CN111826422B - 检测荧光偏振的光学系统以及偏振度测量单元 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测荧光偏振的光学系统，包括：用于发射偏振光的偏振光束发射单元；样本架，包括用于容纳该样本的样本室；分光器，用于将穿过针孔的诱导荧光分成水平偏振诱导荧光和垂直偏振诱导荧光，以及两个光电检测器，用于接收该水平偏振诱导荧光和该垂直偏振诱导荧光，其中该分光器和该两个光电检测器集成于一紧实尺寸。本发明的光学系统能够用于现场检测样本荧光偏振，可以简单且准确进行荧光偏振测量。
Description
技术领域
本发明涉及光学技术领域，特别涉及一种检测荧光偏振的光学系统以及偏振度测量单元。
背景技术
荧光偏振(Fluorescence polarization，FP)度的测量是根据目标分子的惯性矩(moment of inertia)的变化。为了诱导惯性矩的变化，使样本与具有目标DNA的互补序列的探针(probe)混合。此外，该探针具有附着于其5'位置的FAM-荧光标记。当杂交(hybridization)发生时，具有FAM-探针的DNA变得较重且其长度较长，导致其惯性矩的改变。当FAM-探针的偶极矩(dipole moment)与入射激光光束在相同的偏振方向时，FAM-探针吸收一确定波长(483nm)的光子。并且由于其激发寿命，它在精确的时间(2nsec)发射荧光光子。这种荧光发生在任何被入射激光光束激发的FAM-探针中，无论它是否附着于DNA上。然而，附着于DNA的FAM-探针的总质量较重，因此其惯性矩变得比未附着的FAM-探针的惯性矩大，亦即附着于DNA的FAM-探针比未附着的FAM-探针旋转得慢得多。因此，在发射时间(2nsec)内发生荧光时，发射的荧光光子表现出两种不同的偏振特性，附着或未附着于DNA。斯托克斯矢量(Stokes vector)已明确的定义偏振特性，称为偏振度(Degree ofPolarization)。
典型的偏振度测量结果显示未附着的FAM-探针的分子量约为5000g/mol，中型DNA约为10000g/mol，大型DNA大约为20000g/mol。
因此，只要在探针-DNA杂交作用中有重量变化，FP测量可用来鉴定/筛选目标DNA序列。
FP测量是一种简单且准确的DNA鉴定方法。与其他DNA鉴定方法不同，FP测量有一个优点，就是在大多数的情况下无需在测量前过滤。近年来，FP已成为分析生物领域里杂交现象的有力工具之一，FP测量的简单及直接测量的过程，让使用者能够实时看到这种现象。FP测量还有一个极大的优势，就是在大多数情况下在测量前不需要过滤。目前，有一些案例，如大流行病和食物中毒等，“现场”鉴定DNA的需求非常的强。在这些情况下，现场筛检是非常重要的一步。现场筛检需要简单的样本制备，便携式的装置和电池操作，以及快速和准确的测量结果。因此，FP测量可能是现场测量最具前途的分析方法之一。然而，任何现有的FP测量系统都庞大且昂贵。无法把这些设备用在现场测量上。如果能够提供电池操作、手持的FP测量装置，对社会而言将是一个巨大的贡献。
发明内容
本发明提供一种简单且准确的检测荧光偏振的光学系统，该光学系统能够用于现场检测样本荧光偏振。在本发明的检测荧光偏振的光学系统中，采用激光光源、简单的光学结构、常用的光电单元、缩短的光径长度，以及可选择入射波长的复数个光源。本发明一个实施例中的检测荧光偏振的光学系统还包括一个电池操作系统以及网络连接。这些组件使本发明的检测荧光偏振的光学系统能够达到定点照护的目的。
本发明实施例中提供的检测荧光偏振的光学系统，可以简化激光光学系统以达到手持设备的尺寸、FB测量的精度以及再现性，电力消耗小，可以使用电池供电，以及快速且简便的样本制备，以利于现场测量。
在本发明中，上述目的是通过下列手段实现：采用半导体激光二极管或LED作为光源的系统；只采用一种透镜组件，即准直透镜作为光源的系统；采用一对偏振器分别检测水平和垂直偏振光束的系统；采用偏振光束分光器以检测水平和垂直偏振光束的系统；采用一对硅光电检测器进行偏振检测的系统；采用直接附着在偏振光束分光器的硅光电检测器的系统；采用复数个光源的系统；采用准直激光束直接入射到样本的系统；采用可调整荧光光束检测角度的系统；采用能同时测量荧光强度测量的系统；以及采用能同时测量光吸收测量的系统。
