CN111840551B - 治疗糖尿病的非侵入式近红外光控的纳米材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗糖尿病的非侵入式近红外光控的纳米材料，本发明要求保护上转换荧光纳米材料在制备治疗糖尿病的工具中的应用，上转换荧光纳米材料包括稀土元素掺杂的无机纳米材料、靶向肝细胞的分子以及水溶性高分子。本发明公开了非侵入式上转换荧光纳米材料的新用途，在糖尿病治疗过程中，不需要对动物进行手术植入侵入性的光纤，使用具有高组织穿透性的近红外光激发生物体内的上转换纳米材料，通过上转换材料将近红外波段的光转化为可见光，从而激活光敏蛋白，实现在高时间‑空间分辨率的条件下，不依赖胰岛素，远程调控细胞内葡萄糖代谢相关信号通路，促进糖原合成，抑制糖异生，降低血糖水平。

Description

治疗糖尿病的非侵入式近红外光控的纳米材料
技术领域
本发明涉及糖尿病医学研究领域，尤其涉及一种治疗糖尿病的非侵入式近红外光控的纳米材料。
背景技术
光遗传学技术是将遗传学技术和光控调节技术相结合而产生的一项全新的技术。在过去的十余年里，光遗传学在多个研究领域取得了长足的进展，包括神经科学，肿瘤治疗，信号通路研究以及外泌体工程等前沿领域。为了丰富光遗传学研究的工具箱，科学家们已经开发出了包括视紫红质、视黄质、光敏色素、隐色素等光敏感蛋白元件。光遗传技术通过对目的细胞进行基因改造，植入相应光敏感蛋白，通过光控的方法精准激活目的区域的目的细胞中的光敏蛋白，调控细胞功能，从而改变个体的生理状态。
目前所应用的光遗传蛋白只对可见光波段的光发生响应(如紫光、蓝光、绿光、黄光)，因此，由于短波长光子较差的组织穿透能力，极大地限制了光遗传学在活体上的应用。在传统的光遗传研究实验中，为了传递光信号往往需要在动物体内植入光导纤维等光学器件，这不仅会导致实验动物出现较高的死亡率，而且存活的动物在整个实验过程中将一直遭受因光学器件植入所带来的痛苦，其行为也会受到光纤的束缚，这将对实验结果(尤其是动物行为学实验)带来巨大的不确定性。研究者们尝试过将光学器件的尺寸缩减到了毫米尺寸，并且集成了无线充电模块，虽然这有效地减小了动物的痛苦并提高了实验结果的可靠性，但是仍然需要一个侵入性地植入过程。
糖尿病治疗需要患者规律注射胰岛素并且采用一种或多种降糖药组合的方式稳定血糖水平。而二型糖尿病的病理生理学过程中，病人不仅是胰岛素相对缺乏，而且对胰岛素产生了抵抗性，因此，传统用于一型糖尿病治疗的胰岛素注射方式对于二型糖尿病收效甚微。鉴于二型糖尿病的复杂致病因素，胰岛素抵抗的机理仍尚未被阐明，因此亟待发现新的方法来规避胰岛素抵抗，从而精准控制血糖水平。
CN108686208A公开了一种修复受损神经的非侵入式近红外光控的纳米材料，其中公开了非侵入式近红外光控的纳米材料为上转换荧光纳米材料，并公开了上转换荧光纳米材料在神经元修复过程中的用途。但是，由于生物体的体内环境的复杂性，上转换荧光纳米材料是否对糖尿病的治疗有效仍未可知。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种治疗糖尿病的非侵入式近红外光控的纳米材料，本发明公开了非侵入式上转换荧光纳米材料的新用途，在糖尿病治疗过程中，不需要对动物进行手术植入侵入性的光纤，使用具有高组织穿透性的近红外光激发生物体内的上转换纳米材料，通过上转换材料将近红外波段的光转化为可见光，从而激活光敏蛋白，实现在高时间-空间分辨率的条件下，不依赖胰岛素，远程调控细胞内葡萄糖代谢相关信号通路，促进糖原合成，抑制糖异生，降低血糖水平。
本发明要求保护上转换荧光纳米材料在制备治疗糖尿病的工具中的应用，上转换荧光纳米材料包括稀土元素掺杂的无机纳米材料、靶向肝细胞的分子以及水溶性高分子，靶向肝细胞的分子以及水溶性高分子连接在稀土元素掺杂的无机纳米材料的表面。
进一步地，治疗糖尿病的工具有多种类型：如可在表面修饰转相后通过分子靶向被受损部位的指定细胞摄取或吸附；或者与生物材料复合，通过手术直接置于受损部位，通过体外施加光刺激激发上转换材料完成修复。
上转换荧光纳米材料在修复时起到的作用：靶向到特定部位或细胞内后，利用近红外光(NIR)在体提供所需波长的光。本发明的上转换荧光纳米材料将近红外波段的光转化为可见光。
进一步地，上述工具的使用方法包括以下步骤：
(1)采用负载光敏蛋白的质粒转染生物体，使负载光敏蛋白的质粒在生物体的肝脏细胞中表达；
(2)将上转换荧光纳米材料注射入经步骤(1)处理的生物体内，并采用近红外光照射生物体的肝脏部位。
进一步地，在步骤(1)中，光敏蛋白为CIBN和CRY2、LOV、UVR8或PhyB和PIF，优选地，负载光敏蛋白的质粒为mCherry-CRY2-iSH和CIBN-CAAX。
