CN111840557A

CN111840557A - 磷酸二酯酶4抑制剂的用途

Info

Publication number: CN111840557A
Application number: CN202010348196.9A
Authority: CN
Inventors: 王淼; 万青; 徐传胜
Original assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2019-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明涉及治疗或预防血管疾病的药物和方法。具体而言，本发明涉及通过下调磷酸二酯酶4而治疗或预防血管内皮功能紊乱相关疾病的方法，以及磷酸二酯酶4抑制剂在制备用于治疗或预防血管内皮功能紊乱相关疾病的药物中的用途。

Description

磷酸二酯酶4抑制剂的用途

技术领域

背景技术

血管内皮细胞参与促进血管舒张、抑制平滑肌增生以及抑制血管内皮炎症等一系列过程，以维持血管内稳态。而内皮功能紊乱显著提高了心血管疾病的风险。

目前临床上能改善血管内皮功能的药物均会导致患者产生一定的药物不良反应，如他汀类药物长期使用会引起肌痛，使患者难以长期耐受；双胍类药物会引起胃肠障碍或偶尔引起乳酸性酸中毒；噻唑烷衍生物会引起体液贮留或体重增加、肝功能障碍等严重副作用。因此，寻求安全而有效的血管内皮功能紊乱相关疾病的治疗药物十分有必要。

磷酸二酯酶4(PDE4)是一种cAMP代谢酶，其在调节炎症过程中发挥重要作用，通过抑制磷酸二酯酶4，特别是抑制其B亚型(PDE4B)来实现抑制炎症(Komatsu等，Naturecommunications.2013；4:1684)。由于抑制中性粒细胞过度活化的活性，PDE4抑制剂被研究作为抗炎剂(Suzuki等，Acta pharmaceutica(Zagreb,Croatia).2015；65:191-197)。

虽然现有技术已报道磷酸二酯酶4具有多种生物活性，但至今还未报道过磷酸二酯酶4抑制剂能够直接减轻血管内皮功能紊乱或改善血管内皮功能及其作用机制。

发明内容

在一方面，本发明提供了一种治疗或预防对象的血管内皮功能紊乱相关疾病的方法，包括给所述对象施用含有有效量的磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂的药物组合物，所述抑制剂抑制PDE4的表达和/或活性。

在另一方面，本发明涉及PDE4抑制剂在制备用于治疗或预防对象的血管内皮功能紊乱相关疾病的药物组合物中的用途，所述抑制剂抑制PDE4的表达和/或活性。

在又一方面，本发明提供了含有有效量的PDE4抑制剂的药物组合物，其用于治疗或预防对象的血管内皮功能紊乱相关疾病，所述抑制剂抑制PDE4的表达和/或活性。

在本发明所述方面的实施方案中，PDE4抑制剂为选择性PDE4抑制剂。

在本发明所述方面的具体实施方案中，选择性PDE4抑制剂选自吡拉米司特、咯利普兰、AN-2728、AN-2898、CBS-3595、ELB-353、KF-66490、K-34、LAS-37779、IBFB-211913、AWD-12-281、西潘茶碱、西洛司特、罗氟司特、BAY19-8004和SCH-351591、AN-6415、indus-82010、TPI-PD3、ELB-353、CC-11050、GSK-256066、奥米司特、OX-914、替托司特、MEM-1414和RPL-554及其衍生物、溶剂合物、多晶型物、前药、活性代谢物和/或这些化合物的药学上可接受的盐。

在本发明所述方面的一个具体实施方案中，选择性PDE4抑制剂为吡拉米司特。在本发明所述方面的另一个具体实施方案中，选择性PDE4抑制剂为咯利普兰。在本发明所述方面的又一个具体实施方案中，选择性PDE4抑制剂为罗氟司特。

在本发明所述方面的实施方案中，选择性PDE4抑制剂可直接作用于血管内皮细胞。

在本发明所述方面的实施方案中，选择性PDE4抑制剂可抑制炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用。因此，在一些实施方案中，所述血管内皮功能紊乱相关疾病是以炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用为特征或由炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用介导的疾病。

在本发明所述方面的实施方案中，血管内皮功能紊乱相关疾病是动脉粥样硬化。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化以血管内皮功能紊乱为特征或由血管内皮功能紊乱介导。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化以炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用为特征或由炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用介导。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化以内皮依赖性血管舒缩受损为特征或由内皮依赖性血管舒缩受损介导。

在本发明所述方面的另一实施方案中，血管内皮功能紊乱相关疾病是心肌缺血、缺血-再灌注损伤、高血压、动脉瘤、心梗后心力衰竭、血管成形术后再狭窄、动脉炎、糖尿病、肥胖症、代谢综合征、或其任意组合。在一些实施方案中，上述疾病以血管内皮功能紊乱为特征或由血管内皮功能紊乱介导。在一些实施方案中，上述疾病以炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用为特征或由炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用介导。在一些实施方案中，上述疾病以内皮依赖性血管舒缩受损为特征或由内皮依赖性血管舒缩受损介导。

在本发明所述方面的一个具体实施方案中，所述对象患有动脉粥样硬化，且进一步患有高脂血症、糖尿病、肥胖症、代谢综合征或其他代谢性疾病。在本发明所述方面的另一个具体实施方案中，所述对象患有动脉粥样硬化，且进一步患有心肌缺血、心肌缺血-再灌注损伤、心肌梗塞、动脉瘤、心梗后心力衰竭、血管成形术后再狭窄、动脉炎、高血压或其任意组合。

在本发明所述方面的另一实施方案中，血管内皮功能紊乱相关疾病为任何部位的组织缺血-再灌注损伤。

在本发明所述方面的实施方案中，所述药物组合物以片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂施用。

在本发明所述方面的实施方案中，所述药物组合物通过口服、含服、吸入、静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射或冠脉内施用的方式施用给对象。

在另一方面，本发明提供了一种经皮腔内血管成形术装置，其包括球囊或支架，其中所述装置包含或涂覆有PDE4抑制剂。

附图说明

图1示出小鼠和人损伤的内皮细胞表达PDE4B的表达的代表性切片，Bar＝50μm。图1A分别为在小鼠正常心脏和IR达24小时后心脏的切片中，对PDE4B(红色)和vWF(内皮细胞标志物，绿色)进行免疫荧光染色，图1B为来自室壁瘤患者的心脏切片的免疫荧光染色。

图2示出PDE4B在IR达24小时后心脏中的表达。左图为小鼠正常心脏和IR损伤心脏中PDE4B的相对蛋白表达水平；右图示出所有四种PDE4亚型的mRNA相对量。

图3示出PDE4B缺失可减轻小鼠心肌缺血-再灌注损伤。图3A示出对照组和PDE4BKO组伊文思蓝灌注心脏的TTC染色横切面的代表性照片。图3B和图3C分别示出PDE4B KO和对照小鼠在I/R后24小时定量的梗塞面积(IS)和风险面积(AAR)。图3D显示了代表性超声心动图，图3E-3G分别显示了缩短分数(FS％)、射血分数(EF％)、面积变化分数(FAC％)。图3B、C、E、F、G分别进行非配对学生t检验(n＝10)，*P<0.05，**P<0.01，N.S.表示非显著。

