 구현예에서, 대상은 CF를 가진 인간 환자일 것이다. 용어 "CF인 대상", "CF를 앓고 있는 대상", "CF를 가진 대상" 및 "CF 대상"은 본원에서 등가로 간주되며, 상호 호환적으로 사용된다. 대상은 임의의 연령일 수 있으며, 예컨대 신생아, 영아, 유아, 소아, 청소년 또는 성인일 수 있다. 다르게 표현하면, 대상은 적어도 5 세, 예컨대 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 세이다. 특정 구현예에서, 대상은 본 발명에 따라 치료될 병태의 증상을 포함하는 잘-확립된 CFTR 기능부전 표현형을 갖는다 (예컨대, 만성 감염, 만성 염증 및/또는 기도 리모델링을 포함함). "잘-확립된"은 대상에서 표현형이 적어도 2 년, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 년 동안 관찰되었음을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자는 유효량의 마이크로/나노입자를 치료될 점막 표면에 전달하기 위해 임의의 편리한 형태로 또는 임의의 편리한 수단에 의해 대상에 투여될 수 있다. 이는 장관(예컨대 경구, 볼, 설하, 직장) 또는 국소 경로 또는 흡입(비강 흡입 포함)에 의한 것일 수 있다. 투여는 전신 분포 또는 전달이 표적 부위 또는 위치에 영향을 주지만 환자에서 다른 위치는 본질적으로 영향을 받지 않음을 의미하는 국소 분포를 달성할 수 있다. 당업자는 임의의 특정 부위 또는 위치에 적합한 적절한 투여 수단을 선택할 수 있을 것이다. 전술된 바와 같이, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 용도의 마이크로/나노입자는 수용체 친화성 분자에 의해 표적 부위로 표적화될 수 있다.
본 발명에서의 용도의 알지네이트 올리고머는 유효량의 알지네이트 올리고머를 치료될 점막 표면에 전달하기 위한 임의의 편리한 형태로 또는 임의의 편리한 수단에 의해 대상에 투여될 수 있다. 이는 비경구(예컨대 정맥 내, 척추 내, 근육 내, 피하), 장내(예컨대 경구, 볼, 설하, 직장), 또는 국소 경로에 의한 것 또는 흡입(비강 흡입 포함)에 의한 것일 수 있다. 투여는 전신 분포 또는 전달이 표적 부위 또는 위치에 영향을 주지만 환자에서 다른 위치는 본질적으로 영향을 받지 않음을 의미하는 국소 분포를 달성할 수 있다. 당업자는 임의의 특정 부위 또는 위치에 적합한 적절한 투여 수단을 선택할 수 있을 것이다. 특히 비경구 투여에 의해 달성되는 전신 투여는 편리성에 대해 바람직할 수 있다.
당업자는 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자 및 알지네이트 올리고머를 당해 분야에 공지되고 문헌에 광범위하게 기재된 임의의 통상적인 방법에 따라 이들 투여 경로 및 신체 분포에 적합한 약제학적 조성물로 제형화할 수 있을 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자 및 알지네이트 올리고머는 선택적으로 다른 활성제와 함께, 1종 이상의 통상적인 담체, 희석제 및/또는 부형제와 더불어, 정제, 환제, 과립제 (예, 자유 형태 또는 캡슐에 포함된), 산제 (예, 흡입성 산제), 로젠제, 사셰제(sachet), 카세제(cachet), 엘릭서제, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어롤제 (고체로서 또는 액체 매질 중에), 스프레이제 (예, 비강 스프레이제), 네불라이저에 사용하기 위한 조성물, 도포제, 크림제, 연고제, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐제, 좌제, 페서리제, 멸균 주사용액제, 멸균 포장 산제 등으로 제조할 수 있다. 장용 코팅된 고체 또는 액체 조성물, 예컨대 장용 코팅된 정제 및 장용 코팅된 과립(장용 코팅된 캡슐 또는 비-장용-코팅된 캡슐, 즉 코팅이 장용 코팅일 수 있거나 장용 코팅이 아닐 수 있는 것으로 제공될 수 있음); 멸균 주사용 조성물이 특히 주목된다.
적합한 담체, 부형제 및 희석제에 대한 예로는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 칼슘 포스페이트, 불활성 알지네이트 폴리머, 트라가칸트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 워터 시럽(water syrup), 물, 물/에탄올, 물/글리콜, 물/폴리에틸렌, 고장성 염수, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일 또는 지방 물질, 예를 들어 경질 지방 또는 이들의 적정 혼합물이 있다. 주목할만한 부형제 및 희석제는 만니톨 및 고장성 염수 (식염수)이다.
조성물은 부가적으로 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁화제, 보존제, 감미제, 향료 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여가능한 형태, 예를 들어, 전술한 정맥 내 전달에 적합한 용액은 멸균성이어야 하며 생리적으로 허용될 수 없는 물질은 없어야 하며, 투여시 다른 부작용이나 자극을 최소화하기 위해 낮은 삼투성을 가져야 하며, 따라서 용액은 바람직하게는 등장성 또는 약 고장성, 예컨대 고장성 염수(식염수)이어야 한다. 적정 비히클로는 멸균 주사용수, 소듐 클로라이드 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드 주사액, 유산화 링거 주사액 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., Easton: Mack Publishing Co., pp. 1405-1412와 1461-1487 (1975) 및 The National Formulary XIV, 14th ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975)에 기술된 것과 같은 기타 용액 등의, 비경구 용액을 투여하기 위해 통상적으로 사용되는 수계 비히클을 포함하며, 상기한 문헌들은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다. 이들 용액은 비경구용 용액에 통상적으로 사용되는 보존제, 항미생물제, 완충액 및 항산화제, 부형제, 및 제품의 제조, 보관 또는 사용을 방해하지 않으며 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자 및 알지네이트 올리고머와 함께 호환가능한 기타 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자 및/또는 알지네이트 올리고머를 포함하는 단순 멸균 액체 조성물이 특히 편리할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자 및/또는 알지네이트 올리고머의 고체 또는 액체 제형은 위내 또는 기타 상부 위장관 부위들에서의 분해는 방지하고, 하부 위장관, 예를 들어 소장에서의 분해는 허용하는, 장 코팅과 함께 제공될 수 있다. 이러한 코팅은 지방산, 왁스, 셀락(shellac), 플라스틱 및 식물 섬유 등의 폴리머로부터 통상적으로 제조된다. 이에 대한 구체적인 예로는, 비제한적으로, 메틸 아크릴레이트-메타크릴산 코폴리머, 메틸 메타크릴레이트-메타크릴산 코폴리머, 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트 (하이프로멜로스 아세테이트 숙시네이트), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP), 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트 및 소듐 알지네이트 폴리머가 있다. 장용 코팅된 정제 및 장용 코팅된 과립(장용 코팅된 캡슐 또는 비-장용 코팅된 캡슐로 제공될 수 있음)이 특이 주목된다. 장용 코팅된 과립은 그 내용이 참조로써 본원에 포함된 WO 1989008448 및 Al-Khedairy, E.B.H, 2006, Iraqi J.Pharm.Sci., Vol.15 (1) 49의 교시에 따라 제조될 수 있지만, 당업자는 사용될 수 있는 추가 대안 기술을 알고 있을 것이다.
국소 투여를 위해, 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자 및/또는 알지네이트 올리고머는 크림, 연고, 겔, 고약 등으로 혼입될 수 있다. 적합한 것으로 예상되는 추가의 국소 시스템은 제자리 약물 전달 시스템, 예컨대 고체, 반-고체, 비정형 또는 액체 결정질 겔 매트릭스가 제자리에서 형성되고 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자 및/또는 알지네이트 올리고머를 포함할 수 있는 겔이다. 이러한 매트릭스는 매트릭스로부터 마이크로/나노입자 및/또는 알지네이트 올리고머의 방출을 제어하도록 편리하게 고안될 수 있으며, 예컨대 방출은 선택한 기간 동안 지연 및/또는 지속될 수 있다. 이러한 시스템은 점막 표면과 접촉할 때만 겔을 형성할 수 있다. 전형적으로 겔은 점막 접착성이다.
본 발명의 조성물에서 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자 및/또는 알지네이트 올리고머의 상대적인 함량은 요구되는 투여량 및 따르는 투약법에 따라 달라질 수 있지만, 치료될 대상의 신체 크기, 대상의 특정 질환의 특성, 및 표적 치료 부위의 위치 및 정체성과 같은 변수를 고려하여 표적 치료 부위 또는 부위에서 유효량을 달성하기에 충분할 것이다. 당업자는 조성물에서 투여 또는 적용 횟수를 최소화하기 위해 다중 용량 투여 섭생을 따르거나 증가시키는 경우 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자 및/또는 알지네이트 올리고머의 양이 감소될 수 있음을 알 것이다.