为达到手持设备尺寸的目的，采用激光二极管作为光源，而不是常用的卤素灯/钨丝灯/氙气灯。荧光偏振测量需要单色光化良好的光源。这是因为常用于荧光偏振测量的荧光剂，如FITC，具有非常窄的吸收带宽(493nm±10nm)。因此，FITC材料的激发需要493nm的单色光源。在先前的设计中，系统使用卤素灯、钨丝灯或氙气灯作为光源。图1A和1B显示卤素灯和氙气灯发出的光谱。如图所示，卤素灯和氙气灯具有宽的光谱。当使用单色仪或带通滤光片选择特定波长时，所选的波长的强度变得非常的微弱(图1C)。对于半导体激光二极管，发射光在本质上几乎是单色光(图1)。因此，所选的波长的相对强度变得比卤素灯和氙气灯的相对强度强很多。使用半导体激光二极管作为检测荧光偏振的光学系统的光源时，发出的荧光更强。再者，使用激光二极管作为光源时，可以从系统中排除相当复杂/昂贵的单色仪。
本发明的光学系统通过使用针孔和偏振光束分光器检测偏振，缩短光径并排除准直透镜。图3显示典型的检测荧光偏振的光学系统。入射光经单色仪单色化，然后由偏振板加以准直和偏振。偏振光束被分光器分为两半。一半光束通过准直透镜传送到光电检测器。另一半光束被送到样本进行荧光反应。发射的荧光光子通过另一个旋转以取得最大输出的偏振器，再藉另一个准直透镜到达光电检测器。图7显示具有本发明的荧光偏振检测单元的本发明的光学系统结构。激光束被准直并直接发送到样本。荧光偏振检测单元是由针孔、偏振光束分光器和两个硅光电检测器所组成。在该系统中,可以排除偏振板、具有准直透镜的分光器和旋转的偏振板。本发明的光学系统提供更短的光径和更少的玻璃表面。光的强度随着距离的倒数平方而下降。准直透镜的排除还可以降低每个玻璃表面所造成的反射损失。硅光电检测器直接附着在偏振光束分光器上，提供更短的光径长度，排除准直透镜，且无需光电检测器的光学校准。本发明的光学系统的另一设计是采用复数个光源来选择入射光束。如图8所示，排除单色仪和光学组件的设计，使得本发明的光学系统得以采用复数个具有偏振板的激光光源或LED光源。使得本系统得以使用相同的检测单元，测量具不同激发波长的不同荧光标记。
本发明的光学系统采用没有光电倍增管的低成本硅光电检测器。典型的荧光偏振测量系统采用光电倍增管来检测荧光光子。这是由于激发光束强度弱而导致发射的荧光光子非常的弱。在本发明的光学系统中，使用的是来自激光二极管的强单色光。相对强的荧光发射使得低成本的硅光电检测器测量荧光偏振具有可行性。利用激光光源和极度缩短的光径，在本发明中，可以藉一对低成本的硅光电检测器进行偏振的检测，但大多数的荧光偏振测量系统必须使用昂贵的光电倍增器。
本发明的光学系统排除单色波选择单元。单色仪对温度的波动和环境的振动都非常敏感，因此使得当前的检测荧光偏振的光学系统都不适合供「定点照护」使用。在本发明中，采用激光光源的光学系统，排除使用单色仪的需要，使得系统的成本下降和尺寸变小。
本发明中的光学系统，通过直接激光的激发，排除诸如光纤的波导组件。由于单色仪的尺寸，具有单色仪的系统难以将光束直接入射到样本的表面。因此，需使用光纤将入射光束引导到样本的表面。由光纤收集发射的荧光光子，同时将的引导到光电倍增器。在本发明中，不需要单色仪，也不需要波导组件，应用的激光直接激发荧光标记。
本发明的光学系统不需要反射镜。之前的设计使用反射镜将荧光束引导到检测单元。在本发明中，荧光束是直接发送到PD传感器单元。
在本发明的光学系统中，激光束直接撞击样本。先前的设计是利用一个放置在撞击样本的光束前的二向色镜，以选择入射光束的波长。在本发明方案中，激光束直接撞击样本，因此可以排除二向色镜。
本发明涉及一种荧光偏振的光学系统，包括：光源，包括用于发射光束的半导体激光二极管；准直透镜，设置在该光束的光径上，用于准直该光束；偏振板，设置于该准直透镜旁的光径上，用于偏振该光束；样本架，用于接收该偏振光束，该样品架包括样本室，该样本室用于容纳该与探针混合以诱导荧光的样本；偏振度测量单元，包括针孔板，该针孔板设有针孔，用于使来自样本的诱导荧光通过，以减少杂散的荧光，一个分光器，用于将通过针孔的诱导荧光分成水平偏振诱导荧光和垂直偏振诱导荧光，以及两个光电检测器，用于接收该水平偏振诱导荧光和该垂直偏振诱导荧光，以进行现场检测，其中该针孔板附着于该分光器的表面，且该两个光电检测器分别附着于该分光器不同的表面上。