图4示出PDE4B缺失有助于改善MI/R的微血管血流恢复，Bar＝50μm。图4A显示了在每个不同时间点的代表性血流图像。图4B显示了血流量的相对变化(相对于基线的百分比变化)。图4C是在心脏冰冻切片上进行的髓过氧化物酶(MPO，绿色)和DAPI(核染色，蓝色)的免疫荧光染色的代表性照片，并且定量缺血区域中的MPO阳性细胞。图4B进行two-wayANOVA的Bonferroni检验(n＝7)。图4C进行非配对学生t检验(n＝6)，*P<0.05，**P<0.01。

图5示出PDE4B缺失改善下肢缺血-再灌注后的血流恢复。图5A显示了在每个时间点的代表性灌注图像。图5B记录在释放动脉结扎之前和之后的指定时间点微血管血流量相对于基线的变化。图5B进行two-way ANOVA的Bonferroni检验(n＝11,12)。在缺血之前的基线，所测定的对照和PDE4B KO小鼠之间组织灌注没有差异(89.16±3.14对94.52±2.77PU，p＝0.237，非配对学生t检验)。

图6示出PDE4B缺失可减少中性粒细胞-内皮(EC)细胞相互作用，并抑制由LPS和ATP诱导的促炎性因子IL-1β的产生。图6A显示了每种处理条件下细胞粘附的代表性照片。图6B显示在C5a存在时呈现相对于无刺激条件下粘附细胞的倍数变化，细胞基因型标记在每列下方。图6C显示用LPS加ATP共同刺激中性粒细胞6小时后，由ELISA检测的IL-1β水平。所有结果都来自至少3个独立的数据集。图6B进行one-way ANOVA的Tukey多重比较检验(n＝10-12)。图6C进行非配对学生t检验(n＝6)。结果以平均值±SEM表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图7显示来源于PDE4B敲除的骨髓细胞的小鼠表现出可明显减轻心肌缺血-再灌注损伤。图7A示出通过骨髓移植产生嵌合小鼠的示意图。图7B示出骨髓移植后淋巴细胞(LYM)、中性粒细胞(NE)和单核细胞(MON)占白细胞的百分比。图7C和图7D从左至右分别示出野生型骨髓移植到野生型小鼠、野生型骨髓移植到PDE4B KO小鼠、PDE4B KO骨髓移植到野生型小鼠、PDE4B KO骨髓移植到PDE4B KO小鼠后，在I/R后定量的梗塞面积(IS)和风险面积(AAR)。

图8示出野生型骨髓移植到野生型小鼠、野生型骨髓移植到PDE4B KO小鼠、PDE4BKO骨髓移植到野生型小鼠、PDE4B KO骨髓移植到PDE4B KO小鼠后，在I/R的指定时间点下肢微血管血流量相对于基线的变化。

图9示出吡拉米司特(PICL)减少中性粒细胞-内皮细胞相互作用、改善心脏微循环并防止MI/R损伤。图9A显示了注射载体组和注射10mg/kg吡拉米司特组的伊文思蓝灌注心脏的TTC染色横切面的代表性照片。图9B和图9C分别为定量的梗塞面积和风险面积。图9D-9G分别显示了代表性超声心动图、缩短分数(FS％)、射血分数(EF％)、以及面积变化分数(FAC％)。图9H显示代表性灌注图像，图9I显示灌注结果的统计。图9J显示了通过流式细胞术检测缺血心脏组织中噬中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)，并定量细胞计数和CD11b⁺细胞中中性粒细胞的百分比。图9K显示对心脏切片进行针对MPO的免疫荧光染色以及MPO阳性细胞数量的定量。图9L和M分别显示有或无C5a时，在各浓度吡拉米司特处理条件下的细胞粘附。图9N显示由LPS和ATP诱导的中性粒细胞在各浓度吡拉米司特处理下IL-1β的产生。图9B和C进行one way ANOVA的Dunn多重比较检验(n＝10,9,11)。图9E、F和G进行非配对学生t检验(n＝9,8)，图9K进行非配对学生t检验(n＝6)。图9I进行two-way ANOVA的Bonferroni检验(n＝8)。图9J进行one-way ANOVA的Tukey多重比较检验(n＝9-11)。*P<0.05，**P<0.01，N.S.表示非显著。

图10示出I/R后，吡拉米司特改善下肢再灌注损伤。图10A显示了在每个时间点的代表性血流图像。图10B显示在释放动脉结扎之前和之后的指定时间点记录相对于基线的微血管血流量。图10B进行two-way ANOVA的Bonferroni检验(n＝10)。

图11示出LPS加ATP刺激下PDE4在内皮细胞(EC)和中性粒细胞中的表达。图11A显示四种PDE4亚型在内皮细胞(EC)中的表达。图11B显示在LPS加ATP处理6小时后，PDE4在中性粒细胞中的表达。

图12示出利用ApoE^SA/SA小鼠模型研究PDE4抑制剂咯利普兰对动脉粥样硬化病变的影响。图12A-B为胸主动脉的染色统计分析(**P<0.01)，图12C-D为心脏冠脉的染色统计分析(*P<0.05)。

图13示出吡拉米司特对血管张力的影响。图13A为加入乙酰胆碱(Ach)和吡拉米司特对血管舒张的影响，图13B为加入硝普钠(SNP)和吡拉米司特对血管舒张的影响。

图14示出罗氟司特减轻小鼠心肌缺血-再灌注损伤。图14A和图14B分别示出注射载体组和注射1mg/kg罗氟司特(roflumilast)组小鼠在I/R 24小时后伊文思蓝灌注心脏的TTC染色横切面所定量的梗塞面积(A)和风险面积(B)统计结果。图14A、B分别进行非配对学生t检验(n＝5,6)，结果以平均值±SEM表示，*P<0.05，N.S.表示非显著。

具体实施方式

本发明人令人惊奇地发现，PDE4的表达在小鼠心肌缺血-再灌注(IR)心脏的血管内皮和人类动脉瘤患者的血管内皮中显著增加，PDE4表达的上调导致骨髓衍生的白细胞(主要是中性粒细胞)对心脏组织浸润的增加，并产生了多种促炎细胞因子，从而引起心脏重塑和功能障碍。本发明人还发现，抑制PDE4的活性可减少动脉粥样硬化的发生以及促进血管舒张。

如本文所用，“血管内皮”通常指衬于血管内表面的单层扁平上皮，也称内皮细胞。在炎症时高表达粘附分子，与血流中白细胞表面粘附分子相互作用，从而介导白细胞穿越血管壁。内皮细胞或血管内皮是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成。它形成血管的内壁，是血管管腔内血液及其他血管壁(单层鳞状上皮)的接口。内皮细胞亦属一类非专职抗原提呈细胞，他们吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，还参与集体免疫活动，包括：血管收缩及血管舒张，从而控制血压；凝血(血栓形成及纤维蛋白溶解)；动脉粥样硬化；血管生成；炎症及肿胀(如浮肿)；内皮细胞亦控制一些物质，如白细胞进出血管等。

