CN111808046A - 一种喹硫平人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

一种喹硫平人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种喹硫平人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。喹硫平人工半抗原的分子结构式如式(Ⅰ)，喹硫平人工抗原的分子结构式如式(Ⅱ)。本发明的喹硫平人工半抗原最大程度地保留了喹硫平的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的喹硫平人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗喹硫平抗体，经免疫Balb/c小鼠获得的免疫腹水的效价高达1∶78000，可用于对喹硫平进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

Description

一种喹硫平人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种喹硫平人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
喹硫平是一种非典型抗精神病药物，可用于精神分裂症、急性躁狂、双相抑郁及双相障碍的维持治疗等。随着其在临床的广泛应用，对其不良反应的认识也越来越深。
经调查报告显示，服用喹硫平也会伴随着一定的不良现象，常见不良反应为头晕、嗜睡、体位性低血压、心悸、口干、食欲不振和便秘。亦可引起催乳素水平升高、体重增加、腹痛、无症状性转氨酶增高、血总胆固醇和甘油三酯增高、兴奋与失眠等。
目前，对喹硫平的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准确的要求。因此建立快速、灵敏、准确的检测技术是很有必要的。
免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。但是，由于包括喹硫平在内的大多数小分子化合物(分子量小于1000)，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上带上端位为活性基团的连接臂，再与大分子载体结合，生成半抗原-载体偶联物(即人工抗原)，人工抗原可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。
现有技术中还未有喹硫平人工半抗原、人工抗原的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种喹硫平-牛丙种球蛋白人工抗原的制备方法，所制备的喹硫平-牛丙种球蛋白人工抗原可进行动物免疫，取得相应的喹硫平抗体，可用于各种喹硫平类免疫分析法的研究，为喹硫平的检测提供更加方便快速准确的途径。
本发明首先提供了一喹硫平人工半抗原，该喹硫平人工半抗原最大程度的保留了喹硫平的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。
一种喹硫平人工半抗原，其分子结构式如(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002561959560000021
本发明公开了一种喹硫平人工半抗原的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)称取富马酸喹硫平溶于纯化水中，用1N的氢氧化钠溶液调节pH＝9，用二氯甲烷萃取三次，收集有机相干燥、过滤、减压蒸干得淡黄色油状物A；
(2)将淡黄色油状物A和丁二酸酐按摩尔比1∶1～1.5混合，加入吡啶溶解，在100℃油浴中搅拌回流反应18小时；结束反应，冷却至室温，减压蒸干溶剂，加入纯化水，用二氯甲烷萃取三次，收集有机相干燥、过滤、减压蒸干得到棕黑色油状残渣，该残渣经TLC薄层色谱(溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95％乙醇：1,4-二氧六环：浓氨水＝10:8:1:1)分离得到黄色油状物Ⅰ，即喹硫平人工半抗原。
通过上述方法，在喹硫平的羟基位置上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能较大程度地保留喹硫平的特征结构，又提供了可以与载体蛋白偶联的活性位点。
与采用环状的连接臂相比，本发明所采用的连接臂为链状，可以尽可能的降低免疫时T细胞对连接臂识别度，这样免疫得到的抗体对喹硫平的特异性和亲和力更强。
本发明还提供了一种喹硫平人工抗原，其分子结构如(Ⅱ)所示：
Figure BDA0002561959560000031
式(Ⅱ)中，BGG为牛丙种球蛋白。
本发明还提供了一种所述喹硫平人工抗原的制备方法，所述喹硫平人工抗原是通过活泼酯法使所述喹硫平人工半抗原与牛丙种球蛋白结合，获得所述喹硫平人工抗原。
具体地，采用活泼酯法制备喹硫平人工抗原时，包括以下步骤：
(a)将喹硫平人工半抗原Ⅰ与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以摩尔比为1∶1.35～1.5∶1.35～1.5溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液；
(b)将上清液滴加到牛丙种球蛋白溶液中，混合液在4℃下静置过夜，经透析、离心取上清液，获得喹硫平人工抗原。
