CN111826335A - 一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物筛选技术领域，尤其涉及一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，包括步骤：四环素类抗生素储存液、若干份液态富集培养基和若干份固态选择培养基配制；若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基和固态选择培养基的制备；家用净水器滤芯中四环素类抗菌的分离和纯化。相比于现有技术，本发明操作简便易行，安全环保，能够有效地筛选到目的细菌。
Description
技术领域
本发明属于微生物筛选技术领域，尤其涉及一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法。
背景技术
近些年来，大量不合理的抗生素的使用导致在地下水、土壤、空气的抗性细菌的种类和数目越来越多，并开始由单一耐药性逐渐进化为多重耐药性，甚至饮用水中都能检测抗性细菌的存在。自来水中的抗生素可能诱导抗生素抗性微生物富集，抗性基因可通过水平转移使微生物获得多重抗生素抗性，“超级细菌”的出现更是给人体健康造成无法挽回的灾难。
随着社会经济水平快速提升，消费者对饮用水的安全问题关注度越来越高，使得净水行业及净水技术得到迅猛发展，滤芯是净水器净水效果的核心所在，因此滤芯的生物安全逐渐受到学者的广泛重视。目前对于净水器滤芯中是否存在抗生素抗性菌的研究很少，比较多的还是环境水体中抗性菌的筛选和培养，而无法判断居民家中最常见的净水设备中是否存在生物风险。
有鉴于此，确有必要提供一种从家用净水器滤芯中筛选抗生素抗性菌的方法。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术的不足，而提供一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，操作简便易行，安全环保，能够有效地筛选到目的细菌。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，包括以下步骤：
1)在无菌条件下，配制四环素类抗生素储存液、若干份液态富集培养基和若干份固态选择培养基；
2)往每份所述液态富集培养基中加入不等量的四环素类抗生素储存液，得到若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基；
3)往每份所述固态选择培养基中加入不等量的四环素类抗生素储存液，得到若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的固态选择培养基；
4)取家用净水器的滤芯放入无菌水中，室温下振荡培养后，取上清液加入到步骤2)所得的若干份液态富集培养基中，于30℃恒温振荡培养，得到若干份菌悬液；
5)将若干份所述菌悬液进行若干次离心清洗，去除上层培养基，得到若干份清洗干净的富集培养液；
6)先对步骤3)得到的若干固态选择培养基进行高压灭菌处理，再进行倒平板后置于生化培养箱中；
7)用灭菌生理盐水稀释步骤5)得到的富集培养液后，将其滴加到经过倒平板且具有相应四环素类抗生素浓度的固态选择培养基中，均匀涂布，于30℃恒温生化培养箱培养，生长出菌落，将菌落纯化后得到初筛四环素类抗性单菌落；
8)分别取每种初筛四环素类抗性单菌落1环接种于步骤2)所得的含有一定浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基中，30～35℃下培养8～10h，再将得到的富集培养液用无菌水稀释，然后分别取稀释后的富集培养液滴到含有相应四环素类抗生素浓度的固体选择培养基上，均匀涂布，30～35℃下倒置培养24～48h，得到的菌株即为复筛四环素类抗性菌株；
9)将得到的复筛四环素类抗性菌株接种于含有四环素类抗生素的固体选择培养基上，驯化转接3～5次，能生长保持良好的菌落，即为四环素类抗性菌。
需要说明的是，本发明之所以选择四环素类选择培养基是利用微生物对四环素的抗性的原理，只允许抗性菌生长，并同时抑制或阻止其他微生物生长。除了常见的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及厌氧菌外，多数立克次体属、支原体属、衣原体属等也对本品过敏。四环素的作用机制在于药物能特异性地与细菌核糖体30s亚基的A位置结合，阻止氨基酰-tRNA在该位上的联结，从而抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。因此，通过在培养基中按最低抑菌浓度侵入四环素类抗生素筛选抗生素抗性微生物。
作为本发明所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，所述四环素类抗生素储存液的制备方法为：使用无水乙醇配制，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装后于-20℃下避光保存，保存时间不超过30天。