如本文所用，术语“血管内皮功能紊乱”在临床上通常评估为内皮依赖性血管舒缩受损，例如血管舒张与血管收缩之间不平衡，是内皮细胞的生理学失能，阻止其执行其正常生物化学功能。正常内皮细胞参与介导凝血、血小板粘附、免疫功能、容量控制及血管内与血管外空间的电解质内容物等过程。内皮功能紊乱与动脉壁内的促炎性、促氧化性及促凝血性变化以及增加的血管壁厚度和胶原含量相关。内皮功能紊乱被视为动脉粥样硬化及动脉僵硬发展及进展中的重要事件，且出现在临床上明显的血管并发症之前。内皮功能紊乱对于检测血管疾病及预测不利的血管事件具有预后意义。动脉粥样硬化及血管疾病/事件的风险因素与内皮功能紊乱相关。内皮损伤还导致急性肾脏损伤和/或慢性或进行性肾脏损伤，例如肾小管间质纤维化、肾小球肾炎、微量或大量蛋白尿、肾病和/或慢性肾病或肾衰竭。有证据表明氧化应激不仅导致内皮功能紊乱或损伤，而且导致血管疾病。

“血管内皮功能紊乱相关疾病”是指其发生与“血管内皮功能紊乱”相关的疾病，其实例包括但不限于动脉粥样硬化、高脂血症、糖尿病、肥胖症、代谢综合征或其他代谢性疾病、心肌缺血、心肌缺血-再灌注损伤、心肌梗塞、动脉瘤、心梗后心力衰竭、血管成形术后再狭窄、动脉炎、高血压或其任意组合。

如本文所用，术语“对象”是指哺乳动物，优选灵长类动物。或者如本文所用，术语“对象”是指人。在本发明的实施方案中，术语“对象”或“患者”可互换使用。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料、药物或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所需的量。对患者施用本发明药物的实际剂量可根据以下身体和生理因素来确定：体重、性别、症状严重程度、所治疗疾病的类型、先前或当前的治疗干预、患者的未知病因疾病、施用时间、具体化合物的排泄率以及施用途径。在任何情况下，将由负责施用的医务人员确定组合物中活性成分的浓度以及用于个体对象的合适剂量。

如本文所用，术语“抑制剂”是指能够降低或消除PDE4的表达和/或活性的任何物质，包括但不限于拮抗性抗体或抗体片段、干扰RNA分子、双链RNA(dsRNA)、小分子或抑制PDE4表达的核酸分子或表达载体等。

在本发明的实施方案中，PDE4抑制剂为选择性PDE4抑制剂。

如本文所用，用于抑制剂时，术语“选择性”和“特异性”可互换使用，意指所述抑制剂仅对于所述靶具有抑制作用，或者相对于对其它化合物或分子的抑制作用，对所述靶的抑制作用更高。

可用于本发明的选择性PDE4抑制剂包括但不限于吡拉米司特、咯利普兰、AN-2728、AN-2898、CBS-3595、ELB-353、KF-66490、K-34、LAS-37779、IBFB-211913、AWD-12-281、西潘茶碱、西洛司特、罗氟司特、BAY19-8004和SCH-351591、AN-6415、indus-82010、TPI-PD3、ELB-353、CC-11050、GSK-256066、奥米司特、OX-914、替托司特、MEM-1414和RPL-554及其衍生物、溶剂合物、多晶型物、前药、活性代谢物和/或这些化合物的药学上可接受的盐。

在本发明的一个具体实施方案中，选择性PDE4抑制剂为吡拉米司特。在本发明的另一个具体实施方案中，选择性PDE4抑制剂为咯利普兰。在本发明的又一个具体实施方案中，选择性PDE4抑制剂为罗氟司特。

在本发明的实施方案中，选择性PDE4抑制剂可直接作用于血管内皮细胞。在本发明的实施方案中，选择性PDE4抑制剂可直接缓解血管内皮功能紊乱。

在本发明的实施方案中，选择性PDE4抑制剂可抑制炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用。因此，在一些实施方案中，所述血管内皮功能紊乱相关疾病是以炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用为特征或由炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用介导的疾病。

如本文所用，术语“炎性细胞”为参与炎症反应的细胞，包括白细胞。所述白细胞为一类人体内的免疫细胞，根据其形态、功能和来源部位可以分为三大类：粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，其中粒细胞又可根据胞质中颗粒的染色性质不同，分为中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞三种。在本发明的具体实施方案中，“炎性细胞”为“中性粒细胞”。

在本发明的实施方案中，血管内皮功能紊乱相关疾病是动脉粥样硬化。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化以血管内皮功能紊乱为特征或由血管内皮功能紊乱介导。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化以炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用为特征或由炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用介导。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化以内皮依赖性血管舒缩受损为特征或由内皮依赖性血管舒缩受损介导。动脉粥样硬化是一种发生在血管内皮的炎性疾病，其由多种因素包括高血压引起。动脉粥样硬化的进一步发展可阻塞动脉腔，引起心肌缺血、心肌缺血-再灌注损伤、心肌梗塞、动脉瘤、心梗后心力衰竭、血管成形术后再狭窄等危及生命的心血管疾病。

在本发明的实施方案中，血管内皮功能紊乱相关疾病还是心肌缺血、心肌缺血-再灌注损伤、心肌梗塞、动脉瘤、心梗后心力衰竭、血管成形术后再狭窄、动脉炎、高血压或其任意组合。在一些实施方案中，上述疾病以血管内皮功能紊乱为特征或由血管内皮功能紊乱介导。在一些实施方案中，上述疾病以炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用为特征或由炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用介导。在一些实施方案中，上述疾病以内皮依赖性血管舒缩受损为特征或由内皮依赖性血管舒缩受损介导。

在本发明的实施方案中，所述对象患有动脉粥样硬化。

在本发明的一个具体实施方案中，所述对象患有动脉粥样硬化，和/或进一步患有高脂血症、糖尿病、肥胖症、代谢综合征或其他代谢性疾病。

在本发明的另一个具体实施方案中，所述对象患有动脉粥样硬化，和/或进一步患有心肌缺血、心肌缺血-再灌注损伤、心肌梗塞、动脉瘤、心梗后心力衰竭、血管成形术后再狭窄、动脉炎、高血压或其任意组合。

在本发明的另一实施方案中，血管内皮功能紊乱相关疾病为任何部位的组织缺血-再灌注损伤。

在本发明的实施方案中，本发明的药物组合物以片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂施用。

在另一实施方案中，本发明的药物组合物通过口服、含服、吸入、静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射或冠脉内施用的方式施用给对象。在一个具体实施方案中，本发明的PDE4抑制剂用于冠脉内施用。

