CN115006730A - 基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法、稀土基近红外纳米材料体系及其应用 - Google Patents

基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法、稀土基近红外纳米材料体系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法、稀土基近红外纳米材料体系及其应用，解决现有光遗传领域中的有创、低效率、单一化以及高成本等问题。针对不同类型的光敏蛋白设计合成与之匹配的稀土基近红外纳米材料作为其中继激发光源。将两种不同的光敏蛋白分别表达目标神经细胞膜上，将两种与其响应波段相匹配的近红外中继纳米材料转至对应的目标神经细胞区域。使用不同通道近红外光源对目标区域进行刺激，目标区域的两种中继材料可分别将不同通道的近红外激发光源转换成为可被目标光敏蛋白接收响应的可见光，使光敏通道蛋白被激活从而实现利用不同光源对相同种神经细胞或同一光源对不同种神经细胞的兴奋或抑制的独立控制。

Description

基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法、稀土 基近红外纳米材料体系及其应用
技术领域
本发明属于光遗传学技术领域，具体涉及一种基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法稀土基近红外纳米材料体系及其应用。
背景技术
记录和操控神经元的活性是神经科学和脑科学机制研究的最基本手段。光遗传学技术是一项先进的，高时空特异性的应用基因工程技术。这项技术将光控技术与遗传学技术相结合，结合了光敏蛋白的特性。通过遗传学方法使得光敏蛋白的基因在某一种特定的细胞内特异性地表达，再通过光控技术，使用与所表达的光敏蛋白相关的一定波长的光，给予相应的光照刺激，因为光敏蛋白的特异性变化，从而改变细胞的活动状态。新兴的光遗传学技术最先广泛应用于神经科学，多用于脑环路功能与行为学的关系、抑郁症的治疗、癫痫以及帕金森综合征治疗研究。
在2006年，斯坦福的博士Karl Deisseroth在自己的研究中首次提到了光遗传学(Optogenetics)，因其具有的高度的时空分辨率，短短的十多年，神经科学的研究已经取得了许多重大的突破，神经科学的研究得到了飞速的发展。它结合光敏感的通道蛋白的特性与神经元的兴奋抑制与膜内外电位的密切关系，通过相应的光刺激，使表达光敏感通道蛋白的神经元膜内外电位发生变化，从而改变神经元的活动状态，实现高时空精度的开关(兴奋，正常，抑制)功能。此外，光遗传技术也被科研人员用于心脏光起搏，并研究其在心脏中的价值。心脏光遗传学是一个新兴的研究方向，一般是指将源于绿藻(chlamydomonasreinhardtii)的光敏感蛋白视紫红质通道蛋白ChR2特异性表达于心肌细胞上，通过蓝光照射使ChR2 通道开放，胞外阳离子流入细胞内，使细胞膜电位去极化，从而引发心肌细胞产生动作电位，电活动可以从少数心肌细胞向周围相邻的心肌细胞传导，最终使整个心脏兴奋和收缩，从而实现光控小鼠心脏起搏模型的搭建。近几年来，光遗传学在可控的基因编辑、基因治疗及细胞治疗领域也取得了一系列进展。2017年，叶海峰课题组开发了远红光调控转基因表达控制系统。实现只需一束远红光即可调控基因表达。利用多学科技术交叉，建立了通过智能手机APP超远程调控人工定制胰岛细胞治疗糖尿病的电子药物平台。在2018年，他们将远红光调控转基因表达控制系统与CRISPR-dCas9基因编辑两大技术相结合，开发出了远红光调控的 CRISPR-dCas9内源基因转录激活装置(FACE)。随后他们相继开发出了光控的分割型Cre-loxp系统(FISC)以及光控的非离子通道类遗传开关(REDMAP)。可以实现精准调准细胞信号通路、高效调控细胞和小鼠内源基因的表达、动物体内的血糖稳态控制等。目前关于光遗传的这些研究进展不仅扩展了哺乳动物细胞基因编辑的光遗传学工具，还加速了光遗传学从基础研究向生物医学转化研究的进展。
然而，目前几种主要的光敏蛋白和其对应的相应光波长分别如下：ChR2-蓝光460nm；嗜盐碱菌里发现的Halorhodopsin(NphR盐系菌视紫红质)-黄光593nm；苏打盐红菌里发现的Arch(古紫质)-黄绿光566nm；ΔphyA-660nm+730nm。由于生物组织对这些光能的强烈吸收和散射，这些位于可见区的光很难穿透生物组织，比如蓝光仅能穿透约1个毫米左右的生物组织。这种实质性的局限性以及长时间的可见光暴露还会引起细胞毒性，突出表明了将这些光诱导的光敏蛋白应用于体内研究应用和临床转化的难度。此外，光遗传中大多数的光控设备还存在有创、高成本、操纵复杂以及误差过大等限制，比如使用光纤从外部光源传递光不仅刺激区域有限、通道单一、对活体造成损伤，还会导致空间位阻，可能干扰动物的自然运动，并阻碍对复杂行为背后的神经回路的研究。头戴式、背带式的设备也或多或少对动物行为造成干扰而导致实验数据偏移。
近些年来，随着纳米生物技术的发展，纳米材料在生物分子检测、生物成像以及疾病诊疗等方面的应用越来与广泛。尤其稀土基纳米材料因其高荧光强度、低成本、快速反馈、高灵敏、无辐射等特点在生物应用领域中展示出了卓越的优势。稀土离子有5s轨道和5p轨道的保护，因此环境对稀土离子荧光的影响非常微弱，这使得其荧光发射光谱谱线尖锐(强度高、发射峰窄)且稳定。此外，不同稀土离子的掺杂组合使最终纳米粒子的发射谱带更具可定制性，如可以同时实现双近红外光源激发的LaF3:Nd,Yb,Er，还有单光源激发红绿光双色荧光的CaF2:Yb,Er，它们可以在吸收近红外光后，发射出高效的上转换可见光荧光。这些特性使得稀土基纳米材料可以作为一种中继介导材料，将具有组织穿透相对深特性的近红外光应用于光遗传学技术，在满足后者向深层组织传导光学信号的需要的同时还可以极大程度减少对生物组织的创伤。2015年，日本仙台东北大学的HiromuYawo 首次证实了在稀土基纳米材料NaYF4:Sc,Yb,Tm的介导下，在细胞爬片上可以通过近红外光有效调控神经元的活性。早期关于稀土基纳米材料介导的光遗传应用探索主要还是停留在体外。2017年，中国香港城市大学史鹏首次将稀土基纳米材料 NaYF4:Yb,Er@NaYF4介导的光遗传方法应用在了啮齿类哺乳动物中，实现了小鼠中枢神经系统的无线光调控。更进一步，日本理化研究所的Chen在2018年将 NaYF4:Yb,Tm@SiO2纳米粒子注射到小鼠双侧VTA区，通过近红外激发光照射，展示了该技术在神经疾病治疗方面的应用潜力，这是目前对稀土基纳米材料介导的无线光遗传学技术在体内应用最深入的研究。虽然基于稀土基近红外纳米材料介导的光遗传的研究很大程度的改善了对于生物体的损伤，但其应用还是面临着一些局限。在该方法中，一种材料体系只能针对一种视蛋白来对神经元介导刺激以对其功能进行研究，并且一种材料体系必须单独配置与之相匹配的光照刺激系统，当改变研究目标神经元所使用的视蛋白时，不仅需要重新设计合成介导纳米材料体系，还需要重新配置匹配的光照刺激系统并再次进行活体的立体定位注射，这不仅会大幅增加实验的耗时、成本以及操作复杂度，还会由于多次的注射增加对生物组织的损伤和感染风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法。能够解决现有光遗传领域中的有创、低效率、单一化以及高成本等问题，能够同时实现对两种目标神经细胞的兴奋或抑制的独立光遗传操控。