蓝光响应的光敏蛋白隐花色素2(CRY2)及转录因子CIBN是光遗传研究中常用的一对蛋白组合。本发明将具有独特光能转换能力(将近红外光转换为蓝光)的UCNP与一对融合蛋白分子(CRY2/CIBN)相结合，用于选择性地远程激活PI3K/AKT信号通路。CIBN与一小段细胞膜定位序列CAAX相融合，同时它的配对分子CRY2与一个红色荧光蛋白mCherry以及用于结合内源性PI3K催化亚基p110α的iSH2结构域相融合，在UCNP的光转换作用下，近红外光可以深入穿透组织内部并上转换激活mCherry-CRY2-iSH2融合蛋白，在CRY2结合到固定在细胞膜上的CIBN的程中，PI3K的催化亚基p110α也被带到细胞膜附近，从而促使PIP2磷酸化成PIP3，随后激活PI3K/AKT的通路通过促进糖原合成以及抑制糖异生从而控制葡萄糖代谢。因此，本发明的方法实现了通过近红外光触发细胞信号通路的方式，改善胰岛素抵抗的二型糖尿病模型的血糖水平。
进一步地，在步骤(2)中，近红外光的波长为0.7μm-2.5μm，优选为800-1000nm，功率为0.5-2W/cm2。每天一次，每次照射1-5分钟。更优选地，近红外光的波长为980nm。采用近红外光作为激发光，其具有显著提升的组织穿透深度。
进一步地，在步骤(2)中，上转换荧光纳米材料的单剂量为5mg/kg体重，每天一次。
进一步地，上转换荧光纳米材料用于降低血糖水平。
进一步地，糖尿病为二型糖尿病。
进一步地，靶向肝细胞的分子选自甘草次酸(GA)和/或甘草酸；稀土元素掺杂的无机纳米材料和靶向肝细胞的分子的质量比为1：0.02-0.1。GA是一种能选择性地识别靶向肝胞表面受体的小分子化合物。
进一步地，水溶性高分子选自聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酸和聚乙烯亚胺中的一种或几种；优选为PEG。
进一步地，稀土元素掺杂的无机纳米材料和水溶性高分子的质量比为1：1-2。
本发明通过在稀土元素掺杂的无机纳米材料表面修饰PEG和GA来增加稀土元素掺杂的无机纳米材料在体内的循环时间以及肝靶向能力。
进一步地，稀土元素掺杂的无机纳米材料为核壳结构，其中核材质包括第一基质材料和稀土元素离子，壳材质包括第二基质材料，第一基质材料和第二基质材料分别独立地选自NaYF4、NaGdF4、KYF4(优选NaYF4)，稀土元素离子为Tm3+、Yb3+、Nd3+、Tm3+、Er3+、Ho3+、Eu3 +、Tb3+(优选Tm3+)。上转换荧光纳米材料中含有镧系稀土元素，其具有将近红外光转换为紫外-可见光波段的特性。因此可以解决当前光遗传蛋白主要响应短波长光子(紫外光，蓝光，绿光)激活的问题。
进一步地，第一基质材料、稀土元素离子和第二基质材料的摩尔比为1：0.4-0.6：1。
优选地，上转换荧光纳米材料为UCNP-PEG-GA，其制备方法包括以下步骤：
合成具有核壳结构的NaYF4:Yb/Tm@NaYF4上转换纳米颗粒(UCNP)，然后在UCNP颗粒表面通过羧基置换法修饰聚丙烯酸(PAA)，使UCNP转为水相，然后通过EDC/NHS反应修饰聚乙二醇(PEG)和具有肝细胞靶向能力的PEG-GA，即得到UCNP-PEG-GA溶液。其中，PEG-GA表示连接了聚乙二醇的甘草次酸。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
1、本发明公开了一种非侵入式上转换荧光纳米材料在制备治疗糖尿病的工具中的应用，基于该技术，在应用过程中，能够避免每天注射胰岛素的方式稳定血糖、避免服用一种或多种有一定副作用的降糖药。相比于传统光遗传学，无需施加手术侵入性的植入光纤，避免创伤带来的一系列副反应，摆脱光纤束缚，提高灵活性。
2、本发明使用具有高组织穿透性的非侵入式上转换荧光纳米材料，相比于可见光，极大提高了组织穿透性。非侵入式近红外光控的纳米材料选择性富集于肝脏内，通过近红外光来远程调控葡萄糖代谢。上转换荧光纳米颗粒以及光遗传学技术用于选择性地激活PI3K/AKT信号通路，形成一种非胰岛素依赖的二型糖尿病治疗方式。这一方法具有快速响应(秒级)，深层组织穿透(厘米级)以及光照剂量可调等特点，成功地在体外及动物体内实现了葡萄糖代谢的调控，为面对二型糖尿病临床治疗上的挑战提供了一种可能的开发替代策略。
3、通过光照控制的方式，可以调控光照剂量及光照部位，可以根据血糖水平的高低，灵活调整光照治疗的幅度，同时使用激光能准确对损伤部位进行精准治疗，避免对其他组织器官产生影响。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1是UCNP-PEG-GA的合成路线示意图及不同材料的透射电镜图；
图2是不同材料的动态光散射测试结果；
图3是不同材料的荧光光谱图、紫外吸收光谱及电位测试结果；
图4是不同细胞的细胞活力测试结果及Calcein-AM/PI死活双染测试结果；
图5是不同细胞对不同材料的摄取情况统计结果；