本发明的药物组合物可以原样使用，或在一些实施方案中，与合适的药物载体、载剂或包含惰性成分的赋形剂组合使用。本发明的药物组合物还指直接或间接地由任何两种或更多种成分的组合、络合或聚集，或由一种或多种成分的解离，或由一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用产生的任何产物。通常，药物组合物通过以下进行制备：将活性成分与液体载体、载剂或赋形剂或细碎的固体载体、载剂或赋形剂或两者均匀且紧密地混合，之后，若有必要，使产品成型成为所需的制剂。药物组合物包含足够的活性成分以产生所需的效果，在本发明中，所述活性成分是PDE4抑制剂，具体来说是选择性PDE4抑制剂。

本文使用的“药学可接受的载体”是指载体、载剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容，对其接受者无害。包括任何和所有的溶剂、分散介质、抗氧化剂、盐、包衣、表面活性剂、防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸、抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、溶液阻滞剂(例如石蜡)、吸附剂(例如，高岭土、膨润土)、药物稳定剂(例如，十二烷基硫酸钠)、凝胶、粘合剂(例如，糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、藻酸盐)、赋形剂(例如，乳糖、聚乙二醇)、崩解剂(例如琼脂、淀粉、乳糖、磷酸钙、碳酸钙、海藻酸、山梨醇、甘氨酸)、润湿剂(例如，十六烷醇、单硬脂酸甘油酯)、润滑剂、吸收促进剂(例如，季铵盐)、可食用油(例如，杏仁油、椰油、油性酯或丙二醇)、甜味剂、调味剂、着色剂、填充剂(例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、硅酸)、压片润滑剂(例如，硬脂酸镁、淀粉、葡萄糖、乳糖、白垩)、吸入用载体(例如，烃抛射剂)、缓冲剂或诸如此类的物质及其组合。

合适的药物组合物的制备是本领域技术人员根据本公开内容已知的，并示例于“Remington：The Science and Practice of Pharmacy，”第21版，2005，其通过参考并入本文中。另外，对于人类施用来说，应当理解，制备还应满足药物审批机构所要求的对无菌性、热原性、整体安全性以及纯度的标准。

基于本领域常识，本领域技术人员知晓适用于所需药物组合物的载体和赋形剂，例如抗氧化剂、分散剂、乳化剂、防腐剂、增溶剂、着色剂、络合剂、防腐剂、调味剂、缓冲剂、粘度调节剂、表面活性剂、助剂、粘合剂、润滑剂、载体、稀释剂、稳定剂或渗透促进剂。通过适当选择助剂和/或赋形剂，可以实现精确适合所述活性化合物和/或所需起效的药物给药形式(例如缓释形式或肠溶形式)。

本发明的药物组合物以不同频率施用于有此需要的对象，该频率可随着血管内皮功能紊乱相关疾病的严重性而变化。本领域技术人员可以容易地根据给药途径及患者临床状况确定施用频率。频率范围可是每天三次至每二周或每三周一次，例如每天三次、每天两次、每天一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周一次、每二周一次、或每三周一次。

本发明的PDE4抑制剂，例如吡拉米司特、咯利普兰和罗氟司特，可以以一次或多次剂量给予，剂量水平可是0.5至100mg/kg(体重)、1至50mg/kg(体重)、5至20mg/kg(体重)或5至10mg/kg(体重)。

本发明的PDE4抑制剂，例如吡拉米司特、咯利普兰和罗氟司特，每日施用约1mg/kg(体重)至约20mg/kg(体重)、约2mg/kg(体重)至约20mg/kg(体重)、约3mg/kg(体重)至约20mg/kg(体重)、约4mg/kg(体重)至约20mg/kg(体重)、约5mg/kg(体重)至约20mg/kg(体重)、约6mg/kg(体重)至约20mg/kg(体重)、约7mg/kg(体重)至约20mg/kg(体重)、约8mg/kg(体重)至约20mg/kg(体重)、约9mg/kg(体重)至约20mg/kg(体重)、约10mg/kg(体重)至约20mg/kg(体重)、约11mg/kg(体重)或更多、约12mg/kg(体重)或更多、约13mg/kg(体重)或更多、约14mg/kg(体重)或更多、约15mg/kg(体重)或更多、约16mg/kg(体重)或更多、约17mg/kg(体重)或更多、约18mg/kg(体重)或更多、约19mg/kg(体重)或更多、或约20mg/kg(体重)或更多。在某些实施方案中，本发明的PDE4抑制剂，例如吡拉米司特、咯利普兰和罗氟司特，每日施用约10.0mg/kg(体重)的剂量。在某些实施方案中，该药物组合物每日通过皮下施用约5.0mg/kg(体重)的剂量。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物单位剂型可以含有0.1至10mg活性化合物，例如约0.1mg活性化合物、0.2mg活性化合物、0.3mg活性化合物、0.4mg活性化合物、0.5mg活性化合物、0.6mg活性化合物、0.7mg活性化合物、0.8mg活性化合物、0.9mg活性化合物、1.0mg活性化合物、1.5mg活性化合物、2.0mg活性化合物、2.5mg活性化合物、3.0mg活性化合物、3.5mg活性化合物、4.0mg活性化合物、4.5mg活性化合物、5.0mg活性化合物、5.5mg活性化合物、6.0mg活性化合物、6.5mg活性化合物、7.0mg活性化合物、7.5mg活性化合物、8.0mg活性化合物、8.5mg活性化合物、9.0mg活性化合物、9.5mg活性化合物、10mg活性化合物。

本发明的药物组合物可以是例如片剂、包衣片剂、胶囊剂、小胶囊剂、栓剂、膜剂、乳剂、混悬液、凝胶剂或溶液的形式。在一些实施方案中，本文所述的药物包含约0.05至约99重量％(基于总制剂的重量百分比)总量的活性化合物。在其它实施方案中，本文所述的药物包含在约0.10至约70重量％总量的活性化合物。在其它实施方案中，本文所述的药物包含在约0.10至约50重量％总量的活性化合物。通过适当选择助剂和/或赋形剂，可以实现精确适合所述活性化合物和/或所需起效的药物给药形式(例如延迟释放形式或肠溶形式)。

在本发明的实施方案中，本发明提供了用于治疗对象的血管内皮功能紊乱相关疾病的药物组合物，其包含PDE4抑制剂以及其他常规的临床治疗心血管疾病的药物。在具体实施方案中，本发明的药物组合物能够防止白细胞对内皮细胞粘附和浸润。在具体实施方案中，本发明的药物组合物能够减轻动脉粥样硬化的发生以及斑块的形成。在具体实施方案中，本发明的药物组合物能够促进血管舒张。

在另一实施方案中，本发明还提供了用于预防或治疗对象任何部位的组织缺血-再灌注损伤的药物组合物，其包含PDE4抑制剂和其他常规药物。

实施例

在此描述的实施例是用于说明的目的，并不意在限制本发明的范围，本领域技术人员可以根据本发明的精神和教导对具体步骤进行修改。除非另有规定或从内容明显看出，否则所记载的与一些实施方案有关的任何特征可以与任何其他实施方案来结合使用。