本发明中牛丙种球蛋白溶液是将牛丙种球蛋白溶于磷酸根离子浓度为0.01mol/L的PBS(pH＝7.2-7.4)缓冲液中制成的。
步骤(b)中，所述牛丙种球蛋白溶液的浓度为5mg/ml，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1∶10。
本发明选用牛丙种球蛋白(BGG)作为大分子载体，与牛血清蛋白(BSA)相比具有以下优点：①牛丙种球蛋白能够结合更多的喹硫平人工半抗原，免疫原性较好；②从实验看，牛丙种球蛋白与喹硫平人工半抗原的结合更稳定，牛血清蛋白与喹硫平人工半抗原结合后，喹硫平人工半抗原容易在后续处理中脱离，从而使最终的人工抗原在长期保存中容易产生沉淀，稳定性差；③用牛丙种球蛋白与喹硫平人工半抗原结合后形成的喹硫平人工抗原，经动物免疫得到的抗喹硫平抗体的特异性更好。
本发明还提供了所述喹硫平人工抗原在制备抗喹硫平抗体中的应用。
本发明还提供了一种抗喹硫平抗体，是由所述喹硫平人工抗原经动物免疫得到的、可与喹硫平发生特异性免疫反应的球蛋白。
本发明还提供了所述抗喹硫平的抗体在检测喹硫平中的应用。
试验发现，将所述喹硫平人工抗原免疫Balb/c小鼠，获得的单克隆抗体的效价为1∶78000。表明本发明的喹硫平人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗喹硫平抗体，该抗喹硫平抗体可用于喹硫平的免疫检测和分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的喹硫平人工半抗原最大程度地保留了喹硫平的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的喹硫平人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗喹硫平抗体，经免疫新Balb/c小鼠获得的免疫腹水的效价高达1∶78000，可用于对喹硫平进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为本发明喹硫平人工抗原的制备流程图；
其中，THF表示四氢呋喃，MeOH表示甲醇，DCC表示二环己基碳二亚胺，DMF表示N，N-二甲基甲酰胺，Et3N表示三乙胺，BSA表示牛血清蛋白，BGG表示牛丙种球蛋白，下同；
图2为本发明喹硫平人工半抗原的液相色谱图；
其中，mAU表示毫吸光度单位，min表示分钟；
图3为本发明喹硫平半抗原的质谱图；
其中，Relative Abundance表示相对丰度；m/z表示荷质比；
图4为喹硫平人工半抗原、牛丙种球蛋白、喹硫平人工抗原的紫外扫描图；
其中，A表示紫外-可见吸光度，λ(nm)表示波长(nm)；
图5为对比例1喹硫平人工抗原的制备流程图；
图6为对比例2喹硫平人工抗原的制备流程图；
图7为对比例3喹硫平人工抗原的制备流程图；
图8为对比例4喹硫平人工抗原的制备流程图；
图9为对比例5喹硫平人工抗原的制备流程图；
图10为对比例6喹硫平人工抗原的制备流程图；
图11为对比例7喹硫平人工抗原的制备流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施一种喹硫平人工抗原的制备方法(反应历程如图1)，包括以下步骤：
(1)人工半抗原的制备：
①称取富马酸喹硫平200mg(0.45mmol)于50ml尖底离心管中，加入20ml纯化水溶解，待溶清后再加入浓氨水调节溶液pH＝9，此时有大量白色沉淀出现，每次用20ml二氯甲烷萃取，共萃取三次，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得淡黄色油状物A170mg(0.44mmol)；
对该淡黄色油状产物A进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：氨水＝10：8：1：1(v/v)，产物Rf＝0.8；
②将淡黄色油状物A170mg(0.44mmol)和丁二酸酐66mg(0.66mmol)置于50ml单口圆底烧瓶中，加入10ml吡啶溶解，再加搅拌子，在100℃油浴中搅拌回流反应18小时；结束反应，冷却至室温，减压蒸干溶剂，加入纯化水，用二氯甲烷萃取三次，收集有机相干燥、过滤、减压蒸干得到棕黑色油状残渣，该残渣经TLC薄层色谱(溶剂和洗脱机为无水乙醇，层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1,4-二氧六环：浓氨水＝10:8:1:1)分离得到黄色油状物Ⅰ116mg(0.24mmol)，即喹硫平人工半抗原。
对该黄色油状物Ⅰ进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：氨水＝10：8：1：1(v/v)，产物Rf＝0.3；
喹硫平人工半抗原的液相色谱图见图2(紫外检测器，波长220nm)。
从图2可以看出经过纯化得到的喹硫平人工半抗原的纯度达到99.9％以上。
喹硫平半抗原的质谱图见图3。从图3可以看出本实施例得到的喹硫平人工半抗原的分子离子峰的质荷比(m/z)为483，与其理论分子量吻合，它的主要碎片离子峰的质荷比(m/z)与其主要碎片的理论值吻合，可以确定步骤②得到的黄色油状物Ⅰ就是本发明所设计的喹硫平人工半抗原。
(2)喹硫平人工抗原的制备：