在一个具体实施例中，上述的光学系统还包括滤光器，设置在该准直透镜和该偏振板之间，用于过滤该该准直透镜准直后的光束。
在一个具体实施例中，上述的样本室是一个圆管槽或方形槽。
在一个具体实施例中，上述的样本室是一个玻璃管单元，使偏振度测量单元得以在玻璃管单元的周围、且在偏振板的外部，以任何角度接收该诱导荧光。
在一个具体实施例中，上述的光源是复数个光源。
在一个具体实施例中，上述的复数个光源的波长相同或不同。
在一个具体实施例中，上述的光学系统是可携式的。
在一个具体实施方案中，上述的与探针混合的样本，具有目标DNA的互补序列。
在一个具体实施例中，上述的光学系统还包括另一个光电检测器，设置于该样本架一侧的附近，且与偏振度测量单元的方向垂直，以增强荧光强度的测量能力。
本发明另涉及一种检测荧光偏振的偏振度测量单元，包括：针孔板，该针孔板设有针孔，用于使与探针混合的样本所诱导的荧光通过；分光器，用于将穿过针孔的诱导荧光分成水平偏振诱导荧光和垂直偏振诱导荧光；以及和两个光电检测器，用于接收该水平偏振诱导荧光和该垂直偏振诱导荧光，其中，该针孔板附着于该分光器的一个表面，且两个光电检测器各自附着于该分光器不同的表面。
本发明还涉及一种荧光偏振的光学系统，包括：光源，包括用于发射激光束的半导体激光二极管：第一准直透镜，设置于该激光束的光径上，用于准直该激光束，第一偏振板，设置于该第一准直透镜旁的该光径上，用于偏振该激光束，样本架，用于容纳与一探针混合以诱导荧光的样本的样本室；偏振度检测单元，包括：两个第二偏振板，各偏振板设置于该样本架的一侧，用于将该诱导荧光偏振成水平偏振诱导荧光和垂直偏振诱导荧光，两个第二准直透镜，分别设置于对应于该两个第二偏振板中的一个第二偏振板的旁边，用于准直该偏振诱导荧光；以及两个光电检测器，分别设置于对应于该两个准直透镜中的一个准直透镜的旁边，用于接收两个第二准直透镜准直得到的准直水平偏振诱导荧光和准直垂直偏振诱导荧光，以进行现场检测。
在一个具体实施例中，上述的光学系统还包括滤光器，设置于第一准直透镜和第一偏振板之间，用于过滤该第一准直透镜准直后的激光束。
在一个具体实施例中，上述的两个光电检测器、该两个第二准直透镜以及该两个第二偏振板，分别设置在该样本架的两侧，与该样本架以180°或90°
定位。
在一个具体实施例中，上述的样本架是玻璃管或方形玻璃管。
在一个具体实施方案中，上述的光源的数量在一个以上，且设置在样本架的周围。
在一个具体实施例中，上述的半导体激光二极管的波长是相同或不同的波长。
在一个具体实施例中，该光学系统是可携式的。
本发明另涉及一种用于检测样本的荧光偏振的光学系统，包括：光源，包括用于发射激光束的半导体激光二极管；准直透镜，设置于该激光束的一光径上，用于准直该激光束；第一滤光器，设置于该准直透镜的旁边，用于过滤该准直光；偏振板，设置于该第一滤光器旁的该光径上，用于偏振该激光束，样本架，用于接收该偏振光束，该样本架包括样本室，该样本室用于容纳与探针混合以诱导荧光的样本；偏振度检测单元，该偏振度检测单元包括：第二滤光器，用于过滤该诱导荧光；偏振光束分光器，用于将该诱导荧光分成水平偏振诱导荧光和垂直偏振诱导荧光；以及两个光电检测器，设置于该偏振光束分光器的两侧，用于接收该水平偏振诱导荧光和该垂直偏振诱导荧光，以进行现场检测。
在一个具体实施例中，该样本架是玻璃管或方形玻璃管。
在一个具体实施例中，该光学系统是可携式的。
附图说明
图1A为卤素灯的发射光谱，其为广泛扩散。
图1B为氙气灯的发射光谱，其为广泛扩散。
图1C为说明通过单色仪(monochromator)选择一特定波长的白光，导致强度的降低的示意图。
图2为半导体激光二极管(semiconductor laser diode)的光谱，其本质上几乎是单色光。
图3为典型的偏振度测量系统。