实施例1：材料和方法

动物

建立PDE4亚型B敲除(PDE4B KO)小鼠并且与C57BL/6J小鼠回交超过10次。敲除(KO)小鼠和同窝对照由杂合小鼠杂交(或与纯合KO小鼠杂交)产生。鉴于在杂合和野生型同窝小鼠之间未检测到表征表型的差异，将这些对照小鼠合并在一起用于进一步分析。C57BL/6J野生型(WT，Ptges+/+)或衍生自Ptges-/-与Ptges+/+(或+/-)繁殖的Ptges+/-小鼠用作PDE4B KO小鼠的对照。

将PDE4抑制剂吡拉米司特(PICL-H：10mg/kg；PICL-L：5mg/kg)或载体在左冠状动脉结扎后和再灌注12小时后腹膜内施用于雄性C57BL/6J小鼠(8-12周龄)。再灌注24小时后牺牲小鼠以收集样品。

所有动物方案均遵循中国国家心血管病中心阜外医院实验动物中心动物管理和实验委员会的指导。

人类心脏室壁瘤样本

人类心脏室壁瘤样本得自阜外医院收治的5例室壁瘤患者。在修复手术期间收集样品，在10％福尔马林缓冲剂中固定过夜，并进一步处理以用于石蜡包埋和组织切片。样本采集由阜外医院医学伦理委员会批准，并从每位患者处获取书面知情同意书。

统计分析

用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，California，USA)进行统计分析。学生t检验(双尾，非配对)用于两组比较。当涉及时间因素时，使用two-way ANOVA进行数据比较。使用one-way ANOVA进行多组比较。two-way ANOVA或one-wayANOVA后，进行事后检验，除非另有说明，均进行Bonferroni校正。数据表示为平均值±SEM。P值<0.05被认为是显著的并用星号标记(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。

心肌缺血/再灌注(I/R)小鼠模型

如Gao等人(Circ Res.2010；107:1445-1453)所述，使用无人工通气的方法诱导心肌I/R损伤。简言之，吸入3％异氟烷麻醉小鼠，接着吸入1.5-2％异氟烷以维持麻醉。将小鼠置于仰卧位。切开左侧胸部的皮肤，简单分离胸部肌肉。然后，通过左侧第4肋间胸廓切开术迅速暴露胸腔。打开心包后，暴露小鼠心脏，并用7-0丝缝线将自起始处2～3mm处的左前降支(LAD)冠状动脉用活结结扎。通过左心室的前壁变白与心电图(ECG)ST段抬高的同时发生，证实结扎的成功。然后迅速将心脏放回到胸腔，然后手动排空空气，并用4-0缝合线关闭胸腔。将活结缝线的内端切到尽可能短，缝线另一端长约0.8cm，留在胸腔外。然后停止麻醉，让动物恢复。在局部缺血30分钟后，再次麻醉小鼠，通过平滑地拉动缝合线的长端松开活结，直到感觉到完全松开，此时心肌再灌注开始。在I/R后24小时，用超声心动图(VisualSonics VeVo 2100成像系统)通过评估射血分数(EF)、左心室缩短分数(FS)、左心室面积变化分数(FAC)、峰值左心室后壁厚度的二尖瓣比值(E/A)、左心室前壁厚度(LVAW)、左心室后壁厚度(LVPW)以及左心室体积和左心室质量测定心脏功能和心室结构。各组死亡率相似，约为20％。在I/R后24小时，将LAD在前一位置再闭塞，并通过升主动脉将2％伊文思蓝染料(Sigma，Darmstadt，Germany)注入心腔中。然后使小鼠安乐死，收集其心脏并用PBS冲洗。然后将心脏在-80℃下冷冻30分钟，并在结扎线以下横切成6片。将切片与1％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Amresco，America)在37℃的暗室中孵育10分钟，然后用福尔马林固定2小时。使用立体显微镜(Zeiss,Germany)拍照。使用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics)测量和计算缺血区域、梗塞组织和左心室面积。

I/R过程中心肌微循环血流灌注的检测

使用戊巴比妥钠将小鼠麻醉，插管并用正压呼吸器通气。除去胸肌后，通过胸廓两侧和中间部分第4肋间胸廓切开术打开胸腔。然后通过切断两侧的2-4个肋骨并除去前胸壁来完全暴露心脏。通过7-0丝缝线在距起点2-3mm结扎LAD冠状动脉使心脏缺血。30分钟后，移除结扎线以使缺血心肌再灌注。在基线(结扎前)、结扎后0和30分钟以及再灌注后0、10、20和30分钟使用激光多普勒血流仪(PeriCam PSI System，Perimed，Sweden)测量心脏的血流量。盲法测定并分析左心室心外膜血流量。

在结扎后立即向雄性C57BL/6J小鼠(8-12周龄)腹膜内施用PDE4抑制剂吡拉米司特(PICL-H：10mg/kg)或载体。

对后肢I/R的微循环反应的检测

小鼠用戊巴比妥钠麻醉，左侧股动脉钝性剥离。通过结扎股动脉分叉处近端部位的动脉诱导后肢缺血(HLI)，然后在10分钟后通过释放缝线进行再灌注。在不同时间点(基线；结扎后0和10分钟；再灌注后0、5、10和20分钟)，通过激光多普勒血流仪在结扎之前和之后立即监测I/R期间后肢远端血流量。

活体显微镜检查中性粒细胞粘附

通过活体显微镜检查股动脉监测体内的中性粒细胞粘附。小鼠在股动脉结扎前用罗丹明6G(Sigma,Darmstadt,Germany；50mg/kg于盐溶液中)静脉注射。使用尼康相机(S1TC01M)连接的尼康显微镜(E400；绿色荧光激发)对中性粒细胞粘附进行活体成像与录像。离线分析延时视频，在不同时间点(结扎前；再灌注后2、5、10、20和30分钟)计数滚动中性粒细胞数量1分钟。

骨髓移植

用亚致死剂量的10Gy(Gammacell 40 137Csγ-照射源)照射受体小鼠(WT或PDE4BKO)10-12分钟。每个受体通过球后静脉注射5×10⁶的WT-或KO-骨髓细胞来重建。然后让小鼠恢复约5周，包括抗生素治疗1-2周(1-2mg/ml庆大霉素或1.1mg/ml新霉素和1000μg/ml饮用水中的多粘菌素B)。然后对骨髓嵌合小鼠进行I/R损伤研究。

流式细胞术分析

在MI/R后24小时分离心脏，并从心尖切下约20mg心脏组织。然后在37℃振荡器中用胶原酶(0.895mg/ml，II型，Sigma，USA)和蛋白酶(0.5mg/ml，XIV型，Sigma，USA)消化切碎的组织7分钟。使用74μm过滤器过滤消化混合物，并在4℃以200g离心5分钟。将细胞沉淀用100μl FACS缓冲剂重悬，其中50μl用抗体混合物(PE Rat Anti-Mouse CD45,FITC RatAnti-Mouse CD11b,APC-Cy7 Rat Anti-Mouse Ly-6G；BD Biosciences；New York,USA)在冰上染色，置于黑暗中30分钟。然后每个样品加入250μl FACS缓冲剂，用74μm尼龙膜过滤，并通过流式细胞仪以恒定流速和固定的收集时间进行分析。