주사 (예컨대 정맥 내, 척추 내, 근육 내 또는 피하 주사)로 본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머를 전달하기 위한 대표적인 수용액은 멸균 상태이며, 0.1 내지 10%, 예컨대 0.1 내지 5%, 0.1 내지 2%, 0.1 내지 1%, 0.1 내지 0.8%, 0.1 내지 0.5%, 0.1 내지 0.2%, 0.2 내지 10%, 0.2 내지 5%, 0.2 내지 2%, 0.2 내지 1%, 0.2 내지 0.8%, 0.2 내지 0.5%, 0.5 내지 10%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1%, 0.5 내지 0.8%, 0.8 내지 10%, 0.8 내지 5%, 0.8 내지 2%, 0.8 내지 1%, 1 내지 10%, 1 내지 5%, 1 내지 2%, 2 내지 10%, 2 내지 5% 또는 5 내지 10% w/v의 알지네이트 올리고머를 함유할 수 있고 나머지는 물 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자를 호흡기에 투여하기 위해 사용되는 대표적인 흡입성 용액은 전형적으로 멸균될 것이며 0.1 내지 10%, 예컨대 0.1 내지 5%, 0.1 내지 2%, 0.1 내지 1%, 0.1 내지 0.8%, 0.1 내지 0.5%, 0.1 내지 0.2%, 0.2 내지 10%, 0.2 내지 5%, 0.2 내지 2%, 0.2 내지 1%, 0.2 내지 0.8%, 0.2 내지 0.5%, 0.5 내지 10%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1%, 0.5 내지 0.8%, 0.8 내지 10%, 0.8 내지 5%, 0.8 내지 2%, 0.8 내지 1%, 1 내지 10%, 1 내지 5%, 1 내지 2%, 2 내지 10%, 2 내지 5% 또는 5 내지 10% w/v의 마이크로/나노입자를 함유할 것이고, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 물, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머를 호흡기에 투여하기 위해 사용되는 대표적인 흡입성 용액은 전형적으로 멸균될 것이며 0.1 내지 10%, 예컨대 0.1 내지 5%, 0.1 내지 2%, 0.1 내지 1%, 0.1 내지 0.8%, 0.1 내지 0.5%, 0.1 내지 0.2%, 0.2 내지 10%, 0.2 내지 5%, 0.2 내지 2%, 0.2 내지 1%, 0.2 내지 0.8%, 0.2 내지 0.5%, 0.5 내지 10%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1%, 0.5 내지 0.8%, 0.8 내지 10%, 0.8 내지 5%, 0.8 내지 2%, 0.8 내지 1%, 1 내지 10%, 1 내지 5%, 1 내지 2%, 2 내지 10%, 2 내지 5% 또는 5 내지 10% w/v의 알지네이트 올리고머를 함유할 것이고, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 물, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자를 코 또는 부비동에 투여하기 위해 멸균 수용액 제형이 사용될 수 있으며; 예컨대 비강 스프레이 장치, 예컨대 프로펠라가 없는 또는 프로펠라가 보조된 것에 의해 투여될 수 있다. 대표적인 제형은 0.1 내지 10%, 예컨대 0.1 내지 5%, 0.1 내지 2%, 0.1 내지 1%, 0.1 내지 0.8%, 0.1 내지 0.5%, 0.1 내지 0.2%, 0.2 내지 10%, 0.2 내지 5%, 0.2 내지 2%, 0.2 내지 1%, 0.2 내지 0.8%, 0.2 내지 0.5%, 0.5 내지 10%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1%, 0.5 내지 0.8%, 0.8 내지 10%, 0.8 내지 5%, 0.8 내지 2%, 0.8 내지 1%, 1 내지 10%, 1 내지 5%, 1 내지 2%, 2 내지 10%, 2 내지 5% 또는 5 내지 10% w/v의 마이크로/나노입자를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 물, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머를 코 또는 부비동에 투여하기 위해 멸균 수용액 제형이 사용될 수 있으며; 예컨대 비강 스프레이 장치, 예컨대 프로펠라가 없는 또는 프로펠라가 보조된 것에 의해 투여될 수 있다. 대표적인 제형은 0.1 내지 10%, 예컨대 0.1 내지 5%, 0.1 내지 2%, 0.1 내지 1%, 0.1 내지 0.8%, 0.1 내지 0.5%, 0.1 내지 0.2%, 0.2 내지 10%, 0.2 내지 5%, 0.2 내지 2%, 0.2 내지 1%, 0.2 내지 0.8%, 0.2 내지 0.5%, 0.5 내지 10%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1%, 0.5 내지 0.8%, 0.8 내지 10%, 0.8 내지 5%, 0.8 내지 2%, 0.8 내지 1%, 1 내지 10%, 1 내지 5%, 1 내지 2%, 2 내지 10%, 2 내지 5% 또는 5 내지 10% w/v의 알지네이트 올리고머를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 물, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자)를 포함할 수 있다.
본 발명의 알지네이트 올리고머를 하기도에 투여하기 위해 사용되는 대표적인 흡입성 분말은 90% 이하, 예컨대 85% 이하, 80%, 75% 또는 70%, 예컨대 50 내지 90%, 55 내지 90%, 60 내지 90%, 65 내지 90%, 70 내지 90%, 75 내지 90%, 80 내지 90%, 85 내지 90%, 50 내지 85%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 65 내지 85%, 70 내지 85%, 75 내지 85%, 80 내지 85%, 50 내지 80%, 55 내지 80%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 70 내지 80%, 75 내지 80%, 50 내지 70%, 55 내지 70%, 60 내지 70%, 또는 65 내지 70% w/v 또는 w/w의 올리고머를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자를 하기도에 투여하기 위해 사용되는 대표적인 흡입성 분말은 90% 이하, 예컨대 85% 이하, 80%, 75% 또는 70%, 예컨대 50 내지 90%, 55 내지 90%, 60 내지 90%, 65 내지 90%, 70 내지 90%, 75 내지 90%, 80 내지 90%, 85 내지 90%, 50 내지 85%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 65 내지 85%, 70 내지 85%, 75 내지 85%, 80 내지 85%, 50 내지 80%, 55 내지 80%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 70 내지 80%, 75 내지 80%, 50 내지 70%, 55 내지 70%, 60 내지 70%, 또는 65 내지 70% w/v 또는 w/w의 마이크로/나노입자를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머를 하부 위장관에 투여하기 위해 사용되는 대표적인 정제는 99% 이하, 95% 이하, 90%, 85% 또는 80%, 예컨대 50 내지 95%, 55 내지 95%, 60 내지 95%, 65 내지 95%, 70 내지 95%, 75 내지 95%, 80 내지 95%, 85 내지 95%, 90 내지 95%, 50 내지 90%, 50 내지 90%, 55 내지 90%, 60 내지 90%, 65 내지 90%, 70 내지 90%, 75 내지 90%, 80 내지 90%, 85 내지 90%, 50 내지 90%, 55 내지 85%, 60 내지 80% 또는, 65 내지 75% w/v 또는 w/w의 올리고머를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머를 하부 위장관에 투여하는데 장용 코팅된 정제가 또한 효과적일 수 있다. 대표적인 장용 코팅된 정제는 95% 이하, 예컨대 90% 이하, 85% 또는 80%, 예컨대 55 내지 90%, 60 내지 90%, 65 내지 90%, 70 내지 90%, 75 내지 90%, 80 내지 90%, 85 내지 90%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 65 내지 85%, 70 내지 85%, 75 내지 85%, 80 내지 85%, 50 내지 80%, 55 내지 80%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 70 내지 80%, 또는 75 내지 80% w/v 또는 w/w의 올리고머를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 장용 코팅 (예컨대 지방산, 왁스, 셀락, 플라스틱, 및 식물 섬유를 포함하는 중합체) 포함, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자를 하부 위장관에 투여하는데 장용 코팅된 정제가 또한 효과적일 수 있다. 대표적인 장용 코팅된 정제는 95% 이하, 예컨대 90% 이하, 85% 또는 80%, 예컨대 55 내지 90%, 60 내지 90%, 65 내지 90%, 70 내지 90%, 75 내지 90%, 80 내지 90%, 85 내지 90%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 65 내지 85%, 70 내지 85%, 75 내지 85%, 80 내지 85%, 50 내지 80%, 55 내지 80%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 70 내지 80%, 또는 75 내지 80% w/v 또는 w/w의 마이크로/나노입자를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 장용 코팅(예컨대 지방산, 왁스, 셀락, 플라스틱, 및 식물 섬유를 포함하는 중합체) 포함, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머를 하부 위장관에 투여하는데 장용 코팅된 과립이 또한 효과적일 수 있다. 