本发明的构思是：
本发明针对所选用的不同类型的具有不同光响应波段的光敏蛋白设计合成与之匹配的稀土基近红外纳米材料作为其中继激发光源。通过病毒载体并结合特异启动子的遗传学方法将两种不同的光敏蛋白(兴奋型/兴奋型、兴奋型/抑制型、抑制型/抑制型)分别表达在所选定的两种目标神经细胞膜上。利用脑立体定位注射方式，将两种设计合成的与其响应波段相匹配的近红外中继纳米材料转至对应的目标神经细胞区域。使用不同通道近红外光源对目标区域进行非侵入式的无创光照刺激，目标区域的两种中继材料可分别将不同通道的近红外激发光源转换成为可被目标光敏蛋白接收响应的可见光，使光敏通道蛋白被激活从而实现利用不同光源对相同种神经细胞或同一光源对不同种神经细胞的兴奋或抑制的独立控制。
本发明的技术方案是提供一种基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
步骤1、将两种稀土基近红外纳米材料分别作为两种目标神经细胞的中继激发光源，所述两种目标神经细胞表达有特定光敏蛋白；
步骤2、使用近红外激发光源对分布有目标神经细胞的区域进行非侵入式无创光照刺激，两种稀土基近红外纳米材料分别将近红外激发光源转换成为可被相应特定光敏蛋白接收的响应波段可见光，使光敏蛋白被激活，实现两种目标神经细胞的兴奋或抑制的独立控制。
进一步地，步骤1中，所述两种目标神经细胞表达不同光响应波段的光敏蛋白；
步骤2采用单一近红外激发光源对目标区域进行非侵入式的无创光照刺激，目标区域的两种稀土基近红外纳米材料分别将单一波段近红外激发光源转换成为可被相应光敏蛋白接收的响应波段可见光，使光敏蛋白被激活，从而实现利用单一波段近红外激发光源同时对两种目标神经细胞的调控。
进一步地，所述两种稀土基近红外纳米材料为： NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4，和NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4；
所述近红外激发光源波长位于977-985nm之间；
对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：ChR2和eBR；或，Mac和eBR；或C1V1和ChR2。
进一步地，所述近红外激发光源波长为980nm。
进一步地，所述两种稀土基近红外纳米材料为： NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd和 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；
所述近红外激发光源波长位于799-811nm之间；
对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：C1V1和ChR2；或，ChR2和 eBR；或，Mac和eBR。
进一步地，所述近红外激发光源波长为808nm。
进一步地，步骤1中，所述两种目标神经细胞表达有不同光响应波段的光敏蛋白；
步骤2采用两种近红外激发光源对目标区域进行非侵入式的无创光照刺激，目标区域的两种稀土基近红外纳米材料分别将近红外激发光源转换成为可被相应的表达在不同神经元上的具有不同光响应波段的光敏蛋白接收的可见光，使光敏蛋白被激活，从而实现利用两种不同波长近红外激发光源对两种不同目标神经细胞的独立调控。
进一步地，所述两种稀土基近红外纳米材料为： NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4和NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；
对应两种近红外激发光源波长分别位于974-985nm，798-812nm；
对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：C1V1和ChR2，或ChR2和 eBR，或Mac和eBR。
进一步地，对应两种近红外激发光源波长分别为980nm和808nm。
进一步地，所述两种稀土基近红外纳米材料为： NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd和 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4；对应两种近红外激发光源波长分别位于799-811nm，977nm-986nm；
对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：ChR2和C1V1，或ChR2和 eBR，或Mac和eBR。
进一步地，对应两种近红外激发光源波长分别为808nm和980nm。
本发明还提供另一种基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
步骤1、将两种稀土基近红外纳米材料分别作为同种目标神经细胞的中继激发光源，所述两种目标神经细胞表达有相同光敏蛋白；
步骤2、使用两种不同波段近红外激发光源对分布有目标神经细胞的区域进行非侵入式无创光照刺激，两种稀土基近红外纳米材料分别将两种不同波长近红外激发光源转换成为可被光敏蛋白接收响应的可见光，使光敏蛋白被激活，实现利用两种不同波长近红外激发光源同时对一种目标神经细胞兴奋或抑制的调控。
进一步地，所述两种稀土基近红外纳米材料为： NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4和NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；
对应两种近红外激发光源波长分别位于974-985nm，799-811nm；
所述目标神经细胞表达的光敏蛋白为ChR2或Mac。
进一步地，对应两种近红外激发光源波长分别为：980nm和808nm。
进一步地，所述两种稀土基近红外纳米材料为： NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4和 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；