图6图示了没有诱导和由UMO+NIR诱导的mCherry-CRY2-iSH2融合蛋白的膜易位与CIBN CAAX结合示意图；
图7是HepG2细胞接受NIR照射前后的红色荧光通道成像结果；
图8是针对图7的c1-c2中沿白色箭头的mCherry荧光的像素强度分布结果；
图9是单转染了mCherry-CRY2-iSH2质粒的HepG2细胞在接受NIR照射前后的红色荧光通道成像结果；
图10是不同试验组的细胞免疫荧光染色实验结果及荧光图的半定量统计结果；
图11是在不同NIR照射时间下，GlcN预处理的HepG 2细胞的多色荧光图像；
图12是图11的半定量统计结果；
图13是不同试验组的AKT，p AKT，GSK 3β，p GSK 3β，FOXO 1p FOXO 1和GAPDH的蛋白质印迹测试结果；
图14是不同试验组的葡萄糖含量、细胞存活率、糖原含量、葡萄糖产量及PI3K抑制剂作用下的糖原合成和抑制糖异生情况测试结果；
图15是尾静脉注射不同纳米材料的小鼠肝脏的荧光强度比较结果及注射同一纳米材料后不同器官中的分布情况；
图16是小鼠肝脏冰冻切片的时程共聚焦荧光图像；
图17是UMO的体内实验步骤示意图、不同试验组的小鼠血糖水平和葡萄糖耐量测试结果及肝脏的糖原含量测试结果；
图18是不同试验组小鼠肝脏的过碘酸-雪夫染色图片结果；
图19是接受UMO+NIR治疗的二型糖尿病小鼠肝脏中AKT和GSK3β的磷酸化水平测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明以下实施例及附图中，如无特殊说明，UMO指的是本发明制备的UCNP-PEG-GA材料和一对融合蛋白分子(CRY2/CIBN)的结合，且并未实施NIR激光照射；
UMO+NIR指的是对UMO实施NIR激光照射。
如无特殊说明，以下实施例中NIR光照的条件为波长980nm，功率1.2W/cm2，每次照射3分钟。
实施例1：UCNP-PEG-GA的合成
1、具有核壳结构的NaYF4:Yb/Tm@NaYF4上转换纳米颗粒(UCNP)的合成：
核壳结构的NaYF4:Yb/Tm@NaYF4上转换纳米颗粒是通过热溶剂法合成的。
首先合成核NaYF4:Yb/Tm：在称量天平上分别称取0.695mmol YCl3(135.78mg)，0.30mmol YbCl3(83.82mg)以及0.005mmol TmCl3(1.38mg)，加入到50mL的三颈烧瓶中，随后加入12mL油酸和15mL十八烯。将三颈烧瓶在加热台上固定好后，向反应装置中通入氮气5min以排除空气，然后开始升温，反应体系在磁力搅拌状态下保持160℃搅拌0.5h，使反应物溶解并去除反应体系中多余的氧气和水分。关闭加热，待反应体系降温至室温，此时将准备好的含有4mmol氟化铵(148mg)和2.5mmol氢氧化钠(100mg)的10ml甲醇溶液通过注射器逐滴加入到反应体系中，室温下维持磁力搅拌2h后，打开加热，对反应体系升温，在100℃保持15min除去反应物中多余的甲醇，随后继续加热到300℃并在此条件下保持反应1h。待反应结束后关闭加热，将反应体系降温至室温，将反应后得到的产物与乙醇按1:3体积比混合，通过10000转离心分离，并洗涤三次后，将所得沉淀重分散在18mL环己烷溶液中，即得到NaYF4:Yb/Tm上转换纳米颗粒(以下简称UCNP核)。
接下来合成具有核壳结构的NaYF4:Yb/Tm@NaYF4上转换纳米颗粒：与前面过程相类似，称取0.695mmol YCl3(135.78mg)加入50ml三颈烧瓶中，并加入12mL油酸和15mL十八烯后，先通氮气排除空气，然后使反应装置在160℃保持搅拌30min使反应物溶解并除去水氧。关闭加热，待反应溶液冷却到80℃，通过注射器向反应体系中加入6ml上述得到的NaYF4:Yb/Tm的环己烷溶液，然后升温至120℃使混合溶液中环己烷蒸发。关闭加热，反应物冷却到室温后，逐滴加入10mL含有4mmol氟化铵(148mg)和2.5mmol氢氧化钠(100mg)的甲醇溶液。室温搅拌2h后升温除去甲醇，然后在，加热到75℃保温10min以除去溶剂甲醇。除去甲醇后，加热到300℃并在此条件下保持反应1h，冷却后产物用乙醇离心洗涤三次后溶解在环己烷中，即得到具有核壳结构的NaYF4:Yb/Tm@NaYF4上转换纳米颗粒(以下简称UCNP核-壳)。
2、上转换纳米颗粒UCNP的修饰
首先，在步骤1合成的UCNP表面通过羧基置换法修饰聚丙烯酸(polyacrylicacid，PAA)使UCNP转水相。PAA通过配体交换法置换掉UCNP表面的油酸，从而包覆到UCNP表面。具体是将过量的分子量为2000的PAA溶液在超声状态下滴入UCNP的环己烷溶液中，保持超声1h，期间不断用移液器吹吸溶液使之混合均匀，然后将反应容器置于50℃水浴环境下搅拌8h，待溶液静置分层后用分液漏斗分离出下层水相溶液，经14000转乙醇和水溶液离心洗涤三次后，将沉淀重新用超纯水溶解，即得到水溶性的UCNP-PAA。