이러한 과립은 그 자체로 장용 코팅이 제공되거나 제공되지 않을 수 있는 캡슐에 제공될 수 있다. 대표적인 장용 코팅된 과립은 95% 이하, 예컨대 90% 이하, 85% 또는 80%, 예컨대 55 내지 90%, 60 내지 90%, 65 내지 90%, 70 내지 90%, 75 내지 90%, 80 내지 90%, 85 내지 90%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 65 내지 85%, 70 내지 85%, 75 내지 85%, 80 내지 85%, 50 내지 80%, 55 내지 80%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 70 내지 80%, 또는 75 내지 80% w/v 또는 w/w의 올리고머를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 장용 코팅(예컨대 지방산, 왁스, 셀락, 플라스틱, 및 식물 섬유를 포함하는 중합체) 포함, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자를 하부 위장관에 투여하는데 장용 코팅된 과립이 또한 효과적일 수 있다. 이러한 과립은 그 자체로 장용 코팅이 제공되거나 제공되지 않을 수 있는 캡슐에 제공될 수 있다. 대표적인 장용 코팅된 과립은 95% 이하, 예컨대 90% 이하, 85% 또는 80%, 예컨대 55 내지 90%, 60 내지 90%, 65 내지 90%, 70 내지 90%, 75 내지 90%, 80 내지 90%, 85 내지 90%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 65 내지 85%, 70 내지 85%, 75 내지 85%, 80 내지 85%, 50 내지 80%, 55 내지 80%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 70 내지 80%, 또는 75 내지 80% w/v 또는 w/w의 마이크로/나노입자를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 장용 코팅(예컨대 지방산, 왁스, 셀락, 플라스틱, 및 식물 섬유를 포함하는 중합체) 포함, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머 및/또는 마이크로/나노입자를 여성 생식기의 하부에 투여하기 위해 페서리가 사용될 수 있다.대표적인 제형은 1 내지 25%, 1 내지 20%, 예컨대 1 내지 15%, 1 내지 10%, 1 내지 9%, 1 내지 8%, 1 내지 7%, 1 내지 6%, 5 내지 25%, 5 내지 20%, 5 내지 15%, 5 내지 10%, 5 내지 9%, 5 내지 8%, 5 내지 7%, 5 내지 6%, 8 내지 25%, 8 내지 20%, 8 내지 15%, 8 내지 10%, 9 내지 25%, 9 내지 20%, 또는 9 내지 15% w/v 또는 w/w의 올리고머를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 고체 부형제(예컨대 파라핀 등) 포함, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자)를 포함할 수 있다. 다른 대표적인 제형은 1 내지 25%, 1 내지 20%, 예컨대 1 내지 15%, 1 내지 10%, 1 내지 9%, 1 내지 8%, 1 내지 7%, 1 내지 6%, 5 내지 25%, 5 내지 20%, 5 내지 15%, 5 내지 10%, 5 내지 9%, 5 내지 8%, 5 내지 7%, 5 내지 6%, 8 내지 25%, 8 내지 20%, 8 내지 15%, 8 내지 10%, 9 내지 25%, 9 내지 20%, 또는 9 내지 15% w/v 또는 w/w의 마이크로/나노입자를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 고체 부형제(예컨대 파라핀 등) 포함, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머를 간, 췌장 또는 생식계의 점막 표면에 직접적으로 전달하기 위한 대표적인 수용액은 멸균될 것이며 6 내지 25%, 예컨대 6 내지 20%, 6 내지 15%, 6 내지 10%, 8 내지 25%, 8 내지 20%, 8 내지 15 %, 9 내지 25%, 9 내지 20%, 9 내지 15 %, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 또는 15 내지 25% w/v의 올리고머를 함유할 수 있으며, 나머지는 물 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자를 간, 췌장 또는 생식계의 점막 표면에 직접적으로 전달하기 위한 대표적인 수용액은 멸균될 것이며 6 내지 25%, 예컨대 6 내지 20%, 6 내지 15%, 6 내지 10%, 8 내지 25%, 8 내지 20%, 8 내지 15 %, 9 내지 25%, 9 내지 20%, 9 내지 15 %, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 또는 15 내지 25% w/v의 마이크로/나노입자를 함유할 수 있으며, 나머지는 물 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자를 위장관의 하부에 투여하기 위해 직장 좌제가 사용될 수 있다. 대표적인 제형은 0.1 내지 10%, 예컨대 0.1 내지 5%, 0.1 내지 2%, 0.1 내지 1%, 0.1 내지 0.8%, 0.1 내지 0.5%, 0.1 내지 0.2%, 0.2 내지 10%, 0.2 내지 5%, 0.2 내지 2%, 0.2 내지 1%, 0.2 내지 0.8%, 0.2 내지 0.5%, 0.5 내지 10%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1%, 0.5 내지 0.8%, 0.8 내지 10%, 0.8 내지 5%, 0.8 내지 2%, 0.8 내지 1%, 1 내지 10%, 1 내지 5%, 1 내지 2%, 2 내지 10%, 2 내지 5% 또는 5 내지 10% w/v의 마이크로/나노입자를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 고체 부형제 포함, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알지네이트 올리고머를 위장관의 하부에 투여하기 위해 직장 좌제가 사용될 수 있다. 대표적인 제형은 0.1 내지 10%, 예컨대 0.1 내지 5%, 0.1 내지 2%, 0.1 내지 1%, 0.1 내지 0.8%, 0.1 내지 0.5%, 0.1 내지 0.2%, 0.2 내지 10%, 0.2 내지 5%, 0.2 내지 2%, 0.2 내지 1%, 0.2 내지 0.8%, 0.2 내지 0.5%, 0.5 내지 10%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1%, 0.5 내지 0.8%, 0.8 내지 10%, 0.8 내지 5%, 0.8 내지 2%, 0.8 내지 1%, 1 내지 10%, 1 내지 5%, 1 내지 2%, 2 내지 10%, 2 내지 5% 또는 5 내지 10% w/v의 알지네이트 올리고머를 함유할 수 있으며, 나머지는 약학적으로 허용되는 부형제, 고체 부형제 포함, 및/또는 사용되는 경우 다른 활성제(예컨대 본 발명에서 사용되는 마이크로/나노입자)를 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예를 참조하여 추가로 설명될 것이며, 여기서,
도 1은 실시예 1 및 2의 트랜스웰 점액 RTN 침투 분석의 개략도를 도시한다.
도 2는 시간(분)에 따른 CF 점액 내 음이온성(사각형) 및 양이온성(다이아몬드) RTN의 전위%를 도시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 3은 시간(분)에 따른 정상 점액 내 음이온성(사각형) 및 양이온성(다이아몬드) RTN의 전위%를 도시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 CF(다이아몬드) 및 정상 점액(NM; 사각형)을 통한 양이온성 RTN 제형의 누적 농도(ng/cm2) 및 전위%의 비교를 도시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 CF(다이아몬드) 및 정상(사각형) 점액을 통한 음이온성 RTN 제형의 누적 농도(ng/cm2) 및 전위%의 비교를 도시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 OligoG(사각형) 또는 OligoM(삼각형) 처리 하의 또는 비처리(다이아몬드) 하의 시간(분)에 따른 CF 점액에서 양이온성 RTN의 평균 누적 농도(ng/cm2) 및 전위%의 비교를 도시한다. 점액을 OligoG 또는 OligoM을 처리하고 평형화한 후 RTN을 첨가하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 OligoG(사각형) 또는 OligoM(삼각형) 처리 하의 또는 비처리(다이아몬드) 하의 시간(분)에 따른 정상 점액에서 양이온성 RTN의 평균 누적 농도(ng/cm2) 및 전위%의 비교를 도시한다. 점액을 OligoG 또는 OligoM을 처리하고 평형화한 후 RTN을 첨가하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 8은 OligoG(사각형) 또는 OligoM(삼각형) 처리 하의 또는 비처리(다이아몬드) 하의 시간(분)에 따른 CF 점액에서 음이온성 RTN의 평균 누적 농도(ng/cm2) 및 전위%의 비교를 도시한다. 점액을 OligoG 또는 OligoM을 처리하고 평형화한 후 RTN을 첨가하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 OligoG(사각형) 또는 OligoM(삼각형) 처리 하의 또는 비처리(다이아몬드) 하의 시간(분)에 따른 정상 점액에서 음이온성 RTN의 평균 누적 농도(ng/cm2) 및 전위%의 비교를 도시한다. 점액을 OligoG 또는 OligoM을 처리하고 평형화한 후 RTN을 첨가하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 10은 전위 전(A) 및 OligoM으로 처리한 CF 점액(B) 및 CF 점액을 통한 전위 후 양이온성 RTN의 TEM 사진을 도시한다.