对应两种近红外激发光源波长分别位于977-986nm，798-812nm；
所述目标神经细胞表达的光敏蛋白为C1V1或eBR。
进一步地，对应两种近红外激发光源波长分别为：980nm和808nm。
进一步地，由于通常所制备的稀土基纳米粒子表面会有一定量油酸的存在，会导致材料的疏水性，从而无法在光遗传实验中进行应用。此外材料直接与生物组织接触，还可能会产生一定的生物毒副作用，造成安全性风险。本发明基于近红外纳米材料的水溶性及生物相容性改性修饰方法，在所述稀土基近红外纳米材料表面连接有一层生物相容的功能性磷脂。本发明通过设计逐层连接方法，将 PAA、PEI、DSPE-PEG、PVP等表面修饰剂包覆在纳米粒子表面，不仅阻隔了纳米材料与生物组织的直接接触，大大提高其生物相容性，还由于引进了亲水端有机物质，可以显著改善材料的水溶性。
本发明还提供一种稀土基近红外纳米材料体系，其特殊之处在于：包括 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4； NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd； NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4；NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd。
本发明还提供一种上述稀土基近红外纳米材料体系作为中继介导材料在光遗传技术的应用。
本发明还提供一种上述稀土基近红外纳米材料体系作为多模造影材料，在活体内的多模成像定位方法中的应用。首先，所设计合成材料中的Yb，Er及Tm离子由于其特有的优异荧光特性可在活体内目标神经细胞周围可通过近红外激发光的刺激下实现荧光成像定位。其次，材料中的Gd离子具有很强的顺磁性，并且其对称8S7/2基态提供相对较长的电子弛豫时间，这些特征使该材料可用于MRI成像定位。另外，Lu离子的存在是材料具有了很高的X射线吸收系数，因而还可以进行在体的CT成像探测定位。
本发明的有益效果是：
1、与现有技术相比，该发明突破了传统光遗传领域的研究瓶颈，打破了固有的一种光源对一种目标神经元的激发控制的限制，该发明不仅拓展了现有光遗传领域的光控技术方法，还为神经学领域的研究开辟全新的研究思路。
2、基于本发明所设计合成的稀土基纳米中继材料体系实现了一种光源对两种目标神经元的“1对2”光控模式、两种光源对一种目标神经元的“2对1”光控模式以及以两种光源分别独立控制两种目标神经元的“并联式1对1”光控模式。
3、近红外光源的使用相较于可见光激发可以减少生物组织对光的散射、吸收，大幅提高生物组织的穿透能力。而近红外敏化介质即稀土基近红外纳米材料由于本身的高发光转化效率和高分散性，可以“零距离”且全方位的对目标细胞进行激发，高效且安全的完成对目标细胞的光控过程，达到对细胞选择性地兴奋或者抑制的目的。
4、该发明实际操作性高，可以通过脑定位注射、特异性启动子或是亚细胞器定位肽，将光敏感蛋白锚定在靶向细胞或细胞器进行操作。并以近红外光作为刺激媒介，可实现神经细胞的毫秒级操控。此方案对实验动物的创伤远远小于传统方法，没有异物侵入组织，不需要定位的光纤来局部刺激细胞，也不必穿戴任何光学器件，仅通过设计的弥散光大范围刺激目标即可完成对特定细胞的光控激活过程。
5、该发明具有非常广泛的适用性，可以针对不同光遗传应用场景、不同的光敏通道蛋白，定制与之相匹配的近红外荧光敏化方案。根据通道蛋白的响应波长设计最高效匹配的敏化纳米材料发光波段，还可以根据目标细胞的特点对材料的溶解性、表面电位、靶向能力及尺寸形貌等性能进行剪裁设计，以实现精准可控的细胞刺激或基因编辑。该发明的广泛适用性使其有望推广至整个光遗传领域，为突破该领域的光控穿透深度、灵敏度及安全性限制提出全新的解决方案。
附图说明
图1为本发明方法原理示意图。
图2为实施例中方法流程。
图3为本发明所制得样品的荧光光谱图；
其中：a谱图为NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4的发射光谱图，激发光为980 nm，光响应波段为974-985nm，光发射波段主要位于441-494nm，对应着Tm3+的1G4→3H6的能级跃迁辐射。
b谱图为NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd的发射光谱图，激发光为808nm，光响应波段为799-811nm，发射波段主要位于442-488nm，同样对应着Tm3+的1G4→3H6的能级跃迁辐射。
c谱图为NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4的发射光谱图，激发光为980nm，光响应波段为977nm-986nm，发射波段主要位于518-556nm，对应着Er3+的2H11/2→4I15/2与4S3/2→4I15/2的能级跃迁辐射。
d谱图为NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd的发射光谱图，激发光为808nm，光响应波段为798-812nm，发射波段主要位于516-558nm，同样对应着Er3+的2H11/2→4I15/2与4S3/2 4I15/2的能级跃迁辐射。
图4为本发明所制得样品的TEM图；
其中，a图为NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4的TEM图；
b图为NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd的TEM图；
c图为NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4的TEM图；
d图为NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd的TEM图；四组样品纳米材料的形貌均为不规则球状，可以看到当材料由三层结构(图a、c)增加至四层结构(图b、d)时，粒径由25-30nm左右增加至30-35nm左右。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1