作为本发明所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，所述液态富集培养基的制备方法为：称取蛋白胨、酵母粉和NaCl，加入超纯水定容，溶解并不断搅拌，于120℃下高压灭菌，再放入45±1℃的水浴箱冷却待用。
作为本发明所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，所述固态选择培养基的制备方法为：称取蛋白胨、酵母粉、NaCl和琼脂，加入超纯水定容，溶解并不断搅拌，于120℃下高压灭菌。
作为本发明所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，在步骤2)中，若干份所述液态富集培养基中，含有的四环素类抗生素的浓度成梯度关系，第N份所述液态富集培养基中含有的四环素类抗生素的浓度为第N-1份所述液态富集培养基中含有的四环素类抗生素的浓度的1.5～5倍，N≥2。
作为本发明所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，在步骤3)中，若干份所述固态选择培养基中，含有的四环素类抗生素的浓度成梯度关系，第N份所述固态选择培养基中含有的四环素类抗生素的浓度为第N-1份所述固态选择培养基中含有的四环素类抗生素的浓度的1.5～5倍，N≥2。
作为本发明所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，在步骤4)中，以200r/min的转速在室温下振荡培养0.5～2h；以150r/min的转速在30℃恒温下振荡培养10天。
作为本发明所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，在步骤5)中，以5000r/min的转速离心5min后，去除上层培养基，再加入生理盐水，以5000r/min的转速离心5min，重复离心清洗3次。
相比于现有技术，本发明的有益效果包括但不限于：
1)本发明利用细菌对四环素类抗生素的耐受性，以家用净水器滤芯作为分离源，有效地筛选到目的细菌，提高了筛菌的效率。
2)本发明提供的这种抗性菌筛选方法，采用了富集分离的培养方式，从滤芯中筛选出具有四环素类抗性的微生物，具有操作简便易行，准确率高，安全环保，筛选结果理想的效果，适用于不同品牌和原理净水器滤芯中某类抗生素抗性细菌的快速分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不限于此。
1)以下实施例中，除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和试剂如下：
设备：A.恒温培养箱：36℃士1℃。B.冰箱：2℃～5℃。C.电子天平：感量0.01g。D.涡旋振荡器。E.无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。F.离心管：2mL(具0.01mL刻度)、50mL(具1mL刻度)。G.无菌锥形瓶：容量100mL、250mL、1000mL。H.无菌培养皿：直径90mm。I.注射器：2mL。J.紫外灯：波长360nm～366nm，功率≤6W。K.使用超过一年的美的牌五级超滤净水器第二级颗粒活性炭滤芯。L.镊子，涂布刀，接种环。
材料：A.蛋白胨；B.酵母粉；C.琼脂；D.氯化钠；E.四环素；F金霉素；G.超纯水。
以上取样工具及相关试剂材料应提前准备、灭菌。颗粒活性炭滤芯生物膜样品收集在无菌的50mL的聚丙烯离心管中，于-20℃用生物冰袋冷冻尽快送回实验室分析。
2)在以下实施例中，每天检查培养箱温度两次,以确保规定的范围内操作。所采用的测温仪器为温度计，该温度计至少每年进行一次NIST认证。
3)在以下实施例中，对每次制备后的培养基进行空白试验预测试，确保培养基无菌。
4)在以下实施例中，将稀释液通过灭菌滤膜，并放置于培养板上，在35℃下培养24小时,若无菌落生长则说明稀释液无菌。
5)以下实施例均在无菌环境下进行，无菌环境指的是在操作前，将牛皮纸包好的锥形瓶、2mL离心管与培养皿一起在120℃下高压灭菌，消除样品间干扰。
实施例1
一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，包括以下步骤：
1)在无菌条件下，配制四环素储存液、若干份液态富集培养基和若干份固态选择培养基；
四环素储存液的制备：四环素储存液使用无水乙醇配制，经0.22μm滤膜过滤除菌，1mL/份分装，避光保存于-20℃冰箱，保存时间不超过30天。
液态富集培养基的制备：准确称取10g蛋白胨、5g酵母粉、10gNaCl，加入超纯水定容到1000mL，溶解并不断搅拌，使用前120℃高压灭菌20min，将经过灭菌的培养基放入45℃士1℃的水浴箱冷却待用。
固体选择培养基的制备：准确称取10g蛋白胨、5g酵母粉、10gNaCl、15g琼脂，加入超纯水定容到1000mL，溶解并不断搅拌。