도 11은 OligoG 및 OligoM 유무와 관계 없이, 양이온성 및 음이온성 RTN으로, 또는 OligoG 및 OligoM 단독으로 형질감염한 후 16HBE 세포 생존율을 도시한다. 비처리 세포가 또한 100% 생존으로 도시된다. 유의한 컷-오프가 p<0.05인 T-검정을 수행하였으며, 비처리 대조군과 유의하게 상이한 조건은 점선으로 도시하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 12는 다양한 CFTR 조절제의 화학적 구조를 도시한다.
실시예
실시예 1 - 정상 및 낭포성 섬유증 점액을 가로지르는 양이온성 및 음이온성 나노입자의 전위 및 알지네이트 올리고머의 영향
재료 및 방법
재료
수용체-표적화 나노복합체 (RTN) 제형은 리포좀 DOTMA/DOPE 또는 DOPG/DOPE (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, USA) 펩티드 Y (ChinaPeptides, Shanghai, China), 및 Cy-3 사일런서 GAPDH siRNA (Thermo Fisher Scientific, Northumberland, UK)를 포함한다.
시험관 내 형질감염용 RTN을 OPTIMEM (Life Technology, Paisley, UK)에서 제조한 반면, 나머지는 DNAse/ RNAse가 없는 물(Thermo Fisher Scientific, Northumberland, UK)에서 제조하였다. 모든 RTN을 실온에서 인큐베이션 한 반면, 형광으로 표지된 siRNA (Cy-3)을 함유하는 THOSE를 어둡게 유지하였다.
펩티드 Y 용액을 DOTMA/DOPE 용액에 첨가하고, 마지막으로 Cy-3 siRNA를 신속하게 혼합하며 첨가하고, 30 분 동안 인큐베이션하여, 양이온성 siRNA RTN를 1:4:1 (리포좀:펩티드:siRNA) 중량비로 제조하였다. siRNA를 신속하게 혼합하며 펩티드에 첨가하고 30 분 동안 인큐베이션 하여, 음이온성 siRNA RTN를 20:2.7:1(리포좀:펩티드:siRNA) 중량비로 제조하였다. DOPG/DOPE를 첨가하고 추가 30 분 동안 인큐베이션 하였다.
스톡 농도(μg/μl) 및 펩티드 Y 및 DOTMA/DOPE 희석 인자의 예 및 3 개의 RTN을 제조하기 위해 혼합한 최종 양이 표 1 및 2에 나와 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
알지네이트 올리고머 - OligoG(알지네이트 올리고머, DP 5 내지 20, 평균 분자량 3200 Da, 90-95% G 잔기) 및 OligoM (알지네이트 올리고머, 12mer, 100% M)을 AlgiPharma AS, 노르웨이로부터 제공받았다.
트랜스웰 점액 RTN 침투 분석
트랜스웰(6.5 mm, 3.0 μm 기공 폴리에스터 막 인서트, Corning, UK)가 있는 24-웰 플레이트에서, 2 또는 3 회 반복으로, 물이 담긴 뚜껑이 있는 용기에 두고 37℃ 인큐베이터에서 유지하며 트랜스웰 점액 RTN 침투 분석을 수행하였다(도 8). Trizma-Base (Sigma Aldrich, Dorset, UK)를 사용하여 50 mM 및 pH 7.4로 트리스-완충액을 제조하였다. 600 μl의 트리스-완충액을 각각의 웰에 첨가하고 상부에 트랜스웰을 두었다. 1 μl의 CF 또는 비-CF (정상) 점액 (Epithelix Sarl, 제네바, 스위스)을 상부에 첨가하고 각각의 트랜스웰을 가로질러 도말하였다. 일부 경우 2 μl의 5 mg/ml의 OligoG 또는 OligoM (AlgiPharma AS, 노르웨이)을 또한 첨가하고 점액과 혼합하였다. 플레이트를 30 분 동안 인큐베이션하여 점액을 평형화하였다. 140 ng/μl siRNA RTN를 제조하고 각각의 트랜스웰에 3 μl를 첨가하였다. 3 μl의 140 ng/μl siRNA이 있는 트리스-완충액의 양성 대조군 및 순수한 트리스-완충액의 음성 대조군을 또한 포함하였다. 5, 10, 15, 30, 45, 60 및 120 분 후에, 200 μl의 트리스-완충액을 수집하고 96-웰 플레이트(Nunc MicroWell, 96-Well, Optical-Bottom, Coverglass Base, Thermo-Fisher Scientific) 내로 피펫팅하였다. 각각의 수집 후 200 μl의 트리스-완충액을 웰에 대체하였다. SiRNA 형광을 FLUOstar OPTIMA Microplate Reader (BMG, Labtech) (560±10 nm 여기, 590±10 nm 방출 파장)에서 측정하였다.
RTN 크기 및 전하 결정
RTN 제형을 DNAse/RNAse가 없는 물로 1 μg/mL siRNA 농도에서 1 mL로 희석하고 제조사의 DTS 프로그램 (v5.03)을 사용하여 처리된, 1.330 굴절률, 78.5 유전 상수, 0.8871 cP 점도 및 25℃ 온도에서 자동 샘플링된 샘플 당 10 회 측정하여 Malvern Nano ZS Zetasizer (Malvern, UK)를 사용하여 이의 크기 및 전하 (ζ-전위)를 결정하였다.
누적 농도 및 전위 백분율 계산
초기에 점액을 통한 RTN의 전위 백분율을 계산해야 한다. 점액을 통한 RTN 분석에 대한 원시 형광 데이터를 형광계로부터 수득한다. 음성 대조군 값 (트리스 완충액)을 개별 샘플 데이터 및 양성 대조군 (트리스 완충액 중의 siRNA)에서 뺀다. 5 분 데이터를 10 분 데이터에, 10 분 데이터를 15 분 데이터에 더하여 누적 데이터를 계산한다. 양성 대조군의 합도 또한 계산한다. 점액을 통한 RTN의 전위 백분율은 누적 데이터에 100을 곱하고 양성 대조군의 합으로 이를 나누어 계산한다.
누적 농도를 계산하기 위해, 침투 데이터 백분율을 처음에 100으로 나눈다. 이제 이러한 데이터에 420을 곱한다 - 이는, ng 단위의 양이온성 RTN 내부의 siRNA의 농도임 (140 ng/μl siRNA x 각각의 웰에 첨가된 3μl = 420 ng/웰). 이러한 데이터에 358.4 ng/웰을 곱해야 하는 음이온성 제형의 경우 이는 다르다. 마지막으로, 이러한 데이터를 분석에 사용된 트랜스웰의 표면적인 cm2 단위로 0.33으로 나눈다.
유의성은 p<0.05인 p-값 유의성 컷-오프를 사용하여 2 개 샘플 T-검정으로 결정하였다.
점액을 통한 RTN 확산
점액을 통한 RTN 확산을 픽 2 법칙(Fick's second Law)을 사용하여 계산한다;
Figure pct00003
수학식 I(픽 2 법칙)
dM/dt는 ng/s/cm2 당 플럭스 (F)이고 (정상 상태에서 수송 속도를 계산하기 위해 플롯팅된 RTN 누적 농도의 선형 추세선 방정식으로 식별됨), D는 cm2s-1 단위의 확산 계수이고, C는 ng/cm3 단위의 점액 상의 SiRNA 의 농도이고, h는 cm 단위의 트랜스웰 상의 점액의 두께이다.
플럭스를 구하기 위해, 그래프의 곡선이 안정기에 도달하기 전의 지점을 선택하여 누적 농도 데이터 지점의 산포 XY 그래프를 플롯팅한다. 플롯팅된 그래프는 방정식 및 R2 값을 나타내는 선형 추세선을 추가하기 전에 가능한한 직선을 가져야 한다. R2 값은 이론상 최상의 플럭스 값을 얻기 위해 가능한한 1에 가까워야 한다.
본 실시예에서, 플럭스는 9.86 ng/cm2/분이다.
픽의 방정식에 플럭스를 적용하기 위해서는 분을 초로 계산해야 한다. 이를 위해, 플럭스를 60으로 나눈다.
