CN111821508B - 一种复合冷冻凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种复合冷冻凝胶及其制备方法和应用,所述复合冷冻凝胶包括两性离子冷冻凝胶和分散在所述两性离子冷冻凝胶中的纳米氧化锌,所述两性离子冷冻凝胶由两性离子单体在0℃以下通过自交联而成。本发明通过以两性离子单体为主体材料,添加纳米氧化锌颗粒,在低温下两性离子单体发生自交联,将纳米氧化锌包裹在冷冻凝胶内部。在室温下,凝胶中由水形成的冰晶融化使冷冻凝胶形成大小均匀的孔隙,有利于细胞粘附和物质运输,同时能够稳定释放纳米氧化锌颗粒,纳米氧化锌颗粒进一步在成骨细胞的酸性囊泡内溶解释放锌离子,利用锌离子促进成骨细胞分化和增殖的特性发挥促成骨功能。
Description
技术领域
本发明属于骨组织工程医用材料制备技术领域,尤其涉及一种复合冷冻凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
对因畸形、外伤及牙缺失后牙槽骨吸收等原因造成的骨缺损进行修复,是当前临床工作中需解决的重大难题。然而,骨再生是一个缓慢、复杂的生理过程,现有修复手段也存在各种缺陷。因此,设计、研发兼具良好骨引导性(可提供骨引导支架)和骨诱导性(可诱导新骨形成)的骨组织支架已成为研究热点。
以水为溶剂,在零度以下低温环境中,使两性离子单体、交联剂、引发剂等反应物发生交联反应可形成两性离子冷冻凝胶。溶剂冷冻形成的冰晶在室温下融化后,会在凝胶中形成多孔结构。因此,由此产生的两性离子冷冻凝胶同时拥有高度相互连接的大孔和柔软而有弹性的结构,不仅能满足组织与支架内的氧气和营养物质运送需求,还能为骨原细胞募集与粘附提供较大的表面积。除此之外,两性离子冷冻凝胶还具有与宿主组织亲和性高和生物安全性良好等优势。然而,该材料并不包含生物活性成分,无法有效地诱导骨组织再生。因此,在两性离子冷冻凝胶中加入具有骨诱导性的生物材料,构建复合两性离子冷冻凝胶支架,可能是实现骨缺损快速修复的有效方法。
纳米氧化锌具有良好的表面活性和催化性能,在生物传感、抗菌、生物支架等领域具有潜在应用价值。研究表明,纳米氧化锌的生物学性能与其表面形貌、粒径等相关,粒径较小的纳米氧化锌(<100nm)能被成骨细胞摄取,并在溶酶体等酸性囊泡内逐步溶解,释放锌离子,进而发挥促成骨与促成血管等功能。然而,局部纳米氧化锌急性暴露会诱导产生一定的毒性,因此,需要通过构建合理的缓释体系,安全有效地释放纳米氧化锌,保持骨缺损区域处纳米氧化锌的浓度均衡有效且不过剩,以减少纳米氧化锌的毒性。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明的第一个目的是提出一种复合冷冻凝胶,即两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶,能够诱导骨组织再生,同时具有良好的缓释性能,降低活性成分的毒性。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶,包括两性离子冷冻凝胶和分散在所述两性离子冷冻凝胶中的纳米氧化锌。
所述两性离子冷冻凝胶在两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶中的质量百分比为98.5%~99.998%。
所述纳米氧化锌在两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶中的质量百分比为0.002%~1.5%。
所述纳米氧化锌的粒径为50~100nm。
所述两性离子冷冻凝胶由两性离子单体在0℃以下通过自交联而成。
所述两性离子单体为甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和/或甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱。
所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶具有大小为10~500μm的孔隙。
本发明的第二个目的是提供一种两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶的制备方法,包括如下步骤:
(1)将纳米氧化锌、水、两性离子单体和非两性离子单体混合,得到前驱体溶液;
(2)加入引发剂,在不高于0℃的温度下进行交联反应;
(3)交联反应结束后解冻,获得两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶。
步骤(1)中,所述非两性离子单体选自甲基丙烯酸羟乙酯。
步骤(1)中,纳米氧化锌、水、两性离子单体和非两性离子单体的混合具体为:将纳米氧化锌分散于水中得到纳米氧化锌分散液,将两性离子单体和非两性离子单体溶于纳米氧化锌分散液混合,得到前驱体溶液。
步骤(1)中,所述前驱体溶液中纳米氧化锌、水、两性离子单体和非两性离子单体的质量百分比分别为:
纳米氧化锌0.001%~1.5%;
水50%~92%;
两性离子单体5%~30%;
非两性离子单体2%~15%。
所述纳米氧化锌分散液的浓度为10~100μg/mL。