2)往每份液态富集培养基中加入不等量的四环素储存液，得到若干份含有不同浓度(分别为1、5、10、50、100、500μg/L)的四环素的液态富集培养基，将其分装于三角瓶中，于4℃保存；
3)往每份固态选择培养基中加入不等量的四环素储存液，得到若干份含有不同浓度(分别为1、5、10、50、100、500μg/L)的四环素的固态选择培养基，使用前，于120℃高压灭菌20min；
4)取合适重量的家用净水器的滤芯作为样品，放入无菌水中，以200r/min的转速在室温下振荡培养0.5～2h，取上清液加入到步骤2)所得的若干份液态富集培养基中，以150r/min的转速在30℃恒温下振荡培养10天，得到若干份菌悬液；
5)将若干份菌悬液进行离心清洗，具体的，以5000r/min的转速离心5min后，去除上层培养基，再加入生理盐水至50mL，以5000r/min的转速离心5min，重复离心清洗3次，得到若干份清洗干净的富集培养液；
6)先对步骤3)得到的若干固态选择培养基进行高压灭菌处理，再进行倒平板后置于生化培养箱中；
7)用灭菌生理盐水将步骤5)得到的富集培养液稀释至浓度为10-3、10-4、10-5，分别取100μL滴加到步骤6)得到的具有相应四环素浓度的固态选择培养基中，均匀涂布，于30℃恒温生化培养箱培养，生长出菌落，将菌落纯化后得到4种初筛四环素抗性单菌落；具有相应四环素浓度的固态选择培养基是指与未加入家用净水器的滤芯前的液态富集培养基具有相同的四环素浓度的固态选择培养基；
8)分别取每种初筛四环素类抗性单菌落1环接种于5mL含有一定浓度的四环素的液态富集培养基中，35℃下培养10h，再取1mL得到的富集培养液用无菌水稀释至浓度为10-3、10-4、10-5，然后分别取稀释后的富集培养液滴到含有相应四环素浓度的固体选择培养基上，均匀涂布，35℃下倒置培养48h，得到3种复筛四环素抗性菌株；
9)将得到的复筛四环素抗性菌株接种于含有四环素的固体选择培养基上，驯化转接5次，共有2株生长保持良好的菌落，即为四环素抗性菌。
其中，步骤4)～9)为家用进水器滤芯中四环素抗性菌的分离和纯化。
通过鉴定，上述2种菌株分别为沙门氏菌属Salmonella sp.(1株)和大肠杆菌属Escherichia sp.(1株)。
实施例2
一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，包括以下步骤：
1)在无菌条件下，配制金霉素储存液、若干份富集培养液和若干份固态选择培养基；
金霉素储存液的制备：金霉素储存液使用无水乙醇配制，经0.22μm滤膜过滤除菌，1mL/份分装，避光保存于-20℃冰箱，保存时间不超过30天。
液态富集培养基的制备：准确称取10g蛋白胨、5g酵母粉、10gNaCl，加入超纯水定容到1000mL，溶解并不断搅拌，使用前120℃高压灭菌20min，将经过灭菌的培养基放入45℃士1℃的水浴箱冷却待用。
固体选择培养基的制备：准确称取10g蛋白胨、5g酵母粉、10gNaCl、15g琼脂，加入超纯水定容到1000mL，溶解并不断搅拌。
2)往每份液态富集培养基中加入不等量的金霉素储存液，得到若干份含有不同浓度的金霉素的液态富集培养基，将其分装于三角瓶中，于4℃保存；
3)往每份固态选择培养基中加入不等量的金霉素储存液，得到若干份含有不同浓度(分别为1、5、10、50、100、500μg/L)的金霉素的固态选择培养基，使用前，于120℃高压灭菌20min；
4)取合适重量的家用净水器的滤芯作为样品，放入无菌水中，以200r/min的转速在室温下振荡培养0.5～2h，取上清液加入到步骤2)所得的若干份液态富集培养基中，以150r/min的转速在30℃恒温下振荡培养10天，得到若干份菌悬液；
5)将若干份所述菌悬液进行离心清洗，具体的，以5000r/min的转速离心5min后，去除上层培养基，再加入生理盐水至50mL，以5000r/min的转速离心5min，重复离心清洗3次，得到若干份清洗干净的富集培养液；
6)先对步骤3)得到的若干固态选择培养基进行高压灭菌处理，再进行倒平板后置于生化培养箱中；
7)用灭菌生理盐水将步骤5)得到的富集培养液稀释至浓度为10-3、10-4、10-5，分别取100μL滴加到步骤6)得到的具有相应金霉素浓度的固态选择培养基中，均匀涂布，于30℃恒温生化培养箱培养，生长出菌落，将菌落纯化后得到4种初筛金霉素抗性单菌落；具有相应四环素浓度的固态选择培养基是指与未加入家用净水器的滤芯前的液态富集培养基具有相同的金霉素浓度的固态选择培养基；
8)分别取每种初筛金霉素类抗性单菌落1环接种于5mL含有一定浓度的金霉素的富集培养液中，35℃下培养10h，再取1mL得到的富集培养液用无菌水稀释至浓度为10-3、10-4、10-5，然后分别取稀释后的富集培养液滴到含有相应金霉素浓度的固体选择培养基上，均匀涂布，35℃下倒置培养48h，得到3种复筛金霉素抗性菌株；
9)将得到的复筛金霉素抗性菌株接种于含有四环素的固体选择培养基上，驯化转接5次，共有2株生长保持良好的菌落，即为金霉素抗性菌。
其中，步骤4)～9)为家用进水器滤芯中金霉素抗性菌的分离和纯化。