结合图1和图2，本实施例是针对两种常用光敏阳离子通道蛋白C1V1(兴奋性；响应波长：540nm)与ChR2(兴奋型；响应波长：470nm)，拟从发光波段、代谢速率、分散稳定性及安全性等方面对纳米材料的尺寸、形状、壳层结构、组成及表面性能进行设计剪裁。为了显著降低生物组织对于激发光源的散射、吸收及自荧光干扰，我们甄选出可以实现激发光位于生物组织的高透过窗口处即近红外区的稀土离子(NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4 980nm→470nm； NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd 808nm→540nm)，通过能级匹配及能量传递过程计算出可以实现上转换发光的离子掺杂配比，使其可以高效率地将所吸收光能传递给光敏通道蛋白以实现对于目标细胞的兴奋与抑制控制。其次为了确保材料在生物体内进行循环并能够突破血脑屏障的阻隔，我们通过调节反应速率、时长、温度以及离子浓度和溶剂比例等条件将材料的尺寸分布控制在30-50nm范围以内。
近红外敏化纳米材料的制备
(1)将Y(CH3COO)3与Tm(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。在氮气保护氛围下加温后自然冷却至室温。之后，引入氟源和钠源，分别向混合溶液中加入NH4F和NaOH的甲醇溶液，在氮气保护氛围下升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，离心洗涤得到NaYF4:Tm的固体粉末并分散至环己烷中保存。将Lu(CH3COO)3与Yb(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。加入上一步合成的NaYF4:Tm，再引入氟源和钠源。在氮气保护氛围下升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，冷却离心洗涤得到NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb的固体粉末。将Gd(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。在氮气保护氛围下加温后自然冷却至室温。之后，加入上一步合成的NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb，再引入氟源和钠源。在氮气保护氛围下搅拌后升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，冷却至室温。离心洗涤得到NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4的固体粉末并分散至环己烷中保存，其荧光光谱图如图3中a所示，TEM图见图4中 a。
(2)将Y(CH3COO)3、Yb(CH3COO)3与Er(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。在氮气保护氛围下加温后自然冷却至室温。之后，引入氟源和钠源，分别向混合溶液中加入NH4F和NaOH的甲醇溶液，在氮气保护氛围下升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，离心洗涤得到NaYF4:Yb，Er的固体粉末并分散至环己烷中保存。将Lu(CH3COO)3与Yb(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。加入上一步合成的NaYF4:Yb，Er，再引入氟源和钠源。在氮气保护氛围下升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，冷却离心洗涤得到 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb的固体粉末。将Lu(CH3COO)3与Nd(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。在氮气保护氛围下加温后自然冷却至室温。之后，加入上一步合成的NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb，再引入氟源和钠源。在氮气保护氛围下搅拌后升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，冷却至室温。离心洗涤得到NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd的固体粉末。将Gd(CH3COO)3与 Nd(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。在氮气保护氛围下加温后自然冷却至室温。之后，加入上一步合成的NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd，再引入氟源和钠源。在氮气保护氛围下搅拌后升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，冷却至室温。离心洗涤得到 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd的固体粉末并分散至环己烷中保存，其荧光光谱图如图3中d所示，TEM图见图4中d。
纳米材料水溶性及生物相容性改性修饰
由于所合成的纳米材料是疏水性的，因为其表面包覆着油酸配体。为了使纳米材料具有良好的亲水性和生物相容性，我们在其表面连接一层生物相容的功能性磷脂DSPE-PEG2000-COOH，其中DSPE端具有疏水性，通过疏水-疏水相互作用与纳米材料表面的油酸结合，PEG2000-COOH端是亲水性的，能使纳米材料很好地分散于水溶液中。首先将5mg表面包覆油酸的纳米材料、20mg DSPE-PEG2000-COOH和3mL三氯甲烷混合于5mL圆底烧瓶中，然后搅拌20 分钟，接着将混合液置于旋转蒸发器中干燥，保持加热温度至35℃以加速溶液挥发，温度不宜过高否则容易爆沸。当在烧瓶内壁上形成脂膜时，加入4mL超纯水超声30分钟。使纳米材料形成溶液。最后用离心机将多余磷脂除去，得到 DSPE-PEG2000-COOH修饰的纳米材料。
AAV病毒载体的构建及目标细胞转染
采用三质粒共转染方式分别将光敏通道蛋白C1V1于ChR2构建在AAV病毒载体上，完成后对实验组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，待动物完全麻醉后，用弯剪将小鼠头顶被毛剪除。使用小鼠适配器对小鼠头部进行固定。在肉眼条件下，调节两侧耳杆的高度和上颚固定杆的高度使动物头部处于水平。用碘伏或酒精棉球对头皮进行消毒后，用眼科剪沿正中线剪开头皮，用无菌脱脂棉球擦拭除去颅骨筋膜组织和血液，使前囟和后囟清晰可见。将微量注射器装载到微量注射泵上，保持垂直，旋紧螺栓压紧注射器活塞末端。选择对应靶区的注射位点。用微型颅钻垂直钻孔。用70％酒精对注射器针头部位进行消毒后，以100L/s速度吸取适量病毒，将针头缓缓下沉到靶区，用一次性注射器在颅骨开口处滴上生理盐水封闭，防止组织干燥，以100nL/min的速度将病毒与纳米材料溶液注射入靶点，注射结束后额外停针10min，使病毒充分扩散。完毕后以1mm/min速度上提注射器，以防止速度过快导致病毒液渗出，用角针和无菌缝合线缝合头皮并，给与利多卡因林可霉素凝胶镇痛和消炎。将动物至于加热毯上保持体温直到清醒后放回饲养笼内，饲养3-4周，使病毒充分表达。在其他实施例中还可以选择脊髓部位的神经细胞作为目标神经细胞。