免疫荧光染色

按照Hao等人(Circulation.2017；135:1253-1264)中描述的相同方案进行免疫荧光染色。简而言之，将石蜡切片(5μm)去石蜡化，再水合，并使用EDTA抗原修复水(PH9.0；ZSGB-BIO，北京，中国)进行抗原修复。并且在结扎线下以200微米的间隔连续收集心脏冰冻切片(10μm)，总共4个水平。用95％乙醇将冷冻切片固定15分钟。与含有0.3％Triton X-100的正常山羊血清在室温孵育90分钟进行封闭和膜破裂后，将样品与一抗在4℃孵育过夜，随后用Alexa Fluor-488偶联或Alexa Fluor-594偶联的二抗在室温孵育1小时。然后将切片用含有染色细胞核的DAPI的VectaShield介质封片并使用Zeiss显微镜系统(AXI0；Zeiss)或激光扫描共聚焦显微镜系统(SP8；Leica)成像。为了确定阳性细胞，使用Image-Pro Plus6.0软件(Media Cybernetics，Inc，Rockville，MD，USA)分析图像。研究中使用的一抗和稀释倍数如下：小鼠单克隆抗PDE4B抗体(1：100；Novus，Littleton，CO，USA)，兔抗髓过氧化物酶(MPO)抗体(1:50；Abcam，Cambridge，UK)，和羊多克隆抗Von Willebrand因子(vWF)抗体(1：100；Abcam，Cambridge，UK，用于描绘内皮细胞)。

细胞研究

内皮细胞：如前所述(Hao等，Cell metabolism.2011；13:592-600)，分离小鼠主动脉内皮细胞(MAEC)。简单来说，收获主动脉并切成1至2mm²切片。主动脉节段的内腔侧附接到培养皿上，然后在含有20％胎牛血清(FBS)和100μg/mL内皮细胞(EC)生长补充剂的DMEM培养基中培养5到7天，以允许EC的生长。然后，将EC传代并培养。第2至6代的MAEC用于本研究。

髓细胞：用4％Brewer改良硫乙醇盐培养基(BD，Franklin Lakes，NJ，USA)(1mL/小鼠)腹膜内注射小鼠。5小时后，腹膜腹水用含有0.1％BSA的PBS洗涤以便收集，然后离心(800rpm，3分钟)。收集主要是髓细胞的沉积白细胞并用于细胞粘附研究。

内皮细胞-中性粒细胞粘附研究：对于内皮细胞-中性粒细胞粘附测定，将MAEC接种到96孔平底板中，并与指定药物(溶于DMSO)一起孵育2小时。接下来，加入溶于PBS中的补体因子5a(C5a)至最终浓度为100nM，并孵育30分钟。在含有10％FBS的RPMI培养基中制备从小鼠腹膜收集的中性粒细胞。当EC的制备完成时，含有指定药物的培养基被含有中性粒细胞(每孔5×10⁴)的RPMI培养基替代。然后将EC和中性粒细胞共培养30分钟。随后，用含罗丹明6G(200μg/mL；Sigma，Darmstadt，Germany)的RPMI培养基冲洗细胞一次，然后用新鲜的1640培养基洗涤3次。荧光信号最终由酶标仪(激发波长560nm；发射波长560nm；InfiniteM200；Tecan,Hombrechtikon,Switzerland)检测。

ELISA分析：用LPS(1μg/mL；E.Coli，Sigma，Darmstadt，Germany)加ATP(5mM；Sigma，Darmstadt，Germany)刺激小鼠腹膜收集的全部中性粒细胞(5×10⁵/孔)6小时。然后通过离心(3000rpm，5分钟)收集上清液。根据制造商的方案用市售ELISA试剂盒(R&DSystems，Minnesota，USA)在上清液中测定IL-1β。使用酶标仪(Infinite M200；Tecan，Hombrechtikon，Switzerland)在450nm处测量OD。一旦信号稳定并与未刺激的野生型对照标准化即可进行数据分析。

高血脂高血压模型：运用ApoE^SA/SA小鼠(具体的构建方法参见WO2018/196874)给予高脂饮食(HFD:含有21％脂肪和0.2％胆固醇)，同时为了诱导高血压，在小鼠饮用水中添加多西环素(Dox)(1mg/ml)，即同时对小鼠喂予HFD+DOX。

血管张力检测：将小鼠用CO₂处死。小鼠的心脏放在Krebs缓冲溶液里(118.3mMNaCl,4.7mM KCl,2.5mM CaCl₂,1.2mM MgSO₄,1.2mM KH₂PO₄,25mM NaHCO₃,和11.1mM葡萄糖)，冠脉从主动脉段开始在体视显微镜下轻轻分离出一段没有分支的冠脉，并剪成约2mm长一段(不同小鼠冠脉差异比较大，有的可以分出两段，有的只能分离一段)。用两根钨丝将血管固定到Multi Myograph(620M,Danish,Myo Technology A/S,Aarhus,Denmark)的一个加样槽的探头两段。每个反应槽里加入5ml Krebs缓冲溶液，37℃孵育并通入二元气(95％O₂-5％CO₂)。在初张力为0的状态下平衡30min，然后给予一个大约1mN的初张力。在平衡10min后用60mM的KCL缓冲溶液刺激。检测PDE4是否是血管内皮依赖性时，50nM U46619刺激，然后梯度加入PDE4抑制剂吡拉米司特(10nM-10uM)，洗三遍。加入含100uM的L-NAMEKrebs缓冲溶液作用15min，接着加入50nM U46619刺激，然后梯度加入PDE4抑制剂吡拉米司特(10nM-10uM)，最后用梯度硝普钠(10nM-10uM)舒张。

实施例2：内皮PDE4B在缺血损伤的人和小鼠心脏中表达

首先，针对PDE4B(红色)、vWF(内皮细胞标志物，绿色)以及细胞核(DAPI，蓝色)进行的免疫荧光染色检测到在健康小鼠中，PDE4B的表达水平低(图1A)。然而，在进行缺血再灌注24小时的损伤的心脏中，PDE4B表达上调并且主要在内皮细胞中观察到(图1A)。且来自患有室壁瘤的患者的心脏在损伤区域的血管内皮中也显示出PDE4B的表达(图1B)。此外，如图2左栏所示，PDE4B的蛋白质表达在MI/R损伤中升高；在图2右栏中，在MI/R损伤中的四种PDE4亚型中，PDE4A、PDE4B和PDE4D的mRNA表达均上调。因此，在血管内皮功能紊乱相关疾病发生时，对象血管内皮的PDE4表达明显地增加。

实施例3：PDE4B缺失可减轻小鼠心肌缺血-再灌注损伤

之前的数据表明磷酸二酯酶-4在炎症反应中起关键作用。因此本发明人研究了PDE4B在体内MI/R中的潜在作用。首先，通过对PDE4B KO小鼠及其同窝对照的左前降支冠状动脉进行结扎造成缺血，缺血30分钟后解除结扎，进行24小时再灌注。在本申请之后的实施例中也使用相同的MI/R方案。缺失PDE4B显著降低了风险区域(AAR)的梗塞面积(IS)百分比，其中各组之间的AAR相似(图3A-C)。接下来，超声心动图显示与同窝对照相比，PDE4B KO小鼠显著改善MI/R引起的心脏收缩功能障碍，如左心室射血分数(EF％)、缩短分数(FS％)和面积变化分数(FAC％)所反映的(图3D-G)。与对照相比，未进行心肌缺血-再灌注的PDE4BKO小鼠显示超声参数没有差异(图3D-G)。这些结果表明内皮细胞PDE4B活性缺失对MI/R损伤有保护作用。