通过EDC/NHS偶联的方式，将GA预先结合到分子量约为2400的一端Boc保护的双末端氨基PEG(Boc-NH-PEG-NH2)上。首先，取47mg GA溶解在5mL二氯甲烷中，再将其逐滴滴入到5mL含有DCC和NHS的二氯甲烷溶液中(摩尔比为GA:DCC:NHS＝1:2:1.2)，搅拌30min后，加入240mg Boc-NH-PEG-NH2并搅拌24h。GA分子上的羧基基团与Boc-NH-PEG-NH2分子中的氨基基团通过DCC/NHS反应，得到Boc-NH-PEG-GA反应完成后，加入2mL三氟乙酸去除PEG氨基末端的Boc，将产物超滤冻干后即得到纯净的NH2-PEG-GA。
将以上制备的UCNP-PAA通过EDC和NHS与NH2-PEG-GA反应，然后NH2-PEG-GA中的氨基通过NHS/EDC反应，与PAA分子的羧基连接。为了平衡纳米材料的肝细胞靶向能力以及水溶性，同时还在UCNP表面接入水溶性的PEG。具体是NH2-PEG-GA和NH2-PEG-NH2按照1:3的摩尔比修饰到UCNP表面。按照EDC:NHS＝1:0.6溶解在超纯水中，逐滴加入UCNP-PAA水溶液中，搅拌30min后，加入NH2-PEG-GA和NH2-PEG-NH2的混合水溶液，继续搅拌24h。反应结束后用超纯水离心洗涤三次，重分散在超纯水或PBS中，即得到水溶性的UCNP-PEG-GA。
另外，同时按照上述方法，制备UCNP-PEG作为对照例，不同之处在于，在合成UCNP-PAA之后，将其通过EDC和NHS只与NH2-PEG-NH2反应，而不与NH2-PEG-GA反应，得到水溶性的表面只连接了PEG的UCNP。
图1a是UCNP-PEG-GA的合成路线示意图。图1b-g是UCNP核，UCNP核-壳以及UCNP-PEG-GA的透射电镜(TEM)图，从图中可看出，UCNP核的平均粒径大概为22nm(图1b-c)，UCNP核-壳(图1d-e)和UCNP-PEG-GA(图1f-g)的粒径为45nm左右，其颗粒尺寸通过动态光散射(DLS)进行了进一步验证(图2)，图2a、b、c分别是UCNP核，UCNP核-壳以及UCNP-PEG-GA的DLS图。
从荧光光谱图(图3a)中可以看到，相比于UCNP核，UCNP核-壳在475nm处的发射光强度提高了约4倍，此外，对UCNP进行表面修饰不会对UCNP的上转换效率造成明显影响。在紫外吸收光谱(图3b)中，PEG-GA和UCNP-PEG-GA在250nm处都存在明显的来自GA的吸收峰，而纯净的PEG溶液在对应的波长范围内没有明显吸收，这证明了PEG-GA被成功合成并且随后成功修饰到了UCNP核-壳的表面。此外，纳米材料的电位在修饰过程中也存在明显的变化，如UCNP经过PAA修饰后变为-31.4mV，UCNP-PAA修饰上NH2-PEG-NH2后变为-1.9mV，UCNP-PAA经过NH2-PEG-GA修饰后变为-4.7mV(图3c)。这些结果都有效地证明了UCNP颗粒表面经过上述偶联策略成功修饰上了PEG或者PEG-GA。
实施例2：细胞模型及相关研究
HepG2细胞购买自ATCC，HUVEC细胞是来自唐仲英血液学研究中心的馈赠。细胞均使用含10％FBS，25mM葡萄糖的DMEM培养基培养在37℃，含5％CO2的湿润环境下。
为了得到胰岛素抵抗的HepG2细胞模型，HepG2细胞使用含18mM葡萄糖胺(glucosamine，GlcN)，5mM葡萄糖的DMEM低糖培养基诱导培养18小时，即得到胰岛素抵抗的HepG2细胞模型。质粒转染通过jetPRIME(Polyplus)试剂完成，当细胞生长至50％密度时，将质粒CIBN-CAAX与mCherry-CRY2-iSH按照1：1.2加入转染缓冲液中，涡旋震荡5秒后加入转染试剂(1μg质粒对应50μL转染缓冲液与1μL转染试剂)，静置10min后加入到细胞培养基中，摇匀，6h后更换含有200μg/mLUCNP-PEG-GA的新鲜培养基，培养12小时后更换培养基移除多余的UCNP-PEG-GA，转染24h后观察转染效率并进行实验。
在进行免疫荧光及免疫印迹实验前，细胞被施加近红外激光照射(980nm，1.2W/cm2,每次照射3min，间隔3min，共3次)。随后细胞被使用4％的多聚甲醛室温固定20min用于免疫荧光染色或者离心收集用于免疫印迹实验。在涉及加入PI3K抑制剂的对照实验中，细胞培养基中被加入10μM的小分子抑制剂(LY294002)预处理24h，随后进行后续的相关实验。
检测细胞活力，将细胞以8000个细胞每孔的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后，更换含有不同浓度纳米材料的培养基，继续培养24h，随后使用
Figure BDA0002605861470000081