制备含有目标脑区的活体冠状脑切片
使用水合氯醛腹腔注射麻醉实验小鼠，用常温的磷酸盐缓冲液进行心脏灌流 3-5min，待小鼠体内没有血液残留时，随即使用冰冷的4％多聚甲醛溶液缓慢灌流10-15min，断头，取脑，并在4℃的4％PFA溶液中固定过夜。随后在含30％蔗糖的PBS溶液中于4℃脱水3天。将脑组织进行OCT包埋，随后使用冷冻切片机进行全脑切片，在4℃条件下储存于冷冻保护剂(于PBS中的25％甘油和30％乙二醇)中。于PBS中洗涤自由浮动切片，然后于0.3％Triton X-100(T×100)和3％常规驴血清(NDS)中培育30min。在4℃下用于3％NDS中的一次抗体(山羊抗ChAT1: 20，Millipore)培育切片过夜。然后用PBS洗涤切片并且在室温下用二次抗体(与 Cy3或Cy5偶联的驴抗山羊抗体，Jackson Laboratories)培育2h。然后洗涤切片，用DAPI(1:50000)培育20min，再次洗涤，并用PVA-DABCO固定在载玻片上。
中继介导纳米材料在目标区域分布测试
近红外中继介导纳米材料能够均匀稠密地分布在目标细胞的附近区域是其发挥能量中继介导作用的关键前提。本发明将所制备的中继介导纳米材料配制成注射液，并在AAV病毒注射后的不同时刻注射进小鼠目标脑区。之后使用4％多聚甲醛溶液对各实验组小鼠经心脏灌注，再将小鼠大脑置于固定液中固定1天，制作成100μm厚的切片。在0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH＝7.4)中多次洗涤后，用 1％四氧化锇和1.5％亚铁氰化钾在0.1M甲胂酸钠缓冲液中固定1个小时，再用1％四氧化锇在甲胂酸钠缓冲液中固定1个小时。完后用1％醋酸铀酰对切片分段复染 1小时，并通过50％、70％、80％、90％、95％和100％的乙醇分别脱水，每次进行 10分钟。脱水后用环氧丙烷对切片处理10分钟，然后浸泡在新制备的Durcupan 树脂中过夜以进行树脂渗透。将切片转移到玻片上进行平面嵌入，并在60℃烘箱中放置48小时进行树脂固化。将目标脑区从平埋切片中切除，粘在树脂块上。使用切片机的金刚石刀切割出70nm的超薄切片，收集在Formvar涂层的单槽铜网格中，并在50％乙醇和0.4％柠檬酸铅中用2％醋酸铀进行短暂复染。最后，在生物电子显微镜下观察切片，利用CCD相机拍摄图像结果证实近红外中继介导纳米材料均匀稠密地分布在目标细胞区域附近以确保其可以发挥出中继介导发光的作用。
体外光照激活下的电生理测试分析
本发明使用膜片钳实验设备对体外光刺激下的目标细胞的电生理学进行测试分析，以验证体外近红外纳米材料中继介导的光遗传方案对细胞的激活情况。测试所用的脑片分别取自首先经脑立体定位注射了载体腺病毒而后在解剖前24h注射了介导材料的实验小鼠。使用的刺激光源为近红外808nm和980nm的面光源半导体光纤激光器。每次实验之前采用照度计对刺激光强度进行测量和标定。为了判断搭载在腺病毒上的光敏蛋白在目标神经细胞膜上的表达情况，本发明利用共聚焦显微镜对脑片进行观测。在观测到标记荧光蛋白的发光现象确定了目标神经元上成功表达了所选用的光敏蛋白之后，将脑片置于含有33.5℃人工脑脊液 (ACSF)的实验槽内，之后通过显微镜寻找目标细胞并进行膜片钳钳制，当电阻到达高阻后，用合适的电压打破吸附在电极里面的细胞膜部分，进行破膜操作。把吸附在电极内的细胞膜打破后，便形成全细胞记录模式，进行电压钳和电流错记录。记录不同功率、频率及脉宽条件的光刺激下各实验组目标细胞的膜电位值变化情况，分析研究目标细胞的兴奋与抑制情况，证实本发明这种基于近红外诱导的光敏蛋白激活方法可在体外实现。
光遗传活体实验
首先将搭载着所选用光敏通道蛋白并结合有特异启动子的腺病毒载体通过脑立体定位注射的方式打进小鼠目标脑区，2周后再将合成并经修饰的近红外中继介导纳米材料注射进相同的位置。待目标细胞转染完成后进行对小鼠的行为学观测，实验前，实验人员每天用手对小鼠进行抚触约2min，连续进行5天。此步骤是为了让小鼠提前熟悉适应实验人员的操作，尽量减少小鼠因为实验人员操作所产生的焦虑情绪，在行为测试前一天(第0天)，让小鼠在旷场中自由探索约15min，使其提前适应箱体环境。逐次拿出小鼠，用医用脱脂棉花包裹小鼠轻轻抚触，每只5 min。在实验日(第1天和第2天)当天，将小鼠从饲养间带入行为测试房间，并适应至少30min。随后小鼠被放入旷场，自由探索5min后，再录制3min的基线，然后给予光遗传刺激。多次刺激实验中，刺激间隔至少为2min，每次刺激发生在旷场不同位置，以防止动物产生空间依赖的恐惧记忆。实验结束后，小鼠被送回饲养笼。对比小鼠在不同光源刺激及光刺激前后的行为变化规律，证实在活体内光遗传实验中，基于近红外光敏材料中继的双通道光遗传技术方法可以安全且独立地对目标神经元上的通道蛋白进行激活，实现对于两种不同神经细胞兴奋的独立有效控制。
实施例2
在本实施例中，选用了两种光敏蛋白ChR2(兴奋型；响应波长：470nm)和eBR(抑制型；响应波长：540nm)，所使用的中继介导纳米材料为本发明设计合成的NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→470nm)与 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→540nm)。
NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4材料的制备过程如下：
将Y(CH3COO)3、Yb(CH3COO)3与Er(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。在氮气保护氛围下加温后自然冷却至室温。之后，引入氟源和钠源，分别向混合溶液中加入NH4F和NaOH的甲醇溶液，在氮气保护氛围下升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，离心洗涤得到NaYF4:Yb,Er的固体粉末并分散至环己烷中保存。将Lu(CH3COO)3与Yb(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。加入上一步合成的NaYF4:Yb,Er，再引入氟源和钠源。在氮气保护氛围下升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，冷却离心洗涤得到 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb的固体粉末。将Gd(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。在氮气保护氛围下加温后自然冷却至室温。之后，加入上一步合成的 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb，再引入氟源和钠源。在氮气保护氛围下搅拌后升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，冷却至室温。离心洗涤得到 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4的固体粉末并分散至环己烷中保存，其荧光光谱图如图3中c所示，TEM图见图4中c。