③将116mg(0.24mmol)喹硫平人工半抗原置于50ml圆底烧瓶中，加入5.8ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，再加入37mg(0.32mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和66mg(0.32mmol)二环己基碳二亚胺，20℃搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
④称取14.500g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L，钠离子浓度为0.17mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑤称取0.29g牛丙种球蛋白溶于58ml步骤④的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛丙种球蛋白溶液。
⑥在快速搅拌下，将步骤③的上清液缓慢滴加到⑤的牛丙种球蛋白溶液中，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1∶10，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑦将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤④的PBS缓冲液透析7次，透析结束后，离心取上清液即得到人工抗原：喹硫平-牛丙种球蛋白偶联物(如式Ⅱ)。
喹硫平人工抗原制备前后的紫外扫描图见图4。其中，曲线a为喹硫平人工半抗原的紫外扫描图，曲线b为牛丙种球蛋白的紫外扫描图，曲线c为喹硫平人工抗原的紫外扫描图。喹硫平人工半抗原的最大吸收波长为263nm，喹硫平人工抗原的最大吸收波长为285nm，与喹硫平半抗原、牛丙种球蛋白相比，喹硫平人工抗原的最大吸收波长和吸光度都出现明显变化，说明喹硫平半抗原与牛丙种球蛋白偶联成功。
对比例1
本实施一种喹硫平人工抗原的制备方法(反应历程如图5)，包括以下步骤：
(1)喹硫平人工半抗原的制备：
①称取富马酸喹硫平200mg(0.45mmol)于50ml尖底离心管中，加入20ml纯化水溶解，待溶清后再加入浓氨水调节溶液pH＝9，此时有大量白色沉淀出现，每次用20ml二氯甲烷萃取，共萃取三次，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得淡黄色油状物A162mg(0.42mmol)；
对该淡黄色油状产物A进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：氨水＝10：8：1：1(v/v)，产物Rf＝0.8；
②将上步淡黄色油状物A162mg(0.42mmol)与碘化钾140mg(0.84mmol)置于50ml单口圆底烧瓶中，加入15mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，溶解完全后再加入溴乙酸乙酯141μL(1.27mmol)在138℃油浴中搅拌反应18小时；结束反应，冷却至室温，减压蒸干溶剂，然后加入20ml纯化水，用20ml*3的乙酸乙酯萃取，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得到棕黑色油状残渣，该残渣经TLC薄层色谱(溶剂和洗脱机为无水乙醇，层析液为乙酸乙酯)分离得到棕黄色油状物B98mg(0.21mmol)；
对该灰棕黄色油状物B进行TLC检测，层析液为乙酸乙酯，产物Rf＝0.9；
③将棕黄色油状物B98mg(0.21mmol)溶于2ml甲醇、2ml四氢呋喃(THF)和5ml1N的氢氧化钠溶液，室温下搅拌反应16小时；结束反应，用1N的盐酸调pH＝3，此时有大量的白色沉淀出现，用15ml*3乙酸乙酯萃取，收集有机相相，再分别用30ml纯化水和30ml饱和的食盐水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、转干得淡黄色油状物Ⅲ82mg(0.19mmol)即喹硫平人工半抗原(如式Ⅲ)。
对该淡黄色油状物Ⅲ进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：氨水＝10：8：1：1(v/v)，产物Rf＝0.3；
(2)喹硫平人工抗原的制备：
④将82mg(0.19mmol)喹硫平人工半抗原置于50ml圆底烧瓶中，加入4.1ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，再加入32mg(0.28mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和58mg(0.28mmol)二环己基碳二亚胺，25℃搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
⑤称取14.500g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L，钠离子浓度为0.17mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑥称取0.205g牛血清蛋白溶于41ml步骤⑤的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑦在快速搅拌下，将步骤④的上清液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶10，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析7次，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：喹硫平-牛血清蛋白偶联物(如式Ⅳ)。