플럭스 = 9.86/ 60 = 0.16 ng/cm2/s
h = cm 단위의 장벽 (트랜스웰) 두께 = 0.0035 cm
C0 = ng/cm3 단위의 RTN 내부의 SiRNA의 농도 = 양이온성 RTN의 경우 140000 ng/cm3, 음이온성 RTN의 경우 119800 ng/cm3.
D를 구하면 cm2s-1 단위인 점액을 통한 RTN의 확산(Dm)이 될 것이다.
물을 통한 RTN 확산
물을 통한 RTN 확산을 수학식 II(스트로크 법칙(Stoke's Law))를 사용하여 계산하였다;
Figure pct00004
수학식 II(스트로크 법칙)
D는 cm2s-1 단위의 확산 계수이고, K는 Boltzman 상수이고, T는 켈빈 온도이고, η은 gs-1nm-1 단위의 점도이고, r은 RTN의 반경이다.
Boltzman 상수 = 1.38E-02 nm2gs-2k-1
온도 = 310 켈빈
Pi = 3.1416
점도 = 6.92E-10 gs-1nm-1
반경 = 2로 나눈, nm (직경)단위의 RTN의 측정된 크기.
D를 구하면 nm2s-1 단위의 물을 통한 RTN의 확산(Dw)이 될 것이다.
이러한 값은 Dw에 10-8을 곱하여 cm2s-1 단위로 변환될 필요가 있다.
투과 전자 현미경(TEM)
전자 현미경 조사를 위해, 전술된 바와 같이 제조한 RTN을 Formvar/탄소 지지 필름(Agar Scientific)으로 코팅된 300-메시 구리 그리드에 적용하였다. 제조하기 전에, 그리드를 30 mA (음극성)에서 15 초 동안 Emitech K350G system (Emitech Ltd.)에서 "글로우 방전"하였다. 몇 초 후, 그리드를 여과지로 블로팅하여 건조시켰다. 이어서 샘플(나노입자)을, 여과지로 블로팅하고 공기 건조시키기 전에 1% 우라닐 아세테이트를 사용하여 2 내지 3 초 동안 네거티브 염색하였다. Philips CM120 BioTwin 투과 전자 현미경을 사용하고 120 kV의 가속 전압에서 작동시켜 이미지화를 수행하였다. 이미지를 AMT 5MP 디지털 TEM 카메라(Deben UK Limited, Bury St. Edmunds, Suffolk)를 사용하여 캡쳐하였다.
MTS 세포 생존 분석
siRNA RTN 및 OligoG 또는 OligoM의 세포 생존력을 시험하였다. 100 ng/웰의 RTN siRNA 제형, 15 μl의 5 mg/ml OligoG 및 OligoM 및 상이한 siRNA RTN 제형과 조합된 15 μl의 OligoG 또는 OligoM을 OPTIMEM을 사용하여 최대 150 μl로 제조하였다. 이들을 96웰 플레이트(Greiner Bio-One, 마이크로플레이트, PS, 편평 바닥, 투명) 중의 16HBE 세포에 첨가하고 4 시간 동안 두었다. 세포를 PBS로 세척하고 150 μl의 새로운 배지로 대체하였다. 24 시간 후에, 배지를 제거하고 20 μl의 MTS 분석 시약(Promega)을 포함하는 100 μl의 새로운 배지를 첨가하였다. 인큐베이션 4 시간 후에, 490 nm에서 FLUOstar OPTIMA Microplate Reader(BMG, Labtech)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
결과
낭포성 섬유증 점액을 가로지르는 양이온성 및 음이온성 RTN 전위
Cy3-태깅된 siRNA-함유 양이온성 및 음이온성 RTN을 제조하고 크기 및 전하에 대해 측정하였다. 이들의 평균 값을 표 3에 보고하고 CF 점액에서 수행된 트랜스웰 점액 침투 분석 내내 동일하게 유지하였다.
Figure pct00005
기도 상피의 점액 장벽을 모방하기 위해 이러한 RTN을 트랜스웰(도 1) 상의 점액 층의 상부에 첨가하였다 - 막을 통해 전위되어 완충 용액(트리스 완충액)에 침착되도록 함. 전위된 RTN이 있는 완충액 샘플을 5, 10, 15, 30, 45, 60 및 120 분의 특정 시점에서 수집하였다. RTN 형광을 측정하고 siRNA 양성 대조군과 비교하여 특정 시점 후의 누적 RTN 전위를 결정하였다. 그런 다음 RTN의 전위 백분율(%) 및 누적 농도를 계산하여, 상이한 RTN 제형에서 siRNA 농도의 차이를 정규화하였다. 수행된 모든 실험의 평균 전위 % 및 누적 농도를 또한 계산하였다. 전위 %는 각각의 100% siRNA 양성 대조군과 비교하여 계산된 바와 같이 수집 완충액을 통한 RTN 침투 정도를 보여줄 수 있으며, RTN이 점액을 통해 이동하는지 여부를 결정할 수 있다. 마지막으로, 점액과 물을 통한 나노입자의 확산에 대한 픽 및 스트로크 법칙을 각각 적용하여 RTN 확산 속도를 결정하고 비교하였다(표 12).
도 2는 음이온성 RTN이 양이온성 RTN보다 더 높은 전위%를 가짐을 보여준다.
정상 점액을 가로지르는 양이온성 및 음이온성 RTN 전위
CF 점액을 사용한 실험과 유사하게, 건강한 공여자로부터의 점액 ('정상 점액'으로 지칭됨)을 사용하여 실험을 수행하였다. 사용된 제형의 평균 크기 및 전하 값을 표 4에 나타내고 정상 점액에 대해 수행된 트랜스웰 점액 침투 분석 내내 동일하게 유지하였다.
Figure pct00006
RTN 제형은 CF 점액의 사전 결정된 기공 크기인 약 140 ± 50 nm의 허용가능한 크기를 가졌으며, 트랜스웰 점액 침투 분석에 사용하였으며, 이번에는 트랜스웰 막의 장벽으로서 정상 점액을 사용하였다. 샘플을 수집하고 Cy3-siRNA의 형광을 측정하였다. 그런 다음 RTN의 전위 백분율(%) 및 누적 농도를 계산하여, 상이한 RTN 제형에서 siRNA 농도의 차이를 정규화하였다. 점액 및 물을 통한 나노입자의 확산에 대해 픽 및 스토크 법칙을 각각 적용하여 수행된 모든 실험의 평균 전위 % 및 누적 농도를 또한 계산하고, RTN의 확산 속도를 결정하고 비교하였다(도 12).
음이온성 RTN은 양이온성 RTN보다 더 높은 전위 백분율을 가졌다. 전위 %에 대한 T-검정은 양이온성 RTN이 음이온성 RTN과 유의하게 다름을 나타낸다(표 5).
Figure pct00007
CF 및 정상 점액을 가로지르는 양이온성 및 음이온성의 전위 비교
CF 또는 정상 점액에서 상이한 RTN 제형의 전위를 비교하면 CF 점액이 실제로 RTN을 늦추는지 여부와 누적 정도를 결정할 수 있다.
도 4 및 5는 CF 점액에 적용했을 때 둘 모두의 RTN 제형이 정상 점액에 비해 감소된 RTN 누적 농도 및 전위%를 가짐을 보여준다. 양이온성 및 음이온성 제형에서, 누적 농도는 CF 점액에서보다 각각 30% 및 20% 더 낮다. T-검정은 CF 및 정상 점액 상의 양이온성 및 음이온성 RTN의 전위 속도가 유의하게 다름을 결정하였다(표 6).
Figure pct00008
점액 층을 가로지르는 RTN 전위에 대한 OligoG 및 OligoM의 영향
점액을 통한 RTN 전위의 경향을 확립하여, OligoG 및 OligoM을 사용하여 RTN 전위 효율을 향상시키고 이들의 누적 농도를 증가시킬 수 있는지를 결정하였다. OligoG 및 OligoM을 양이온성 및 음이온성 RTN 제형 둘 모두에 대해 전술된 바와 같은 동일한 트랜스웰 점액 침투 분석으로 시험하였다.
양이온성 RTN
도 6은 CF 점액 층을 가로지르는 양이온성 RTN 전위에 대한 OligoG 및 OligoM의 영향을 도시한다. 비처리된 양이온성 RTN은 가장 낮은 전위 효율을 가진 반면 OligoG 및 OligoM 둘 모두는 양이온성 RTN 제형의 누적 농도 및 전위 %를 증가시켰다. OligoM은 OligoG에 비해 훨씬 더 높은 RTN 최종 농도를 보여주며, 이는 T-검정(표 7) 및 ANOVA에 의해 뒷받침된 관찰이다.