待所选用的两种光敏蛋白分别表达在两种目标神经元上之后，将合成的这两种材料混合注射进小鼠的目标脑区，具体实验操作方法与实施例一中相同。这样，通过单一980nm光源就可以实现同时对两种神经元的兴奋和抑制调控。通过与上述实施方案中相同的检测步骤，验证了该实施方案的可行性。此方法不仅拓展了光遗传技术的应用范围，还为更复杂更综合的神经功能的研究提供了可行的操作方法。
实施例3
在本实施例中，选用的两种光敏蛋白均属抑制型，分别是Mac(抑制型；响应波长：470nm)和eBR(抑制型；响应波长：540nm)。使用的中继介导纳米材料与实施例二中的相同，分别为NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→470 nm)与NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→540nm)。用与实施例一相同的方法证实了通过单一980nm光源就可以实现同时对两种神经元抑制的调控。
实施例4
在本实施例中，在实施例1的基础上，将所使用的中继介导纳米材料 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→470nm)改为本发明合成的 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→470nm)，通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过单一808nm光源就可以实现同时对两种神经元兴奋的调控。
NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd材料的制备方法如下：
将Y(CH3COO)3与Tm(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。在氮气保护氛围下加温后自然冷却至室温。之后，引入氟源和钠源，分别向混合溶液中加入NH4F和NaOH的甲醇溶液，在氮气保护氛围下升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，离心洗涤得到NaYF4:Tm的固体粉末并分散至环己烷中保存。将Lu(CH3COO)3与Yb(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。加入上一步合成的NaYF4:Tm，再引入氟源和钠源。在氮气保护氛围下升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，冷却离心洗涤得到NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb的固体粉末。将Lu(CH3COO)3与Nd(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。在氮气保护氛围下加温后自然冷却至室温。之后，加入上一步合成的 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb，再引入氟源和钠源。在氮气保护氛围下搅拌后升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，冷却至室温。离心洗涤得到 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd的固体粉末。将Gd(CH3COO)3与 Nd(CH3COO)3溶解进十八烯和油酸的混合溶液。在氮气保护氛围下加温后自然冷却至室温。之后，加入上一步合成的NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd，再引入氟源和钠源。在氮气保护氛围下搅拌后升温去除甲醇与水。除尽后升温形成特定晶型结构，冷却至室温。离心洗涤得到NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd的固体粉末并分散至环己烷中保存，其荧光光谱图如图3中b所示，TEM图见图4中b。
实施例5
在本实施例中，在实施例2的基础上，将所使用的中继介导纳米材NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→540nm)改为了本发明合成的 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→540nm)，通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过不同的两种光源实现对于两种不同神经细胞兴奋与抑制的独立有效控制。
实施例6
在本实施例中，在实施例3的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→540nm)改为本发明合成的 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→540nm)，通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过不同的两种光源实现对于两种不同神经细胞抑制的独立有效控制。
实施例7
在本实施例中，在实施例1的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→540nm)改为本发明合成的NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→540nm)，通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过单一980nm光源实现对于两种不同神经细胞兴奋的独立有效控制。
实施例8