所述前驱体溶液中,两性离子单体的浓度为60~100mg/mL。当两性离子单体为甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱时,两性离子单体的浓度为60~100mg/mL;当两性离子单体为甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱时,两性离子单体的浓/度为60~90mg/mL。
步骤(2)中,所述交联反应温度为-10~-30℃;所述交联反应时间为12~48h,优选24h。
步骤(2)中,所述引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺二者的组合,单一引发剂使用不能有效引发凝胶反应,所述过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为(0.5~1.5):1,优选约1:1。
所述引发剂以溶液的形式加入前驱体溶液中,其中过硫酸铵与前驱体溶液混合后浓度为0.5~5mg/mL,四甲基乙二胺与前驱体溶液混合后浓度为0.35~4mg/mL。
步骤(3)中,所述解冻方法为将温度升高到0℃以上,具体为将温度升高到10~30℃;优选地,使交联反应结束后得到的反应体系自然升温到室温进行解冻。
本发明的第三个目的是提供上述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶的应用。
具体地,本发明提供上述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶在制备细胞支架材料中的应用。
同时,本发明提供上述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶在制备骨修复支架材料中的应用。
相对于现有技术,本发明通过以两性离子单体为主体材料,添加纳米氧化锌颗粒,在低温下两性离子单体发生自交联,将纳米氧化锌包裹在冷冻凝胶内部。在室温下,凝胶中由水形成的冰晶融化使冷冻凝胶形成大小均匀的孔隙,有利于细胞粘附和物质运输,同时能够稳定释放纳米氧化锌颗粒,纳米氧化锌颗粒进一步在成骨细胞的酸性囊泡内逐步溶解释放锌离子,利用锌离子的促成骨细胞分化和增殖的特性发挥促成骨功能。
附图说明
图1为本发明的两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶的制备过程示意图(A)、外观照片(B)和扫描电镜图(C);
图2为纳米氧化锌的扫描电镜图(A)和透射电镜图(B);
图3为实施例1的两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶对纳米氧化锌的降解曲线;
图4为将成骨细胞接种到实施例1和对比例1的冷冻凝胶后的荧光显微镜照片;
图5为成骨细胞分别接种于实施例1和对比例1的冷冻凝胶后的矿化结节的生长情况(A)和成骨分化基因表达水平(B);
图6为SD大鼠颅骨缺损区植入实施例1和对比例1的冷冻凝胶后的Micro-CT结果(A、B)、HE染色实验结果(C)和Masson染色实验结果(D)。
具体实施方式
以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案,但不应该理解为对本发明的保护范围的任何限制。
本发明提供一种两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶,包括两性离子冷冻凝胶和分散在所述两性离子冷冻凝胶中的纳米氧化锌。所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶的制备过程示意图如图1所示,由两性离子单体、非两性离子单体、纳米氧化锌形成前驱体溶液,在引发剂作用下,两性离子单体在低温下进行冷冻交联,形成具有网络结构的两性离子冷冻凝胶,将纳米氧化锌包裹其中,最后在室温下冰晶融化,形成具有连续孔径结构的两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶。
具体地,两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶的制备步骤如下:
实施例1
(1)称取50mg纳米氧化锌粉末,均匀分散在100mL去离子水中,配制浓度为500μg/mL纳米氧化锌溶液,经超声作用(40Khz,180W)2h后,得到稳定分散的纳米氧化锌溶液,进一步使用去离子水稀释至20μg/mL纳米氧化锌溶液备用。
(2)取上述20μg/mL纳米氧化锌溶液4.5mL,依次加入甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和甲基丙烯酸羟乙酯,配制为含60mg/mL甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、28mg/mL甲基丙烯酸羟乙酯的前驱体溶液。在前驱体溶液中添加500μL的过硫酸铵溶液(初始浓度为10mg/mL)和6.45μL四甲基乙二胺溶液(初始浓度为775mg/mL)引发凝胶聚合。在-15℃下反应24h,聚合完成后,在室温下解冻,即得所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶。