Figure pct00009
OligoG 및 OligoM으로 처리된 CF 점액을 통한 양이온성 RTN 전위의 누적 농도는 모든 시점에서 비처리된 CF 점액의 것과 유의하게 상이하였다. 유사하게, OligoM은 특히 45 분 수집 시점 이후에 OligoG에 비해 양이온성 RTN 전위에서 훨씬 더 나은 효과를 가지며 전위%는 심지어 100% 침투율을 초과한다. 최종 120 분 시점에 대한 ANOVA 다중 비교 시험은 유사하게 두 Oligo가 비처리된 점액과 비교하여 유의하게 상이한 RTN 누적 농도 효과를 갖는다는 것, 및 OligoM이 OligoG와 비교하여 RTN의 침투 효율 및 속도에 대해 유의하게 증가된 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
CF 점액에서 나타나는 것과 유사한 경향은 이러한 분석을 위해 정상 점액을 사용할 때 감지될 수 있다(도 7). CF 점액에서 나타난 바와 같이, OligoG 또는 비처리된 정상 점액과 비교하여, OligoM은 RTN 전위 효율을 최대로 증가시킨다. OligoG는 CF 점액에서 관찰되는 바와 같이, 비처리된 정상 점액에 대해 여전히 더 높은 누적 농도를 나타내지만, 100% 전위를 초과하는 OligoM 만큼은 높지 않다. 이러한 관찰의 중요성은 아래 나타난 T-검정으로 강조된다(표 8).
Figure pct00010
30 분 시점 후에 OligoM은 양이온성 RTN의 누적 농도 증가에 유의한 영향을 미쳤지만, 30 분 및 45 분 시점에서만 OligoG에 대해서도 마찬가지이다. OligoM은 RTN 누적 농도의 급격한 증가와 함께 45 분 후의 시점에서 OligoG의 것과 비교하여 RTN의 전위 속도의 상당한 향상을 보여준다. 대조적으로, OligoG를 사용한 점액 처리는 지속적으로 더 높은 누적 RTN 농도를 가지고 있음에도 불구하고 비처리된 점액에 대해 동일한 전위 프로파일을 나타내는 것으로 보인다. ANOVA 검정은 또한 최종 시점에서 t-검정 결과를 검증한다.
음이온성 RTN
도 8은 CF 점액 층을 가로지르는 음이온성 RTN 전위에 대한 OligoG 및 OligoM의 영향을 도시한다. 비처리된 CF 점액과 비교하여 두 Oligo는 더 높은 누적 농도 및 전위 % 경향을 나타냈지만, 이러한 차이는 유의하지 않은 것으로 밝혀졌고(표 9) ANOVA 검정으로 확인하였다(도시되지 않음).
Figure pct00011
OligoG 또는 OligoM으로 처리한 (또는 처리하지 않은) 정상 점액에서 동일한 실험을 수행하였다. 결과를 도 9에 도시하였다. 여기서, Oligo의 비효율성은 모든 플롯팅된 선이 서로 매우 가깝고 거의 동일한 추세를 보여주기 때문에 더 분명하다. 120 분의 최종 시점에서 약간의 차이가 있는데, OligoG로 처리한 점액은 약간 낮은 누적 RTN 농도를 가는 반면, 비처리된 점액은 약간 더 높은 농도를 가짐을 나타낸다. 그러나, 모든 조건은 통계적으로 유의하지 않으며, t-검정(표 10) 및 ANOVA 값(도시되지 않음)에 의해 검증되었다.
Figure pct00012
RTN 크기 및 전하에 대한 OligoM 및 OligoG의 영향
OligoG 및 OligoM을 이용한 점액 처리가 주로 양이온성 RTN과 같은 RTN 제형의 전위에서 유의한 차이를 보인다는 것을 결정한 후, 이것이 RTN의 전하를 변경한 결과로 발생하는지 확인하려는 시도를 하였다. 음이온성 및 양이온성 RTN 제형을 제조하고 3 개의 동일한 에펜도르프로 분할하였다. 2 개는 OligoG 또는 OligoM으로 2 분 동안 처리하였다. 이들의 크기 및 전하를 측정하였다(표 11).
Figure pct00013
표 11은 두 Oligo가 양이온성 및 음이온성 RTN의 전하를 변화시켜 보다 음성으로 만든다는 것을 보여준다. 이는 양이온성 RTN에서 대부분 명백하며, 전하가 양에서 음으로 완전히 변화하여 비처리된 음이온성 RTN과 거의 유사한 수준의 전하로 변한다. 특히 양이온성 제형에서 각각 측정한 후 이들의 크기가 감소하는 것도 분명하다. 비처리된 것을 먼저 측정하였고, OligoG 및 OligoM 처리된 것은 이후에 측정하였으며, 각각의 측정은 약 20 분 동안 지속하였다. OligoM은 OligoG보다 약간 더 작은 전하 차이를 생성하는 것처럼 보이지만 값은 서로 유의하게 다르지 않다.
CF 및 정상 점액에서 RTN의 접힘-임피던스
픽 및 스트로크 법칙을 사용하여, 접힘 임피던스와 함께 OligoG 또는 OligoM으로 처리되거나 처리되지 않은 CF 및 정상 점액에서 RTN의 확산 계수를 계산하였다(표 12). 이러한 계산은 나노복합체 크기를 고려하고 최적의 장애물이 없는 확산을 제어하는 역할을 하는 물에서의 확산과 비교할 때 점액 내 RTN의 접힘-임피던스를 결정할 수 있다.
Figure pct00014
CF 및 정상 점액 둘 모두에서, 양이온성 RTN의 접힘-임피던스는 비처리된 점액과 비교할 때 OligoM으로 처리한 후 현저하게 감소한다(각각 2.6 및 1.7-배). OligoM은 OligoG에 비해 CF 점액에서 점액 임피던스 감소에 있어서 1.8배 차이가 있고 정상 점액에서 1.7배 차이가 있다. 음이온성 RTN의 경우, Oligo는 전위 효율을 높이거나 낮추는데 큰 영향을 미치지 않는다.
트랜스웰로부터 회수된 RTN의 투과 전자 현미경( TEM )
도 10에 도시된 바와 같이, OligoM의 존재 또는 부재 하에 CF 점액 층을 가로질러 전위된 후 하부 트랜스웰 챔버로부터 회수된 양이온성 RTN은 구조적으로 온전하고 전위 이전의 형태와 비교하여 실질적으로 변하지 않는다.
OligoG, OligoM 및 RTN의 세포독성
RTN 및/또는 OligoG 또는 OligoM 단독 또는 결합이 16HBE 세포 (불멸화된 인간 기관지 상피세포)에 독성을 유발하는지 여부를 결정하기 위해 MTS 분석을 수행하였다. 16HBE 세포를 96-웰 플레이트에 60 내지 70% 컨플루언시로 접종하고 밤새 인큐베이션되도록 하였다. RTN 제형을 100 ng/웰로 적용하였다. Oligo를 형질감염 시 RTN 또는 OPTIMEM 단독과 혼합하였다. 4 시간 후에, 시험 배지를 제거하고 새로운 배지와 MTS 용액으로 4 시간 더 교체하였다. 이어서, 이의 흡광도를 판독하고 형질감염되지 않은 대조군과 비교하여 각 시험 조건에서 세포 생존율 %를 계산하였다. 결과를 도 11에 도시하였다.
알 수 있듯이, OligoG 단독은 OligoM 단독에 비해 세포 독성이 더 있다. 또한, 음이온성 RTN은 양이온성 RTN보다 독성이 적다. 양이온성과 음이온성 RTN 제형 사이의 T-검정은 음이온성 RTN과 비교하여 양이온성 RTN이 유의하게 더 높은 독성을 가짐을 나타낸다(p-값 0.0276; p-값 컷 오프 유의성은 p<0.05임). 가장 높고 가장 유의한 독성은 OligoG와 조합된 RTN에서 볼 수 있다. 반면에, OligoM은 양이온성 RTN을 양이온성 RTN 단독보다 덜 독성으로 만들고 음이온성 RTN 독성에는 영향을 미치지 않는다.
논의
본 연구로부터 다음의 결론을 도출할 수 있다:
1. CF 점액은 정상 점액보다 RTN 전위를 더 많이 억제한다.
2. 음이온성 RTN은 정상 및 CF 점액 둘 모두에서 양이온성 RTN보다 더 효과적으로 전위된다.