在本实施例中，在实施例5的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→470nm)改为本发明合成的 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→470nm)，通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过单一808nm光源实现对于两种不同神经细胞兴奋与抑制的独立有效控制。
实施例9
在本实施例中，在实施例6的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→470nm)改为本发明合成的 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→470nm)，通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过单一808nm光源实现对于两种不同神经细胞抑制的独立有效控制。
实施例10
在本实施例中，在实施例1的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→540nm)改为本发明合成的NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→470nm)，将目标神经细胞改为单一一种，所表达光敏蛋白为ChR2(兴奋型；响应波长：470 nm)。通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过不同的两种光源实现对于单一神经细胞兴奋的独立有效控制。
实施例11
在本实施例中，在实施例1的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→540nm)改为本发明合成的NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→470nm)，将目标神经细胞改为单一一种，所表达光敏蛋白为Mac(抑制型；响应波长：470 nm)。通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过不同的两种光源实现对于单一神经细胞抑制的独立有效控制。
实施例12
在本实施例中，在实施例1的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→470nm)改为本发明合成的 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→540nm)，将目标神经细胞改为单一一种，所表达光敏蛋白为C1V1(兴奋性；响应波长：540nm)。通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过不同的两种光源实现对于单一神经细胞兴奋的独立有效控制。
实施例13
在本实施例中，在实施例1的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→470nm)改为本发明合成的 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→540nm)，将目标神经细胞改为单一一种，所表达光敏蛋白为eBR(抑制型；响应波长：540nm)。通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过不同的两种光源实现对于单一神经细胞抑制的独立有效控制。
实施例14
在本实施例中，在实施例4的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→540nm)改为了本发明合成的NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→540nm)，通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过不同的两种光源实现对于两种不同神经细胞兴奋的独立有效控制。
实施例15
在本实施例中，在实施例8的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→540nm)改为了本发明合成的NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→540nm)，通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过不同的两种光源实现对于两种不同神经细胞兴奋与抑制的独立有效控制。
实施例16
在本实施例中，在实施例9的基础上，将所使用的中继介导纳米材 NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd(808nm→540nm)改为了本发明合成的NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4(980nm→540nm)，通过与实施方案一中相同的实验与检测步骤，验证了可以通过不同的两种光源实现对于两种不同神经细胞抑制的独立有效控制。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (22)

1.基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将两种稀土基近红外纳米材料分别作为两种目标神经细胞的中继激发光源，所述两种目标神经细胞表达有特定光敏蛋白；
步骤2、使用近红外激发光源对分布有目标神经细胞的区域进行非侵入式无创光照刺激，两种稀土基近红外纳米材料分别将近红外激发光源转换成为可被相应特定光敏蛋白接收响应的可见光，使光敏蛋白被激活，实现两种目标神经细胞的兴奋或抑制的独立控制。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述两种目标神经细胞表达不同光响应波段的光敏蛋白；
步骤2采用单一近红外激发光源对目标区域进行非侵入式的无创光照刺激，目标区域的两种稀土基近红外纳米材料分别将单一波长近红外激发光源转换成为可被相应光敏蛋白接收响应的可见光，使光敏蛋白被激活，从而实现利用单一波长近红外激发光源同时对两种目标神经细胞的调控。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述两种稀土基近红外纳米材料为：NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4和NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4；
所述近红外激发光源波长位于977-985nm之间；