实施例2
(1)称取50mg纳米氧化锌粉末,均匀分散在100mL去离子水中,配制浓度为500μg/mL纳米氧化锌溶液,经超声作用(40Khz,180W)2h后,得到稳定分散的纳米氧化锌溶液,进一步使用去离子水稀释至20μg/mL纳米氧化锌溶液备用。
(2)取上述20μg/mL纳米氧化锌溶液4.5mL,依次加入甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和甲基丙烯酸羟乙酯,配制为含90mg/mL甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、41.9mg/mL甲基丙烯酸羟乙酯的前驱体溶液。在前驱体溶液中添加500μL的过硫酸铵溶液(初始浓度为10mg/mL)和6.45μL四甲基乙二胺溶液(初始浓度为775mg/mL)引发凝胶聚合。在-20℃下反应24h,聚合完成后,在室温下解冻,即得所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶。
实施例3
(1)称取50mg纳米氧化锌粉末,均匀分散在100mL去离子水中,配制浓度为500μg/mL纳米氧化锌溶液,经超声作用(40Khz,180W)2h后,得到稳定分散的纳米氧化锌溶液,进一步使用去离子水稀释至10μg/mL纳米氧化锌溶液备用。
(2)取上述10μg/mL纳米氧化锌溶液4.5mL,依次加入甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和甲基丙烯酸羟乙酯,配制为含60mg/mL甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、28mg/mL甲基丙烯酸羟乙酯的前驱体溶液。在前驱体溶液中添加500μL的过硫酸铵溶液(初始浓度为10mg/mL)和6.45μL四甲基乙二胺溶液(初始浓度为775mg/mL)引发凝胶聚合。在-15℃下反应24h,聚合完成后,在室温下解冻,即得所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶。
实施例4
(1)称取50mg纳米氧化锌粉末,均匀分散在100mL去离子水中,配制浓度为500μg/mL纳米氧化锌溶液,经超声作用(40Khz,180W)2h后,得到稳定分散的纳米氧化锌溶液,进一步使用去离子水稀释至10μg/mL纳米氧化锌溶液备用。
(2)取上述10μg/mL纳米氧化锌溶液4.5mL,依次加入甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和甲基丙烯酸羟乙酯,配制为含90mg/mL甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、41.9mg/mL甲基丙烯酸羟乙酯的前驱体溶液。在前驱体溶液中添加500μL的过硫酸铵溶液(初始浓度为10mg/mL)和6.45μL四甲基乙二胺溶液(初始浓度为775mg/mL)引发凝胶聚合。在-20℃下反应24h,聚合完成后,在室温下解冻,即得所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶。
实施例5
(1)称取50mg纳米氧化锌粉末,均匀分散在100mL去离子水中,配制浓度为500μg/mL纳米氧化锌溶液,经超声作用(40Khz,180W)2h后,得到稳定分散的纳米氧化锌溶液,进一步使用去离子水稀释至10μg/mL纳米氧化锌溶液备用。
(2)取上述10μg/mL纳米氧化锌溶液4.5mL,依次加入甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和甲基丙烯酸羟乙酯,配制为含90mg/mL甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、41.9mg/mL甲基丙烯酸羟乙酯的前驱体溶液。在前驱体溶液中添加500μL的过硫酸铵溶液(初始浓度为10mg/mL)和6.45μL四甲基乙二胺溶液(初始浓度为775mg/mL)引发凝胶聚合。在-30℃下反应24h,聚合完成后,在室温下解冻,即得所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶。
实施例6
(1)称取50mg纳米氧化锌粉末,均匀分散在100mL去离子水中,配制浓度为500μg/mL纳米氧化锌溶液,经超声作用(40Khz,180W)2h后,得到稳定分散的纳米氧化锌溶液,进一步使用去离子水稀释至10μg/mL纳米氧化锌溶液备用。
(2)取上述10μg/mL纳米氧化锌溶液4.5mL,依次加入甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱和甲基丙烯酸羟乙酯,配制为含60mg/mL甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱、34.1mg/mL甲基丙烯酸羟乙酯的前驱体溶液。在前驱体溶液中添加500μL的过硫酸铵溶液(初始浓度为10mg/mL)和6.45μL四甲基乙二胺溶液(初始浓度为775mg/mL)引发凝胶聚合。在-20℃下反应24h,聚合完成后,在室温下解冻,即得所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶。