3. Oligo M은 정상 및 CF 점액을 통한 양이온성 RTN 전위를 OligoG보다 훨씬 더 많이 향상시킨다.
4. OligoM은 음이온성 RTN의 전위에 유의한 영향을 미치지 않는다.
5. OligoM과 함께 사용될 때 양이온성 RTN은 본원에서 시험된 모든 시스템에서 가장 높은 확산 속도를 가진다.
6. 양이온성 RTN은 OligoM의 존재 또는 부재 하에 CF 점액을 통한 전위 이전의 형태에 비해 구조적으로 온전하고 실질적으로 변하지 않은 상태로 유지된다.
7. OligoM은 양이온성 RTN을 16HBE 세포를 덜 독성으로 만든다.
실시예 2 - 정상 및 CF 인간 기도 점액을 통한 양이온성 나노복합체의 전위에 대한 PEG화의 영향.
방법
양이온성 나노복합체 제형
각각 1:4:1의 중량비로 0, 5 또는 10% PEG(각각 2.5 μg/μL의 PEG)를 포함하는 DOTMA/DOPE 리포좀(0.5 μg/μL), 펩티드 Y(2 μg/μL) 및 Cy3-표지된 siRNA(0.5 μg/μL, Thermo Fisher Scientific)로 제조한 양이온성 나노복합체를 제형화하였다. 예컨대, 리포좀(1 μg) 및 펩티드 Y(4 μg)를 뉴클레아제가 없는 물(1 μL)에 첨가하였다. Cy3-표지된 siRNA (1 μg)를 이어서 혼합물에 첨가하고 신속하게 혼합하였다. 나노복합체를 빛으로부터 떨어진 실온에서 30 내지 40 분 동안 인큐베이션 하여 복합체를 형성하였다.
양이온성 나노복합체 특성분석
각각의 나노복합체의 크기 및 제타 전위를 Zetasizer Nano ZS를 사용하여 측정하였다. 나노복합체(0% PEG를 가진 양이온성의 경우 10 μL 또는 5 또는 10% PEG를 가진 것들의 경우 16.7 μL)를 MilliQ 물(최대 940 μL의 용액을 제조하는데 요구되는 부피)에 희석하였다. 920 μL의 각각의 희석된 나노복합체 샘플을 큐벳으로 옮기고 Zetasizer Nano ZS에 두어 이의 크기 및 이어서 제타 전위를 측정하였다.
트랜스웰 분석
실시예 1에 기술된 바와 같음
결과
각각 1:4:1의 중량비로 0, 5 또는 10% PEG를 가진 DOTMA/DOPE, 펩티드 Y 및 Cy3-표지된 siRNA로 제조된 양이온성 나노복합체를 제형화하였다. Cy3-표지된 siRNA는 형광을 측정하여 정상 및 CF 인간 점액을 통해 나노복합체 전위의 정량화를 가능케 하였다. 전위된 나노복합체의 누적 침투 및 농도를 정량화하고 플롯팅하였다. 각각의 나노복합체의 크기 및 제타 전위를 또한 측정하였다. 이는 각각 픽 및 스트로크 법칙을 사용하여 점액과 물에서 전위된 나노복합체의 확산 속도를 계산하기 위해 수행되었다. 종합해보면, 이러한 데이터는 정상 및 CF 점액을 통한 양이온성 나노복합체 전위에 대한 PEG화의 영향을 조사할 수 있도록 한다.
Figure pct00015
Figure pct00016
0, 5 및 10% PEG를 가진 전위된 양이온성 나노복합체의 확산 속도(섹션 3.2에 기술된 것들은 제외)를 픽 및 스트로크 법칙을 이용하여 각각 계산하였다.
표 14는 양이온성 나노복합체의 확산이 정상 점액과 비교하여 CF 점액에서 더 지연되었음을 보여준다. 0, 5 및 10% PEG를 가진 양이온성 나노복합체는 물과 비교할 때 정상 점액에서 각각 6.54-, 8- 및 10.7-배 더 느리게 확산되었다. 이는 PEG화가 정상 점액을 통해 양이온성 나노복합체의 전위를 약간 방해함을 시사한다. 0, 5 및 10% PEG를 가진 양이온성 나노복합체는 물과 비교할 때 CF 점액에서 각각 46.5-, 40.3- 및 43.1-배 더 느리게 확산하였다. 이는 PEG화가 OligoM 처리와는 달리, CF 점액을 통해 양이온성 나노복합체의 전위를 매우 미미하게 개선한다는 것을 시사한다.

Claims (39)

  1. 점액 층을 가로질러 양이온성 마이크로/나노입자를 전위시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
    (a) 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 점액 층을 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계; 또는
    (b)(i) 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
    (b)(ii) 상기 점액 층을 상기 단계 (b)(i)에서 제조된 상기 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 점막 표면의 상피 세포에 관심 분자를 전달하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 관심 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 점막 표면의 점액 층을 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계, 또는
    (b)(i) 상기 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
    (b)(ii) 상기 점막 표면의 점액 층을 상기 단계 (b)(i)에서 제조된 상기 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 마이크로/나노입자가 상기 관심 분자를 운반하거나 상기 분자가 이들의 마이크로/나노입자 형태로 제공되는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 관심 분자가 상기 마이크로/나노입자의 또 다른 성분에 공유결합되거나 상기 마이크로/나노입자의 다른 성분과 구별되는 방법.
  5. 점액 층을 가로질러 관심 분자를 전위시키는 방법으로서, 상기 방법은 점액 층을
    (i) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성되는 것으로서, 여기서 적어도 하나는 양이온성 마이크로/나노입자 형성제이고 적어도 하나는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머이고,
    (ii) 상기 관심 분자를 추가로 포함하는 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 선택적으로, 여기서 관심 분자는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합되는 방법.
  6. 점막 표면의 상피 세포에 관심 분자를 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 점막 표면의 점액 층을
    (i) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성되는 것으로서, 여기서 적어도 하나는 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머이고,
    (ii) 상기 관심 분자를 추가로 포함하는 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 선택적으로, 여기서 관심 분자는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합되는 방법.
  7. 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자로서, 여기서
    (i) 적어도 하나의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머이고,
    (ii) 상기 마이크로/나노입자가 관심 분자를 추가로 포함하며, 선택적으로 여기서 관심 분자는 하나 이상의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분에 공유결합되는 마이크로/나노입자.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로/나노입자가 양친매성 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 및/또는 바이러스 또는 바이러스 유사 입자의 구조적 성분을 포함하는 방법 또는 마이크로/나노입자.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이 양이온성 양친매성 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 및/또는 바이러스 또는 바이러스 유사 입자의 양이온성 구조적 성분인 방법 또는 마이크로/나노입자.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자가 치료적 및/또는 진단적 용도의 분자인 방법 또는 마이크로/나노입자.
  11. 점액 층을 가로지르는 치료적 또는 진단적 양이온성 마이크로/나노입자의 전위 방법에서 사용하기 위한, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머로서, 상기 방법은
    (a) 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 점액 층을 적어도 70%의 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계; 또는
    (b)(i) 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
    (b)(ii) 상기 점액 층을 상기 단계 (b)(i)에서 제조된 상기 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 알지네이트 올리고머.
  12. 대상의 점막 표면의 상피 세포에 치료적 또는 진단적 관심 분자를 전달하기 위한 방법에서 사용하기 위한, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머로서, 상기 방법은
    (a) 상기 치료적 또는 진단적 관심 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자와 함께, 점막 표면의 점액 층을 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시키는 단계; 또는
    (b)(i) 상기 치료적 또는 진단적 관심 분자를 포함하는 양이온성 마이크로/나노입자를 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 적어도 하나의 알지네이트 올리고머와 접촉시켜 상기 알지네이트 올리고머를 운반하는 마이크로/나노입자를 형성하는 단계, 및
    (b)(ii) 상기 점막 표면의 점액 층을 상기 단계 (b)(i)에서 제조된 상기 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 알지네이트 올리고머.
  13. 대상의 점액 층을 가로지르는 치료적 또는 진단적 관심 분자를 전위시키는 방법에서 사용하기 위한, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머로서, 상기 방법은
    (a) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자를 제조하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 상기 알지네이트 올리고머이고, 상기 마이크로/나노입자는 치료적 또는 진단적 관심 분자를 추가로 포함하고, 선택적으로 여기서 치료적 또는 진단적 분자는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합되는 단계 및
    (b) 상기 점액 층을 상기 단계 (a)에서 제조된 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 알지네이트 올리고머.