图4为本发明一个具体实施例的检测荧光偏振的光学系统的示意图。
图5为一个实施例中使用圆管槽的可调整检测角度的检测荧光偏振的光学系统示意图。
图6为本发明一个具体实施例的检测荧光偏振的光学系统的示意图。
图7为本发明一个实施例中的具有圆管槽的检测荧光偏振的光学系统的示意图。
图8为本发明一个实施例中的用于不同荧光标记的复数个偏振光束发射单元示意图。
图9为本发明一个实施例中的显示复数个光电检测器示意图。
图10为本发明一个实施例中的使用本发明的检测荧光偏振的光学系统针对大肠杆菌基因体DNA(E.coli genomic DNA)所做的专一性检测的一个实例示意图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下：
实施例一
图4示出了本发明一个具体实施例的检测荧光偏振的光学系统。如图4所示，偏振光束发射单元(Polarized beam emitting unit)10是由半导体激光器(semi-conductorlaser)101、准直透镜(collimator lens)102、滤光器(optical filter)103和偏振板(polarizer plate)104所组成。该半导体激光器101发射界定波长的偏振激光束。该准直透镜102准直该激光束。准直化后，该激光束通过该滤光器103以及该偏振板104。样本位于一方形槽(square shape cell)2a内。在图4中，该槽是方形，也可以使用圆管槽。图4中的偏振度测量单元是由一对检测器单元所组成。每个检测器单元具有光电检测器(photodetector)31、准直透镜(collimator lens)32以及偏振板(polarizer plate)33。各检测器单元的位置，能使偏振板33对准到其偏振轴是在该激光束的偏振平面，而另一个偏振器板33对准到其偏振轴垂直于该激光束的偏振平面。测量并记录来自各光电检测器31的电压输出。
实施例二
图5显示通过使用圆管槽(round-tube cell)2b可调整检测角度的一个具体实施例。该偏振光束发射单元10由半导体激光器101、准直透镜102、滤光器103以及偏振板104所组成。样本位于圆管槽2b内。偏振度测量单元是由一对检测器单元所组成。各检测器单元分别具有光电检测器31、准直透镜32以及偏振板33。该光电检测器31是以成90度设置。
实施例三
图6示出了本发明一个具体实施例的检测荧光偏振的光学系统。如图6所示，偏振光束发射单元10是由半导体激光器101、准直透镜102、滤光器103以及偏振板104所组成。该半导体激光器101发射界定波长的偏振激光束。该准直透镜102准直该激光束。然后，该准直激光束穿过该滤光器103和该偏振板104。标本是位于方形槽2a中。在该图中，该槽为方形。但是，也可使用圆管槽。图6中的检测器单元是由两个光电检测器31、一个偏振光束分光器34以及一个光学滤光器35组成，其中该两个光电检测器31是以成90度设置。
实施例四
图7示出了本发明一个具体实施例的具有圆管槽2b的检测荧光偏振的光学系统。如图7所示，偏振光束发射单元10是由半导体激光器101、准直透镜102、滤光器103以及一偏振板104所组成。该半导体激光器101发射界定波长的偏振激光束。该准直透镜102准直该激光束。然后该准直激光束通过该滤光器103和该偏振板104。样本是位于圆管槽2b内，使用户可以对样本管采取任何角度。图7中的检测器单元是由两个以90度定位的光电检测器31、一个偏振光束分光器34以及一个针孔板36所组成，其中该针孔板36附着于该偏振光束分光器34的表面上，该光电检测器31附着于该偏振光束分光器34的表面上。将针孔板8和光电检测器6附着于该偏振光束分光器7的表面上，使得光学校准更简单和容易。
实施例五
图8示出了本发明一个具体实施例的用于不同荧光标记的复数个偏振光束发射单元10。复数个偏振光束发射单元具有不同的波长，用于选择入射光束。
实施例六
图9示出了本发明一个具体实施例的复数个光电检测器31。该具体实施例使得系统不仅能通过使用额外增加的一对光电检测器31来检测荧光偏振，而且还能够同时检测荧光光束的强度，提供光子的吸收情形。