(CTG，Promega)化学发光检测法测定细胞活力。在96孔板中每孔加入20μL配制好的CTG溶液，将孔板置于摇床摇晃5min，再静置5min后，使用酶标仪测定每孔的化学发光值，以此换算成每孔的细胞存活率。细胞死活双染实验通过Calcein-AM/PI(YEASEN,#40747ES76)试剂盒完成，当UCNP-PEG-GA纳米材料与细胞共孵育24h后，移除培养基，并用PBS清洗，在共聚焦皿中加入0.5mL按说明书配制好的Calcein-AM/PI染色试剂，37℃孵育15min，经PBS洗涤后于共聚焦显微镜下成像观察(钙黄绿素通道(绿色):Ex:490nm；Em:515nm.PI通道(红色):Ex:535nm；Em:617nm)。同时采用未添加任何其他材料的正常培养基进行细胞的培养，以作为对照。
如图4所示，从细胞活力测试结果中可以看到，当UCNP-PEG-GA的浓度高达200μg/mL时，在HepG2细胞(肝癌细胞)以及HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)中仍然没有表现出明显的细胞毒性(图4a)，并且进一步通过Calcein-AM/PI死活双染的方法证明了UCNP-PEG-GA良好的生物相容性(图4b-e)。从图4b-e中可看出，添加了200μg/mL的UCNP-PEG-GA纳米材料的培养基与正常培养基相比，其中的活细胞数量相当。
细胞对UCNP-PEG-GA的摄取量是通过电感藕合等离子体质谱(ICP-MS)的方法，测定细胞中所含有的稀土元素(Yb)的量得到的。如图5a中所示，HepG2细胞对UCNP-PEG-GA的摄取量约是对UCNP-PEG摄取量的3倍。此外，由于HepG2细胞表面存在的GA受体，HepG2细胞摄入了2倍于HUVEC细胞对UCNP-PEG-GA的摄取量(图5b)，图5中，*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001.。以上结果证明了PEG-GA对UCNP的表面修饰促进了肝脏来源的细胞对纳米颗粒的摄取。
HepG2细胞按照1：1.2的质量比共转染CIBN-CAAX和mCherry-CRY2-iSH2质粒24小时后，加入200μg/mL UCNP-PEG-GA与细胞共孵育，12小时后更换新鲜培养基，随后进行近红外光照刺激实验。如图6所示，mCherry-CRY2-iSH2融合蛋白在没有刺激的情况下随机分布在细胞质内(图6a)，当在UCNP-PEG-GA的辅助下，NIR上转换出的蓝光可以促使融合蛋白中的CRY2分子发生构象变化，识别并与固定在细胞膜上的CIBN结合，并带着其余融合蛋白迅速位移到细胞膜附近，使细胞膜上的红色荧光信号增强(图6b)。
在图7中，在HepG2细胞接受NIR(1W/cm2,2min)照射的前后，分别对其红色荧光通道mCherry进行成像，受到NIR照射后，mCherry在细胞中的分布出现了显著的从细胞质位移到细胞膜的现象(图7a1-a2)，从图7a1的2.5D视角来看，经过NIR照射后，细胞膜处的荧光强度峰显著升高(图7b1-b2)。在图7c1-c2中，一个HepG2细胞被选取作为代表性的例子来研究蛋白膜转位的细节，可以看到，细胞质中的荧光强度由于mCherry-CRY2-iSH2的转位而降低，然而细胞膜上的荧光却因为CRY2结合到锚定在细胞膜上的CIBN上而显著增强。图7c1-c2中贯穿HepG2细胞的白色虚线箭头是为了分析细胞胞质和细胞膜上像素点的荧光分布，照射前如高原台地状的荧光曲线形态说明了mCherry-CRY2-iSH2蛋白在细胞内的均匀分布，在细胞受到NIR照射后，荧光分布转变为典型的峰谷状，表现出蛋白在细胞膜与细胞质间分布的显著不均一性(图8)。
此外，在对照实验中，HepG2细胞被单转染了mCherry-CRY2-iSH2质粒，由于细胞膜上缺失CIBN-CAAX的表达，即使HepG2细胞暴露在NIR的照射下，mCherry-CRY2-iSH2融合蛋白也无法锚定到细胞膜上。开启NIR激光(1W/cm2)持续30s，然后关闭一定时间，如图9所示(比例尺：20μm)，图9a1、b1、c1、d1、e1中，分别为NIR激光开启0s、2s、4s、8s、30s时的荧光照片，图9a2、b2、c2、d2、e2中，分别为NIR激光关闭120s、300s、600s、900s、1200s后的荧光照片。在NIR照射前后，HepG2的细胞质和细胞膜间没有发生蛋白转位现象，这一现象明显区别于在图7中所观察到的。此外，图片中所显示的信息也证明了在本发明的方法中，CRY2与CRY2之间的同源寡聚化是微不足道的，因为HepG2细胞的细胞质中不含任何由NIR照射引起的明显的荧光团。先前有文献报道指出，CRY2自身之间在蓝光的照射下会发生同源寡聚化，这将严重影响光遗传学研究中CIBN/CRY2的相互作用。而CRY2间的同源寡聚化在本发明的方法中可能被抑制，源于融合蛋白中mCherry和iSH结构域所带来的位阻效应。这些结果表明，在NIR照射下，CIBN/CRY2间发生的相互作用可以被用于指引HepG2细胞中特定的蛋白发生定向转位。