  14. 대상의 점막 표면의 상피 세포에 치료적 또는 진단적 관심 분자를 전달하기 위한 방법에서 사용하기 위한, 적어도 70% 만누로네이트 잔기를 가진 알지네이트 올리고머로서, 상기 방법은
    (a) 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분으로 형성된 마이크로/나노입자를 제조하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분은 양이온성 마이크로/나노입자 형성 성분이고 적어도 하나는 상기 알지네이트 올리고머이고, 상기 마이크로/나노입자는 상기 치료적 또는 진단적 관심 분자를 추가로 포함하고, 선택적으로 여기서 치료적 또는 진단적 분자는 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 성분 중 하나 이상에 공유결합되는 단계 및
    (b) 상기 점막 표면의 점액 층을 상기 단계 (a)에서 제조된 마이크로/나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 알지네이트 올리고머.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에서 별도로, 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 병용 제제로서 적어도 70% 만누로네이트 잔기 및 양이온성 마이크로/나노입자를 가진 알지네이트 올리고머를 함유하는 제품.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 점액 층이
    (i) CFTR 기능부전에 의해 영향을 받은 것,
    (ii) 호흡계, 예컨대 코, 비강, 인두, 후두, 기관, 부비동, 기관지 또는 세기관지,
    (iii) 위장관, 예컨대 입, 인두, 식도, 위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 또는 항문,
    (iv) 췌장 및/또는 담관.
    (v) 여성 생식계, 예컨대 질, 자궁 경부, 자궁, 나팔관 또는 난소,
    (vi) 남성 생식계, 예컨대 고환, 부고환, 정관, 부속선, 정낭, 전립선 또는 쿠퍼선의 점막 표면의 점액층인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로/나노입자가 약 1 μm 내지 약 500 μm, 약 10 μm 내지 약 200 μm 또는 약 10 μm 내지 약 100 μm의 마이크로입자인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로/나노입자가 약1 nm 내지 약 1,000 nm, 약 30 nm 내지 약 400 nm, 약 100 nm 내지 약 350 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 50 nm의 나노입자인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로/나노입자가 소낭, 미셀, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 덴드리머, 금속/금속 입자, 탄소 나노튜브, 실리카 입자, 중합체 입자인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  20. 제19항에 있어서, 상기 소낭이 리포좀, 리포플렉스, 폴리머좀, 노이솜, 또는 이들의 하이브리드인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로/나노입자가 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), 2,3-디올레오일옥시 트리메틸암모늄 프로판(DOTAP), 2,3-디-(올레일옥시)프로필 트리메틸 암모늄 (DOTMA), N-[1-(2,3,-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE), N-[1-(2,3,디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시 에틸암모늄 브로마이드(DORIE), 3β-[Ν-(Ν',Ν'-디메틸아미노에탄) 카바모일]콜레스테롤(DC-Choi), 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB), 디옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS) 및 N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민(DODMA)으로부터 선택되는 양이온성 지질을 포함하는 리포좀 또는 리포플렉스인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로/나노입자가 양친매성 자가-조립 마이크로/나노입자 형성 화합물로 형성되고 벌크 생성 방법에 의해 제조되거나 소낭 마이크로/나노입자의 제조의 미세유체 생성 방법에 의해 제조되는 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로/나노입자가 핵산 벡터 또는 이종 펩티드를 운반하는 바이러스이거나 종양 용해성 바이러스인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  24. 제23항에 있어서,
    (i) 핵산 벡터 또는 이종 펩티드를 운반하는 상기 바이러스가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 수두 바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 이들의 하이브리드이거나,
    (ii) 상기 종양 용해성 바이러스가 아데노바이러스, 레오바이러스, 홍역 바이러스, 헤르페스 단순 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 폴리오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 우두 바이러스, 세네카 바이러스, 마라바 바이러스 또는 엔테로바이러스인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  25. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 마이크로/나노입자가 폴리스티렌, 폴리락트산, 폴리아크릴아미드, 멜라민, 폴리(D-L-락티드), 폴리-D-L-글리콜리드, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리(락티드-co-글리콜리드) PLA, 폴리카프로락톤, 키토산, 젤라틴, 알부민, 덱스트란, 아가로스, 폴리-L-글루탐산, 폴리 L-리신을 포함하는 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  26. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속/금속 입자가 금(예컨대 198Au, 199Au), 은(예컨대 107Ag 및 109Ag), 백금(예컨대 195mPt), 철(예컨대 59Fe), 구리(예컨대 61Cu, 64Cu, 및 67Cu), 가돌리늄(예컨대 149Gd, 151Gd), 인듐(예컨대 111ln), 테크네튬(예컨대 99mTc), 갈륨(예컨대 67Ga, 68Ga), 레늄(예컨대 188Re,186Re), 루테튬(예컨대 177Lu), 악티늄(예컨대 225Ac), 이트륨(예컨대 90Y), 안티모니(예컨대 119Sb), 주석(예컨대 117Sn, 113Sn), 디스프로슘(예컨대 159Dy), 코발트(예컨대 56Co, 60Co), 루테늄(예컨대 97Ru, 103Ru,106Ru), 팔라듐(예컨대 103Pd), 카드뮴(예컨대 115Cd), 텔루륨(예컨대 118Te, 123Te), 바륨(예컨대 131Ba, 140Ba), 테르븀(예컨대 160Tb), 란타늄(예컨대 140La), 라듐(예컨대 223Ra, 224Ra), 스트론튬(예컨대 89Sr), 사마륨(예컨대 153Sm), 이테르븀(예컨대 169Yb), 탈륨(예컨대 201TI), 세슘(예컨대 137Cs), 이리듐(예컨대 192Ir) 및 루비듐(예컨대 82Rb)을 포함하는 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  27. 제26항에 있어서, 상기 금속/금속 입자가 마이크로/나노스피어, 마이크로/나노스타, 마이크로/나노케이지 또는 마이크로/나노쉘인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  28. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실리카 마이크로/나노입자가 메조기공 실리카를 포함하는 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  29. 제2항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 분자가 치료 활성제, 진단제, 영상화제, 세포 또는 세포가 생산하는 산물의 특성을 조작하기 위한 제제인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  30. 제29항에 있어서, 상기 치료 활성제가 소분자 약제, 생물학적 치료제 또는 방사성약제인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  31. 제30항에 있어서, 상기 생물학적 치료제가 항체, 펩티드 호르몬, 사이토카인, 펩티드 성장 인자, 펩티드 항원 또는 핵산인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  32. 제31항에 있어서, 상기 치료 활성제가 CFTR 조절제, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 세포독성 화학요법제, 혈관신생 억제제, 항암 단클론 항체, 방사선면역요법제, 면역자극제, 면역억제제, 코르티코스테로이드, 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID), 기관지 확장제, 경구 항당뇨병제, 또는 방사선약제인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 치료 활성제가 유전자 치료, 유전자 편집, RNA 간섭 치료(예컨대 siRNA 또는 miRNA), 안티센스 요법 및 시험관 내 전사된 mRNA 요법에서 사용하기 위한 핵산인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  34. 제29항에 있어서, 상기 진단제가 방사성핵종, 조영제 또는 분자 프로브로서 사용하기 위한 핵산 또는 단백질인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  35. 제29항에 있어서, 상기 세포 조작제가 뉴클레아제(예컨대 Cas9, Cpf1), 프로테아제, 리파제, 보조인자, 전구체 화합물 또는 기질인 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알지네이트 올리고머가 35,000 달톤 미만, 바람직하게는 30,000, 25,000 또는 20,000 달톤 미만의 평균 분자량을 갖는 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알지네이트 올리고머가
    (i) 2 내지 100, 2 내지 75, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 35, 2 내지 30, 2 내지 28, 2 내지 25, 2 내지 22, 2 내지 20, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 15 또는 2 내지 12,
    (ii) 4 내지 100, 4 내지 75, 4 내지 50, 4 내지 35, 4 내지 30, 4 내지 25, 4 내지 22, 4 내지 20, 4 내지 18, 4 내지 16 또는 4 내지 14,
    (iii) 6 내지 50, 6 내지 35, 6 내지 30, 6 내지 25, 6 내지 22, 6 내지 20, 6 내지 18, 6 내지 16 또는 6 내지 14, 또는
    (iv) 8 내지 50, 8 내지 35, 8 내지 30, 8 내지 25, 10 내지 25, 10 내지 22, 10 내지 20, 10 내지 18, 또는 10 내지 15의 중합도(DP), 또는 수 평균 중합도(DPn)을 갖는 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알지네이트 올리고머가 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 또는 약 100% M 잔기를 갖는 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 80%의 M 잔기가 M-블록에 배열되어 있는 방법, 마이크로/나노입자, 알지네이트 올리고머 또는 제품.
KR1020207029962A 2018-03-19 2019-03-19 점액 층을 가로지르는 마이크로/나노입자의 전위를 향상시키기 위한 알지네이트 올리고머의 용도 KR20200136430A (ko)

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