通过鉴定，上述2种菌株分别为沙门氏菌属Salmonella sp.(1株)和大肠杆菌属Escherichia sp.(1株)。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (8)
1.一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在无菌条件下，配制四环素类抗生素储存液、若干份液态富集培养基和若干份固态选择培养基；
2)往每份所述液态富集培养基中加入不等量的四环素类抗生素储存液，得到若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基；
3)往每份所述固态选择培养基中加入不等量的四环素类抗生素储存液，得到若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的固态选择培养基；
4)取家用净水器的滤芯放入无菌水中，室温下振荡培养后，取上清液加入到步骤2)所得的若干份液态富集培养基中，于30℃恒温振荡培养，得到若干份菌悬液；
5)将若干份所述菌悬液进行若干次离心清洗，去除上层培养基，得到若干份清洗干净的富集培养液；
6)先对步骤3)得到的若干固态选择培养基进行高压灭菌处理，再进行倒平板后置于生化培养箱中；
7)用灭菌生理盐水稀释步骤5)得到的富集培养液后，将其滴加到经过倒平板且具有相应四环素类抗生素浓度的固态选择培养基中，均匀涂布，于30℃恒温生化培养箱培养，生长出菌落，将菌落纯化后得到初筛四环素类抗性单菌落；
8)分别取每种初筛四环素类抗性单菌落1环接种于步骤2)所得的含有一定浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基中，30～35℃下培养8～10h，再将得到的富集培养液用无菌水稀释，然后分别取稀释后的富集培养液滴到含有相应四环素类抗生素浓度的固体选择培养基上，均匀涂布，30～35℃下倒置培养24～48h，得到的菌株即为复筛四环素类抗性菌株；
9)将得到的复筛四环素类抗性菌株接种于含有四环素类抗生素的固体选择培养基上，驯化转接3～5次，能生长保持良好的菌落，即为四环素类抗性菌。
2.根据权利要求1所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，所述四环素类抗生素储存液的制备方法为：使用无水乙醇配制，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装后于-20℃下避光保存，保存时间不超过30天。
3.根据权利要求1所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，所述液态富集培养基的制备方法为：称取蛋白胨、酵母粉和NaCl，加入超纯水定容，溶解并不断搅拌，于120℃下高压灭菌，再放入45±1℃的水浴箱冷却待用。
4.根据权利要求1所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，所述固态选择培养基的制备方法为：称取蛋白胨、酵母粉、NaCl和琼脂，加入超纯水定容，溶解并不断搅拌，于120℃下高压灭菌。
5.根据权利要求1所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，在步骤2)中，若干份所述液态富集培养基中，含有的四环素类抗生素的浓度成梯度关系，第N份所述液态富集培养基中含有的四环素类抗生素的浓度为第N-1份所述液态富集培养基中含有的四环素类抗生素的浓度的1.5～5倍，N≥2。
6.根据权利要求1所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，在步骤3)中，若干份所述固态选择培养基中，含有的四环素类抗生素的浓度成梯度关系，第N份所述固态选择培养基中含有的四环素类抗生素的浓度为第N-1份所述固态选择培养基中含有的四环素类抗生素的浓度的1.5～5倍，N≥2。
7.根据权利要求1所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，在步骤4)中，以200r/min的转速在室温下振荡培养0.5～2h；以150r/min的转速在30℃恒温下振荡培养10天。
8.根据权利要求1所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，在步骤5)中，以5000r/min的转速离心5min后，去除上层培养基，再加入生理盐水，以5000r/min的转速离心5min，重复离心清洗3次。
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Non-Patent Citations (1)
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| 刘莉莉等: "城市污水处理厂四环素抗性菌的筛选及其抗性基因分析", 《环境科学学报》 * |
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