实施例3：HepG2细胞胰岛素抵抗模型及相关研究
采用葡萄糖胺(GlcN)诱导HepG2细胞胰岛素抵抗模型，用于评估UMO在体外实验中的作用。图10a-d为细胞免疫荧光染色实验结果，其中图10a、b分别为正常对照组和GlcN诱导组在NIR光照关闭条件下的细胞免疫荧光染色结果；图10c、d分别为正常对照组和GlcN诱导组在NIR光照开启条件下的细胞免疫荧光染色结果。图中分别利用不同的颜色表示mCherry、DAPI、p-AKT的荧光信号。从细胞免疫荧光染色实验中可以看到(图10)，在正常组(图10c)和GlcN处理组(图10d)中p-AKT的荧光信号强度在受到NIR照射后相比于对照组(图10a正常对照组、图10b GlcN对照组)都获得了提高，从荧光图的半定量统计结果可以看到，正常HepG2细胞中的p-AKT信号相比于对照组提高了约5倍，经GlcN处理后胰岛素抵抗的HepG2细胞相比于对照组也表现出约4.5倍的增强(图10e)。在近红外光照时间梯度变化的细胞实验中(图11a1-a6)，AKT磷酸化水平与NIR光照时间正相关，直到荧光强度大约在10分钟时达到饱和。mCherry-CRY2-iSH2的细胞膜转移现象也与之前观察到的一致。图11a1-a6依次对应近红外光照时间为0min、1min、2min、5min、10min、20min时的细胞免疫荧光图。半定量分析这些GlcN处理后HepG2细胞的荧光图片证实了AKT磷酸化水平随NIR光照时间延长呈增加趋势(图12)，图12中，*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001。
在AKT信号通路中，磷酸化的AKT可以促进其下游蛋白分子的磷酸化，包括GSK3β和FOXO1，它们通过增加糖原合成并抑制糖异生协同调控着血糖水平。在蛋白免疫印迹实验中，对HepG2细胞施加不同的处理条件，包括GlcN(+/-)，UMO(+/-)和NIR(+/-)。如图13A所示，无论在正常组还是胰岛素抵抗组HepG2细胞中，UMO+/NIR+都可以显著提高AKT(Ser473)，GSK3β(Ser 9)和FOXO1(Ser 256)的磷酸化水平。但是在标记为ii，iii，iv(分别为UMO-/NIR-/GlcN+，UMO-/NIR+/GlcN-，UMO+/NIR-/GlcN-)的细胞样品组中，相比于对照组(标记为i)，这些蛋白的磷酸化水平没有明显改变。这一结果为NIR触发下的UMO激活导致了AKT，GSK3β和FOXO1的磷酸化这一结论提供有利支撑。从蛋白免疫印迹实验的统计分析结果中可以看出，在UMO激活后，AKT，GSK3β和FOXO1在胰岛素抵抗的HepG2细胞中的磷酸化水平与正常HepG2细胞中的磷酸化水平相近(图13B-D)。这一实验清楚地表明，本发明的方法促进了胰岛素抵抗的HepG2细胞中PI3K/AKT信号通路关键蛋白的磷酸化，从而实现了对二型糖尿病患者血糖的代谢控制。
二型糖尿病患者体内血糖水平的异常升高是因为葡萄糖代谢调节失常。insulin/PI3K/AKT/GSK3β通路的功能紊乱导致了葡萄糖不能被合成为糖原，此外，二型糖尿病患者体内异常活跃的糖异生活动通过FOXO1/PEPCK/G6Pase途径增加葡萄糖的产生，从而进一步恶化了葡萄糖代谢平衡。因此，在治疗二型糖尿病过程中，通过促进糖原合成以及抑制过度的糖异生从而改善血糖水平至关重要。通过监测在采用UCNP-PEG-GA并配合近红外光照射的方式下，经GlcN处理以模拟胰岛素抵抗环境的HepG2细胞中的葡萄糖含量变化，可以看到在图14A中，在正常HepG2细胞培养基中加入胰岛素(100nM)后(insulin组)，细胞的葡萄糖消耗量比正常组(blank组)提高了2.5倍，这一结果符合预期，因为在正常肝细胞中胰岛素可以促进细胞摄入葡萄糖并合成为糖原，然而胰岛素对那些经过GlcN处理后的细胞失去了作用。而本发明的方法(UMO+NIR)却在正常细胞以及胰岛素抵抗的细胞中都能显著促进细胞对葡萄糖的摄入(相对于正常细胞在胰岛素激活下效果的85％增强)，而且在这一方法中，正常及胰岛素抵抗的HepG2细胞都可以耐受UMO+/-NIR的处理，其细胞活力相比于空白组没有明显损失(图14B)。通过对这些细胞中糖原含量的进一步测定，证实了图14A中葡萄糖的消耗确实转变为了糖原(图14C)。另外，细胞暴露在不同处理条件下的糖异生水平也被通过使用无糖培养基所检测，相比于正常细胞，GlcN预处理细胞中的葡萄糖产生量提高了3.4倍(图14D)，并且胰岛素不能对GlcN预处理细胞中的糖异生现象产生抑制作用。作为鲜明对比，UCNP-PEG-GA并配合近红外光照射的方法可以使胰岛素抵抗组中HepG2细胞是糖异生量减半(图14D)。进一步地，本发明还通过实验证明了UMO+NIR对胰岛素抵抗细胞在促进糖原合成和抑制糖异生方面的作用可以被PI3K抑制剂(LY294002)所阻断(图14E，14F)，其中LY294002的浓度为10μM。因此，这些实验结果验证了本发明的方法可以特异性地通过PI3K/AKT通路同时促进糖原合成并减少糖异生，从而有效控制葡萄糖代谢。