实施例7
(1)称取50mg纳米氧化锌粉末,均匀分散在100mL去离子水中,配制浓度为500μg/mL纳米氧化锌溶液,经超声作用(40Khz,180W)2h后,得到稳定分散的纳米氧化锌溶液,进一步使用去离子水稀释至20μg/mL纳米氧化锌溶液备用。
(2)取上述20μg/mL纳米氧化锌溶液4.5mL,依次加入甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和甲基丙烯酸羟乙酯,配制为含90mg/mL甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、41.9mg/mL甲基丙烯酸羟乙酯的前驱体溶液。在前驱体溶液中添加500μL的过硫酸铵溶液(初始浓度为10mg/mL)和6.45μL四甲基乙二胺溶液(初始浓度为775mg/mL)引发凝胶聚合。在-30℃下反应24h,聚合完成后,在室温下解冻,即得所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶。
实施例8
(1)称取50mg纳米氧化锌粉末,均匀分散在100mL去离子水中,配制浓度为500μg/mL纳米氧化锌溶液,经超声作用(40Khz,180W)2h后,得到稳定分散的纳米氧化锌溶液,进一步使用去离子水稀释至20μg/mL纳米氧化锌溶液备用。
(2)取上述20μg/mL纳米氧化锌溶液4.5mL,依次加入甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱和甲基丙烯酸羟乙酯,配制为含90mg/mL甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱、51.1mg/mL甲基丙烯酸羟乙酯的前驱体溶液。在前驱体溶液中添加500μL的过硫酸铵溶液(初始浓度为10mg/mL)和6.45μL四甲基乙二胺溶液(初始浓度为775mg/mL)引发凝胶聚合。在-20℃下反应24h,聚合完成后,在室温下解冻,即得所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶。
对比例1
在不添加纳米氧化锌的情况下,在4.5mL去离子水中加入甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和甲基丙烯酸羟乙酯,配制为含60mg/mL甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和28mg/mL甲基丙烯酸羟乙酯的前驱体溶液。在前驱体溶液中添加500μL的过硫酸铵溶液(初始浓度为10mg/mL)和6.45μL四甲基乙二胺溶液(初始浓度为775mg/mL)引发凝胶聚合。在-15℃下反应24h,聚合完成后,在室温下解冻,即得不含纳米氧化锌的两性离子冷冻凝胶支架,作为与所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶的对照。
对比例2
在不添加纳米氧化锌溶液的情况下,在4.5mL去离子水中加入甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱和甲基丙烯酸羟乙酯,配制为含60mg/mL甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱和34.1mg/mL甲基丙烯酸羟乙酯的溶液,混合均匀形成前驱体溶液。在前驱体溶液中添加500μL的过硫酸铵溶液(初始浓度为10mg/mL)和6.45μL四甲基乙二胺溶液(初始浓度为775mg/mL)引发凝胶聚合。在-20℃下反应24h,聚合完成后,在室温下解冻,即得不含纳米氧化锌的两性离子冷冻凝胶支架,作为与所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶的对照。
制备过程中前驱液中各组分浓度、溶液体积、反应温度如下表1所示:
表1.冷冻凝胶前驱体溶液制备参数(不含引发剂)
结构表征与性能测试
以实施例1的两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶为例,对其进行结构表征和性能测试,结构如下:
(1)实施例1制备出的两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶的外观照片和扫描电镜图分别如图1中B和C所示。其中,图1B示所得两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶大体上颜色通透。用扫描电镜观察其表面形貌,图1C示所得两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶呈现相互贯通的大孔结构,孔径约为10~500μm,且分布均匀。
(2)实施例1所使用的纳米氧化锌的扫描电镜图和透射电镜图分别如图2中A和B所示,用于制备两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶的纳米氧化锌的粒径大小在50~100nm范围内。