实施例4：PDE4B缺失有助于MI/R期间的微血管血流恢复

MI/R损伤的关键决定因素之一是微血管功能障碍(Prasad等，Circulation.2009；120:2105-2112；Gutterman等，Circ Res.2016；118:157-172；Pries和Reglin，Eur HeartJ.2017；38:478-488)。在MI/R小鼠模型中，在指定的时间点以盲法监测进行心脏缺血-再灌注的小鼠的血流量。所监测的心脏面积在对照组和PDE4B KO组之间是相同的。通过激光多普勒成像检查，PDE4B缺失显著改善了冠状动脉血流恢复后的心脏灌注恢复(图4A和B)。与对照小鼠相比，免疫荧光染色还显示PDE4B KO小鼠缺血性心脏组织中髓过氧化物酶(MPO)阳性细胞的聚集少得多(图4C)，而MPO主要存在于中性粒细胞中，这表明PDE4B KO小鼠的中性粒细胞的积累显著减少。

此外，本发明人利用另一种下肢缺血-再灌注小鼠模型，表明PDE4B缺失显著促进了股动脉缺血损伤后的整个下肢的血流恢复，如使用激光多普勒血流计在体内所评估的(图5)。

总的来说，这些结果表明抑制PDE4，尤其是其B亚型，可减少血管炎症，改善心脏微循环并限制MI/R损伤。

实施例5：PDE4B缺失减少中性粒细胞-内皮细胞相互作用，并抑制LPS和ATP诱导的促炎因子IL-1β的产生

在本发明中，将中性粒细胞在单层的小鼠主动脉内皮细胞上孵育，并定量粘附细胞。如图6A和6B所示，中性粒细胞-内皮细胞粘附在PDE4B缺失的内皮细胞和中性粒细胞中显著降低，特别是在刺激中性粒细胞粘附的C5a存在的情况下，其中当中性粒细胞和内皮细胞均为PDE4B缺失细胞时，二者的粘附最低；而仅当内皮细胞为PDE4B缺失细胞时，其粘附也显著低于仅中性粒细胞为PDE4B缺失细胞的情况。以上结果显示出内皮细胞PDE4B缺失对于粘附的缓解大于中性粒细胞PDE4B缺失，而缺失中性粒细胞和内皮细胞的PDE4B有潜在的协同作用，以大大降低二者之间的相互作用以及中性粒细胞对内皮细胞的粘附和浸润。

另外，与对照小鼠相比，LPS+ATP共同刺激的衍生自PDE4B KO小鼠的中性粒细胞的IL-1β分泌明显降低，其中上清液中的IL-1β浓度分别为530.1±36.84pg/mL和342.7±32.19pg/mL(图6C)。

因此，这些数据证明，PDE4B缺失，尤其是内皮细胞的PDE4B缺失降低了中性粒细胞-内皮细胞的相互作用，从而改善了炎症状况。

实施例6：具有PDE4B缺失的骨髓细胞的小鼠防止心肌缺血-再灌注损伤

为了直接测试PDE4B骨髓细胞是否影响心脏IR损伤，通过骨髓细胞(BM)移植产生了野生型骨髓移植到野生型小鼠、野生型骨髓移植到PDE4B KO小鼠、PDE4B KO骨髓移植到野生型小鼠、PDE4B KO骨髓移植到PDE4B KO小鼠的嵌合小鼠(图7A)。骨髓移植后对淋巴细胞(LYM)、中性粒细胞(NE)和单核细胞(MON)的统计显示，上述各种移植策略产生的淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞之间数量没有显著变化(图7B)。用PDE4B KO BM重建的WT小鼠表现出显著减少的梗塞面积(图7C)。用PDE4B KO BM重建PDE4B KO小鼠更显著地减少了MI/R损伤中的这些病理变化(图7C)。这些发现表明骨髓细胞PDE4B的缺失有助于改善心肌缺血-再灌注损伤，且缺失骨髓细胞和小鼠全体细胞(包括血管内皮细胞)的PDE4B可进一步改善心肌缺血-再灌注损伤。

此外，本发明人利用另一种后肢缺血-再灌注的小鼠模型，再次验证了骨髓细胞的PDE4B缺失和全体细胞均缺失PDE4B显著促进股动脉血流恢复后的下肢血流恢复，如在体内用激光多普勒血流计测量的(图8)。

实施例7：吡拉米司特(PICL)减少中性粒细胞-内皮细胞相互作用、改善心脏微循环并防止MI/R损伤

值得注意的是，基于抗炎作用，PDE4抑制剂被认为是治疗慢性炎症性疾病的有前途的新药。本发明进一步研究了吡拉米司特对血管内皮细胞的影响。对C57BL/6J小鼠小鼠进行MI/R手术。在左前降冠状动脉结扎后再灌注前以及再灌注后12小时，分别腹膜内注射载体、5mg/kg(PICL-L)或10mg/kg(PICL-H)吡拉米司特，吡拉米司特以浓度依赖性方式明显减少了梗塞面积(图9A-C)，并改善了MI/R后的心脏功能(图9D-G)。在另一组小鼠中，在MI/R期间测定心肌微循环灌注，通过激光多普勒成像检查，吡拉米司特显著改善MI/R后心脏灌注恢复(图9H和9I)。

流式细胞分析说明与对照相比，损伤心脏的中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)浸润在MI/R损伤中显著升高，而吡拉米司特治疗显著降低了中性粒细胞浸润升高的幅度(绝对计数：738±91对459±69；CD11b⁺细胞中噬中性粒细胞百分比：50.1±1.7％对42.9±2.4％；图9J)。免疫荧光染色也显示在用吡拉米司特处理的损伤的心脏组织中髓过氧化物酶(MPO)阳性细胞(即中性粒细胞)的聚集较少(图9K)。

此外，在LPS加ATP刺激的情况下，PDE4，尤其是PDE4B，在内皮细胞(EC)和中性粒细胞中表达均增加(图11)。用吡拉米司特处理以浓度依赖性的方式显著阻止中性粒细胞与内皮细胞之间的粘附，且粘附情况随吡拉米司特浓度的增加而减少(图9L和图9M)。用吡拉米司特以浓度依赖性方式处理，明显降低LPS加ATP刺激的中性粒细胞中IL-1β的产生(图9N)，表明在炎症环境中，吡拉米司特可降低促炎因子的产生从而改善炎症的进展。此外，吡拉米司特明显改善I/R后的后肢灌注(图10)。