实施例4：活体实验及实验结果
二型糖尿病小鼠模型构建：实验所用的C57BL/6J小鼠来自苏州大学实验动物中心。为了诱导二型糖尿病小鼠模型，6周龄的C57BL/6J小鼠接受低剂量注射链脲霉素(streptozotocin，STZ)并结合高脂饮食喂养，这一诱导过程模拟了二型糖尿病的病理过程。简单来说，通过尾静脉向小鼠体内注射120mg/kg体重剂量的STZ(溶解于10mmol/L，pH4.0的柠檬酸缓冲液中)，STZ需现配现用，并在实验过程中保存在冰上。接受STZ注射后，小鼠先使用正常饲料(14.7kJ/g,13kcal％)喂养3周，然后更换高脂饲料(21.8kJ/g，60kcal％fat，Research Diets，#D12492)喂养5周，挑选出血糖水平大于20mmol/L的小鼠重新随机分组，即为诱导成功的二型糖尿病模型小鼠。小鼠血液葡萄糖水平通过强生公司生产的葡萄糖检测试纸检测。
通过尾静脉向小鼠体内注射溶解于PBS中的UCNP-PEG或UCNP-PEG-GA(5mg/kg体重)。为了研究UCNP相关材料在小鼠体内的分布，注射48h后，解剖下小鼠的心、肝、脾、肺、肾器官，于改造过的MaestroTMEX(CRi.Inc.,MA,USA)活体成像仪下进行上转换成像，通过UCNPs在各个器官中的上转换荧光信号强度分析UCNP相关材料的体内分布。
对小鼠各个器官的半定量荧光强度分析结果证明了UCNP在这些器官中的分布趋势(图15a-c)。图15是尾静脉注射不同纳米材料的小鼠肝脏的荧光强度比较结果，图15b-c分别为UCNP-PEG和UCNP-PEG-GA在不同器官中的分布情况。UCNP-PEG在脾脏中的分布略高于其在肝脏中的分布(图15b)，而对于UCNP-PEG-GA来说(图15c)，这种肝脾间的分布比率与UCNP-PEG相反(图15b)。这些结果证明了，在纳米颗粒表面GA分子的帮助下，UCNP-PEG-GA对肝脏的靶向能力相比于UCNP-PEG提高的大约2倍(图15a)。
实施例5：活体实验及实验结果
将质粒CIBN-CAAX与mCherry-CRY2-iSH按1：1.2质量比混合溶解在PBS中，使PBS中的混合质粒浓度达到35μg/mL，每只实施例4构建的小鼠通过尾静脉注射2mL质粒溶液，整个注射过程在8秒内完成，完成注射后，轻微按压小鼠的肝脏部位，以促进质粒在小鼠肝脏细胞中的表达。为了研究小鼠各个器官中质粒的表达情况，在不同时间点取小鼠各个器官进行冰冻切片，使用DAPI对细胞核染色，经PBS清洗后封片，于共聚焦显微镜下观察光遗传蛋白中mCherry的表达情况来判断质粒的表达水平。
结果表明，肝脏相比于其他器官表现出了最高的转染效率，CIBN/CRY2在小鼠肝脏中的表达在转染一天后到达顶峰(图16)。虽然mCherry的荧光信号随着表达时间的延长有所减弱，但是从图片中我们可以看到，在长达两周的时间内，这些光遗传蛋白依旧维持相当程度的表达量(图16)。图16中，a1-a5依次代表第1天、第2天、第4天、第8天和第14天的mCherry的表达情况，b1-b5依次代表第1天、第2天、第4天、第8天和第14天的DAPI的表达情况，c1-c5依次代表第1天、第2天、第4天、第8天和第14天对应的mCherry和DAPI合并表达情况。
顺利验证了光遗传组件在小鼠体内的成功植入后，将以上体系用于二型糖尿病小鼠的治疗。C57BL/6J小鼠通过低剂量链脲霉素(streptozotocin，STZ)注射并结合高脂饮食(high-fat diet，HFD)诱导二型糖尿病模型，在诱导过程中监测其血糖变化情况。35只小鼠经过STZ/HFD诱导5周后，其中31只小鼠的血糖水平高于20mmol/L，这体现出了二型糖尿病小鼠模型构建的高成功率(88.6％)。
采用UMO的体内实验步骤如图17A所示，当二型糖尿病小鼠在第-2天和-1天分别尾静脉注射了UCNP-PEG-GA和光遗传质粒后，它们将在为期两周的治疗周期内每天接受近红外光照治疗(980nm激光，每次三分钟，1.2W/cm2)。包括对照组在内，所有小鼠的血糖值都被同步监测记录。如图17B所示，在治疗期间，各组小鼠的血糖水平存在明显差异。二型糖尿病小鼠的血糖值在两周内几乎一直维持在24mmol/L，这几乎是正常健康小鼠血糖值的3倍，作为对比，当二型糖尿病小鼠经过UMO+NIR治疗后呈现出明显的血糖下降趋势，在14天中从24.4mmol/L降低到11.8mmol/L(糖尿病+UMO+NIR)。作为一个重要的对比，当二型糖尿病小鼠植入了UMO，但是不施加NIR照射(糖尿病+UMO)时，它们的血糖值依旧维持在高于20mmol/L的水平，这证明了在这一方法中，UCNP介导的近红外光转换作用是不可或缺的。