(3)检测实施例1的两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶对纳米氧化锌的降解情况,结果如图3所示。根据图3的降解曲线可以看出,实施例1的两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶能够对纳米氧化锌进行稳定的降解。在第10天时已有50%左右的纳米氧化锌释放;在第40天时,纳米氧化锌的释放率几乎达到100%,此时,两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶已几乎完全降解。
(4)将实施例1和对比例1的冷冻凝胶均匀平铺至12孔板底,取成骨细胞接种至孔板内,24h后使用荧光显微镜观察,得到如图4所示的荧光显微镜照片。从图4可以看出,将成骨细胞接种于实施例1的冷冻凝胶后,可以在成骨细胞内的酸性囊泡内观察到大量的锌离子荧光,说明实施例1的冷冻凝胶可释放纳米氧化锌,并被成骨细胞摄取后溶解释放锌离子。相比之下,对比例1的成骨细胞中没有观察到任何锌离子相关荧光。
(5)将成骨细胞接种于实施例1和对比例1的冷冻凝胶中,检测冷冻凝胶的促成骨分化性能。
具体地,将成骨细胞分别接种于实施例1和对比例1的冷冻凝胶中,14天后,使用茜素红对成骨细胞进行染色,结果如图5A所示,图5A中暗色区域表示矿化结节。从图5A可以看出,将成骨细胞接种到实施例1的冷冻凝胶后,相较对比例1,在成骨细胞外出现了更明显的矿化结节。
对成骨细胞成骨分化早期(7天)相关基因ALP和Col1α1及成骨分化中晚期(14天)的相关基因OPN的基因表达水平进行检测,结果如图5B所示。图5B反映,实施例1加入纳米氧化锌的冷冻凝胶能够更有效地上调成骨分化相关基因的表达水平。
(6)将实施例1和对比例1的冷冻凝胶分别植入SD大鼠颅骨缺损区,4周后检测骨缺损修复情况。
具体地,建立大鼠颅骨缺损模型,以颅中缝为中线,左右各做一圆形缺损,在左侧(L)颅骨缺损处植入对比例1的冷冻凝胶,在右侧(R)颅骨缺损处植入实施例1的冷冻凝胶,4周后收集颅骨做Micro-CT检测,结果见图6A和6B。结果证实,使用实施例1的含纳米氧化锌颗粒的冷冻凝胶修复的骨缺损区域骨再生明显强于不含纳米氧化锌颗粒的对比例1(图6A),骨缺损区域的骨密度和骨体积均明显增高(图6B)。
HE染色实验也观察到相似的结果,使用实施例1的含纳米氧化锌颗粒的冷冻凝胶修复的骨缺损区域成骨能力明显升高,可观察到更多新生骨形成(图6C)。Masson染色实验发现,使用实施例1的含纳米氧化锌颗粒的冷冻凝胶修复的骨缺损区域的成熟骨水平明显较高,新生骨含量较对比例1明显增多(图6D)。
采用实施例2~8所制备出的冷冻凝胶的结构与性能与实施例1类似,对比例2的结构和性能与对比例1类似。
综上所述,本发明的两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶能够为骨组织再生提供引导,促进成骨细胞粘附以及诱导新骨形成;同时,能持续释放纳米氧化锌颗粒,通过其促骨生成特性促进骨缺损区新骨再生。所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶降解速率稳定,不存在纳米颗粒突释,因此避免了骨缺损区组织急性暴露于过量纳米颗粒。本发明所述两性离子/纳米氧化锌复合冷冻凝胶支架生物相容性良好,且制备工艺温和、简单,用作细胞支架材料、骨修复支架材料。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种复合冷冻凝胶,其特征在于:所述复合冷冻凝胶包括两性离子冷冻凝胶和分散在所述两性离子冷冻凝胶中的纳米氧化锌;所述纳米氧化锌的粒径为50~100nm;
所述两性离子冷冻凝胶在复合冷冻凝胶中的质量百分比为98.5%~99.998%。
2.根据权利要求1所述复合冷冻凝胶,其特征在于:所述两性离子冷冻凝胶由两性离子单体在0℃以下通过自交联而成。
3.根据权利要求2所述复合冷冻凝胶,其特征在于:所述两性离子单体为甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和/或甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱。
4.根据权利要求1~3任意一项所述复合冷冻凝胶,其特征在于:所述复合冷冻凝胶具有大小为10~500μm的孔隙。
5.一种权利要求1~4任意一项所述复合冷冻凝胶的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)将纳米氧化锌、水、两性离子单体和非两性离子单体混合,得到前驱体溶液;
(2)加入引发剂,在不高于0℃的温度下进行交联反应;
(3)交联反应结束后解冻,获得复合冷冻凝胶。
6.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述交联反应温度为-10~-30℃。
7.权利要求1~4任意一项所述复合冷冻凝胶在制备细胞支架材料中的应用。
8.权利要求1~4任意一项所述复合冷冻凝胶在制备骨修复支架材料中的应用。
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