对比例2
本实施一种喹硫平人工抗原的制备方法(反应历程如图6)，包括以下步骤：
(1)喹硫平人工半抗原的制备：
①～③分别与对比例1相同。
(2)喹硫平人工抗原的制备：
采用牛丙种蛋白作载体，与喹硫平人工半抗原Ⅲ进行偶联，偶联步骤与对比例1相同，得到喹硫平人工抗原Ⅴ。
对比例3
本实施一种喹硫平人工抗原的制备方法(反应历程如图7)，包括以下步骤：
(1)喹硫平人工半抗原的制备：
①～③分别与对比例1相同。
(2)喹硫平人工抗原的制备：
④称取80mg(0.18mmol)喹硫平人工半抗原Ⅲ置于50ml圆底烧瓶中，加入4ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入27μL(0.20mmol)三乙胺和26μL(0.20mmol)氯甲酸异丁酯，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
⑤-⑧分别与对比例1相同；得到喹硫平人工抗原Ⅵ。
对比例4
本实施一种喹硫平人工抗原的制备方法(反应历程如图8)，包括以下步骤：
(1)喹硫平人工半抗原的制备：
①～③分别与对比例1相同。
(2)喹硫平人工抗原的制备：
④与对比例3相同。
⑤称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L，钠离子浓度为0.17mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑥称取0.20g牛丙种球蛋白溶于40ml步骤⑤的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛丙种球蛋白溶液。
⑦在快速搅拌下，将步骤④的上清液缓慢滴加到牛丙种球蛋白溶液中，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1∶10，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析5次，透析结束后离心取上清液即得到喹硫平人工抗原Ⅶ。
对比例5
本实施一种喹硫平人工抗原的制备方法(反应历程如图9)，包括以下步骤：
(1)喹硫平人工半抗原的制备：
①～②分别与实施例1相同。
(2)喹硫平人工抗原的制备：
采用牛血清蛋白作载体，与喹硫平人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步骤与实例1相同，得到喹硫平人工抗原Ⅷ。
对比例6
本实施一种喹硫平人工抗原的制备方法(反应历程如图10)，包括以下步骤：
(1)喹硫平人工半抗原的制备：
①～②分别与实施例1相同。
(2)喹硫平人工抗原的制备：
③称取100mg(0.21mmol)喹硫平人工半抗原Ⅲ置于50ml圆底烧瓶中，加入5ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入31μL(0.23mmol)三乙胺和30μL(0.23mmol)氯甲酸异丁酯，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
④称取14.500g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L，钠离子浓度为0.17mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑤称取0.25g牛血清蛋白溶于50ml步骤④的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑥在快速搅拌下，将步骤③的上清液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶10，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑦将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤④的PBS缓冲液透析7次，透析结束后离心取上清液即得到喹硫平人工抗原Ⅸ。
对比例7
本实施一种喹硫平人工抗原的制备方法(反应历程如图11)，包括以下步骤：
(1)喹硫平人工半抗原的制备：
①～②分别与实施例1相同。
(2)喹硫平人工抗原的制备：
采用牛丙种蛋白作载体，与喹硫平人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步骤与对比例6相同，得到喹硫平人工抗原Ⅹ。
实施例2喹硫平人工抗原的性能测定
(1)喹硫平人工抗原的鉴定：
摩尔吸收系数ε：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的喹硫平人工半抗原溶液，通过紫外扫描图可知喹硫平半抗原的最大吸收波长为263nm，在263nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数(即摩尔吸收系数)的计算公式为：ε＝吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度的测定：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml的牛丙种球蛋白溶液各1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将人工抗原溶液(用PBS缓冲液配制)按一定比例稀释，在655nm处测得人工抗原的吸光值，从曲线上读取人工抗原溶液的相应蛋白浓度值。