实施例8：咯利普兰减少动脉粥样硬化的发生

使用如WO 2018/196874构建的高脂高血压小鼠模型ApoE^SA/SA小鼠，并诱导小鼠产生高血脂和高血压，研究PDE4选择性抑制剂咯利普兰(Rolipram)对动脉粥样硬化病变的影响。对ApoE^SA/SA小鼠给予高脂饮食(HFD:含有21％脂肪和0.2％胆固醇)，同时为了诱导高血压，在小鼠饮用水中添加多西环素(Dox)(1mg/ml)，即对小鼠喂予HFD+DOX，并分别向小鼠每天腹膜内注射载体或以10mg/kg注射咯利普兰，4周后，对小鼠进行取材，分别对胸主动脉及心脏冠脉进行油红病理染色统计分析。

对胸主动脉进行油红病理染色(图12A)，可以发现咯利普兰组小鼠(n＝10)斑块面积明显少于载体对照组(n＝8)，且图12B的统计也显示，用咯利普兰处理的小鼠的斑块百分比显著小于对照组。

同样的，对心脏切片进行油红病理染色(图13A)，可以发现咯利普兰组小鼠(n＝9)心脏血管斑块面积明显少于对照组(n＝8)，且图13B的统计也显示，用咯利普兰处理的小鼠斑块面积的绝对计数显著小于对照组。

因此，这些数据显示，选择性抑制PDE4的活性，有助于减少动脉粥样硬化斑块的形成及动脉粥样硬化的发生。

实施例9：吡拉米司特通过内皮细胞介导血管舒张

将小鼠用CO₂处死，并分别用载体、如图所示浓度的吡拉米司特(piclamilast)、乙酰胆碱(Ach)和硝普钠(SNP)处理心脏冠脉段，研究吡拉米司特对血管舒张的影响。

乙酰胆碱(Ach)可以作用于血管内皮细胞，刺激内皮细胞产生NO，NO为舒血管物质，可以作用于血管平滑肌，使平滑肌舒张，进而使血管舒张，血压下降。乙酰胆碱无法直接作用于平滑肌细胞使其舒张，故通过乙酰胆碱的作用体现出的血管舒张情况，可以间接反应血管内皮的功能。在本实施例中，载体用作阴性对照，乙酰胆碱用作阳性对照，从图13A可以看出，PDE4抑制剂吡拉米司特可以刺激小鼠心脏冠脉血管的舒张，且其变化水平类似于常规舒张剂乙酰胆碱。

硝普纳(SNP)可以直接作用于血管平滑肌，使其舒张，进而降低血压。故通过硝普纳的作用体现的血管舒张的情况，可以间接的反应血管平滑肌的功能。在本实施例中，添加内皮型一氧化氮合酶抑制剂L-NAME，从而探究吡拉米司特是否可以直接作用于血管平滑肌以使血管舒张。如图13B所示，加入吡拉米司特并没有使血管舒张，而加入SNP使血管显著舒张，因此图13B显示吡拉米司特引起的舒张是内皮依赖性的。

上述结果表明，本发明的PDE4抑制剂能够直接作用于血管内皮细胞，并以内皮依赖性方式促进血管舒张，从而缓解血管内皮功能紊乱。

实施例10：罗氟司特减轻小鼠心肌缺血-再灌注损伤

本发明进一步研究了罗氟司特对血管内皮细胞的影响。与实施例7类似，对C57BL/6J小鼠进行MI/R手术，在左前降冠状动脉结扎后再灌注前以及再灌注后12小时，分别向小鼠腹膜内注射载体、1mg/kg罗氟司特。由图14可以看出，罗氟司特明显减少了小鼠梗塞面积。

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Claims

1.一种治疗或预防对象的血管内皮功能紊乱相关疾病的方法，包括给所述对象施用含有有效量的磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂的药物组合物，所述抑制剂抑制PDE4的表达和/或活性。

2.PDE4抑制剂在制备用于治疗或预防对象的血管内皮功能紊乱相关疾病的药物组合物中的用途，所述抑制剂抑制PDE4的表达和/或活性。

3.含有有效量的PDE4抑制剂的药物组合物，其用于治疗或预防对象的血管内皮功能紊乱相关疾病，所述抑制剂抑制PDE4的表达和/或活性。

4.权利要求1-3中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述PDE4抑制剂为选择性PDE4抑制剂。

5.权利要求1-4中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述选择性PDE4抑制剂选自吡拉米司特、咯利普兰、AN-2728、AN-2898、CBS-3595、ELB-353、KF-66490、K-34、LAS-37779、IBFB-211913、AWD-12-281、西潘茶碱、西洛司特、罗氟司特、BAY19-8004和SCH-351591、AN-6415、indus-82010、TPI-PD3、ELB-353、CC-11050、GSK-256066、奥米司特、OX-914、替托司特、MEM-1414和RPL-554及其衍生物、溶剂合物、多晶型物、前药、活性代谢物和/或这些化合物的药学上可接受的盐。

6.权利要求1-5中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述选择性PDE4抑制剂是吡拉米司特。

7.权利要求1-5中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述选择性PDE4抑制剂是咯利普兰。

8.权利要求1-7中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述PDE4抑制剂直接作用于血管内皮细胞。

9.权利要求1-8中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述PDE4抑制剂抑制炎性细胞与血管内皮细胞之间的相互作用。

10.权利要求1-9中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述血管内皮功能紊乱相关疾病是动脉粥样硬化。

11.权利要求1-10中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述血管内皮功能紊乱相关疾病是心肌缺血、缺血-再灌注损伤、高血压、动脉瘤、心梗后心力衰竭、血管成形术后再狭窄、动脉炎、糖尿病、肥胖症、代谢综合征、或其任意组合。

12.权利要求1-11中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述对象患有动脉粥样硬化，且进一步患有高脂血症、糖尿病、肥胖症、代谢综合征或其他代谢性疾病。

13.权利要求1-12中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述对象患有动脉粥样硬化，且进一步患有心肌缺血、心肌缺血-再灌注损伤、心肌梗塞、动脉瘤、心梗后心力衰竭、血管成形术后再狭窄、动脉炎、高血压或其任意组合。

14.权利要求1-13中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述药物组合物以片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂施用。

15.权利要求1-13中任一项的方法、用途或药物组合物，其中所述药物组合物通过口服、含服、吸入、静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射或冠脉内施用的方式施用给对象。

16.一种经皮腔内血管成形术装置，其包括球囊或支架，其中所述装置包含或涂覆有PDE4抑制剂。

17.权利要求16的装置，其中所述PDE4抑制剂为选择性PDE4抑制剂。

18.权利要求16或17的装置，其中所述选择性PDE4抑制剂选自吡拉米司特、咯利普兰、AN-2728、AN-2898、CBS-3595、ELB-353、KF-66490、K-34、LAS-37779、IBFB-211913、AWD-12-281、西潘茶碱、西洛司特、罗氟司特、BAY19-8004和SCH-351591、AN-6415、indus-82010、TPI-PD3、ELB-353、CC-11050、GSK-256066、奥米司特、OX-914、替托司特、MEM-1414和RPL-554及其衍生物、溶剂合物、多晶型物、前药、活性代谢物和/或这些化合物的药学上可接受的盐。