实施例七
为制备样本，从目标样本中提取DNA，然后使用标准PCR程序扩增DNA数。在DNA扩增后，将荧光探针添加到扩增后的DNA中而使样本已准备好待检测。为了操作该系统，通过连接器将本发明的光学系统连接到计算机设备，例如笔记型个人计算机或桌上型个人计算机，然后运行本发明的光学系统测量软件，该软件最好是图形用户界面(graphical userinterface，GUI)的形式。然后，启动本发明的光学系统，将一含有样本的单元放入本发明的光学系统的样本架内，然后开始荧光测量。荧光偏振值显示在屏幕上，Y轴为mP值，X轴为时间刻度，以秒为单位。mP值通常是在10到20秒后稳定。如果mP值高于参考值这是一种针对各种DNA提供的参考mP值，显示该样本含有目标的DNA；如果mP值未达到参考值，显示该样本不含目标的DNA。
图10显示使用实施例三、图6所描述的具体实施例的本发明光学系统，对大肠杆菌基因组DNA的特异性检测的一个实施例。在目标DNA片段的不对称PCR扩增后，使用本发明的光学系统进行偏振度测量，检测到102-107大肠杆菌基因组DNA。此大肠杆菌检测试验的特异性呈现了在侦测所投入的沙门氏菌基因组DNA或所使用的鲑鱼精子DNA——此非特异性，随机序列阴性对照组DNA——时，其信号是可忽略不计的。
本说明书已十分详细的描述和举例说明本发明，以利本技术领域的人员制造和使用本发明，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，各种替换、修改和改进应是显而易见的。
本技术领域的人员能理解，本发明非常适于实现所述的目标，并达成所述的目的和优点，以及其所固有的目的和优点。细胞、动物和制程及其制备方法，是优选的具体实施方案的代表，是例示性的，无意限制本发明的范围。本技术领域的人员知道如何修改和另做其他用途。
Claims (10)
1.一种检测荧光偏振的光学系统，其特征在于，包括：
光源，包括用于发射光束的半导体激光二极管；
准直透镜，设置于所述光束的光径上，用于准直该光束；
偏振板，设置于所述准直透镜旁的光径上，用于偏振该光束；
样本架，用于接收该偏振光束，所述样本架包括样本室，所述样本室用于容纳与探针混合以诱导荧光的样本；和
偏振度测量单元，包括
针孔板，设有使来自所述样本诱导的荧光穿过的针孔，用于减少杂散的荧光，
分光器，用于将穿过所述针孔的该诱导荧光分成水平偏振诱导荧光和垂直偏振诱导荧光，和
两个光电检测器，用于接收所述水平偏振诱导荧光以及所述垂直偏振诱导荧光，以进行现场检测，
其中，所述针孔板附着于所述分光器的表面，且所述两个光电检测器分别附着于所述分光器的不同表面。
2.如权利要求1所述的光学系统，其特征在于，还包括滤光器，设置于所述准直透镜和所述偏振板之间，用于过滤所述准直透镜准直后的光束。
3.如权利要求1所述的光学系统，其特征在于，所述样本室是圆管槽或方形槽。
4.如权利要求1所述的光学系统，其特征在于，所述样本室是玻璃管单元，所述偏振度测量单元设置在所述玻璃管单元周围、且在所述偏振板外部。
5.如权利要求1所述的光学系统，其特征在于，所述光源是复数个光源。
6.如权利要求5所述的光学系统，其特征在于，所述复数个光源的波长相同或不同。
7.如权利要求1所述的光学系统，其特征在于，所述光学系统是可携式的。
8.如权利要求1所述的光学系统，其特征在于，与所述探针混合的所述样本，具有目标DNA的互补序列。
9.如权利要求1所述的光学系统，其特征在于，还包括另一光电检测器，设置在所述样本架一侧的附近，且与所述偏振度测量单元的方向垂直。
10.一种检测荧光偏振的偏振度测量单元，其特征在于，包括：
针孔板，设有针孔，用于通过与探针混合的样本所诱导的荧光；
分光器，用于将穿过所述针孔的所述诱导荧光分成水平偏振诱导荧光和垂直偏振诱导荧光，
两个光电检测器，用于接收所述水平偏振诱导荧光和所述垂直偏振诱导荧光，
其中，所述针孔板附着于所述分光器的一个表面，且两个光电检测器分别附着于所述分光器的不同表面。
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