偶联比测定：配制100μg/ml牛丙种球蛋白的PBS溶液，将偶联物(即喹硫平人工抗原)用PBS稀释到100μg/ml，以PBS为空白对照，在285nm处分别测得吸光值A2、A1，则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/150000)。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol)，150000为牛丙种球蛋白的分子量，100×10-3为牛丙种球蛋白浓度(g/L)。
采用牛血清蛋白作为载体，偶联比的计算式为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000)，其中，65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3为牛血清蛋白浓度(g/L)。
表1各喹硫平人工抗原的偶联比和摩尔吸收系数
编号 人工抗原 偶联比 偶联物蛋白浓度 摩尔吸收系数
实施例1 Ⅱ 20 3.25mg/ml 4625.13
对比例1 Ⅳ 16 2.46mg/ml 3915.58
对比例2 Ⅴ 30 4.15mg/ml 3915.58
对比例3 Ⅵ 15 3.06mg/ml 3915.58
对比例4 Ⅶ 21 2.96mg/ml 3915.58
对比例5 Ⅷ 17 2.79mg/ml 4625.13
对比例6 Ⅸ 18 2.21mg/ml 4625.13
对比例7 Ⅹ 13 2.06mg/ml 4625.13
由表1可见，人工半抗原的结构，人工半抗原的活化方法以及载体蛋白的结构对人工半抗原与载体蛋白交联时的偶联比都是有影响的。
(2)动物免疫
将制备的各喹硫平人工抗原免疫Balb/c小鼠，得到的免疫腹水经ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。
表2各免疫腹水的效价检测结果
编号 喹硫平人工抗原 免疫腹水效价
实施例1 Ⅱ 1∶78000
对比例1 Ⅳ 1∶70000
对比例2 Ⅴ 1∶42000
对比例3 Ⅵ 1∶30000
对比例4 Ⅶ 1∶6000
对比例5 Ⅷ 1∶40000
对比例6 Ⅸ 1∶8000
对比例7 Ⅹ 1∶20000
由表2可见，与实施例1相比，利用各对比例喹硫平人工抗原进行动物免疫获得的免疫腹水，其效价均偏低，不能用于免疫分析中。而利用喹硫平人工抗原Ⅱ进行动物免疫获得的免疫腹水，其效价达1∶78000，完全可用于免疫分析中，能为喹硫平的检测提供更加方便快速准确的途径。

Claims (9)

1.一种喹硫平人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002561959550000011
2.如权利要求1所述喹硫平人工半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取富马酸喹硫平溶于纯化水中，用浓氨水调节pH＝9，用二氯甲烷萃取三次，收集有机相干燥、过滤、减压蒸干得淡黄色油状物A；
(2)将淡黄色油状物A和丁二酸酐按摩尔比1∶1～1.5混合，加入吡啶溶解，在100℃油浴中搅拌回流反应18小时；结束反应，冷却至室温，减压蒸干溶剂，加入纯化水，用二氯甲烷萃取三次，收集有机相干燥、过滤、减压蒸干得到棕黑色油状残渣，该残渣经TLC薄层色谱(溶剂和洗脱剂为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95％乙醇：1,4-二氧六环：浓氨水＝10:8:1:1)分离得到黄色油状物Ⅰ，即喹硫平人工半抗原。
3.一种喹硫平人工抗原，其特征在于，其分子结构式如(Ⅱ)所示：
Figure FDA0002561959550000012
式(Ⅱ)中，BGG为牛丙种球蛋白。
4.如权利要求3所述喹硫平人工抗原，其特征在于，所述喹硫平人工抗原通过活泼酯法使权利要求1所述的喹硫平人工半抗原与牛丙种球蛋白结合，获得喹硫平人工抗原。
5.如权利要求4所述喹硫平人工抗原，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将喹硫平人工半抗原Ⅰ与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以摩尔比为1∶1.35～1.5∶1.35～1.5溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液；
(b)将上清液滴加到牛丙种球蛋白溶液中，混合液置于4℃下静置过夜，经透析、离心取上清液，获得喹硫平人工抗原。
6.如权利要求5所述喹硫平人工抗原，其特征在于，步骤(b)中，所述牛丙种球蛋溶液的浓度为5mg/ml，上清液与牛丙种球蛋溶液的体积比为1∶10。
7.权利要求3所述喹硫平人工抗原在制备抗喹硫平抗体中的应用。
8.一种抗喹硫平抗体，其特征在于，是由权利要求3所述喹硫平人工抗原经动物免疫得到的、可与喹硫平发生特异性免疫反应的球蛋白。
9.权利要求8所述抗喹硫平抗体在检测喹硫平中的应用。
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