经过了NIR照射治疗后，对各组小鼠进行了葡萄糖耐量实验，以进一步衡量本发明的方法在面对血糖急剧升高的情况下的治疗效果。在进行葡萄糖耐量实验前，小鼠预先禁食12h并接受了一次近红外光照射治疗。向小鼠腹腔中注射2g/kg体重含量的葡萄糖溶液后，分别在注射后15，30，60，120分钟的时间点检测小鼠的血糖水平，通过血糖曲线变化分析小鼠对葡萄糖含量急剧升高的耐受水平。如图17C所示，各组小鼠腹腔注射葡萄糖后血糖值在15分钟内迅速升高，我们可以观察到，糖尿病+UMO+NIR组小鼠的“时间-血糖”代谢曲线与正常健康小鼠相似，都可以在两小时内将小鼠的血糖值降低到基线水平。而其余两组中的小鼠(糖尿病，糖尿病+UMO)不能有效地缓和急剧升高的血糖(图17C)。对小鼠肝脏的糖原含量进行定量分析，结果表明二型糖尿病小鼠肝脏的糖原合成效率只有正常健康小鼠的30-40％，值得注意的是，与正常健康小鼠相比，UMO+NIR治疗可使糖尿病小鼠肝脏糖原合成效率恢复到90％(图17D)。
小鼠肝脏的过碘酸-雪夫(PAS)染色图片结果显示(图18)，采用UMO+NIR治疗二型糖尿病小鼠可以使肝脏的糖原贮存水平恢复，作为阴性对照，未处理或仅植入UMO但无NIR照射的糖尿病小鼠肝脏的糖原含量明显低于正常健康小鼠或恢复正常的小鼠。图18中，a2-d2图分别对应a1-d1方框中的放大图，图18a1-d1中比例尺为100μm，a2-d2中比例尺为50μm。对小鼠肝脏裂解液的蛋白免疫印迹实验也被用来研究体内葡萄糖代谢过程中关键蛋白的变化。接受UMO+NIR治疗的二型糖尿病小鼠肝脏中AKT和GSK3β的磷酸化水平相比于其他对照组显著提高(图19)，这些实验最终表明，UMO+NIR的体内治疗可以通过PI3K/AKT信号通路远程恢复肝细胞在葡萄糖代谢调控方面的功能，而不需要采用胰岛素注射。
综上，本发明开开发了一种通过近红外上转换介导的光遗传远程改善二型糖尿病模型的血糖水平的新方法，它以快速响应性，深组织穿透性，光照剂量可调性的特点介导了PI3K/AKT通路非胰岛素依赖方式下的激活，并以此为基础成功实现了在体外实验和活体实验中对葡萄糖代谢水平的控制。这一基于UMO的方法可以灵活扩展到其他重要的信号通路，例如NF-κB和MAPK信号通路，用于解决免疫和炎症相关的疾病。本发明的UMO+NIR的方法本质上是一种具有深层组织穿透能力的非侵入式技术，可以实现在高时间-空间分辨率的条件下远程调控细胞内信号通路。这一新技术极大地丰富了光遗传学用于信号通路研究的工具箱，也为传统临床治疗方案提供了新的解决思路。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.上转换荧光纳米材料在制备治疗糖尿病的工具中的应用，其特征在于，所述工具包括上转换荧光纳米材料和光敏蛋白，所述上转换荧光纳米材料包括稀土元素掺杂的无机纳米材料、靶向肝细胞的分子以及水溶性高分子，所述靶向肝细胞的分子以及水溶性高分子连接在稀土元素掺杂的无机纳米材料的表面；
所述稀土元素掺杂的无机纳米材料为具有核壳结构的NaYF4:Yb/Tm@NaYF4上转换纳米颗粒，所述光敏蛋白为CIBN和CRY2；
所述糖尿病为二型糖尿病。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具的使用方法包括以下步骤：
（1）采用负载光敏蛋白的质粒转染生物体，使负载光敏蛋白的质粒在生物体的肝脏细胞中表达；
（2）将所述上转换荧光纳米材料注射入经步骤（1）处理的生物体内，并采用近红外光照射生物体的肝脏部位。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在步骤（2）中，所述近红外光的波长为0.7μm-2.5 μm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述上转换荧光纳米材料用于降低血糖水平。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述靶向肝细胞的分子选自甘草次酸和/或甘草酸；所述稀土元素掺杂的无机纳米材料和靶向肝细胞的分子的质量比为1：0.02-0.1。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述水溶性高分子选自聚乙二醇、聚丙烯酸和聚乙烯亚胺中的一种或几种；所述稀土元素掺杂的无机纳米材料和水溶性高分子的质量比为1：1-2。
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