对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：ChR2和eBR；或，Mac和eBR；或C1V1和ChR2。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述近红外激发光源波长为980nm。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述两种稀土基近红外纳米材料为：NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd和NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；
所述近红外激发光源波长位于799-811nm之间；
对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：C1V1和ChR2；或，ChR2和eBR；或，Mac和eBR。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述近红外激发光源波长为808nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述两种目标神经细胞表达有不同光响应波段的光敏蛋白；
步骤2采用两种近红外激发光源对目标区域进行非侵入式的无创光照刺激，目标区域的两种稀土基近红外纳米材料分别将近红外激发光源转换成为可被相应的表达在不同神经元上的具有不同光响应波段的光敏蛋白接收的可见光，使光敏蛋白被激活，从而实现利用两种不同波长近红外激发光源对两种不同目标神经细胞的独立调控。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述两种稀土基近红外纳米材料为：NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4和NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；
对应两种近红外激发光源波长分别位于974-985nm，798-812nm；
对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：C1V1和ChR2，或ChR2和eBR，或Mac和eBR。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：对应两种近红外激发光源波长分别为980nm和808nm。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述两种稀土基近红外纳米材料为：NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd和NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4；
对应两种近红外激发光源波长分别位于799-811nm，977nm-986nm。
对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：ChR2和C1V1，或ChR2和eBR，或Mac和eBR。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：对应两种近红外激发光源波长分别为808nm和980nm。
12.基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将两种稀土基近红外纳米材料分别作为同种目标神经细胞的中继激发光源，所述两种目标神经细胞表达有相同光敏蛋白；
步骤2、使用两种不同波长近红外激发光源对分布有目标神经细胞的区域进行非侵入式无创光照刺激，两种稀土基近红外纳米材料分别将两种不同波长近红外激发光源转换成为可被光敏蛋白接收响应的可见光，使光敏蛋白被激活，实现利用两种不同波长近红外激发光源同时对一种目标神经细胞的调控。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述两种稀土基近红外纳米材料为：NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4和NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；
对应两种近红外激发光源波长分别位于974-985nm，799-811nm；
所述目标神经细胞表达的光敏蛋白为ChR2或Mac。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，对应两种近红外激发光源波长分别为：980nm和808nm。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述两种稀土基近红外纳米材料为：NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4和NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；
对应两种近红外激发光源波长分别位于977-986nm，798-812nm；
所述目标神经细胞表达的光敏蛋白为C1V1或eBR。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，对应两种近红外激发光源波长分别为：980nm和808nm。
17.根据权利要求1-16任一所述的方法，其特征在于：所述稀土基近红外纳米材料表面连接有一层生物相容的功能性磷脂。
18.一种稀土基近红外纳米材料体系，其特征在于：包括NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4；NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4；NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd。
19.一种权利要求18所述稀土基近红外纳米材料体系作为中继介导材料在光遗传技术的应用。
20.一种权利要求18所述稀土基近红外纳米材料体系作为多模造影材料，在活体内的多模成像定位方法中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于：所述稀土基近红外纳米材料体系作为MRI造影材料，用于MRI成像探测定位。
22.根据权利要求20所述的应用，其特征在于：所述稀土基近红外纳米材料体系作为CT造影材料，用于CT成像探测定位。
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